Summary
血液脳関門の機能障害の動物モデルに適用可能な灌流が続く蛍光トレーサーの腹腔内注入によるマウス脳血管透過性アッセイをご紹介します。1 逸見脳は、透水性の定量的評価と可視化トレーサー/染色の他に使用されます。10 匹のマウスに 5-6 時間を要します。
Abstract
血液脳関門 (BBB) は、毒素や病原体循環から脳微小環境を保護し、脳の恒常性を維持する特殊なバリアです。バリアの主な場所はタイトジャンクショ細胞間と細胞膜に発現排出トランスポーター起因するバリア機能が脳の毛細血管の内皮細胞です。この関数は、ペリサイトおよび単位 (NVU) を形成しているアストロ サイトによって規制されています。脳卒中、アルツハイマー病 (AD) などいくつかの神経疾患脳腫瘍は BBB 機能障害に関連付けられます。BBB 透過性の評価は神経疾患の重症度と治療戦略を採用の成功の評価に重要なため。
いくつかのマウスに正常に適用されている堅牢な透磁率測定モデル遺伝的および実験両方まだここで単純なを提示します。メソッドは、定量性は一般的に適用される顕微鏡によるトレーサー蛍光分析と比較して客観的にです。このメソッドは、マウスはマウスを麻酔続いて水性の不活性蛍光トレーサーのミックスと腹腔内注入されます。動物の心臓の血流は、脳、腎臓や他の臓器を収穫する前に実行されます。臓器の均質化し、遠心上清からの蛍光測定が続きます。直前に灌流心臓穿刺から採血血管コンパートメントに正規化の目的提供しています。組織蛍光が量的に入手するぬれた重量および血清蛍光に正規化されたトレーサー透磁率インデックス。追加の確認のため蛍光可視化用トレーサー対側の半脳免疫組織化学のために保存を利用できます。
Introduction
血液脳関門 (BBB) は、基底膜の鞘は、密接に関連するペリサイト (Pc)、および自分の終わり足の1 で基底膜を包むアストロ サイト (ACs) でサポートされている微小血管内皮細胞 (Ec) で構成されています ,2。ECs は、いくつかの細胞の種類をサポートし、主に ACs と Pc、バリア機能を調節すると対話も神経細胞とミクログリア、すべての一緒にユニットを形成、神経血管 (NVU)。NVU は、血液媒介性毒素や脳を入力してから病原体の輸送を制限する BBB の機能にとって重要です。この関数は、ECs ともトランスポーター p 糖タンパク質 (P ・ gp) その流出内皮を入力分子に戻すなどの操作のために存在するクローディン 5, オクルーディン, 精巣毛細血管-1, などタイト結合分子の結果1,ルーメン32,船。ただし、BBB は EC 膜1,2,3で表現される特定のトランスポーターで栄養 (ブドウ糖、鉄、アミノ酸) など重要な分子の輸送のためできます。EC 層は内腔 (血側) と特定とベクトル輸送機能報4,5 ように abluminal (脳向け膜) の間様々 なトランスポーターの分布に関して高偏極します。.BBB は中枢神経系の環境をしっかりと規制に関して保護、機能 BBB とパーキンソン病などの疾患に CNS ドラッグデリバリーのための大きな課題です。BBB 機能障害神経疾患でもバリア機能障害はアルツハイマー病 (AD) のように、例えば特定のトランスポーター ターゲットへの損傷を含めることができます、特に脳薬物送達が増加することを想定できません。広告で LRP1、怒り、P gp などいくつかのアミロイド β のトランスポーターが調節不全として知られている、無駄な6,7、8をかもしれないそれ故にこれらの運送者を対象とします。BBB は、ストローク、広告、髄膜炎、多発性硬化症と脳腫瘍9,10,11などのいくつかの神経疾患の障害です。治療戦略の重要な部分は、バリア機能を回復させる、従ってその評価は重要です。
