Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

I Vivo blod - hjerne barrieren permeabilitet analysen mus med Fluorescently merket Tracers

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/57038
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Institute of Neurology (Edinger Institute), Goethe University Hospital, 2Pharmazentrum Frankfurt, Institute for General Pharmacology and Toxicology, Goethe University Hospital

Summary

Her presenterer vi en mus hjernen vaskulær permeabilitet analysen bruker intraperitoneal injeksjon av fluorescerende tracers etterfulgt av perfusjon som gjelder for dyr modeller av blod - hjerne barrieren dysfunksjon. En hemi-hjerne er brukt for å vurdere permeabilitet kvantitativt, og den andre for tracer visualisering/immunostaining. Prosedyren tar 5-6 h for 10 mus.

Abstract

Blod - hjerne barrieren (BBB) er en spesialisert barriere som beskytter hjernen microenvironment fra giftstoffer og patogener i sirkulasjon og vedlikeholder hjernen homeostase. De viktigste stedene av barrieren er endotelceller av hjernen kapillærer som barriere funksjon resultater fra stramt intercellulære veikryss og middelklasseinnbyggere transportører uttrykt på plasma membranen. Denne funksjonen er regulert av pericytes og astrocyttene som sammen danner nevrovaskulære enheten (NVU). Flere nevrologiske sykdommer som slag, Alzheimers sykdom (AD), hjernesvulster er forbundet med en svekket BBB-funksjon. Vurdering av BBB permeabilitet er derfor avgjørende å evaluere alvorlighetsgraden av nevrologisk sykdom og suksessen til behandling strategier ansatt.

Vi presenterer her en enkel men robust permeabilitet analysen som er vellykket brukt flere musen modeller både genetiske og eksperimentelle. Metoden er svært kvantitative og objektiv i forhold til tracer fluorescens analysen av mikroskopi som brukes ofte. I denne metoden, er mus injisert intraperitoneally med en blanding av vandig inert fluorescerende tracers etterfulgt av anesthetizing musene. CARDIAC perfusjon av dyrene utføres før høsting hjernen, nyrene eller andre organer. Organer er homogenisert og sentrifugeres etterfulgt av fluorescens måling fra nedbryting. Blod fra den cardiac punktering like før perfusjonsmåling serverer for normalisering hensikt å vaskulære kupé. Vev fluorescens normaliseres til den våte vekt og serum fluorescensen å få en kvantitativ tracer permeabilitet indeks. For ytterligere bekreftelse, kan kontralateral hemi-hjernen bevart for immunohistochemistry benyttes for tracer fluorescens visualisering formål.

Introduction

Blod - hjerne barrieren (BBB) består av mikrovaskulær endotelceller (ECs) støttes av nært knyttet pericytes (PCs), som er ensheathed i den basale lamina, og astrocyttene (ACs) som innhylle kjelleren membranen med slutten-fot1 ,2. ECs samhandle med flere celletyper som støtter og regulere funksjonen barriere, primært ACs og PCer, og også neurons og microglia, som sammen danner nevrovaskulære enheten (NVU). NVU er avgjørende for funksjonen til BBB, som begrenser transport av blodbårne giftstoffer og patogener å hjernen. Denne funksjonen er et resultat av tett-kryss molekyler som claudin-5, occludin, zonula occludens-1, som finnes mellom ECs og også av transportører som p-glykoprotein (P-gp) at middelklasseinnbyggere molekyler angir endotelet tilbake i fartøyet lumen1,2,3. BBB men lar for transport av viktige molekyler som næringsstoffer (glukose, jern, aminosyrer) av bestemte transportører uttrykt på EC plasma membraner1,2,3. EC laget er svært polarisert med hensyn til fordelingen av ulike transportører mellom luminal (blod-mot) og abluminal (hjernen mot membraner) å tillate bestemt og vectorial funksjonen4,5 . Mens BBB er beskyttende forhold til strengt regulere CNS miljøet, er det en stor utfordring for CNS narkotika-leveranser i sykdommer som Parkinsons med en funksjonell BBB. Selv i nevrologiske sykdommer med BBB dysfunksjon, kan det antas at hjernen stoffet levering øker ettersom barriere dysfunction kan omfatte skade på bestemte transporter målene for eksempel som Alzheimers sykdom (AD). I Annonsen, flere amyloid beta transportører som LRP1, RAGE, P-gp er kjent for å være dysregulated og dermed målretting disse transportører kan være nytteløst6,7,8. BBB er svekket i flere nevrologiske sykdommer som slag, annonse, hjernehinnebetennelse, multippel sklerose, og i hjernen svulster9,10,11. Gjenopprette funksjonen barriere er en viktig del av den terapeutiske strategien og dermed sin vurdering er kritiske.

