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Neuroscience

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/57038
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Institute of Neurology (Edinger Institute), Goethe University Hospital, 2Pharmazentrum Frankfurt, Institute for General Pharmacology and Toxicology, Goethe University Hospital

Summary

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Abstract

Barreira hemato - encefálica (BBB) é uma barreira especializada que protege o microambiente do cérebro de toxinas e patógenos na circulação e mantém a homeostase do cérebro. Os principais locais da barreira são células endoteliais dos capilares cerebrais cuja função de barreira resulta de junções intercelulares apertadas e transportadores de efluxo expressados na membrana plasmática. Esta função é regulada por pericitos e astrócitos que juntos formam a unidade neurovascular (NVU). Várias doenças neurológicas, como acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer (AD), tumores cerebrais estão associados uma função prejudicada do BBB. Avaliação da permeabilidade do BBB é, portanto, crucial na avaliação da gravidade da doença neurológica e o sucesso das estratégias de tratamento empregado.

Apresentamos aqui um simples ainda ensaio de permeabilidade robusto que foram aplicadas com êxito ao rato vários modelos ambos, genética e experimental. O método é altamente quantitativa e objectiva em comparação com a análise de fluorescência de traçador por microscopia que é comumente aplicada. Neste método, os ratos são injectados intraperitonealmente com uma mistura de aquosas inertes marcadores fluorescentes, seguido por anestesiar os ratos. Perfusão cardíaca dos animais é executada antes da colheita, cérebro, rins ou outros órgãos. Órgãos são homogeneizados e centrifugados seguido por medição de fluorescência de sobrenadante. Sangue da punção cardíaca antes de perfusão tem finalidade de normalização para o compartimento vascular. A fluorescência de tecido é normalizada para a molhado fluorescência peso e soro para obter um quantitativo índice de permeabilidade do traçador. Para confirmação adicional, o contralateral hemi-cérebro preservado para imuno-histoquímica pode ser utilizado para fins de visualização do traçador fluorescência.

Introduction

A barreira hemato - encefálica (BBB) consiste nas células endoteliais microvasculares (ECs), apoiadas por pericitos intimamente associados (PCs), que são ensheathed na lâmina basal, e astrócitos (ACs) que envolvem a membrana basal com os pés-final1 ,2. ECs interagirem com vários tipos de células que suportam e regulam a função de barreira, principalmente ACs e PCs, e também os neurônios e microglia, que juntos formam a unidade neurovascular (NVU). O NVU é crítico para a função do BBB, que limita o transporte de sangue toxinas e patógenos de entrar no cérebro. Esta função é um resultado da junção apertada-moléculas como claudin-5, occludin, zonula occludens-1, que estão presentes entre o ECs e também devido à ação de transportadores como p-glicoproteína (P-gp) o efluxo moléculas que entram o endotélio de volta para o navio lúmen1,2,3. O BBB entretanto permite o transporte de moléculas essenciais como nutrientes (glicose, ferro, aminoácidos) por transportadores específicos expressados no CE membranas de plasma1,2,3. A camada de CE é altamente polarizada em relação a distribuição de vários transportadores entre o luminal (sangue-face) e abluminal (membranas voltados para o cérebro) para permitir o transporte específico e vectorial função4,5 . Enquanto o BBB é protetor com relação a regulação firmemente no meio do CNS, é um grande desafio para a entrega de drogas CNS em doenças como a doença de Parkinson com um BBB funcional. Mesmo em doenças neurológicas com disfunção do BBB, ele não pode ser considerado que a entrega de drogas do cérebro é maior, particularmente como a disfunção da barreira poderia incluir danos para as metas de transporte específico por exemplo, como a doença de Alzheimer (AD). No anúncio, vários transportadores de amiloide beta, como o LRP1, raiva, P-gp são conhecidos por ser prejudicado e direcionamento, portanto, estes transportadores pode ser fútil6,7,8. O BBB é prejudicado em várias doenças neurológicas como meningite de acidente vascular cerebral, AD, esclerose múltipla e tumores de cérebro9,10,11. Restaurar a função de barreira é uma parte crucial da estratégia terapêutica e, portanto, sua avaliação é fundamental.