この仕事については客観的かつ我々 正しく適用されているマウスのいくつかの行に両方実験的な遺伝子疾患モデル10,12,13 齧歯動物で透水性の試金のための量的なプロトコル ,14。メソッドは、血管コンパートメントからトレーサーを削除するマウスの灌流が続く蛍光トレーサーの単純な腹腔内注射に基づいています。脳や他の臓器が収集した記事の灌流および透水性の客観的評価と蛍光プレート リーダーで組織ホモジネートの測定に基づく絶対透磁率インデックス。組織ホモジネートまたは任意のトレースを受け取りません偽動物からの血清を使用して背景のすべての未加工の蛍光値が修正されます。十分な正規化は、血清量、血清蛍光組織、従って絶対と同等の実験と組織型との間にある透過性インデックスを降伏の重量に含まれます。グループ間の比較を容易にするため絶対浸透率のインデックス値容易に変換できる比率と我々 は以前に12を実行していた。同時に、ストアド ヘミ脳や腎臓に利用できる可視化トレーサー蛍光顕微鏡10。古典的な蛍光顕微鏡とはいえ面倒な切片と半定量分析のためのイメージの主観的な選択のために透磁率の地域差を取得する価値があります。プロトコルの詳細な手順が表示されます、適切な場所にノートが追加されます。これは、他の小動物にスケーリングすることができますマウスの体内透過性アッセイを正常に実行するために必要な情報を提供します。アッセイは、トレーサーの多くの種類に適用できる特異的な蛍光スペクトルとトレーサーの組み合わせによって透過性評価に基づいた料金とサイズを可能にします。
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Protocol
すべての動物は、処理中に痛みや不快感を最小限に抑え最大限大切に取り扱われました。この手順では、当院の動物医療のガイドラインに従って、(承認番号 FK/1044 Regierungspraesidium ダルムシュタット) のローカル委員会によって承認されています。
マウスにおける透過試金の生体内でのための作業手順の概略を図 1に示します。各手順の詳細は次のとおりです。
1. 動物取扱
-
準備およびトレーサーと麻酔薬の投与
- 透磁率測定前日の埋め込み、少なくとも組織のラベルの付いたチューブと金型を準備します。きれいな発煙のフードの下で働いて、80% エタノールで洗浄ツールを使用して、プロトコルの中で無菌状態を維持します。現在のプロトコルのための 3-6 ヶ月の成熟した大人の年齢層の男性または女性の野生型 (WT) またはアンジオポエチン 2 (Ang-2) 関数の利得 (GOF) の CD1 マウスを使用します。10を前述のようにマウスのジェノタイピングを実行します。
注: 80% アルコール滅菌器具にはなりませんが、試料の汚染を最小限に抑えられます。 - 2 mM 株に滅菌 PBS ですべてのトレーサーを希釈し、-20 ° C で光から保護因数を格納
- (テトラメチル ローダミン) TMR などのトレーサーを選択し、(かに) 個別励起/蛍光スペクトルとの FITC は、蛍光顕微鏡による色素間の干渉を最小限に修正可能なリジン (TMR を使用してまたはFITC フィルターそれぞれ)、蛍光測定透水性測定用のプレート リーダー。
注: TMR デキストラン 3 kD FITC デキストラン 3 kD 研究に使用修正可能な両方のリジンおよびそれ故にされる可能性がありますもとアルデヒドの免疫組織化学的解析ポスト固定の地域差を調査するために。 - すべての動物を介護施設ガイドラインに従い細心の注意をもって処理します。1:1 の混合10,13各トレーサーの 100 μ L を使用して追加のトレーサーを組み合わせた場合、200 μ L まで増やすことができます 100 μ L トレーサー ソリューションで各マウス腹腔内を挿入します。トレーサー蛍光バック グラウンド減算の偽コントロールとしてではなく単独で PBS で少なくとも 1 匹の動物を注入します。
- トレーサー注入後 5 分麻酔のケタミン ・ キシラジン i.p 注入と動物 (100 mg と 5-10 mg 0.9% で本体重量 kg あたり生理食塩水重量、それぞれ 25 g マウスあたりカクテル 150 μ L)。
注: 獣医軟膏適用されませんでした目のプロシージャの間に動物の麻酔と灌流/犠牲間の期間は短かったと (10 分) が観察場所目の任意の乾燥はなかった。
- 透磁率測定前日の埋め込み、少なくとも組織のラベルの付いたチューブと金型を準備します。きれいな発煙のフードの下で働いて、80% エタノールで洗浄ツールを使用して、プロトコルの中で無菌状態を維持します。現在のプロトコルのための 3-6 ヶ月の成熟した大人の年齢層の男性または女性の野生型 (WT) またはアンジオポエチン 2 (Ang-2) 関数の利得 (GOF) の CD1 マウスを使用します。10を前述のようにマウスのジェノタイピングを実行します。