I dette arbeidet har vi beskrevet en objektiv og kvantitative protokoll for permeabilitet analysen i gnagere at vi har brukt flere musen linjer både transgene og eksperimentelle modeller10,12,13 ,14. Metoden er basert på en enkelt intraperitoneal injeksjon av fluorescerende tracers etterfulgt av perfusjon av musene fjerne tracers fra vaskulære kupé. Hjernen og andre organer er samlet innlegget perfusjon og permeabilitet vurdert av et mål og absolutt permeabilitet index basert på fluorescens målinger av vev homogenates i en plate-leser. Alle rå fluorescens verdier er korrigert for bakgrunnen med vev homogenates eller serum fra sham dyr som ikke mottar noen tracer. God normalizations er inkludert for serum volum, serum fluorescens og vekten av vev, dermed gir permeabilitet indeks som er absolutt og sammenlignbare mellom eksperimenter og vev typer. For enkel sammenligning mellom grupper, kan de absolutte permeabilitet indeksverdiene lett forvandles til prosenter som vi hadde utført tidligere12. Samtidig, kan lagrede hemi-hjerner og nyre utnyttes for tracer visualisering av fluorescens mikroskopi10. Klassiske fluorescens mikroskopi kan være verdifullt å skaffe regionale aldersforskjell permeabilitet riktignok tungvint på grunn av subjektive utvalg av vev deler og bilder for en semi kvantitativ analyse. Detaljerte trinn presenteres i protokollen og notater legges der det passer. Dette gir nødvendig informasjon for å kunne utføre i vivo permeabilitet analysen i mus som kan skaleres til andre små dyr. Analysen kan brukes til mange typer tracers slik at tillegget og størrelsen basert permeabilitet vurdering av en kombinasjon av tracers med forskjellige fluorescens spectra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrene ble behandlet med den ytterste forsiktighet minimere smerte eller ubehag under prosedyren. Denne fremgangsmåten følger retningslinjene som dyr omsorg i institusjon våre og er godkjent av lokale (Regierungspraesidium Darmstadt, godkjenningsnummer FK/1044).

En skjematisk arbeid trinnene for i vivo permeabilitet analysen i mus er vist i figur 1. Detaljer om hvert trinn er beskrevet nedenfor.

