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Neuroscience

एक Vivo में रक्त-चूहों में मस्तिष्क बाधा पारगम्यता परख फ्लोरोसेंट लेबल अनुरेखकों का उपयोग

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/57038
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Institute of Neurology (Edinger Institute), Goethe University Hospital, 2Pharmazentrum Frankfurt, Institute for General Pharmacology and Toxicology, Goethe University Hospital

Summary

यहां हम एक माउस मस्तिष्क संवहनी पारगम्यता intraperitoneal फ्लोरोसेंट अनुरेखक के इंजेक्शन का उपयोग छिड़काव द्वारा पीछा किया है कि रक्त मस्तिष्क बाधा रोग के पशु मॉडलों के लिए लागू होता है । एक hemi-मस्तिष्क पारगम्यता मात्रात्मक और अनुरेखक दृश्य के लिए अन्य के आकलन के लिए प्रयोग किया जाता है immunostaining/ प्रक्रिया 10 चूहों के लिए 5-6 ज लेता है ।

Abstract

ब्लड-ब्रेन बैरियर (BBB) एक विशेष बाधा है जो रक्त परिसंचरण में विषाक्त पदार्थों और रोगजनकों से मस्तिष्क microenvironment की रक्षा करता है और मस्तिष्क homeostasis को बनाए रखता है । बैरियर की प्रमुख साइटें मस्तिष्क केशिकाओं की endothelial कोशिकाएं होती हैं, जिनका बैरियर फंक्शन परिणाम तंग सेलुलर जंक्शनों और समाप्ति ट्रांसपोर्टरों से प्लाज्मा झिल्ली पर व्यक्त होता है । इस समारोह pericytes और astrocytes द्वारा विनियमित है कि एक साथ neurovascular इकाई (NVU) फार्म । कई स्नायविक रोगों जैसे स्ट्रोक, अल्जाइमर रोग (AD), ब्रेन ट्यूमर एक बिगड़ा BBB समारोह के साथ जुड़े रहे हैं. BBB पारगम्यता का आकलन इसलिए मस्तिष्क संबंधी रोग की गंभीरता का मूल्यांकन करने में महत्वपूर्ण है और उपचार रणनीतियों की सफलता के लिए कार्यरत.

हम यहां एक सरल अभी तक मजबूत पारगम्यता परख है कि सफलतापूर्वक कई माउस मॉडल दोनों, आनुवंशिक और प्रयोगात्मक करने के लिए लागू किया गया है वर्तमान । विधि अत्यधिक मात्रात्मक और सूक्ष्मता है कि सामांयतः लागू किया जाता है द्वारा अनुरेखक प्रतिदीप्ति विश्लेषण की तुलना में उद्देश्य है । इस विधि में, चूहों anesthetizing चूहों के द्वारा पीछा जलीय निष्क्रिय फ्लोरोसेंट अनुरेखक का एक मिश्रण के साथ intraperitoneally इंजेक्ट कर रहे हैं. कार्डियक छिड़काव जानवरों की कटाई मस्तिष्क, गुर्दे या अन्य अंगों से पहले किया जाता है । अंगों homogenized और supernatant से प्रतिदीप्ति माप के बाद केंद्रापसारक हैं । हृदय पंचर से खींचा रक्त बस से पहले छिड़काव संवहनी डिब्बे के लिए सामान्य प्रयोजन के लिए कार्य करता है. ऊतक प्रतिदीप्ति गीला वजन और सीरम प्रतिदीप्ति के लिए सामान्यीकृत है एक मात्रात्मक अनुरेखक पारगम्यता सूचकांक प्राप्त करने के लिए. अतिरिक्त पुष्टि के लिए, contralateral hemi-immunohistochemistry के लिए संरक्षित मस्तिष्क अनुरेखक प्रतिदीप्ति दृश्य प्रयोजनों के लिए उपयोग किया जा सकता है.

Introduction

रक्त-मस्तिष्क बाधा (BBB) microvascular endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) द्वारा समर्थित बारीकी से संबद्ध pericytes (पीसी), जो बेसल ensheathed में लेमिना हैं, और astrocytes (ACs) है कि उनके अंत फुट के साथ तहखाने झिल्ली ढंक के होते हैं1 ,2. ईसीएस कई सेल प्रकार है कि समर्थन और बाधा समारोह, मुख्य रूप से ACs और पीसी को विनियमित करने के साथ बातचीत, और भी न्यूरॉन्स और microglia, सभी जिनमें से एक साथ neurovascular इकाई (NVU) फार्म. NVU BBB, जो रक्त जनित विषाक्त पदार्थों और मस्तिष्क में प्रवेश करने से रोगजनकों के परिवहन की सीमा के समारोह के लिए महत्वपूर्ण है । इस समारोह में इस तरह के claudin-5, occludin, zonula occludens-1, जो ईसीएस के बीच मौजूद है और भी ऐसे पी के रूप में ट्रांसपोर्टरों की कार्रवाई के कारण ग्लाइकोप्रोटीन (पी जीपी) के रूप में तंग जंक्शन अणुओं का परिणाम है कि समाप्ति अणुओं है कि endothelium में वापस प्रवेश पोत लुमेन1,2,3. BBB लेकिन ऐसे पोषक तत्वों के रूप में आवश्यक अणुओं के परिवहन के लिए अनुमति देता है (ग्लूकोज, लौह, एमिनो एसिड) विशिष्ट चुनाव आयोग प्लाज्मा झिल्ली1पर व्यक्त ट्रांसपोर्टरों द्वारा,2,3। चुनाव आयोग परत अत्यधिक चमकदार (रक्त का सामना करना पड़) और abluminal (मस्तिष्क-सामना झिल्ली) के बीच विभिंन ट्रांसपोर्टरों के वितरण के संबंध में ध्रुवीकरण के लिए अनुमति देने के लिए विशिष्ट और वैक्टर परिवहन समारोह4,5 . जबकि BBB कसकर सीएनएस वातावरण को विनियमित करने के संबंध में सुरक्षात्मक है, यह एक कार्यात्मक BBB के साथ पार्किंसंस जैसे रोगों में सीएनएस दवा वितरण के लिए एक प्रमुख चुनौती है । BBB रोग के साथ मस्तिष्क संबंधी रोगों में भी, यह नहीं माना जा सकता है कि मस्तिष्क दवा वितरण विशेष रूप से बाधा रोग उदाहरण के लिए अल्जाइमर रोग (विज्ञापन) के रूप में विशिष्ट ट्रांसपोर्टर लक्ष्य को नुकसान शामिल हो सकता है के रूप में वृद्धि हुई है । विज्ञापन में, LRP1, क्रोध, पी जीपी के रूप में कई amyloid बीटा ट्रांसपोर्टरों dysregulated होने के लिए जाना जाता है और इसलिए इन ट्रांसपोर्टरों लक्ष्यीकरण व्यर्थ हो सकता है6,7,8। BBB स्ट्रोक, विज्ञापन, दिमागी बुखार, कई स्केलेरोसिस के रूप में कई स्नायविक रोगों में बिगड़ा हुआ है, और मस्तिष्क ट्यूमर में9,10,11. बाधा समारोह बहाल चिकित्सीय रणनीति का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है और इस तरह अपने आकलन महत्वपूर्ण है ।