-
血のコレクションおよび心臓の血流
- 心筋灌流 10 分局所麻酔薬投与後の動物を準備します。動物の麻酔外科平面に達したことを確認するために足けいれん反応がないことを確認してください。
- 自分の背中に動物を置き、80% エタノールを腹部の皮膚に適用されます。小さなハサミを使用して、胸郭のすぐ下に小さな切開 (2 cm) で腹壁を開きます。横隔膜から肝臓を分離し、ゆっくりと横隔膜の胸腔内15の公開を切り取ります。
- 両側に胸郭をカットし、左心室を公開するためにカットの胸骨を修正します。左心室の後部の蠕動灌流システムに接続されている 21 ゲージ蝶針を挿入します。
- 右心房を穴をあけるとすぐに (10 s) 血清採血管に血液 (と最後カットオフ) 1 mL ピペット チップを使用して胸腔内に放出の 200-300 μ L を収集して氷の上保存します。
注: この灌流プロシージャは非生存です。 - 血液を収集すると、すぐに灌流システム (10-12 rpm, 5 mL/分) に切り替えるし、暖かい (RT) 1x PBS で 3 分のための動物を灌流 (Ca の無料2 +/Mg2 +イオン)。
注: PBS 含んでいる Ca2 +/Mg2 +イオンはより良い心臓の活動の灌流中に利用できます。灌流に使用される PBS の合計量は 15 〜 20 mL の範囲内です。 - 肝臓の色に注意して灌流品質を評価する腎臓灌流後ホワイト/ペールに表示されます。
注: 腎臓や肝灌流必ずしも大動脈から脳が特に心房穿刺中に手順 3 で準備中に破裂を得る動脈 (頸動脈・椎骨) 到達として脳血流。
2. ティッシュの処理
- オルガン コレクションとストレージ
- 灌流末、頚部転位と収穫脳と腎臓によって動物の死を確認します。脳血流を脳 (髄膜の血管で目に見える血) の色によって灌流の品質が良い場合、透磁率の解析から動物を除外するを確認します。メス (図 1) を使用して 2 hemibrains に脳を分けます。
- メスの 1 つ hemibrain の嗅葉と小脳の無料で解剖し、大脳半球を 2 mL チューブに転送します。小脳の透水性評価に必要な場合、その他のチューブでヘミ小脳を格納します。
- 1 つの腎臓を別の 2 mL チューブに転送します。ドライアイスにサンプルをすぐに保存します。
- 組織-tek 社最適切削温度 (O.C.T) ドライアイスの化合物で残りの腎臓とヘミ脳 (小脳と嗅葉から成る) をネイティブで埋め込みます。
- 最終的には、遠心分離機の 10、000 g、4 ° C で 10 分間で血清採血管で氷の上保存血液サンプル血清培養上清を 1.5 mL チューブに転送し、ドライアイス コンテナーに配置します。
- さらに処理まで-80 ° C の冷凍庫にドライアイスで収集されたすべてのサンプルを転送します。
注:、凍結融解後の均質化効率の増加として均質化の手順に進む前にサンプルを凍結することが重要です。
- 均質化および遠心分離
- 氷-80 ° C でダウン凍結ヘミ大脳と腎臓のサンプルを解凍し、臓器を含むチューブの重量を量る。これらの重みから組織重量を得るためのいくつかの空管 (約 20) の平均値を減算します。追加 300 μ L、200 μ L 冷 1 の腎臓とヘミ-大脳をそれぞれ含むチューブ X PBS。
注: (ヘミ小脳、100 mg 以下) のような組織の量を減らすため個々 のチューブを計量することをお勧めします。 - 約 15 ストロークを実行することによって電気のオーバーヘッド攪拌 (1, 000 rpm) に接続されているポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) 杵と元エッペン チューブ内の各サンプルを均質化 (1 ストロークを 1 と 1 を =)。サンプルの間に PBS で杵を洗い、次のサンプルに進む前に乾燥拭いてください。
注: 螢光を潜在的な干渉により均質化時に洗剤の使用を避けた。ただし、組織を徹底的に均質化、1 つのラウンドの凍結融解後、どちらがより効率的に細胞内のトレーサーがこのプロトコルで検出されたも。 - 光と卓上遠心分離機で 4 ° C、20 分 15,000 g で最後にすべて一緒に遠心から保護されている氷の上の均質化のサンプルを格納します。即時蛍光または後で解析する-80 ° C で氷の上清を新しい 1.5 mL チューブに転送します。