1. animal håndtering

  1. Utarbeidelse og administrasjon av tracers og bedøvelse
    1. Forberede merket rør og mugg vev innebygging minst en dag før permeabilitet analysen. Opprettholde sterile forhold gjennom protokollen ved arbeider under ren avtrekksvifte og bruke verktøy med 80% etanol. Bruk mann eller kvinne vill-type (WT) eller angiopoietin-2 (Ang-2) gevinst-av-funksjon (GOF) CD1 mus i eldre voksne alderen 3-6 måneder for gjeldende protokollen. Utføre genotyperingteknologi av mus som beskrevet tidligere 10.
      Merk: 80% alkohol vil ikke resultere i sterilt instrumenter, men vil redusere forurensning av prøvene forberedt.
    2. Fortynne alle tracers i sterilt PBS i 2 mM aksjer og lagre dele beskyttet mot lyset på 20 ° C.
    3. Velg tracers som (Tetramethyl Rhodamine) TMR og (fluorescein isothiocyanate) FITC med forskjellige eksitasjon/utslipp spectra og som er lysin fixable resulterer i minimal støy mellom fargestoffer både av fluorescens mikroskopi (bruker TMR eller FITC filtrerer henholdsvis) og fluorometry i en plate-leser for permeabilitet analysen.
      Merk: TMR dekstran 3 kD og FITC dekstran 3 kD brukt i studien er begge lysin fixable og dermed kan også brukes til immunohistochemical analyse etter fiksering med aldehyder for å undersøke regionale forskjeller.
    4. Behandle alle dyr med omhu følge institusjon retningslinjene. Injiser intraperitoneally hver musen med 100 µL tracer løsning som kan økes til 200 µL når en ekstra tracer kombineres med 100 µL av hver tracer i en 1:1 blanding10,13. Sette inn minst ett dyr med PBS alene i stedet for tracers som humbug kontroll for autofluorescence bakgrunn subtraksjon.
    5. 5 min etter tracer injeksjon, bedøve dyret med i.p injeksjon av ketamin og Xylazine (100 mg og 5-10 mg 0,9% saltløsning per kg kroppen vekt henholdsvis 150 µL av cocktail per 25 g musen).
      Merk: Vet salve ble ikke brukt på øynene under prosedyren som perioden mellom dyr anestesi og perfusjon/offer var kort (10 minutter) hvor alle tørking av øynene var ikke observert.
  2. Blod samling og kardial perfusjon
    1. Forberede dyrene cardiac perfusjon 10 min etter bedøvende administrasjon. Sjekk fravær av pote rykk svar for å sikre at dyret nådd et kirurgisk fly av anestesi.
    2. Lå dyrene på ryggen og bruke 80% etanol på huden i mageområdet. Liten saks, åpne opp bukveggen med et lite innsnitt (2 cm) like under ribbe buret. Skille leveren fra membranen og sakte skjær gjennom membranen utsette pleural hulrom 15.
    3. Skjær ribbe buret bilateralt og fastsette cut sternum slik at venstre ventrikkel. Sett inn en 21-gauge sommerfugl nål koblet til en peristaltiske perfusjon system i bakre av venstre ventrikkel.
    4. Punktering høyre atrium og raskt (innen 10 s) samle 200-300 µL av blod ut i brysthulen bruker 1 mL pipette-spisser (med slutten cut-off) i serum samling rør og lagre det på is.
      Merk: Denne perfusjon prosedyren er ikke-overlevelse.
    5. Så snart blod samles, slå på perfusjon systemet (10-12 rpm, 5 mL/min) og perfuse dyr for 3 min med varm (RT) 1 x PBS (gratis Ca2 /Mg2 + ioner).
      Merk: PBS inneholder Ca2 +/Mg2 + ioner kan utnyttes for bedre hjerte aktivitet under perfusjonen. Den totale mengden PBS brukes for perfusjonsmåling er i størrelsesorden 15-20 mL.
    6. Vurdere perfusjon kvalitet ved å merke fargen på lever, nyrer, som hvite/bleke etter perfusjon.
      Merk: Nyre eller lever perfusjon betyr ikke nødvendigvis hjernen perfusjon som arteriene (carotis/ryggvirvel) nå hjernen fra aortabuen kan få sprukket under utarbeidelsen i trinn 3 spesielt under atrial punktering.