इस काम में, हम एक उद्देश्य और में पारगम्यता परख के लिए मात्रात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है कुतर कि हम सफलतापूर्वक कई माउस लाइनों के लिए लागू दोनों ट्रांसजेनिक और प्रयोगात्मक रोग मॉडल10,12,13 ,14. विधि फ्लोरोसेंट अनुरेखकों की एक सरल intraperitoneal इंजेक्शन चूहों के छिड़काव द्वारा पीछा संवहनी से नाड़ी डिब्बे को दूर करने के लिए पर आधारित है. मस्तिष्क और अंय अंगों के बाद छिड़काव और एक उद्देश्य और निरपेक्ष पारगम्यता सूचकांक एक प्लेट रीडर में ऊतक homogenates के प्रतिदीप्ति माप के आधार पर मूल्यांकन के बाद एकत्र कर रहे हैं । सभी कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों की पृष्ठभूमि के लिए सही है कि किसी भी अनुरेखक प्राप्त नहीं है कि अन्तर्वासना जानवरों से ऊतक homogenates या सीरम का उपयोग कर. पर्याप्त सामांयीकरण सीरम की मात्रा, सीरम प्रतिदीप्ति, और ऊतकों के वजन के लिए शामिल हैं, इस प्रकार पारगम्यता सूचकांक है कि निरपेक्ष है और प्रयोगों और ऊतक प्रकार के बीच तुलनीय उपज. समूहों के बीच तुलना में आसानी के लिए, निरपेक्ष पारगम्यता सूचकांक मूल्यों को आसानी से अनुपात में तब्दील किया जा सकता है के रूप में हम पहले12प्रदर्शन किया था । समवर्ती, संग्रहित hemi-दिमाग और गुर्दे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी10द्वारा अनुरेखक दृश्य के लिए उपयोग किया जा सकता है. क्लासिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी पारगम्यता में क्षेत्रीय अंतर प्राप्त करने में मूल्यवान हो सकता है, हालांकि एक अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के लिए ऊतक वर्गों और छवियों के व्यक्तिपरक चयन के कारण बोझिल. विस्तृत कदम प्रोटोकॉल में प्रस्तुत कर रहे हैं और नोट्स जहां उचित जोड़ा जाता है । यह सफलतापूर्वक अंय छोटे जानवरों के लिए स्केल किया जा सकता है कि चूहों में vivo पारगम्यता परख में प्रदर्शन के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करता है । परख के आरोप के लिए अनुमति अनुरेखकों के कई प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है और विशिष्ट प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा के साथ अनुरेखकों का एक संयोजन द्वारा आकार पारगम्यता मूल्यांकन आधारित.

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Protocol

सभी जानवरों की प्रक्रिया के दौरान दर्द या असुविधा को कम करने के अत्यंत देखभाल के साथ नियंत्रित किया गया । यह प्रक्रिया हमारे संस्थान के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करती है और इसे स्थानीय समिति (Regierungspraesidium Darmstadt, अनुमोदन संख्या FK/1044) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

चूहों में vivo पारगम्यता परख में के लिए काम के कदम का एक योजनाबद्ध चित्रा 1में दिखाया गया है. हर कदम का ब्यौरा नीचे बताया गया है ।