- 氷-80 ° C でダウン凍結ヘミ大脳と腎臓のサンプルを解凍し、臓器を含むチューブの重量を量る。これらの重みから組織重量を得るためのいくつかの空管 (約 20) の平均値を減算します。追加 300 μ L、200 μ L 冷 1 の腎臓とヘミ-大脳をそれぞれ含むチューブ X PBS。
- 蛍光測定と定量化
- 前の手順の最後に固定されている場合は、氷の上箔と光から守り-80 ° C で保存組織培養上清、血清サンプルを解凍します。
- 黒 384 ウェル プレートに希釈血清 (30 μ L 1 × PBS + 20 μ L の血清) または組織培養上清 (として) の 50 μ L をピペットします。適切な背景差分を確保するため血清および組織培養上清の偽動物から少なくとも 1 つのサンプルは、この組織ホモジネートの背景は通常希釈剤として使用される PBS のそれより高い。
メモ: 3 偽動物の平均は偽蛍光値 (データは示されていない) に非常に小さな変動が観察されたが、自発に使用できます。また脳サンプルなど低蛍光サンプルの信号対雑音比を高めることができる PBS で希釈して使用される血清の量を減らせます。40 μ L の PBS で希釈し最大 10 μ L の血清を調べた。泡が井戸に存在しないことを確認します。 - 384 ウェル ブラック プレートをプレート リーダーに挿入し、蛍光測定を選択する新しいスクリプトを開きます。
- ゲインを最適に設定し、それぞれ TMR や FITC dyee の 550/580 または 490/520 の励起/蛍光 (nm) の値に使用生蛍光ユニット (RFUs) を取得する測定を開始します。
- プレート リーダーから未加工の蛍光ユニット (RFUs) を使用して、対応する偽値を差し引いた透磁率指数 (PI) を計算します。
- * 透水性インデックス(mL/g)= (組織 RFUs/g 組織重量)/(血清血清 RFUs/mL)
- 例の計算脳透磁率指数 (PI) 動物 GOF1 (表 1):
- GOF1 脳 RFUs - 偽脳 RFUs 154 22.5 を = = 131.5
- GOF1 血清 RFUs - 偽血清 RFUs 38305 27 を = = 38278
- 脳の重量 (g) = 0.195
- 血清量 (ml) = 0.02
- 脳の透過性インデックス (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
注: 透磁率指数の計算は、絶対と同等の実験と組織型との間にある値を得られます。これらはしかし 2 グループ12間の比較の容易さのための比率として表示できます。1 まだ維持間の動物変化対照群をコントロール グループ平均を運転、制御グループの平均 PI と両方のグループで各動物の PI を割ることによってこれを実現できます。この変換は、1 に設定されて、コントロール グループを基準にして実験的グループ (またはグループ) の値を提供します。
- トレーサーの蛍光可視化
- クライオスタットのセクションは-20 ° C に設定し、室温で置かれたスライドをセクションを転送 10 μ m に組織-tek 社化合物 (O.C.T) (ステップ 2.1) でネイティブに埋め込まれた腎臓/ヘミ-脳ブロックをカットします。セクション乾燥 (約 30 分)、一度転送は使用するまで-80 ° C のフリーザーにスライドします。
- 染色の日に 10 分、37 ° C でスライドを解凍し、PBS でクイック洗濯後室温で 10 分間 4 %paraformaladehyde (PFA) のセクションを修正します。
- 室温で 1 時間 0.5% トリトン X-100 pH 7.5 1 %bsa を含む滅菌 PBS の透過/ブロック バッファーのセクションを孵化させなさい。
- CD31 一次抗体と室温で 1.5 h のスライドを孵化させなさい (0.5 mg/ml、クローン メック 13.3)、トリトン X-100 (pH 7.2) PBS の 3 つの 5 分洗浄後滅菌 PBS、0.5% BSA 0.25% を含むバッファーの 1: 100 で希釈しました。