Neste trabalho, descrevemos um objectivo e quantitativo protocolo para ensaio de permeabilidade em roedores que nós aplicada com êxito a várias linhas de rato ambos doença transgénicos e experimental modelos10,12,13 ,14. O método é baseado em uma simples injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes seguido de perfusão dos ratos para remover os marcadores do compartimento vascular. Cérebro e outros órgãos são coletados post perfusão e avaliados por um objectivo de permeabilidade e índice de permeabilidade absoluta com base nas medidas de fluorescência do tecido homogenates em um leitor de placa. Todos os valores de fluorescência crus são corrigidos para o plano de fundo usando o soro de animais de Souza que não recebem qualquer marcador ou tecido homogenates. Amplas normalizações são incluídas para o volume de soro, fluorescência de soro e o peso dos tecidos, produzindo assim o índice de permeabilidade absoluta e comparáveis entre as experiências e os tipos de tecido. Para facilitar a comparação entre os grupos, os valores de índice de permeabilidade absoluta podem ser prontamente transformados rácios como tinha anteriormente foram realizadas12. Simultaneamente, armazenado hemi-cérebro e rim poderiam ser utilizados para visualização de traçador por microscopia de fluorescência10. A microscopia de fluorescência clássico pode ser valiosa na obtenção diferença regional na permeabilidade, embora complicado devido à seleção subjetiva de imagens para uma análise semi-quantitativa e seções do tecido. As etapas detalhadas são apresentadas no protocolo e notas são adicionadas quando necessário. Isto fornece as informações necessárias para executar com êxito o ensaio de permeabilidade em vivo nos ratos que podem ser escalados para outros pequenos animais. O ensaio pode ser aplicado a vários tipos de marcadores permitindo a carga e o tamanho com base em avaliação de permeabilidade por uma combinação de marcadores com espectros de fluorescência distintas.

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Protocol

Todos os animais foram tratados com o máximo cuidado, minimizando a dor ou desconforto durante o procedimento. Este procedimento segue as orientações de cuidados com animais de nossa instituição e foi aprovado pelo comitê local (Regierungspraesidium Darmstadt, número de aprovação FK/1044).

Um esquema das etapas de trabalho na vivo o ensaio de permeabilidade em camundongos é mostrado na Figura 1. Os detalhes de cada etapa são descritos abaixo.