1. पशु हैंडलिंग

  1. अनुरेखकों और निश्चेतक की तैयारी और प्रशासन
    1. के लिए लेबल ट्यूबों और molds ऊतक embedding परख से पहले एक दिन से कम एंबेडिंग तैयार । स्वच्छ धुएं हूड के तहत काम करने और ८०% इथेनॉल के साथ साफ उपकरणों का उपयोग करके प्रोटोकॉल भर में बाँझ शर्तों बनाए रखें । का प्रयोग करें पुरुष या महिला वंय-प्रकार (WT) या angiopoietin-2 (आंग-2) लाभ के समारोह (गोफ) CD1 चूहों वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए 3-6 महीने के परिपक्व वयस्क आयु समूह में । पहले 10के रूप में बताए गए चूहों का genotyping प्रदर्शन करें ।
      नोट: ८०% शराब बाँझ उपकरणों में परिणाम नहीं होगा, लेकिन तैयार नमूनों के संदूषण को कम करेगा.
    2. 2 मिमी शेयरों में बाँझ पंजाबियों में सभी अनुरेखकों को पतला और aliquots प्रकाश से सुरक्षित-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    3. (Tetramethyl Rhodamine) टीएमआर और (fluorescein isothiocyanate) विशिष्ट FITC/उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ उत्तेजना के रूप में अनुरेखकों चुनें और है कि lysine माइक्रोस्कोपी द्वारा दोनों रंजक के बीच न्यूनतम हस्तक्षेप में जिसके परिणामस्वरूप के लिए कर रहे हैं (fixable का उपयोग प्रतिदीप्ति या FITC फ़िल्टर क्रमशः) और पारगम्यता परख के लिए एक प्लेट रीडर में fluorometry द्वारा ।
      नोट: टीएमआर dextran 3 केडी और FITC dextran 3 केडी अध्ययन में प्रयुक्त lysine fixable और इसलिए भी immunohistochemical विश्लेषण के बाद aldehydes के साथ निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ताकि क्षेत्रीय मतभेदों की जांच करने के लिए ।
    4. संस्थागत देखभाल दिशानिर्देश के बाद अत्यंत सावधानी के साथ सभी जानवरों को संभालें । १०० µ l अनुरेखक समाधान है कि २०० µ करने के लिए बढ़ा जा सकता है जब एक अतिरिक्त अनुरेखक एक 1:1 मिश्रण में प्रत्येक अनुरेखक के १०० µ एल का उपयोग कर संयुक्त है के साथ प्रत्येक माउस intraperitoneally इंजेक्षन10,13. autofluorescence पृष्ठभूमि घटाव के लिए शर्म की बात है नियंत्रण के रूप में काम करने के बजाय अनुरेखकों के अकेले पंजाबियों के साथ कम से एक पशु सुई.
    5. अनुरेखक इंजेक्शन के बाद 5 मिनट, Ketamine और Xylazine के एक i. p इंजेक्शन के साथ पशु anesthetize (१०० मिलीग्राम और 5-10 मिलीग्राम ०.९% खारा में प्रति किलो शरीर के वजन क्रमशः, १५० µ एल प्रति कॉकटेल की 25 जी माउस).
      नोट: पशु संज्ञाहरण और छिड़काव के बीच की अवधि के रूप में प्रक्रिया के दौरान डॉक्टर मरहम आंखों पर लागू नहीं किया गया था (10 मिनट) जहां आंखों के किसी भी सुखाने मनाया नहीं था ।
  2. रक्त संग्रह और कार्डियक छिड़काव
    1. संवेदनाहारी प्रशासन के बाद कार्डियक छिड़काव 10 मिनट के लिए जानवरों को तैयार करें । आदेश में पंजा चिकोटी प्रतिक्रिया के अभाव की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि पशु संज्ञाहरण के एक शल्य विमान तक पहुंच गया ।
    2. उनकी पीठ पर पशुओं रखना और उदर क्षेत्र की त्वचा पर ८०% इथेनॉल लागू होते हैं । छोटे कैंची का प्रयोग, बस रिब पिंजरे के नीचे एक छोटा सा चीरा (2 सेमी) के साथ पेट की दीवार को खोलने । डायाफ्राम से अलग जिगर और फिर धीरे डायाफ्राम फुफ्फुस गुहा 15को उजागर के माध्यम से कटौती ।
    3. रिब पिंजरे को द्विपक्षीय रूप से काटें और कट उरोस्थि को ठीक करें ताकि वाम निलय का पर्दाफाश हो सके । एक 21 गेज तितली सुई बाईं निलय के पीछे में एक सिकुड़नेवाला छिड़काव प्रणाली से जुड़ा डालें.
    4. सही atrium और जल्दी से पंचर (10 एस के भीतर) रक्त के 200-300 µ एल इकट्ठा छाती गुहा में जारी 1 मिलीलीटर पिपेट युक्तियों का उपयोग कर (अंत कट के साथ) सीरम संग्रह ट्यूबों में और यह बर्फ पर दुकान ।
      नोट: यह छिड़काव प्रक्रिया गैर-उत्तरजीविता है ।
    5. जैसे ही रक्त एकत्र किया जाता है, छिड़काव प्रणाली पर स्विच (10-12 rpm, 5 मिलीलीटर/) और गर्म (आरटी) 1x पंजाबियों के साथ 3 मिनट के लिए पशु perfuse (Ca के नि: शुल्क2 +/2 + आयनों) ।
      नोट: छिड़काव के दौरान बेहतर हृदय गतिविधि के लिए सीए2 +/Mg2 + आयनों युक्त पंजाबियों का उपयोग किया जा सकता है । छिड़काव के लिए इस्तेमाल होने वाले पंजाबियों की कुल रकम 15-20 एमएल की रेंज में है ।
    6. जिगर, गुर्दे, जो दिखाई सफेद/छिड़काव के बाद पीला का रंग टिप्पण द्वारा छिड़काव गुणवत्ता का आकलन करें ।
      नोट: गुर्दे या जिगर छिड़काव जरूरी नहीं संकेत मस्तिष्क छिड़काव के रूप में धमनियों (मन्या/कशेरुका) महाधमनी से मस्तिष्क तक पहुँचने के लिए विशेष रूप से अलिंद पंचर के दौरान चरण 3 में तैयारी के दौरान टूटना हो सकता है.