- 蛍光標識抗体希釈 1: 500 (2 mg/mL) の種特異的に室温で 1 時間上のバッファーの二次抗体の孵化を実行します。CD31、1: 500 の希釈でヤギ抗ラット 568 アレクサやアレクサ 488 を使用できます。DAPI を含める (300 μ M) 二次抗体で、核を染色する (1:1、ストックから 000 希釈) をミックスします。
- アクア polymount とステンド グラスのセクションをマウントし、暗闇の中で常温で重合のために一晩置いておきます。
- スペクトル イメージング共焦点レーザー スキャン顕微鏡システムを使用して画像を取得します。NIS 要素ソフトウェア (バージョン 4.3) によってイメージを分析します。モンタージュの数字の生成のため、Photoshop などのソフトウェアを使用できます。
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Representative Results
我々 は最近、アンジオポエチン 2 (Ang-2) 関数の利得 (GOF) マウスではある健康の条件10の高いコントロール マウスより脳血管透過性を示しています。脳卒中誘発マウス、GOF マウスが大きな梗塞サイズは、コントロールの同腹子より大きな透磁率を持っていたことを示していますがだった。これらの結果は、BBB で透磁率にアン 2 の重要な役割を表示します。プロトコルは、GOF マウスを利用したがって、体内透過試金を記述する同腹子を制御するそれらを比較します。ただし、このメソッドは、疾患モデル、遺伝子組換えマウスの任意のモデルに適用することができます。 または BBB 透過性を変更我々 は、 10、11,12,13では以前と同じ治療薬。
循環時間が長く、以前の研究16でも観察されている血管のコンパートメントからより多くのクリアランスにつながるよう、透磁率の分析のための短い循環時間 (15 分) が示唆されました。3 のクリアランス kD 2 h (図 2で FITC デキストランC, D) 15 分(図 2よりはるかA、B)脳組織のように同様に腎臓で。脳でそのまま血液脳関門これら大人の WT マウス (図 B D) のための非常に小さな管外トレーサーがあります。このメソッドを適用すると、WT 同腹子とアン 2 GOF のトレーサー透磁率を比較しました。表形式 (表 1) で示された結果は、WT マウスと比較された GOF マウスの脳ではトレーサー蓄積を示します。ただし、腎臓の蛍光は、これらのグループの間は変更されません。蛍光画像確認 GOF マウス(図 3における管外トレーサーの増加B, D) WT マウス(図 3と比較されたとき、C)トレーサーが血管コンパートメントに限られています。
図 1.蛍光トレーサーを使用して体内の透磁率の分析のワークフローの模式図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。短くて長い循環時間でトレーサー クリアランス。透磁率測定、15 分の短い循環時間のトレーサー循環時間を確立するために(A, B) 2 h (C, D)ポスト トレーサー注入法の長い循環時間に比べていた。2 h の長い循環時間は、FITC デキストラン 3 kD (緑の非常に高いクリアランスのために潜在的の短い 15 分の循環時間(A)と比較して(C)基底の透磁率が高く、腎臓に蓄積するトレーサーの非常に低い量につながった血管コンパートメントからのチャネル)。この効果は、タイトな血液脳関門(B, D)によって特徴付けられる脳さらに劇的です。CD31 染色 (赤いチャネル) 関心領域の血管の存在を確認しました。各時点と動物のトレーサー投与 2 野生型アダルト CD1 マウスから 1 つの動物から代表的なイメージを見ぬけぬまま灌血管内のトレーサーを視覚化します。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。GOF マウス脳透磁率の変化を評価するためにトレーサーの染色蛍光します。3 の透過性を増加した kD (赤) で TMR デキストラン トレーサーはアン 2 GOF マウス(B、D)に比べて WT 同腹子(A, C)皮質領域で視覚化すること。WT 動物のトレーサーは、管外のトレーサーは GOF マウス ( B、Dの白い矢印) で観測できるに対し血管 (, C) に制限されます。結合画像 (青) の CD31 の染色(A ~ D)は船の存在を確認します。図は、WT と 2 GOF マウス i.p トレーサーを注入し、血流を注射後 15 分を犠牲に、2 から代表的なイメージを示しています。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 動物 ID | 脳重量 (g) | 腎重量 (g) | 血清量 (mL) | 血清 RFU | 腎臓 RFU | 脳 RFU | ペルミインデックス (10 ^-3 ml/g) | |