2. vev behandling

  1. Orgel innsamling og oppbevaring
    1. På slutten av perfusjonen, bekrefte drap av dyret av cervical forvridning og avling hjernen og nyrene. Kontroller hjernen perfusjon av fargen på hjernen (ingen synlig blod i fartøy av meninges), for å utelate dyrene fra permeabilitet analyse når perfusjon kvalitet ikke er bra. Skille hjernen i 2 hemibrains ved hjelp av en skalpell (figur 1).
    2. Dissekere med en skalpell en hemibrain olfactory lobes og lillehjernen og overføre hemicerebrum til en 2-mL tube. Lagre hemi-lillehjernen i en ekstra rør nødvendig for lillehjernen permeabilitet vurdering.
    3. Overføre en enkelt nyre til en annen 2-mL tube. Lagre prøvene umiddelbart på tørris.
    4. Bygge innfødt gjenværende nyre og hemi-hjerne (bestående av lillehjernen og olfactory lobes) i vev-tek optimal kutte temperatur (O.C.T) sammensatte på tørris.
    5. Til slutt sentrifuge blodprøvene lagret på isen i serum samling rør på 10, 000 g, 10 min på 4 ° C. Overføre serum supernatants til 1,5 mL rør og plassere dem i beholderen tørris.
    6. Overføre alle prøvene samlet på tørris-80 ° C fryser før videre behandling.
      Merk: Det er viktig å fryse prøvene før du fortsetter til homogeniseringstrinnene som homogenisering effektivitet øker etter som fryse tining.
  2. Homogenisering og sentrifugering
    1. Tine på is hemi-hjernen og nyrene prøvene fryses ned på-80 ° C og veie rør som inneholder organer. Fra disse vekter, trekk middelverdien av flere tomme rør (ca 20) å få vev vekten. Legger 300 µL og 200 µL av kaldt 1 X PBS til rør som inneholder nyre og hemi-hjernen, henholdsvis.
      Merk: For lavere mengder vev (som hemi-lillehjernen, under 100 mg) veier personlige rør anbefales.
    2. Homogenize hvert utvalg i opprinnelige eppendorf røret med en polytetrafluoroethylene (PTFE) støter knyttet til en elektrisk overhead rørestang (1, 000 rpm) ved å utføre ca 15 slag (1 strøk = 1 opp og 1 ned). Skyll pistil med PBS mellom prøver og tørke tørr før du fortsetter til neste prøven.
      Merk: Bruk av rengjøringsmidler i løpet homogenisering ble unngått på grunn av forstyrrelser med fluorometry. Intracellulær tracer oppdages imidlertid også i denne protokollen, som vev er grundig homogenisert, som er mer effektivt etter en runde med fryse tining.
    3. Lagre homogenisert prøvene på is beskyttet fra lys og sentrifuger alle sammen i slutten på 15.000 g, 20 min, 4 ° C i en tabletop sentrifuge. Overføre supernatants til en ny 1,5 mL-rør på is for umiddelbar fluorometry eller på-80 ° C skal analyseres senere.
  3. Fluorescens måling og kvantifisering
    1. Hvis frosset på slutten av forrige trinn, tine på is vev nedbryting og serum prøvene lagret på-80 grader beskytte dem fra lys med folie.
    2. Pipetter 50 µL utvannet serum (30 µL 1 x PBS + 20 µL serum) eller vev supernatants (som er) i en 384-vel svart plate. Inkluder minst ett utvalg fra sham dyr for serum og vev supernatants å sikre riktig bakgrunn subtraksjon, som denne vev homogenate bakgrunn er vanligvis høyere enn PBS som fortynningsmiddel.
      Merk: Gjennomsnittlig 3 humbug dyr kan brukes til autofluorescence, selv om en svært liten variasjon i humbug autofluorescence verdier (data ikke vist) ble observert. Mengden av serum brukt kan reduseres ved å fortynne det med PBS, som også kan øke signalet til støyforhold for prøver med lav fluorescens som hjernen prøvene. Opptil 10 µL serum ble testet fortynne den med 40 µL PBS. Kontroller at det finnes noen bobler i brønnene.
    3. Den 384-vel svarte platen inn platen leseren og åpne en ny skriften å velge fluorescens måling.