2. ऊतक प्रसंस्करण

  1. अंग संग्रह और भंडारण
    1. छिड़काव के अंत में, ग्रीवा विस्थापन और फसल मस्तिष्क और गुर्दे द्वारा पशु की मौत की पुष्टि करें । दिमाग के रंग से मस्तिष्क छिड़काव सत्यापित करें (मेनिन्जेस के जहाजों में कोई दिखाई रक्त), तो के रूप में पारगम्यता विश्लेषण से जानवरों को बाहर करने के लिए जब छिड़काव गुणवत्ता अच्छा नहीं है. एक स्केलपेल (चित्रा 1) का उपयोग कर 2 hemibrains में मस्तिष्क को अलग.
    2. काटना के साथ एक स्केलपेल एक hemibrain मुक्त घ्राण पालियों और सेरिबैलम और एक 2 एमएल ट्यूब करने के लिए hemicerebrum हस्तांतरण । एक अतिरिक्त ट्यूब में hemi-सेरिबैलम स्टोर अनुमस्तिष्क पारगम्यता आकलन के लिए आवश्यक है ।
    3. एक और 2-एमएल ट्यूब के लिए एक भी गुर्दा हस्तांतरण । सूखी बर्फ पर तुरंत नमूनों की दुकान ।
    4. natively शेष गुर्दे और hemi-मस्तिष्क एंबेड (सेरिबैलम और घ्राण पालियों में शामिल) ऊतक-टेक इष्टतम काटने तापमान (ओ. सी. टी.) सूखी बर्फ पर यौगिक ।
    5. अंत में, 10, 000 जी, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट में सीरम संग्रह ट्यूबों में बर्फ पर संग्रहीत रक्त के नमूने केंद्रापसारक । १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए सीरम supernatants हस्तांतरण और उंहें सूखी बर्फ कंटेनर में जगह है ।
    6. आगे प्रसंस्करण तक सूखी बर्फ-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर पर एकत्र सभी नमूनों स्थानांतरण ।
      नोट: यह homogenization चरणों के लिए आगे बढ़ने से पहले नमूनों फ्रीज करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में homogenization क्षमता बढ़ जाती है के रूप में स्थिर गल के बाद ।
  2. Homogenization और केंद्रापसारक
    1. बर्फ पर गल-८० डिग्री सेल्सियस पर नीचे जमे हुए hemi-मस्तिष्क और गुर्दे के नमूने और अंगों युक्त ट्यूबों तौलना । इन वजन से, कई खाली ट्यूबों का मतलब मूल्य घटाना (के बारे में 20) के लिए ऊतक वजन मिलता है । क्रमशः गुर्दे और hemi-मस्तिष्क युक्त ट्यूबों के लिए कोल्ड 1x पंजाब के ३०० µ l और २०० µ l को जोड़ें ।
      नोट: ऊतक की कम मात्रा के लिए (जैसे hemi-सेरिबैलम, नीचे १०० मिलीग्राम) व्यक्तिगत ट्यूबों वजनी की सिफारिश की है ।
    2. एक polytetrafluoroethylene के साथ मूल eppendorf ट्यूब में प्रत्येक नमूने Homogenize (PTFE) के बारे में 15 स्ट्रोक (1 स्ट्रोक = 1 ऊपर और 1 नीचे) प्रदर्शन करके एक बिजली के ओवरहेड सरगर्मी (1, 000 rpm) से जुड़ी खल । इन नमूनों के बीच में पंजाबियों के साथ मूसल कुल्ला और अगले नमूने के लिए आगे बढ़ने से पहले सूखी पोंछ ।
      नोट: homogenization के दौरान डिटर्जेंट का उपयोग fluorometry के साथ संभावित व्यवधान के कारण टाला गया था. हालांकि, intracellular अनुरेखक भी इस प्रोटोकॉल में पाया जाता है के रूप में ऊतक अच्छी तरह से homogenized है, जो फ्रीज के एक दौर के बाद अधिक कुशल है गल.
    3. बर्फ पर homogenized नमूनों की दुकान प्रकाश से सुरक्षित और अंत में १५,००० जी, 20 मिनट, एक तालिका में 4 डिग्री सेल्सियस के एक स्तर पर केंद्रापसारक में सभी एक साथ केंद्रापसारक । तत्काल fluorometry या पर-८० डिग्री सेल्सियस के लिए बर्फ पर एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए supernatants स्थानांतरण बाद में विश्लेषण किया जाना है ।
  3. प्रतिदीप्ति मापन तथा ठहराव
    1. यदि पिछले कदम के अंत में जमे हुए, बर्फ पर गल ऊतक supernatant और सीरम के नमूने पर संग्रहीत-८० ˚ ग उन्हें पन्नी के साथ प्रकाश से बचाती है.
    2. पिपेट ५० पतला सीरम के µ एल (30 µ l 1x पंजाबियों + 20 µ एल सीरम) या ऊतक supernatants (के रूप में है) में एक ३८४-अच्छी तरह से काली प्लेट । सही पृष्ठभूमि घटाव सुनिश्चित करने के लिए सीरम और ऊतक supernatants के लिए अन्तर्वासना एनिमल्स से कम से एक नमूना शामिल करें, क्योंकि इस ऊतक homogenate पृष्ठभूमि सामान्य रूप से मंदक के रूप में इस्तेमाल किया पंजाबियों की तुलना में अधिक है ।
      नोट: autofluorescence के लिए 3 शम पशुओं का एक औसत इस्तेमाल किया जा सकता है हालांकि अन्तर्वासना autofluorescence मूल्यों में बहुत कम परिवर्तनशीलता (डेटा नहीं दिखाया गया) मनाया गया । उपयोग किए गए सीरम की मात्रा को पंजाबियों के साथ कमजोर करके कम किया जा सकता है, जो मस्तिष्क के नमूनों जैसे कम प्रतिदीप्ति वाले नमूनों के लिए शोर अनुपात के संकेत को भी बढ़ा सकता है. तक 10 µ एल सीरम ४० µ l पंजाबियों के साथ यह कमजोर परीक्षण किया गया था. सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले कुओं में मौजूद हैं ।
    3. प्लेट रीडर में ३८४-अच्छी तरह से काली प्लेट डालें और प्रतिदीप्ति माप का चयन एक नई स्क्रिप्ट खोलें ।
    4. टीएमआर या FITC dyee के लिए इष्टतम और उत्तेजना/उत्सर्जन (एनएम) मान 550/580 या 490/520 का उपयोग करने के लिए क्रमशः लाभ सेट करें और raw प्रतिदीप्ति इकाइयां (RFUs) प्राप्त करने के लिए माप प्रारंभ करें ।
    5. प्लेट रीडर से कच्चे प्रतिदीप्ति इकाइयों (RFUs) का उपयोग करने के लिए इसी अन्तर्वासना मूल्यों को घटाकर बाद पारगम्यता सूचकांक (PI) की गणना करने के लिए.
      1. * पारगम्यता सूचकांक (एमएल जी/ = (ऊतक RFUs/जी ऊतक वजन)/(सीरम RFUs/एमएल सीरम)
    6. पशु GOF1 के मस्तिष्क पारगम्यता सूचकांक (PI) के लिए उदाहरण परिकलन (तालिका 1):
      1. GOF1 ब्रेन RFUs-शम मस् RFUs = १५४-२२.५ = १३१.५
      2. GOF1 सीरम RFUs-शम सीरम RFUs = ३८३०५-27 = ३८२७८
      3. मस्तिष्क वजन (g) = ०.१९५
      4. सीरम वॉल्यूम (ml) = ०.०२
      5. मस्तिष्क पारगम्यता सूचकांक (10-3 मिलीलीटर/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = ०.३५२
        नोट: पारगम्यता सूचकांक परिकलन मानों निरपेक्ष और प्रयोगों और ऊतक प्रकार के बीच तुलनीय हैं कि उपज. इन तथापि 2 समूहों के बीच तुलना में आसानी के लिए अनुपात के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है 12। यह नियंत्रण समूह का अर्थ pi के साथ दोनों समूहों में प्रत्येक जानवर के pi विभाजित द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, नियंत्रण समूह के माध्यम से 1 अभी तक नियंत्रण समूह में अंतर पशु भिंनता रखते हुए ड्राइविंग मतलब है । यह परिवर्तक मान 1 के लिए सेट नियंत्रण समूह के सापेक्ष प्रायोगिक समूह (या समूह) के लिए प्रदान करता है ।
  4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस अनुरेखक के दृश्य
    1. hemi-मस्तिष्क ब्लॉक ऊतक-टेक यौगिक (ओ. सी. टी.) में natively एंबेडेड (चरण २.१) एक cryostat पर 10 µm वर्गों में-20 डिग्री सेल्सियस और कमरे के तापमान पर रखा स्लाइड करने के लिए वर्गों हस्तांतरण में कटौती । एक बार जब वर्गों सूख रहे है (के बारे में 30 मिनट), स्थानांतरित करने के लिए स्लाइड-८० ° c फ्रीजर उपयोग जब तक ।
    2. धुंधला होने के दिन, 10 मिनट के लिए ३७ ° c पर स्लाइडें गल, और फिर पंजाब में त्वरित धुलाई के बाद कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% paraformaladehyde (पीएफए) के साथ वर्गों को ठीक करें ।
    3. permeabilization/अवरुद्ध में वर्गों की मशीन 1% BSA और ०.५% ट्राइटन X-१०० पीएच ७.५ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए युक्त बाँझ पंजाबियों के बने बफर ।
    4. CD31 प्राथमिक एंटीबॉडी (०.५ मिलीग्राम/एमएल, क्लोन MEC १३.३) के साथ कमरे के तापमान पर १.५ घंटे के लिए, 1:100 में पतला बाँझ पंजाबियों, ०.५% BSA, ०.२५% ट्राइटन एक्स-१०० (पीएच ७.२) के साथ के लिए स्लाइड की मशीन पंजाब में तीन 5 मिनट बहाकर द्वारा पीछा किया ।
    5. 1 एच के लिए ऊपर बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी की मशीन का प्रदर्शन प्रजाति के साथ कमरे के तापमान पर विशेष फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी पतला 1:500 (2 मिलीग्राम/एमएल) । CD31 के लिए, बकरी विरोधी चूहे alexa ५६८ या alexa ४८८ 1:500 के एक कमजोर पड़ने पर इस्तेमाल किया जा सकता है । DAPI (३०० µ एम) माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण (1: स्टॉक से 1000 कमजोर पड़ने) में शामिल करने के लिए नाभिक के लिए दाग ।
    6. एक्वा polymount के साथ दाग वर्गों माउंट और यह अंधेरे में कमरे के तापमान पर बहुलकीकरण के लिए रात भर छोड़ दें ।
    7. एक वर्णक्रमीय इमेजिंग फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग कर छवियों को प्राप्त । NIS तत्वों सॉफ्टवेयर द्वारा छवियों का विश्लेषण (संस्करण ४.३) । ऐसे फ़ोटोशॉप के रूप में सॉफ्टवेयर असेंबल आंकड़े के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Representative Results