1. animal manipulação

  1. Preparação e administração de traçadores e anestésicos
    1. Prepare tubos etiquetados e moldes para tecido incorporação, pelo menos, um dia antes do ensaio de permeabilidade. Manter condições estéreis em todo o protocolo, trabalhando sob a coifa limpa e usando ferramentas limpadas com 80% de etanol. Use o macho ou fêmea selvagem-tipo (WT) ou os ratos (GOF) CD1 de ganho-de-função angiopoietina-2 (Ang-2) na faixa etária adulta madura de 3-6 meses para o protocolo atual. Realize a genotipagem dos ratos conforme descrito anteriormente, 10.
      Nota: 80% de álcool não resultará em instrumentos estéreis, mas vai minimizar a contaminação das amostras preparadas.
    2. Diluir todos os marcadores em PBS estéril em ações de 2mm e armazenar as alíquotas protegidas da luz, a-20 ° C.
    3. Escolha dos marcadores tais como (tetrametil rodamina) TMR e (isotiocianato de fluoresceína) FITC com espectros de excitação/emissão distintos e que são lisina fixável resultando em interferência mínima entre as tinturas por microscopia de fluorescência (usando o TMR ou FITC filtrar respectivamente) e pelo fluorometry em um leitor de placa para o ensaio de permeabilidade.
      Nota: Dextran TMR 3 kD e dextrano FITC 3 kD utilizados no estudo são ambos lisina fixável e, portanto, pode também ser usado para fixação de pós análise imuno-histoquímica com aldeídos a fim de investigar as diferenças regionais.
    4. Lidar com todos os animais com maior cuidado, seguindo as orientações de cuidados institucionais. Injete intraperitonealmente cada rato com solução de rastreamento de 100 µ l que pode ser aumentada até 200 µ l quando um marcador adicional é combinada usando 100 µ l de cada marcador em uma mistura 1:110,13. Injete pelo menos um animal com PBS sozinho em vez dos marcadores para servir como controle de Souza para subtração de fundo de autofluorescência.
    5. 5 min após a injeção do traçador, anestesiar o animal com uma injeção de IP de ketamina e xilazina (100 mg e 5-10 mg em 0,9% soro fisiológico por corpo kg peso respectivamente, 150 µ l do coquetel por rato 25 g).
      Nota: Pomada Vet não foi aplicada sobre os olhos durante o procedimento como o período entre animal anestesia e perfusão/sacrifício foi breve (10 minutos) onde qualquer secagem dos olhos não foi observada.
  2. Perfusão sanguínea de coleção e cardíaca
    1. Prepare os animais para perfusão cardíaca 10 min após a administração anestésica. Verificar a ausência de resposta de contração de pata para garantir que o animal chegou a um plano cirúrgico da anestesia.
    2. Colocar os animais nas suas costas e aplicar 80% de etanol na pele da área abdominal. Usando tesouras pequenas, abra a parede abdominal com uma pequena incisão (2 cm), logo abaixo da caixa torácica. Separar o fígado do diafragma e então lentamente através do diafragma, expondo a cavidade pleural 15.
    3. Cortar a caixa torácica bilateralmente e fixar o esterno cortado para expor o ventrículo esquerdo. Inserir uma agulha de calibre 21 borboleta conectada a um sistema de perfusão peristáltica no posterior do ventrículo esquerdo.
    4. Perfure o átrio direito e rapidamente (dentro de 10 s) recolher 200-300 µ l de sangue lançado na cavidade do peito usando pontas de pipetas de 1 mL (com corte final) em tubos de colheita de soro e armazená-lo no gelo.
      Nota: Este procedimento de perfusão é não-sobrevivência.
    5. Assim que o sangue é colhido, ligue o sistema de perfusão (10-12 rpm, 5 mL/min) e perfundir o animal para 3 min com quente (RT) 1X PBS (livre de Ca2 + /íons de Mg2 + ).
      Nota: PBS contendo Ca2 +/ mg2 + íons podem ser utilizadas para melhor atividade do coração durante a perfusão. A quantidade total de PBS usado para perfusão é na faixa de 15 a 20 mL.
    6. Avaliar a qualidade da perfusão, observando a cor de fígado, rins, que aparecem branco/pálido Após a perfusão.
      Nota: Perfusão hepática ou renais não indicam necessariamente perfusão cerebral como as artérias (carótidas/vertebrais) atingindo o cérebro da aorta pode ser rompido durante a preparação, na etapa 3, particularmente durante a punção atrial.