| 腎臓 | 脳 | |||||||
| GOF 1 | 0.195 | 0.252 | 0.02 | 38305 | 31051 | 154 | 64.4 | 0.352 |
| GOF 2 | 0.177 | 0.249 | 0.02 | 42001 | 31411 | 126 | 60 | 0.278 |
| WT 1 | 0.167 | 0.301 | 0.02 | 40904 | 31591 | 64 | 51.2 | 0.122 |
| WT 2 | 0.146 | 0.294 | 0.02 | 39502 | 31768 | 70 | 54.8 | 0.164 |
| シャム | 0.155 | 0.27 | 0.02 | 27 | 36 | 22.5 | NA | NA |
テーブル 1。組織透過性計算します。アン 2 機能獲得 (GOF) と野生型同腹子 (WT) マウスの計算が明らかに大きい (約倍) 透水性インデックスの脳 WT マウスと比較された GOF マウスの透磁率。腎臓の浸透率はしかし 2 つのグループ間の同じ範囲で。基底腎臓透過性がはるかに大きい脳に比べて堅い障壁を形作らない腎臓の穴あきの内皮細胞が原因。
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Discussion
血液脳関門の機能障害は、プライマリとセカンダリの脳腫瘍や脳卒中を含む神経疾患の数に関連付けられます。BBB 破壊はしばしば命にかかわる中枢神経浮腫を関連付けです。開始の分子機構の解明や BBB の閉鎖したがって神経疾患一般の治療的意義の調査の研究者。ただし、調査方法は蛍光画像17,18の面倒で主観的な定量化に依存する技術的な問題に関連付けられている、BBB 透過性体内の報告は本邦では、します。,19します。 さらに、メソッドのいくつかは、それはより堅い障壁を形成しない表面的な脳血管の透過性を示すものとして虚偽は全脳蛍光イメージング。動物は多くの場合重要な血液分画による誤った解釈につながる灌流客観的脳組織吸光度 (例えばエバンス ブルー透過性評価) に基づく定量化が実行されているときでも。脳の重量は、透磁率の計算に含まれていない多くの場合、血管透過性に起因する浮腫、重量が増加し、純の透過性を変更する必要があります別の変数です。さらに、セックスと動物-動物脳重量のバリエーションは、透磁率の違いを雲ができます。14C スクロースなど [3 H] イヌリン放射性トレーサー脳透磁率インデックス正常に適用されているでは幅広いサイズと料金に基づく蛍光トレーサー20として透水性調査を提供していません。
上記の理由では、単純な客観的・血液脳関門透過性推定体内蛍光トレーサーを用いたマウスで定量的な方法を採用しました。Dextrans は、中程度の高分子量 (3 200 kD) によって特徴付けられる親水性の多糖類であり、共役 fluorophore に基づいて充電未充電の分子として得ることができます。内皮タイトジャンクショ主にクローディン (1、3、5、12) によって形成された、オクルディン、一緒に傍細胞サイズを決定し、細孔残基 (文献21) の最初の細胞外ループに存在電荷により選択性を充電します。体内の血液脳関門の透過性は、糖衣と基底膜 BBB22,23のいずれかの側にある 2 つの構造体に依存しています。Luminally 現在糖衣はアルブミンなど血液媒介性高分子にバリアとしても機能する負荷電オリゴ糖 (ヘパリン硫酸塩) が形成する構造のようなゲルです。糖衣厚や組成の変化は、野生型マウス10に比べて機能マウスのアンジオポエチン 2 の利得で見てきたようにも血管透過性変化に関連付けられます。