हम हाल ही में दिखाया गया है कि angiopoietin-2 (आंग-2) लाभ के समारोह (गोफ) चूहों उच्च मस्तिष्क संवहनी पारगम्यता स्वस्थ स्थिति में नियंत्रण चूहों से10है. स्ट्रोक प्रेरित चूहों में यह भी पता चलता है कि गोफ चूहों नियंत्रण littermates से बड़ा infarct आकार और अधिक से अधिक पारगम्यता था । इन परिणामों BBB में पारगम्यता में आंग-2 की एक महत्वपूर्ण भूमिका दिखाने के लिए । प्रोटोकॉल इसलिए गोफ चूहों का उपयोग किया और उंहें littermates नियंत्रण के लिए vivo पारगम्यता परख में वर्णन की तुलना में । हालांकि, इस विधि किसी भी रोग मॉडल, ट्रांसजेनिक माउस मॉडल या दवा उपचार है कि BBB पारगम्यता को बदलने के रूप में हम पहले किया था करने के लिए लागू किया जा सकता है 10,11,12,13.

एक छोटी संचलन समय (15 मिनट) पारगम्यता विश्लेषण के लिए सुझाव दिया है, के रूप में अब परिसंचरण बार संवहनी डिब्बे, जो भी पिछले अध्ययन में देखा गया है से एक बड़ी मंजूरी के लिए नेतृत्व करेंगे16. 3 केडी FITC के क्लीयरेंस-2 एच में dextran (चित्रा 2 सी, डी) 15 मिनट (चित्रा 2 ए, बी) गुर्दे में के रूप में अच्छी तरह से मस्तिष्क के ऊतकों में से अधिक से अधिक है । मस्तिष्क में, इन वयस्क WT चूहों (चित्र बी, डी) में रक्त मस्तिष्क बाधा बरकरार के कारण बहुत कम extravascular अनुरेखक है. इस पद्धति को लागू करने, WT littermates के साथ आंग-2 गोफ में अनुरेखक पारगम्यता की तुलना की गई. एक तालिका स्वरूप में प्रस्तुत परिणाम (तालिका 1) WT चूहों की तुलना में गोफ चूहों के दिमाग में उच्च अनुरेखक संचय इंगित करते हैं । हालांकि इन समूहों के बीच किडनी प्रतिदीप्ति नहीं बदली है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां गोफ चूहों में extravascular अनुरेखक में वृद्धि की पुष्टि करें (चित्रा 3 बी, डी) जब WT चूहों की तुलना में (चित्रा 3 ए, सी) जहां अनुरेखक संवहनी डिब्बे तक सीमित है.