2. processamento do tecido

  1. Armazenamento e coleta de órgãos
    1. Ao final da perfusão, confirme a morte do animal por deslocamento cervical e colheita cérebro e rins. Verificar perfusão cerebral pela cor dos cérebros (sem sangue visível nos vasos das meninges), a fim de excluir os animais da análise de permeabilidade quando perfusão qualidade não é boa. Separe o cérebro em 2 hemibrains usando um bisturi (Figura 1).
    2. Dissecar com um hemibrain de um bisturi livre de lóbulos olfativo e cerebelo e transferir o hemicerebrum para um tubo de 2 mL. Loja hemi-cerebelo em um tubo adicional, se necessário, para avaliação da permeabilidade cerebelar.
    3. Transferi um único rim para um outro tubo de 2 mL. Armazene as amostras imediatamente em gelo seco.
    4. Incorpore nativamente o restante do rim e hemi-cérebro (incluindo o cerebelo e os lobos olfativos) em tecido-tek ideal da temperatura de corte (O.C.T) composto em gelo seco.
    5. No final, Centrifugar as amostras de sangue armazenadas no gelo em tubos de colheita de soro no 10, 000 g, 10 min a 4 ° C. Sobrenadantes de soro de transferência para tubos de 1,5 mL e colocá-los no recipiente de gelo seco.
    6. Transferência de todas as amostras coletadas em gelo seco para freezer-80 ° C até posterior processamento.
      Nota: É importante congelar as amostras antes de prosseguir para as etapas de homogeneização como aumentos de eficiência de homogeneização depois como congelar descongelar.
  2. Homogeneização e centrifugação
    1. Descongelar no gelo os hemi-cérebro e rim amostras congeladas para baixo a-80 ° C e pesar os tubos que contêm os órgãos. Destes pesos, subtrai o valor médio de vários tubos vazios (cerca de 20) para obter o peso do tecido. Adicionar 300 µ l e 200 µ l de frio 1 X PBS para os tubos contendo o rim e hemi-cérebro, respectivamente.
      Nota: para a menor quantidade de tecido (como hemi-cerebelo, abaixo de 100 mg) pesar os tubos individuais é recomendado.
    2. Homogeneizar a amostra no tubo de eppendorf original com um pilão de politetrafluoretileno (PTFE) anexado a um agitador sobrecarga elétrica (1, 000 rpm), através da realização de cerca de 15 cursos (1 curso = 1 e 1 para baixo). Enxágue o pilão com PBS entre as amostras e seque antes de prosseguir para a próxima amostra.
      Nota: O uso de detergentes durante a homogeneização foi evitado devido a possíveis interferências com fluorometry. No entanto, palpador intracelular também é detectado no presente protocolo como o tecido é completamente homogeneizado, que é mais eficiente depois de uma rodada de congelar descongelar.
    3. Armazene as amostras homogeneizadas no gelo protegido da luz e centrifugar todos junto no final a 15.000 g, 20 min, 4 ° C em uma centrífuga do tabletop. Transferi sobrenadantes para um novos tubos de 1,5 mL no gelo para fluorometry imediata ou a-80 ° C para ser analisado mais tarde.
  3. Quantificação e medição de fluorescência
    1. Se congelado no final da etapa anterior, descongele no gelo, as amostras de tecido sobrenadante e soro armazenadas a-80 ˚ c protegendo-os de luz com a folha.
    2. Pipete 50 µ l de soro diluído (30 µ l 1X PBS + 20 µ l de soro) ou sobrenadantes de tecido (como é) para uma placa 384-bem preta. Incluem pelo menos uma amostra de animal de Souza para soro e tecido sobrenadantes garantir a subtração de fundo apropriada, como este pano de fundo de homogeneizado de tecido é normalmente maior que a de PBS, usado como o diluente.
      Nota: Uma média de 3 animais de Souza pode ser usada para autofluorescência embora observou-se uma variabilidade muito pequena em valores de autofluorescência de Souza (dados não mostrados). A quantidade de soro usada pode ser reduzida por diluir com PBS, que também pode aumentar a relação sinal-ruído para amostras com baixa fluorescência como as amostras de cérebro. Upto 10 µ l de soro foi testado diluir com 40 µ l PBS. Certifique-se de que não há bolhas estão presentes nos poços.
    3. Insira a placa preta 384-bem o leitor e abra um novo script selecionando medição de fluorescência.
    4. Definir o ganho para o ideal e usar valores de excitação/emissão (nm) de 550/580 ou 490/520 para TMR ou FITC dyee respectivamente e iniciar a medição para obter as unidades de fluorescência cru (RFUs).
    5. Use as unidades de fluorescência cru (RFUs) do leitor de placa para calcular o índice de permeabilidade (PI), depois de subtrair os valores correspondentes de Souza.
      1. * Índice de permeabilidade (mL/g) = (RFUs/g de tecido tecido peso) / (soro soro RFUs/mL)
    6. Exemplo cálculo para índice de permeabilidade do cérebro (PI) do animal GOF1 (tabela 1):
      1. GOF1 cérebro RFUs - SHAM cérebro RFUs = 154-22.5 = 131.5
      2. Soro GOF1 RFUs - soro de Souza RFUs = 38305 / 27 = 38278
      3. Peso (g) do cérebro = 0,195
      4. Volume de soro (ml) = 0,02
      5. Cérebro de índice de permeabilidade (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
        Nota: Os cálculos do índice de permeabilidade produzem valores que são absolutos e comparáveis entre as experiências e os tipos de tecido. No entanto estes podem ser apresentados como rácios para facilitar a comparação entre os 2 grupos de 12. Isto pode ser conseguido dividindo o PI de cada animal em ambos os grupos, com o PI médio do grupo controle, dirigindo a média do grupo de controle através de 1 ainda mantendo a variação de animais inter no grupo controle. Essa transformação fornece valores para o grupo experimental (ou grupos) em relação ao grupo controle, definido como 1.
  4. Visualização de imunofluorescência do tracer
    1. Corte os blocos de rim/hemi-cérebro nativamente no composto de tecido-tek (O.C.T) (passo 2.1) incorporados 10 µm seções em um criostato definido como-20 ° C e transferir as seções de slides colocados à temperatura ambiente. Uma vez que as seções são secas (cerca de 30 min), transferência de slides para congelador-80 ° C até o uso.
    2. No dia da coloração, descongelar os slides a 37 ° C por 10 min e em seguida fixar as seções com 4% paraformaladehyde (PFA) durante 10 minutos à temperatura ambiente seguida de lavagem rápida em PBS.
    3. Incube as secções no buffer de permeabilização/bloqueio de PBS estéril contendo 1% de BSA e 0,5% Triton X-100 pH 7,5 por 1h à temperatura ambiente.
    4. Incubar por 1,5 h em temperatura ambiente com anticorpo primário CD31 (0,5 mg/ml, clonar o MEC 13.3), diluído em 1: 100 em tampão contendo PBS estéril, BSA de 0,5%, 0,25% Triton X-100 (pH 7,2) seguido de três lavagens de 5 min em PBS.
    5. Execute a incubação do anticorpo secundário no buffer acima por 1h à temperatura ambiente com espécie fluorescente etiquetado anticorpos diluído 1: 500 (2 mg/mL). Para CD31, anti-rato cabra Alexa 568 ou Alexa 488 pode ser usada em uma diluição de 1: 500. Incluir DAPI (300 µM) no anticorpo secundário mix (1:1, 000 diluição do estoque) para manchar-se para os núcleos.
    6. Montar as seções manchadas com o aqua polymount e deixá-lo durante a noite para polimerização à temperatura ambiente no escuro.
    7. Adquira imagens usando um laser confocal de imagem espectral microscópio sistema de digitalização. Analise imagens pelo software de elementos de NIS (versão 4.3). Software como o Photoshop pode ser usado para a geração de figuras de montagem.