基底膜はその一方で両方血管基底膜実質基底膜やアストロ サイトの基底膜が作られたに対し、血管内皮細胞と血管製を構成する内皮細胞の abluminal 側の存在です。によるアストロ サイト。これらの基底膜はまた負荷電およびこうしてまた電荷の障壁として機能する能力を持っています。この点では、共役 dextrans は、サイズと充電ベースの透磁率の両方の調査を提供しています。たとえば、TMR デキストラン 3 kD はアニオン TXR デキストラン 3 kD は中立的なこれらのトレーサーのいずれかを組み合わせて共役高分子量デキストラン FITC デキストラン 70 など同じミックスで kD マウスに注入、1 つはサイズに基づく透水性を評価できます。我々 はさらに標準蛍光染色の透磁率の地域差を探索する蛍光標識 dextrans のリジン修正可能な自然の利用します。Dextrans はまた、一般的に低免疫原性を示すなり良いトレーサーとして。ルシファーは黄色、カダベリン、フルオレセイン-5-thiosemicarbazide (FTSC) は、低分子量の範囲内にある他のトレーサー (0.4 から 0.8 kD)、修正可能。
私たちのメソッドでトレーサーを注入したマウスを灌続いて i.p ルートで、湿重量と血清蛍光に正規化脳ホモジネートの蛍光を得ること。古典的に使用される immunofluorecence メソッドによる定量化と同様にセクション/画像の選択がないので単純なまだ高い量的・客観的方法です。透過性の試金のための 1 つだけヘミ脳を活用し、同じ動物の地域差を提供する矢状のセクションを分析することによって染色蛍光抗体法の他の hemibrain を利用します。個別の同時測定のためそれぞれのヘミ脳の使用は、我々 のプロトコルの主な利点の 1 つです。また、腎臓や肝臓など他の臓器の透磁率は、基底の透磁率が高いこれらの器官の良い内部統制として機能します。2 つのグループを比較するために、1 つは最初偽動物 (つまりトレーサー注入を受信しませんでした) を減算するだろう両方のグループのすべての動物とすべての組織から蛍光各トレーサー (腎、脳と血清) の種類し、正規化に進みます2 つのグループを比較する計算。血清蛍光組織重量、血清中のボリュームを正規化するために組織の比として得られる透過性指数 (PI) が表示されます。私たちの計算は、実験や組織の種類間で比較することができるトレーサーの透磁率の絶対値をもたらします。これらの値ただし、簡単に表現できます比またはパーセント我々 も以前12に行っているように比較される 2 群間として。これは、すべての動物群の平均 PI と両群れともそれぞれの動物の PI を割ることによって実現できます。これはまだ 1 のコントロール グループの平均からの相対値を与える、実験群の動物間のエラーを維持 1 を介して制御グループ PI を駆動します。
I.p でトレーサーの注入は簡単ですよりコストのかかるに比べてふるさと注入トレーサーの量を増加する必要があります。この点で我々 のデータ (表示されていません) トレーサーの額はほぼ 2 倍大きい値を示しますふるさとに比べて i.p 注入による同様の血清に蛍光値を取得するために必要な。また、循環の時に比べて血流トレーサー吸収にかかる時間のためふるさと i.p ルートの上位です。この点で、i.p 注射後 15 分で血清蛍光値 0.4 4 低・中分子量の範囲でトレーサーの注射 5 分後ふるさとに匹敵した kD (データは示されていない)。傍細胞の透磁率は線形でありかなり組織蛍光が短い循環時間 (15 分) 後検出されたポストの灌流、それ既に場合透水性表現型に報告したので、私達は短い循環時間を提案する私たち以前の出版物10,12,13,14。同時にまだ 1 つは正規化の血清蛍光を得る。長い循環時組織クリアランスはかなり、血清蛍光を大幅に削減し、従って血清に正規化された透磁率の値に影響を与えるかもしれない。トレーサーのサイズ/充満に関連して循環の時に各シナリオ用に最適化するのには、私達は出発点として短い循環時間を提案します。これは、プラズマなどの高分子量溶質にも適用されます Igg、フィブリノーゲン (150-400 kD) 透磁率特性を持つ、非常に大きなサイズと Fc など細胞の受容体と特異的相互作用のため不活性デキストラン トレーサーとは異なり受容体であり、その半減期24を変更します。