Figure 1
चित्र 1. vivo पारगम्यता परख फ्लोरोसेंट खोजकर्ताओं का उपयोग कर के लिए कार्यप्रवाह की योजनाबद्ध । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. अनुरेखक कम और लंबे समय संचलन समय पर मंजूरी. आदेश में पारगम्यता परख, 15 मिनट के एक छोटे संचलन समय के लिए अनुरेखक संचलन समय स्थापित करने के लिए (a, B) 2 एच के एक लंबे संचलन समय की तुलना में था (सी, डी) पोस्ट अनुरेखक इंजेक्शन. 2 एच के अब संचलन समय गुर्दे में अनुरेखक संचय के बहुत कम मात्रा में नेतृत्व में (ग) जहां बेसल पारगम्यता उच्च है एक कम 15 मिनट संचलन समय (क) की तुलना में संभावित FITC dextran के एक बहुत ही उच्च मंजूरी के कारण-3 केडी (ग्रीन चैनल) संवहनी डिब्बे से । यह प्रभाव भी तंग रक्त मस्तिष्क बाधा (बी, डी)द्वारा विशेषता मस्तिष्क में और अधिक नाटकीय था । CD31 धुंधला (लाल चैनल) ब्याज के क्षेत्र में जहाजों की उपस्थिति की पुष्टि की । 2 जंगली प्रकार वयस्क CD1 चूहों से बाहर एक भी जानवर से प्रतिनिधि छवियां प्रत्येक समय बिंदु के लिए अनुरेखक के साथ इंजेक्शन और जानवरों उन्हें intravascular अनुरेखक कल्पना करने के लिए perfusing बिना बलिदान किया गया. स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस अनुरेखकों के लिए दाग गोफ चूहों में मस्तिष्क पारगम्यता परिवर्तन का आकलन करने के लिए. 3 केडी टीएमआर-dextran अनुरेखक की वृद्धि हुई पारगम्यता (लाल में) आंग-2 में visualized किया जा सकता है ( ख, घ) WT littermates की तुलना में एक गोफ चूहों (बी, सी ) प्रांतस्था क्षेत्र में. WT पशुओं में अनुरेखक जहाजों (ए, सी) के लिए प्रतिबंधित है, जबकि extravascular अनुरेखक में गोफ चूहों में मनाया जा सकता है ( B, Dमें सफेद तीर). विलय छवियों में CD31 (नीले रंग में) के लिए धुंधला (A-D) जहाजों की उपस्थिति की पुष्टि करता है । चित्रा 2 WT से प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है और 2 गोफ चूहों अनुरेखकों के साथ इंजेक्शन i. p और बलिदान 15 छिड़काव के साथ मिन पोस्ट इंजेक्शन. स्केल बार = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पशु आईडी मस्तिष्क वजन (g) गुर्दे का वजन (g) सीरम वॉल्यूम (mL) सीरम RFU किडनी RFU ब्रेन RFU पर्म. सूचकांक (10 ^-3 एमएल/
किडनी मस्तिष्क
गोफ 1 ०.१९५ ०.२५२ ०.०२ ३८३०५ ३१०५१ १५४ ६४.४ ०.३५२
गोफ 2 ०.१७७ ०.२४९ ०.०२ ४२००१ ३१४११ १२६ ६० ०.२७८
WT १ ०.१६७ ०.३०१ ०.०२ ४०९०४ ३१५९१ ६४ ५१.२ ०.१२२
WT २ ०.१४६ ०.२९४ ०.०२ ३९५०२ ३१७६८ ७० ५४.८ ०.१६४
अन्तर्वासना ०.१५५ ०.२७ ०.०२ 27 ३६ २२.५ ना ना

तालिका 1. ऊतक पारगम्यता गणना. के लिए पारगम्यता सूचकांक गणना आंग-2 लाभ के समारोह (गोफ) और जंगली प्रकार के littermates (WT) चूहों स्पष्ट रूप से अधिक दिखा (के बारे में 2-गुना) गोफ चूहों में मस्तिष्क पारगम्यता WT चूहों की तुलना में. गुर्दे पारगम्यता 2 समूहों के बीच एक ही श्रेणी में तथापि है. बेसल गुर्दे पारगम्यता बहुत अधिक है मस्तिष्क की तुलना में गुर्दे में fenestrated endothelium की वजह से उम्मीद है कि एक तंग बाधा फार्म नहीं है.

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Discussion

रक्त मस्तिष्क बाधा रोग मस्तिष्क संबंधी विकारों की एक संख्या के साथ जुड़ा हुआ है, प्राथमिक और माध्यमिक मस्तिष्क ट्यूमर या स्ट्रोक सहित. BBB टूटने अक्सर जीवन धमकी सीएनएस शोफ के साथ जुड़ा हुआ है । आणविक तंत्र की elucidation है कि BBB के उद्घाटन या बंद करने को ट्रिगर इसलिए स्नायविक विकारों में चिकित्सीय महत्व के है और सामांयतः शोधकर्ताओं द्वारा जांच की । हालांकि, तरीकों साहित्य में रिपोर्ट vivo में BBB पारगम्यता की जांच करने के लिए, अक्सर तकनीकी कठिनाइयों है कि प्रतिदीप्ति छवियों के थकाऊ और व्यक्तिपरक ठहराव पर निर्भर के साथ जुड़े रहे हैं17,18 , 19. इसके अलावा, कुछ तरीकों के पूरे मस्तिष्क प्रतिदीप्ति इमेजिंग कि ग़लत है के रूप में यह सतही मस्तिष्क वाहिकाओं कि एक तंग बाधा फार्म नहीं की पारगम्यता का अधिक संकेत है शामिल हैं । यहां तक कि जब ठहराव उद्देश्य मस्तिष्क ऊतक अवशोषण (जैसे इवांस ब्लू पारगम्यता मूल्यांकन) के आधार पर प्रदर्शन किया गया है जानवरों अक्सर महत्वपूर्ण रक्त अंश के कारण गलत व्याख्या करने के लिए अग्रणी perfused नहीं कर रहे हैं. मस्तिष्क वजन एक और चर है कि अक्सर पारगम्यता गणना में शामिल नहीं है, लेकिन सूजन संवहनी पारगम्यता के परिणामस्वरूप के रूप में होने की जरूरत है वजन बढ़ाने और शुद्ध पारगम्यता बदल सकते हैं. इसके अलावा, सेक्स और पशु के लिए पशु मस्तिष्क वजन रूपांतरों पारगम्यता मतभेद बादल कर सकते हैं । ऐसे 14सी सुक्रोज और [3H] inulin के रूप में रेडियोधर्मी अनुरेखक सफलतापूर्वक मस्तिष्क पारगम्यता सूचकांक के लिए आवेदन किया गया है, लेकिन आकार और प्रभारी आधारित पारगम्यता जांच के साथ साथ के रूप में विस्तृत श्रृंखला की पेशकश नहीं है फ्लोरोसेंट लेबल वाले अनुरेखकों20.