    4. Angi forsterkningen til optimal og bruke eksitasjon/utslipp (nm) verdier 550/580 eller 490/520 for TMR eller FITC dyee henholdsvis og starte målingen for å få rå fluorescens enheter (RFUs).
    5. Bruke rå fluorescens enhetene (RFUs) fra platen leseren for å beregne permeabilitet indeksen (PI) fratrukket tilsvarende humbug verdier.
      1. * Permeabilitet indeks (mL/g) = (Vev RFUs/g vev vekt) / (Serum RFUs/mL serum)
    6. Eksempel beregning for hjernen permeabilitet indeks (PI) av dyr GOF1 (tabell 1):
      1. GOF1 brain RFUs - HUMBUG hjernen RFUs = 154-22,5 = 131.5
      2. GOF1 serum RFUs - HUMBUG serum RFUs = 38305-27 = 38278
      3. Hjernen vekt (g) = 0.195
      4. Serum volum (ml) = 0,02
      5. Hjernen permeabilitet indeks (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
        Merk: Permeabilitet indeks beregningene gi verdier som er absolutt og sammenlignbare mellom eksperimenter og vev typer. Dette kan imidlertid presenteres som prosenter for enkel sammenligning mellom 2 grupper 12. Dette kan oppnås ved å dele PI av hvert dyr i begge gruppene med mener PI i kontrollgruppen, kjører kontroll gruppe gjennomsnittet gjennom 1 men holder inter dyr variasjonen i kontrollgruppen. Denne endringen gir verdiene for forsøksgruppen (eller grupper) i forhold til kontrollgruppen satt til 1.
  4. Immunofluorescence visualisering av tracer
    1. Kuttet nyre/hemi-hjerne blokkene innebygd innebygd i vev-tek sammensatte (O.C.T) (trinn 2.1) i 10 µm deler på en kryostaten satt til 20 ° C og overføre delene til lysbilder plassert ved romtemperatur. Når delene er tørket (ca 30 min), kan du overføre lysbilder til-80 ° C fryseren før bruk.
    2. På dagen for flekker, tine lysbildene ved 37 ° C i 10 min og deretter ordne delene med 4% paraformaladehyde (PFA) i 10 min ved romtemperatur etterfulgt av rask vask i PBS.
    3. Inkuber delene i permeabilization/blokkerer buffer av sterile PBS med 1% BSA og 0,5% Triton X-100 pH 7.5 1t ved romtemperatur.
    4. Inkuber lysbilder for 1,5 t ved romtemperatur med CD31 primære antistoff (0,5 mg/ml, klone MEC 13,3), fortynnet i 1: 100 i bufferen som inneholder sterilt PBS, 0,5% BSA, 0,25% Triton X-100 (pH 7.2) etterfulgt av tre 5 min vasker i PBS.
    5. Utføre sekundære antistoff inkubasjon i ovennevnte bufferen 1t ved romtemperatur med artsspesifikke fluorescently merket antistoffer utvannet 1:500 (2 mg/mL). For CD31, kan geit anti-rotte Alexa 568 eller Alexa 488 brukes på en fortynning av 1:500. Inkluderer DAPI (300 µM) i sekundære antistoffer blande (1:1, 000 fortynning fra lager) til stain for kjerner.
    6. Montere delene beiset med aqua polymount og la den over natten for polymerisering ved romtemperatur i mørket.
    7. Hente bilder ved hjelp av en spektral tenkelig AC confocal laser skanning mikroskop systemet. Analysere bilder av NIS elementer programvare (versjon 4.3). Som Photoshop kan brukes for generering av montasje.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har nylig vist at angiopoietin-2 (Ang-2) gevinst-av-funksjon (GOF) mus har høyere hjernen vaskulær permeabilitet enn kontroll mus i sunne arbeidsforhold10. I slag-indusert mus var det også viser at GOF musene hadde større betennelsessykdommer størrelser og større permeabilitet enn kontroll littermates. Disse resultatene viser en avgjørende rolle av Ang-2 i permeabilitet på BBB. Protokollen derfor benyttet GOF mus og sammenlignet dem til å kontrollere littermates å beskrive i vivo permeabilitet analysen. Men denne metoden kan brukes på noen sykdom modell, transgene musemodell eller narkotika behandlinger som endrer BBB permeabilitet som vi gjorde tidligere 10,11,12,13.