Dextrans 一方で持っていない任意の特定のトランスポート システム内皮レベル25とタンパク質 (PLVAP)26 が原形質膜小胞の低レベルに関連付けられている脳血管内皮細胞が非常に重要なレベルに pinocytosis に受けないと、dextrans の輸送の主要なルートは傍細胞。トランスジェニック マウスにおける透磁率同腹子野生型と比較しても治療的介入10、後野生型マウスにおける透水性を評価、いくつかのシナリオで正常に上記の方法を用いています。12,13,14。 要するに、免疫組織染色法を組み合わせると、ここで説明した透過性アッセイは単純な、マウス生体内の他の小動物にも適用できるの透水性を評価する手法。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
著者は、この作業を支援する Leduq 財団によって資金を供給 Sphingonet コンソーシアムを認めたいと思います。この作品も「血管分化と改造」共同研究センターによって支えられた (CRC/Transregio23、プロジェクト C1) と 7。FP、COFUND、ゲーテ国際ポスドク プログラム移動で、291776 号の資金。我々 はさらに処理および遺伝子型解析マウスと彼女のテクニカル サポートのキャサリン ・ ソマーを認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamine (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer | ||
| 0.9% Saline | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde solution | Sigma | 252549-1L | prepare a 4% solution |
| Bovine Serum Albumin, fraction V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| goat anti rat alexa 568 | Molecular Probes | A-11077 | |
| goat anti rat alexa 488 | Molecular Probes | A-11006 | |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | |
| Aqua polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-gauge butterfly needle | BD | 387455 | |
| serum collection tube | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL eppendorf tubes | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech precision wipes tissue wipers | Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-well black plate | Greiner | 781086 | |
| slides superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE pestle | Wheaton | 358029 | |
| electric overhead stirrer | VWR | VWR VOS 14 | |
| plate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System | Nikon | ||
| peristaltic perfusion system | BVK Ismatec | ||
| microcentrifuge | eppendorf | 5415R |
References
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