इसके बाद के संस्करण कारणों के लिए, हम एक तरीका है कि सरल, उद्देश्य और मात्रात्मक vivo में वीवो में रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता का अनुमान लगाने में फ्लोरोसेंट लेबल अनुरेखकों का उपयोग कर अपनाया है । Dextrans हाइड्रोफिलिक polysaccharides उनके मध्यम से उच्च आणविक वजन (3-200 केडी) की विशेषता है और संयुग्मित fluorophore के आधार पर आरोप लगाया या uncharged अणुओं के रूप में प्राप्त किया जा सकता है । Endothelial तंग जंक्शनों मुख्य रूप से claudins द्वारा गठित (1, 3, 5 और 12) और occludin, एक साथ paracellular आकार का निर्धारण और चार्ज ताकना अपने पहले selectivity पाश पर मौजूद अवशेषों द्वारा चार्ज extracellular (21में समीक्षित) । रक्त भर में पारगम्यता- vivo में मस्तिष्क बाधा भी glycocalyx और बेसल लेमिना, दो संरचनाओं कि BBB22,23के दोनों तरफ मौजूद हैं पर निर्भर है. चमकदार वर्तमान glycocalyx नकारात्मक आरोप लगाया oligosaccharides (हेपरिन सल्फेट) है कि यह भी एल्ब्युमिन जैसे रक्त जनित अणुओं के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करता है द्वारा गठित संरचना की तरह एक जेल है । glycocalyx मोटाई या संरचना में परिवर्तन भी संवहनी पारगम्यता परिवर्तन के साथ जुड़े रहे हैं के रूप में हम angiopoietin-2 में मनाया समारोह चूहों की तुलना में जंगली प्रकार चूहों10. दूसरी ओर तहखाने झिल्ली दोनों संवहनी तहखाने endothelial कोशिकाओं और pericytes द्वारा बनाई गई झिल्ली शामिल endothelial कोशिकाओं के abluminal ओर मौजूद है, जबकि parenchymal तहखाने झिल्ली या astrocytic तहखाने झिल्ली बनाया द्वारा astrocytes । इन तहखाने झिल्ली भी नकारात्मक आरोप लगाया है और इस तरह भी प्रभारी बाधाओं के रूप में सेवा करने की क्षमता है । इस संबंध में, संयुग्मित dextrans दोनों आकार और आरोप आधारित पारगम्यता की जांच का प्रस्ताव है । उदाहरण के लिए, टीएमआर-dextran 3 केडी anionic है, जबकि TXR-dextran 3 केडी तटस्थ है, एक संयुग्मित उच्च आणविक भार dextran के साथ इन खोजकर्ताओं में से एक के संयोजन ऐसे FITC dextran ७० केडी के रूप में एक ही मिश्रण में चूहों को इंजेक्शन, एक आकार आधारित पारगम्यता का आकलन कर सकता है । हम आगे फ्लोरोसेंट के lysine-fixable प्रकृति का लाभ लेने के dextrans लेबल को मानक इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला में पारगम्यता में क्षेत्रीय मतभेदों का पता लगाने । Dextrans भी आम तौर पर कम immunogenicity प्रदर्शन और इस तरह अच्छा अनुरेखकों के रूप में सेवा. लूसिफ़ेर पीला, cadaverine, fluorescein-5-thiosemicarbazide (FTSC), अंय खोजकर्ताओं कि कम आणविक भार रेंज (0.4-0.8 केडी) में है और fixable हैं ।

हमारे विधि में, अनुरेखकों perfusing चूहों द्वारा पीछा किया और गीले वजन और सीरम प्रतिदीप्ति के लिए सामान्यीकृत homogenates मस्तिष्क के प्रतिदीप्ति प्राप्त करने के बाद i. p मार्ग द्वारा इंजेक्शन थे. यह एक सरल अभी तक अत्यधिक मात्रात्मक और उद्देश्य विधि है के रूप में वहां वर्गों के कोई चयन/immunofluorecence विधि द्वारा ठहराव में के रूप में चित्र है कि क्लासिक का इस्तेमाल किया है । हम केवल एक hemi-पारगम्यता परख के लिए मस्तिष्क का उपयोग और एक ही जानवर में क्षेत्रीय मतभेद प्रदान sagittal वर्गों का विश्लेषण करके धुंधला इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए अन्य hemibrain का उपयोग. प्रत्येक hemi का उपयोग-अलग समवर्ती माप के लिए मस्तिष्क हमारे प्रोटोकॉल में मुख्य लाभ में से एक है । इसके अलावा, गुर्दे, जिगर, आदि जैसे अंय अंगों की पारगम्यता बेसल पारगम्यता इन अंगों में अधिक है के रूप में एक अच्छा आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । आदेश में 2 समूहों की तुलना करने के लिए, एक को पहली बार (है कि अनुरेखक इंजेक्शन प्राप्त नहीं था) autofluorescence दोनों समूहों में सभी जानवरों और सभी प्रकार के ऊतकों (गुर्दे, मस्तिष्क, और सीरम) प्रत्येक अनुरेखक के लिए और फिर सामान्यीकृत करने के लिए आगे बढ़ना 2 समूहों की तुलना गणना । पारगम्यता सूचकांक (PI) है कि सीरम प्रतिदीप्ति ऊतक वजन और सीरम मात्रा को सामान्यीकृत करने के लिए ऊतक के अनुपात के रूप में प्राप्त की है प्रस्तुत किया जाता है. हमारी गणना अनुरेखक पारगम्यता के लिए एक निरपेक्ष मूल्य उपज है कि प्रयोगों और ऊतक प्रकार के बीच की तुलना में किया जा सकता है. इन मूल्यों तथापि, आसानी से अनुपात या 2 समूहों के बीच प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जा रहा है की तुलना में हम भी पहले12किया जा सकता है । यह दोनों समूहों में प्रत्येक जानवर के pi नियंत्रण समूह में सभी जानवरों का मतलब pi के साथ विभाजित करके प्राप्त किया जा सकता है । यह नियंत्रण समूह PI के माध्यम से 1 अभी तक और प्रायोगिक समूह के लिए 1 का अर्थ नियंत्रण समूह से संबंधित है मान दे जानवरों के बीच त्रुटि रखते हुए ड्राइव होगा ।