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Representative Results

Nós recentemente demonstraram que camundongos de (GOF) angiopoietina-2 (Ang-2) ganho-de-função maior permeabilidade vascular do cérebro do que os ratos controle em condições saudáveis10. Em camundongos induzida por acidente vascular cerebral, foi também mostra que os ratos GOF tinham maiores tamanhos de infarto e permeabilidade maior do que o littermates de controle. Esses resultados mostram um papel crítico de Ang-2 na permeabilidade no BBB. O protocolo, portanto, utilizado os ratos GOF e comparou-os para controlar littermates para descrever o ensaio de permeabilidade em vivo . No entanto, esse método pode ser aplicado a qualquer modelo de rato transgénico, modelo de doença ou tratamentos que alteram a permeabilidade BBB, como fizemos anteriormente 10,11,12,13de drogas.

Sugere-se um tempo de circulação curto (15 min) para análise de permeabilidade, como tempos de circulação mais levará a uma maior liberação do compartimento vascular, que tem sido observado também em anteriores estudos16. O afastamento de 3 kD FITC-dextrano a 2 h (Figura 2 C, D) é muito maior do que 15 min (Figura 2 A, B) no rim, bem como no tecido cerebral. No cérebro, há muito pouco traçador extravascular devido intacta barreira hemato - encefálica nestes ratos adultos WT (Figura B, D). Aplicando este método, a permeabilidade do traçador em Ang-2 GOF com littermates WT foi comparada. Os resultados apresentados em um formato de tabela (tabela 1) indicam maior acúmulo de traçador nos cérebros de ratos GOF em comparação com ratos WT. No entanto, a fluorescência de rim não é alterada entre esses grupos. Imagens de imunofluorescência confirmam o aumento extravascular tracer em ratos GOF (Figura 3 B, D) quando comparados aos ratos WT (Figura 3 A, C) onde o tracer é limitado para o compartimento vascular.