En kort sirkulasjon tid (15 min) for permeabilitet analyse foreslås som lengre sirkulasjon ganger vil føre til en større klaring fra vaskulære kammer, som har blitt observert også i tidligere studier16. Rydding av 3 kD FITC-dekstran på 2 t ((figur 2 ) C, D) er mye større enn 15 minutter ((figur 2 ) A, B) i nyre så vel som hjernevev. I hjernen er det svært lite ekstravaskulær overvåking av tracer skyldes intakt blod - hjerne barrieren i disse voksen WT mus (Figur B, D). Bruk denne metoden, ble tracer permeabilitet i Ang-2 GOF med WT littermates sammenlignet. Resultatene presenteres i tabellformat (tabell 1) indikerer høyere tracer akkumulering i hjernen GOF mus sammenlignet WT mus. Nyre fluorescens endres imidlertid ikke mellom disse gruppene. Immunofluorescence bildene bekrefter økningen i ekstravaskulær overvåking av tracer i GOF mus ((Figur 3 ) B, D) sammenlignet med WT mus ((Figur 3 ) A, C) der tracer er begrenset til vaskulære kupé.

Figure 1
Figur 1. Skjematisk av arbeidsflyten for i vivo permeabilitet analysen med fluorescerende tracers. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Tracer klaring på kort og lang sirkulasjon ganger. For å etablere tracer sirkulasjon tiden for permeabilitet analysen, en kort sirkulasjon tid med 15 min ble (A, B) sammenlignet lang sirkulasjon tid 2t (C, D) innlegget tracer injeksjon. Lengre sirkulasjon tidspunktet for 2t førte til svært lave mengder tracer akkumulering i nyre (C) der basale permeabilitet er høy sammenlignet med en kort 15 min sirkulasjon tid (A) potensielt på grunn av en svært høy klarering av FITC dekstran-3 kD (grønn kanalen) fra vaskulære kupé. Denne effekten var enda mer dramatisk i hjernen preget av tett blod - hjerne barrieren (B, D). CD31 flekker (rød kanal) bekreftet tilstedeværelse av fartøyer i området rundt. Representant bilder fra en enkelt dyr av 2 vill-type voksne CD1 mus injisert Tracer for hvert punkt og dyr ble ofret uten perfusing dem til å visualisere de intravascular tracer. Baren skala = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Immunofluorescence flekk for tracers å vurdere hjernen permeabilitet endringer i GOF mus. Økt permeabilitet av 3 kD TMR-dekstran tracer (i rødt) kan visualiseres i Ang-2 GOF mus (B, D) sammenlignet med WT littermates (A, C) i regionen cortex. I WT dyr er tracer begrenset til fartøyene (A, C) mens ekstravaskulær overvåking av tracer kan observeres i GOF mus (hvite pilene i B, D). Flekker for CD31 (i blått) i flettede bilder bekrefter (A-D) tilstedeværelsen av fartøy. Figuren viser representant bilder fra 2 WT og 2 GOF mus injisert med tracers i.p ofret 15 min post injeksjon perfusjon. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dyr ID Hjernen vekt (g) Nyre vekt (g) Serum volum (mL) Serum RFU Nyre RFU Hjernen RFU Perm. Indeks (10 ^-3 ml/g)
Nyre Hjernen
GOF 1 0.195 0.252 0,02 38305 31051 154 64.4 0.352
GOF 2 0.177 0.249 0,02 42001 31411 126 60 0.278
WT 1 0.167 0.301 0,02 40904 31591 64 51,2 0.122
WT 2 0.146 0.294 0,02 39502 31768 70 54,8 0.164
HUMBUG 0.155 0,27 0,02 27 36 22,5 NA NA

Tabell 1. Vev permeabilitet beregninger. Permeabilitet indeks beregninger for Ang-2 gevinst-av-funksjon (GOF) og vill-type littermates (WT) mus tydelig viser større (ca 2-fold) brain permeabilitet i GOF mus sammenlignet WT mus. Nyre permeabilitet er imidlertid i det samme området mellom 2. Basal nyre permeabilitet er mye større forhold til hjernen som forventet på grunn av fenestrated endotelet i nyre som ikke utgjør en tett barriere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Blod - hjerne barrieren dysfunksjon er forbundet med en rekke nevrologiske lidelser, inkludert primære og sekundære hjernesvulster eller slag. BBB oversikt er ofte forbundet med livstruende CNS ødem. Utviklingen av molekylære mekanismer som utløser åpning eller lukking av BBB er derfor terapeutiske betydning i nevrologiske lidelser og vanligvis undersøkt av forskere. Metoder for å undersøke BBB permeabilitet i vivo rapportert i litteraturen, er imidlertid ofte forbundet med tekniske problemer som kjedelig og subjektive kvantifisering fluorescens bilder17,18 , 19. videre noen av metodene omfatter hele hjernen fluorescens imaging som er fallacious som det flere angir av permeabilitet av overfladiske hjernen fartøyer som ikke utgjør en tett barriere. Selv når kvantifisering er utført basert på objektive hjernen vev absorbansen (f.eks evans blå permeabilitet vurdering) dyrene er ofte ikke parfyme fører til feil tolkning på grunn av betydelig blod brøkdel. Hjernen er en annen variabel som ofte ikke er inkludert i permeabilitet beregninger, men må være ødem skyldes vaskulær permeabilitet kan øke vekten og endre netto permeabilitet. Videre kan sex og dyr til dyr hjernen vekt variasjoner Sky permeabilitet forskjeller. Radioaktivt tracers som 14C sukrose og [3 H] inulin er vellykket brukt hjernen permeabilitet indeksen, men gjør ikke tilbud rekke størrelse og kostnad basert permeabilitet undersøkelsen som med fluorescently merket tracers20.