i. p द्वारा अनुरेखकों के इंजेक्शन आसान है, लेकिन अधिक लागत के लिए i. v इंजेक्शन की तुलना में, अनुरेखक की राशि के रूप में वृद्धि की जरूरत है. हमारे डेटा (नहीं दिखाया गया है) इस संबंध में इंगित करता है कि लगभग 2-गुना उच्च राशि अनुरेखक में i. p इंजेक्शन की आवश्यकता है i. v की तुलना में समान सीरम प्रतिदीप्ति मान प्राप्त करने के लिए. इसके अलावा, संचलन के समय i. p मार्ग में अधिक है i. v की तुलना में रक्त प्रवाह में अनुरेखक अवशोषण के लिए उठाए गए समय के कारण. इस संबंध में, सीरम प्रतिदीप्ति मान पर 15 मिनट के बाद i. p इंजेक्शन 5 मिनट के लिए तुलनीय थे कम और मध्यम आणविक भार श्रेणी में अनुरेखकों के लिए के लिए i. v इंजेक्शन 0.4-4 केडी के बीच (डेटा नहीं दिखाया गया). हम एक छोटे संचलन समय सुझाव है क्योंकि paracellular पारगम्यता रैखिक है और अगर काफी ऊतक प्रतिदीप्ति एक छोटी संचलन समय (15 मिनट) के बाद पोस्ट छिड़काव का पता चला है, यह पहले से ही एक पारगम्यता phenotype इंगित करता है के रूप में हम में सूचना दी है हमारे पिछला प्रकाशन10,12,13,14. अभी तक एक ही समय में एक सामांय के लिए सीरम प्रतिदीप्ति प्राप्त कर सकता है । अब परिसंचरण समय पर, ऊतक निकासी काफी है, जो सीरम प्रतिदीप्ति काफी कम कर देता है और इस तरह पारगम्यता को प्रभावित कर सकता है के लिए सीरम सामान्यीकृत मूल्यों । जबकि आकार के संबंध में संचलन के समय/अनुरेखक के प्रभारी प्रत्येक परिदृश्य के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए है, हम प्रारंभिक बिंदु के रूप में एक छोटी परिसंचरण समय का सुझाव. यह भी ऐसे प्लाज्मा IgGs और फाइब्रिनोजेन के रूप में उच्च आणविक वजन solutes के लिए लागू होता है (150-400 केडी) जिनकी पारगम्यता विशेषताओं निष्क्रिय dextran अनुरेखक उनके बहुत बड़े आकार और सेलुलर रिसेप्टर्स के साथ विशिष्ट बातचीत के कारण के विपरीत कर रहे हैं जैसे एफसी रिसेप्टर्स कि उनके आधे जीवन को24बदल जाते हैं । दूसरी ओर Dextrans endothelial स्तर पर किसी भी विशिष्ट परिवहन प्रणाली नहीं है25 और के रूप में मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं pinocytosis plasmalemma पुटिका जुड़े प्रोटीन के बहुत कम स्तर के कारण महत्वपूर्ण स्तर तक नहीं गुजरना (PLVAP)26 dextrans के परिवहन का मुख्य मार्ग paracellular है । हम इस तरह के ट्रांसजेनिक चूहों में जंगली प्रकार littermates की तुलना में पारगम्यता के रूप में कई परिदृश्यों में सफलतापूर्वक उपरोक्त विधि लागू किया गया है और यह भी चिकित्सकीय हस्तक्षेप के बाद जंगली प्रकार के चूहों में पारगम्यता परिवर्तन का आकलन10, 12 , 13 , 14. संक्षेप में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के साथ संयुक्त, पारगम्यता परख यहां वर्णित एक सरल और एक मजबूत तरीका है कि vivo में चूहों की पारगम्यता का आकलन करने के लिए भी अन्य छोटे जानवरों के लिए लागू किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक Sphingonet इस काम के समर्थन के लिए Leduq फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित कंसोर्टियम स्वीकार करना चाहते हैं । यह काम भी सहयोगात्मक अनुसंधान केंद्र द्वारा समर्थित किया गया "संवहनी विभेद और remodeling" (सीआरसी/Transregio23, परियोजना C1) और द्वारा 7. एफ पी, COFUND, गेटे इंटरनेशनल Postdoc कार्यक्रम जाना-इन, No. २९१७७६ धन । हम आगे चूहों हैंडलिंग और genotyping के साथ उसे तकनीकी सहायता के लिए कैथलीन Sommer स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD Thermosfisher D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD Thermosfisher D3306
Ketamine (Ketavet) Zoetis
Xylazine (Rompun) Bayer
0.9% Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS Gibco 10010-015
Tissue-tek O.C.T compound Sakura Finetek 4583
37% Formaldhehyde solution Sigma 252549-1L prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V Roth 8076.3
Triton X-100 Sigma T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 BD Pharmingen 553370
goat anti rat alexa 568 Molecular Probes A-11077
goat anti rat alexa 488 Molecular Probes A-11006
DAPI Molecular Probes D1306
Aqua polymount Polyscience Inc 18606
21-gauge butterfly needle BD 387455
serum collection tube Sarstedt 41.1500.005
2mL eppendorf tubes Sarstedt 72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers Kimberley-Clark Professional 05511
384-well black plate Greiner 781086
slides superfrost plus Thermoscientific J1800AMNZ
PTFE pestle Wheaton 358029
electric overhead stirrer VWR VWR VOS 14
plate reader Tecan Infinite M200
Cryostat Microm GmbH HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System Nikon
peristaltic perfusion system BVK Ismatec
microcentrifuge eppendorf 5415R

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References

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Devraj, K., Guérit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. J. Vis. Exp. (132), e57038, doi:10.3791/57038 (2018).

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