Figure 1
Figura 1. Esquema de fluxo de trabalho para o ensaio da permeabilidade na vivo usando marcadores fluorescentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Apuramento de traçador no curto e longos tempos de circulação. A fim de estabelecer o tempo de circulação do marcador para o ensaio de permeabilidade, um tempo de circulação curto de 15 min (A, B) foi comparado com um tempo de circulação longa de 2 h (C, D) post rastreadoras da injeção. O tempo de circulação mais de 2h levou a quantidades muito baixas de acúmulo de traçador no rim (C) onde a permeabilidade basal é alta em comparação com um curto 15 min tempo de circulação (A) potencialmente devido a uma distância muito alta de FITC dextran-3 kD (verde canal) do compartimento vascular. Este efeito foi ainda mais dramático no cérebro caracteriza-se pela apertado barreira hemato - encefálica (B, D). CD31 coloração (canal vermelho) confirmou a presença de navios na região de interesse. Imagens representativas de um único animal fora 2 selvagem-tipo adulto CD1 ratos injetados com traçador para cada ponto do tempo e os animais foram sacrificadas sem perfusing-los para visualizar o traçador intravascular. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Mancha de marcadores avaliar alterações de permeabilidade cerebral em ratos GOF. Aumento da permeabilidade de 3 kD tracer de TMR-dextrano (em vermelho) pode ser visualizada em ratos de Ang-2 GOF (B, D) em comparação com littermates WT (A, C) na região do córtex. Em animais WT o palpador é restrito aos vasos (A, C) Considerando que o palpador extravascular pode ser observado em ratos GOF (setas brancas em B, D). Coloração para CD31 (em azul) nas imagens mescladas (A-D) confirma a presença de navios. Figura mostra imagens representativas de 2 WT e 2 GOF de ratos injetados com traçadores IP e sacrificados 15 min post injeção com perfusão. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Animal ID Cérebro de peso (g) Rim de peso (g) Volume de soro (mL) Soro RFU Rim RFU Cérebro RFU Perm. Índice (10 ^-3 ml/g)
Rim Cérebro
GOF 1 0,195 0.252 0.02 38305 31051 154 64,4 0.352
GOF 2 0,177 0.249 0.02 42001 31411 126 60 0.278
WT 1 0.167 0.301 0.02 40904 31591 64 51,2 0.122
WT 2 0.146 0,294 0.02 39502 31768 70 54,8 0.164
SOUZA 0.155 0,27 0.02 27 36 22.5 AT AT

Tabela 1. Cálculos de permeabilidade do tecido. Índice de permeabilidade, cálculos para Ang-2 ganho-de-função (GOF) e o selvagem-tipo littermates (WT) ratos mostram claramente maiores (cerca de 2 dobras) cérebro permeabilidade em camundongos GOF em comparação com ratos WT. A permeabilidade de rim é no entanto no mesmo intervalo entre os 2 grupos. A permeabilidade renal basal é muito maior comparado ao cérebro como esperado devido ao endotélio fenestrado no rim que não formam uma barreira apertada.

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Discussion

Disfunção da barreira hemato - encefálica está associada com um número de doenças neurológicas, incluindo tumores cerebrais primários e secundários ou derrame. Repartição BBB é frequentemente associada com edema de CNS fatais. A elucidação dos mecanismos moleculares que acionam a abertura ou encerramento do BBB é, portanto, de importância terapêutica em doenças neurológicas e comumente investigado pelos pesquisadores. No entanto, métodos para investigar BBB permeabilidade na vivo relatados na literatura, são frequentemente associados com dificuldades técnicas que dependem de quantificação subjetiva e tediosa de fluorescência imagens17,18 , 19. Além disso, alguns dos métodos incluem imagens de fluorescência do cérebro inteiro que é falaciosa como mais indicativa da permeabilidade dos vasos superficiais do cérebro que não formam uma barreira apertada. Mesmo quando a quantificação tem sido realizada com base na absorvância de tecido de cérebro objetiva (por exemplo, avaliação de permeabilidade de azul de evans) os animais muitas vezes não são perfundidos levando a interpretação errônea devido a fração significativa de sangue. Peso do cérebro é outra variável que muitas vezes não está incluída nos cálculos de permeabilidade, mas precisa ser como edema resultante da permeabilidade vascular pode aumentar o peso e alterar a permeabilidade a líquidos. Além disso, sexo e variações de peso do cérebro de animal-de-animal podem ofuscar as diferenças de permeabilidade. Traçadores radioativos como 14C sacarose e inulina [3 H] tem sido aplicados com sucesso para o índice de permeabilidade do cérebro, mas que não oferecem a variedade de tamanho e a carga com base em investigação de permeabilidade como com traçadores fluorescente etiquetadas20.