For ovennevnte grunner innført vi en metode som er enkel, objektiv og kvantitative ved estimering blod - hjerne barrieren permeabilitet i vivo i mus med fluorescently merket tracers. Dextrans er hydrofile polysakkarider preget av deres moderat til høy molekylvekt (3-200 kD) og kan fås som belastet eller uncharged molekyler basert på konjugert fluorophore. Endothelial stramt veikryss dannet av hovedsakelig claudins (1, 3, 5 og 12) og sammen occludin, angi paracellular og lade selektivitet av tillegget pore rester stede på deres første ekstracellulære loop (omtalt i21). Permeabilitet over blod - hjerne barrieren i vivo er også avhengig av glycocalyx og den basale lamina, to strukturer som finnes på hver side av BBB22,23. Luminally finnes glycocalyx er en gel struktur dannet av negativt ladde oligosaccharides (heparin sulfater) som også fungerer som en barriere mot blodbårne macromolecules for eksempel albumin. Endringer i glycocalyx tykkelse eller sammensetning er også forbundet med vaskulær permeabilitet endringer vi observert i angiopoietin-2 gevinst funksjon mus sammenlignet med vill type mus10. Kjelleren membranen er derimot tilstede på abluminal side av endotelceller bestående av både vaskulær kjelleren membranen laget av endotelceller og pericytes mens den parenchymal kjelleren membran eller astrocytic kjelleren membran laget av astrocyttene. Disse kjelleren membraner også negativt ladet og dermed har evne til å tjene som kostnad barrierer. I denne forbindelse tilbyr konjugert dextrans både størrelse og kostnad-baserte permeabilitet. For eksempel TMR-dekstran 3 kD er anionic, mens TXR-dekstran 3 kD er nøytral, kombinerer en av disse tracers med konjugert høy molekylvekt dekstran som FITC dekstran 70 kD i den samme blandingen injisert til mus, man kan vurdere permeabilitet basert på størrelse. Videre tar vi nytte av lysin-fixable natur fluorescerende-merket dextrans å utforske med regionale forskjeller i permeabilitet i standard immunofluorescence flekker. Dextrans viser også generelt lav immunogenisitet og dermed tjene som gode tracers. Lucifer gule, cadaverine, fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTSC), er blant annet tracers i området lav molekylvekt (0,4 0,8 kD) og er fixable.

I vår metode, tracers ble injisert i.p vei etterfulgt av perfusing mus og skaffe fluorescens av hjernen homogenates normalisert våt vekt og serum fluorescens. Dette er en enkel ennå meget kvantitative og objektive metode som det er ingen valg av deler/bilder som kvantifisering av immunofluorecence metoden som brukes klassisk. Vi bruker bare én hemi-hjerne for permeabilitet analysen og utnytte de andre hemibrain for immunofluorescence flekker ved å analysere sagittal deler gir regionale forskjeller i samme dyret. Bruk av hver hemi-hjerne for forskjellige samtidige målinger er en av de viktigste fordelene i vår protokollen. Også tjener permeabilitet av andre organer som nyrer, lever, osv som en god intern kontroll som basale permeabilitet er høy i disse organene. For å sammenligne 2 grupper, en må først trekke humbug dyret (som ikke fikk tracer injeksjon) autofluorescence fra alle dyrene i både grupper og alle vev typer (nyrene, hjernen og serum) for hver tracer og deretter videre til normalisert beregninger sammenligning av 2 gruppene. Permeabilitet indeksen (PI) presenteres som er oppnådd som et forhold mellom vev serum fluorescens normalisert til vev vekt og serum. Våre beregninger gi en absolutt verdi for tracer permeabilitet som kan sammenlignes med mellom eksperimenter og vev typer. Disse verdiene imidlertid kan lett uttrykkes som prosenter eller prosent mellom 2 som sammenlignes som vi har også gjort tidligere12. Dette kan oppnås ved å dele PI av hvert dyr i begge gruppene med mener PI av alle dyr i kontrollgruppen. Denne stasjonen kontrollgruppen PI gjennom 1 likevel holde feilen mellom dyr og forsøksgruppen gi verdier som er i forhold til kontroll gruppe gjennomsnittet av 1.