Pelas razões acima, adotamos um método que é simples, objetiva e quantitativa na estimativa de barreira hemato - encefálica permeabilidade na vivo em camundongos usando traçadores fluorescente etiquetadas. Dextranos são polissacarídeos hidrofílicos, caracterizados por seu peso molecular de moderada a alta (3-200 kD) e podem ser obtidos como moléculas carregadas ou descarregadas baseadas o fluoróforo conjugado. Junções apertadas endoteliais formaram por principalmente claudins (1, 3, 5 e 12) e juntos occludin, determinar o tamanho de paracellular e cobrar seletividade pela carga dos poros resíduos presentes no seu primeiro circuito extracelular (revisto em21). Permeabilidade através da barreira hemato - encefálica na vivo também é dependente de glicocálix e a lâmina basal, duas estruturas que estão presentes em ambos os lados da BBB22,23. Luminally presente glicocálix é um gel como estrutura formada por oligossacarídeos carregados negativamente (sulfatos de heparina) que também age como uma barreira para macromoléculas transmitidas pelo sangue, como a albumina. Mudanças na espessura do glicocálix ou composição também estão associadas com alterações de permeabilidade vascular, como observamos em angiopoietina-2 ganho de ratos de função em relação ao tipo selvagem ratos10. Por outro lado a membrana basal está presente no lado abluminal das células endoteliais que compreende tanto a vascular da membrana basal feita por pericitos e células endoteliais, enquanto o parenquimatosa membrana basal ou hamartomas da membrana basal feito por astrócitos. Estas membranas de porão são também negativamente carregadas e, portanto, também tem capacidade para servir como barreiras de carga. A este respeito, conjugados dextranos oferecem investigação de tamanho e de permeabilidade de carga-baseado. Por exemplo, TMR-dextrano 3 kD é aniônicos considerando TXR-dextrano 3 kD é neutro, combinando um destes marcadores com um alto conjugado dextrano peso molecular como dextran FITC 70 kD na mesma mistura injetada aos ratos, um poderia avaliar a permeabilidade baseado no tamanho. Ainda mais, aproveitamos a lisina-fixável natureza dos dextranos fluorescente-etiquetadas para explorar as diferenças regionais na permeabilidade de coloração, o padrão da imunofluorescência. Dextranos também geralmente apresentam baixa imunogenicidade e, portanto, servem como marcadores de boas. Amarelo de Lúcifer, cadaverina, fluoresceína-5-thiosemicarbazide (FTSC), são entre outros marcadores que estão na faixa de baixo peso molecular (0.4-0.8 kD) e são tratáveis.

Em nosso método, os marcadores foram injetados por via IP, seguida por perfusing os ratos e obtenção de fluorescência do cérebro homogenates normalizada para a massa húmida e a fluorescência de soro. Este é um método simples, mas altamente quantitativo e objectivo, como não há nenhuma seleção de seções/imagens como na quantificação pelo método de imunofluorescência que é classicamente usado. Podemos utilizar apenas um hemi-cérebro para o ensaio de permeabilidade e utilizar o outro hemibrain para mancha através da análise de secções sagitais, fornecendo as diferenças regionais no mesmo animal. O uso de cada hemi-cérebro para medições simultâneas distintos é uma das principais vantagens em nosso protocolo. Além disso, permeabilidade de outros órgãos como rins, fígado, etc. serve como um bom controle interno como a permeabilidade basal é alta nesses órgãos. Para comparar os 2 grupos, teria primeiro subtrair o animal de Souza (que não receberam injeção do traçador) autofluorescência de todos os animais de ambos os grupos e todo o tecido tipos (rim, cérebro e soro) para cada tracer e prossiga para normalizado cálculos comparando os 2 grupos. O índice de permeabilidade (PI) é apresentado que é obtido como um rácio de tecido para soro fluorescência normalizado para volume tecidual de peso e soro. Nossos cálculos produzem um valor absoluto para a permeabilidade do traçador que pode ser comparado entre as experiências e os tipos de tecido. Esses valores no entanto, podem ser facilmente expressos rácios ou por cento entre os 2 grupos, sendo comparados como fizemos anteriormente também12. Isto pode ser conseguido dividindo o PI de cada animal em ambos os grupos, com o PI médio de todos os animais do grupo controle. Isto iria conduzir o grupo de controle PI através de 1 ainda mantendo o erro entre os animais e para o grupo experimental dar valores que são em relação à média do grupo de controle de 1.

Injeção de traçadores por IP é mais fácil, mas mais intensivo de custo em comparação com injeção de soro, como a quantidade de traçador precisa ser aumentado. Nossos dados (não mostrados) a este respeito indicam que quase 2 dobras maior quantidade no palpador é exigida pela injeção de IP em relação ao soro para obter soro similar valores de fluorescência. Além disso, o tempo de circulação é maior em rota IP em comparação com o soro devido o tempo necessário para a absorção de traçador no córrego do sangue. A este respeito, valores de fluorescência de soro em 15 min post IP injeção eram comparáveis à injeção de soro de post 5 min para marcadores na faixa de baixo e médio peso molecular entre 0,4-4 kD (dados não mostrados). Sugerimos um tempo curto de circulação porque paracellular permeabilidade é linear e se considerável tecido fluorescência é detectado post perfusão após um tempo de circulação curto (15 min), já indica um fenótipo de permeabilidade como informamos em nosso anteriores Publicações10,12,13,14. No entanto, ao mesmo tempo um poderia obter a fluorescência de soro para normalização. Em tempos mais longos de circulação, liberação de tecido é considerável, que reduz consideravelmente a fluorescência de soro e assim possam afetar valores de permeabilidade normalizados para o soro. Enquanto o tempo de circulação em relação a carga/tamanho do traçador tem que ser otimizado para cada cenário, sugerimos um tempo curto de circulação como ponto de partida. Isso também se aplica a solutos de peso molecular mais elevados tais como plasma IgGs e fibrinogênio (150-400 kD), cujas características de permeabilidade são ao contrário de traçadores de dextrano inertes devido ao seu tamanho extremamente grande e interação específica com receptores celulares tais como Fc receptores que alterar a sua meia-vida de24. Dextranos por outro lado não tem qualquer sistema de transporte específico para o nível endotelial25 e como as células endoteliais do cérebro não sofrem muito pinocitose para níveis significativos devido a baixos níveis de vesículas plasmalema proteína associada (PLVAP)26 , a principal rota de transporte dos dextranos é paracellular. Nós aplicamos o método acima com sucesso em vários cenários tais como permeabilidade em ratos transgênicos em relação ao tipo selvagem littermates e também avaliou as alterações de permeabilidade em camundongos selvagens tipo após intervenção terapêutica10, 12 , 13 , 14. em resumo, combinado com a mancha da imunofluorescência, o ensaio de permeabilidade descrito aqui é um simples e um método robusto para avaliar a permeabilidade de ratos na vivo que também pode ser aplicado a outros animais pequenos.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Os autores gostaria de reconhecer o consórcio Sphingonet, financiado pela Fundação para apoiar este trabalho de Leduq. Este trabalho também foi apoiado pelo centro de pesquisa colaborativa "diferenciação Vascular e remodelação" (CRC / Transregio23, projeto C1) e pela 7. FP, MULTIANUAIS, Goethe internacional Postdoc programa GO-IN, n. º 291776 financiamento. Reconhecemos mais Kathleen Sommer pela sua assistência técnica com ratos, manipulação e genotipagem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD Thermosfisher D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD Thermosfisher D3306
Ketamine (Ketavet) Zoetis
Xylazine (Rompun) Bayer
0.9% Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS Gibco 10010-015
Tissue-tek O.C.T compound Sakura Finetek 4583
37% Formaldhehyde solution Sigma 252549-1L prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V Roth 8076.3
Triton X-100 Sigma T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 BD Pharmingen 553370
goat anti rat alexa 568 Molecular Probes A-11077
goat anti rat alexa 488 Molecular Probes A-11006
DAPI Molecular Probes D1306
Aqua polymount Polyscience Inc 18606
21-gauge butterfly needle BD 387455
serum collection tube Sarstedt 41.1500.005
2mL eppendorf tubes Sarstedt 72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers Kimberley-Clark Professional 05511
384-well black plate Greiner 781086
slides superfrost plus Thermoscientific J1800AMNZ
PTFE pestle Wheaton 358029
electric overhead stirrer VWR VWR VOS 14
plate reader Tecan Infinite M200
Cryostat Microm GmbH HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System Nikon
peristaltic perfusion system BVK Ismatec
microcentrifuge eppendorf 5415R

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References

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  2. Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
  3. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  4. Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
  7. Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
  8. Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
  9. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  10. Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
  11. Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
  12. Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
  13. Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
  14. Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
  16. Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
  17. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  19. Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
  20. Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
  21. Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
  22. Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
  23. Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
  24. Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
  25. Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
  26. Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).

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