Injeksjon av tracers av IP er enklere, men mer kostnader intensiv sammenlignet i.v injeksjon, som mengden tracer må økes. Våre data (vises ikke) i denne forbindelse viser at nesten 2-fold høyere beløp i tracer kreves av i.p injeksjon i forhold til i.v å få lignende serum fluorescens verdier. Også er av sirkulasjon høyere i IP rute sammenlignet med i.v på grunn av tiden tracer absorpsjon i blodet. I denne forbindelse, serum fluorescens verdiene på 15 min post i.p injeksjon var sammenlignes med 5 min post i.v injeksjon for tracers i lav og middels molekylvekt området mellom 0,4-4 kD (data ikke vist). Vi foreslår en kort sirkulasjon tid fordi paracellular permeabilitet er lineær og hvis betydelig vev fluorescens oppdaget innlegget perfusjon etter kort sirkulasjon tid (15 min), det allerede indikerer en permeabilitet fenotypen som vi har rapportert i våre tidligere publikasjoner10,12,13,14. Men på samme tid kan man få serum fluorescens for normalisering. Lengre sirkulasjon ganger er vev klarering betydelig, som reduserer serum fluorescens betraktelig, og dermed kan påvirke permeabilitet verdier normalisert for serum. Mens av sirkulasjon i forhold til størrelse/tillegget av tracer må være optimalisert for hvert scenario, foreslår vi en kort sirkulasjon tid som utgangspunkt. Dette gjelder også høyere molekylvekt solutes som plasma IgGs og fibrinogen (150-400 kD) som permeabilitet er i motsetning til inert dekstran tracers sine svært store og bestemt interaksjon med cellular reseptorer som Fc reseptorer som endrer deres half-life24. Dextrans derimot har ikke noen bestemt transportsystemet på endothelial nivå25 og som hjernen endotelceller ikke gjennomgår pinocytosis til betydelig nivå grunn svært lave nivåer av plasmalemma vesicle forbundet protein (PLVAP)26 , den viktigste ruten av transport av dextrans er paracellular. Vi har brukt det over metoden i flere scenarier som permeabilitet i transgene mus sammenlignet med vill-type littermates og også vurdert permeabilitet endringer i vill type mus etter terapeutisk intervensjon10, 12 , 13 , 14. i sammendraget, kombinert med den immunofluorescence flekker, permeabilitet analysen beskrevet her er en enkel og robust metode for å vurdere permeabilitet av mus i vivo som kan også brukes til andre små dyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å erkjenne Sphingonet consortium finansiert av Leduq foundation for å støtte dette arbeidet. Dette arbeidet ble også støttet av Collaborative Research Center "vaskulær differensiering og remodeling" (CRC / Transregio23, prosjektet C1) og 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc programmet gå-i, nei 291776 finansiering. Vi erkjenner Kathleen Sommer for henne teknisk hjelp med mus håndtering og genotyperingteknologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD Thermosfisher D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD Thermosfisher D3306
Ketamine (Ketavet) Zoetis
Xylazine (Rompun) Bayer
0.9% Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS Gibco 10010-015
Tissue-tek O.C.T compound Sakura Finetek 4583
37% Formaldhehyde solution Sigma 252549-1L prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V Roth 8076.3
Triton X-100 Sigma T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 BD Pharmingen 553370
goat anti rat alexa 568 Molecular Probes A-11077
goat anti rat alexa 488 Molecular Probes A-11006
DAPI Molecular Probes D1306
Aqua polymount Polyscience Inc 18606
21-gauge butterfly needle BD 387455
serum collection tube Sarstedt 41.1500.005
2mL eppendorf tubes Sarstedt 72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers Kimberley-Clark Professional 05511
384-well black plate Greiner 781086
slides superfrost plus Thermoscientific J1800AMNZ
PTFE pestle Wheaton 358029
electric overhead stirrer VWR VWR VOS 14
plate reader Tecan Infinite M200
Cryostat Microm GmbH HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System Nikon
peristaltic perfusion system BVK Ismatec
microcentrifuge eppendorf 5415R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  2. Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
  3. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  4. Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
  7. Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
  8. Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
  9. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  10. Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
  11. Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
  12. Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
  13. Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
  14. Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
  16. Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
  17. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  19. Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
  20. Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
  21. Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
  22. Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
  23. Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
  24. Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
  25. Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
  26. Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).

Tags

Nevrovitenskap problemet 132 blod - hjerne barrieren BBB i vivo permeabilitet kvantitativ fluorescerende tracers endotelceller microvessels kapillærene intraperitoneal perfusjon
<em>I Vivo</em> blod - hjerne barrieren permeabilitet analysen mus med Fluorescently merket Tracers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devraj, K., Guérit, S., Macas,… More

Devraj, K., Guérit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. J. Vis. Exp. (132), e57038, doi:10.3791/57038 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter