Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Published: February 26, 2018 doi: 10.3791/57038
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1Institute of Neurology (Edinger Institute), Goethe University Hospital, 2Pharmazentrum Frankfurt, Institute for General Pharmacology and Toxicology, Goethe University Hospital

Summary

Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.

Abstract

Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine spezialisierte Barriere, die das Gehirn Mikroumgebung von Giftstoffen und Krankheitserregern in der Zirkulation schützt und pflegt Gehirn Homöostase. Die wichtigsten Sehenswürdigkeiten der Barriere sind Endothelzellen der Gehirn-Kapillaren ergibt sich deren Barrierefunktion aus enge interzelluläre Verbindungen und Efflux-Transporter über die Plasmamembran zum Ausdruck gebracht. Diese Funktion wird durch Perizyten und Astrozyten, die zusammen die neurovaskuläre Einheit (NVU bilden) geregelt. Verschiedene neurologische Erkrankungen wie Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit (AD), Hirntumoren eine Beeinträchtigung der BBB Funktion zugeordnet sind. Bewertung der BBB Permeabilität ist daher entscheidend bei der Bewertung der Schwere der neurologischen Erkrankung und den Erfolg der Behandlungsstrategien eingesetzt.

Wir präsentieren hier eine einfache, aber robuste Durchlässigkeit Assay, die auf mehrere Maus erfolgreich angewendet wurden sowohl genetische als auch experimentelle Modelle. Die Methode ist höchst quantitative und Objektive im Vergleich zu den Tracer Fluoreszenzanalyse Mikroskopie, die häufig angewendet wird. Bei dieser Methode werden Mäusen intraperitoneal mit einer Mischung aus wässrigen inert Fluoreszenz Tracer gefolgt von betäuben die Mäuse injiziert. Kardiale Perfusion der Tiere erfolgt vor der Ernte, Gehirn, Nieren oder anderen Organen. Organe sind homogenisiert und zentrifugiert, gefolgt von Fluoreszenzmessung von überstand. Blut aus der Herzpunktion kurz vor Perfusion dient zur Normalisierung soll das vaskuläre Fach. Die Gewebe-Fluoreszenz ist normiert auf die nassen Gewicht und Serum Fluoreszenz zu einer quantitativen Tracer Durchlässigkeit Index. Für zusätzliche Bestätigung sowohl der kontralateralen Hemi-Hirn für Immunohistochemistry bewahrt Tracer Fluoreszenz Visualisierung Zwecke einsetzbar.

Introduction

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) besteht aus der mikrovaskulären Endothelzellen (ECs) unterstützt durch eng Perizyten (PCs), sind Ensheathed in der Basallamina und Astrozyten (ACs), die die Basalmembran mit den End-Füßen1 umhüllen ,2. ECs mit mehreren Zelltypen, die unterstützen und regulieren die Barrierefunktion, in erster Linie ACs und PCs interagieren und auch Neuronen und Mikroglia, alle zusammen die neurovaskuläre Einheit (NVU bilden). Die NVU ist entscheidend für die Funktion der BBB, was den Transport von Blut übertragene Giftstoffe und Erreger in das Gehirn gelangen begrenzt. Diese Funktion ist ein Ergebnis der engen Kreuzung Moleküle wie occludin, Claudin-5, Zonula Occludens-1, die zwischen ECs und auch durch die Einwirkung von Transportern wie p-Glykoprotein (P-Gp), dass Fluth Moleküle, die das Endothel geben Sie wieder anwesend sind das Gefäß Lumen1,2,3. Die BBB kann jedoch für den Transport von wesentlichen Moleküle wie Nährstoffe (Glukose, Aminosäuren, Eisen) durch spezifische Transporter zum Ausdruck auf den EC Plasmamembranen1,2,3. Die EG-Ebene ist in Bezug auf die Verteilung der verschiedenen Transporter zwischen der luminalen (Blut-Einfassung) und abluminalen (Gehirn gerichteten Membranen), um die spezifischen und vektorielle Transport Funktion4,5 ermöglichen stark polarisiert. . Während die BBB Schutzmaßnahmen in Bezug auf die streng regulieren das CNS-Milieu ist, ist es eine große Herausforderung für CNS Drug-Delivery bei Erkrankungen wie Parkinson mit einem funktionalen BBB. Auch bei neurologischen Erkrankungen mit BBB-Dysfunktion kann nicht davon auszugehen, dass die Gehirn-Drug-Delivery erhöht wird, zumal die Barriere Dysfunktion Schaden an den spezifischen Transporter Zielen wie zum Beispiel bei Alzheimer-Krankheit (AD) beinhalten könnte. N. Chr. mehrere Amyloid Beta-Transporter wie LRP1, RAGE, P-Gp sind bekanntermaßen Dysregulated und somit gezielt diese Transporter möglicherweise vergeblich6,7,8. Die BBB ist in verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie Schlaganfall, AD, Meningitis, Multiple Sklerose, und im Gehirn Tumoren9,10,11beeinträchtigt. Die Wiederherstellung der Barrierefunktion ist ein wesentlicher Bestandteil der therapeutischen Strategie und damit ihre Beurteilung ist entscheidend.

In dieser Arbeit haben wir beschrieben, einen objektiven und quantitativen Protokoll für Durchlässigkeit Assay bei Nagetieren, dass wir erfolgreich, mehrere Mauslinien beide transgene und experimentelle Krankheit Modelle10,12,13 angewendet ,14. Die Methode basiert auf einer einfachen intraperitoneale Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion der Mäuse, die Tracer aus dem vaskulären Fach zu entfernen. Gehirn und andere Organe sind gesammelte Post Perfusion und Durchlässigkeit anhand objektiver und absolute Permeabilität Index anhand der Fluoreszenz-Messungen der Gewebe Homogenates in einem Teller-Reader. Alle rohen Fluoreszenz-Werte werden korrigiert, für den Hintergrund mit Gewebe Homogenates oder Serum von Schein-Tiere, die keiner Tracer erhalten. Reichliche Normierungen sind bei Serum, Serum Fluoreszenz, und das Gewicht des Gewebes, so nachgiebig Durchlässigkeit Index, absoluter und vergleichbare zwischen Experimenten und Gewebetypen ist, im Preis inbegriffen. Für Vergleich zwischen Gruppen zu erleichtern können die absolute Permeabilität Indexwerte leicht Verhältnisse umgewandelt werden, wie wir zuvor12durchgeführt hatte. Gleichzeitig könnten gespeicherte Hemi-Gehirn und Niere für die Tracer Visualisierung durch Fluoreszenz-Mikroskopie10genutzt werden. Die klassischen Fluoreszenzmikroskopie kann wichtige regionale Unterschied in der Durchlässigkeit zu erhalten, wenn auch umständlich durch subjektive Auswahl von Gewebeschnitten und Bilder für eine semi-quantitative Analyse bilden. Die einzelnen Schritte werden im Protokoll vorgestellt und Noten werden bei Bedarf hinzugefügt. Dies bietet die notwendige Informationen für die Durchführung von in Vivo Durchlässigkeit Assay erfolgreich bei Mäusen, die auf andere Kleintiere skaliert werden können. Der Test kann auf viele Arten von Tracern angewendet werden ermöglicht die Ladung und die Größe Durchlässigkeit Bewertung durch eine Kombination von Tracern mit unterschiedlichen Fluoreszenz Spektren gestützt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Tiere wurden mit größter Sorgfalt, die Minimierung von Schmerzen oder Beschwerden während des Verfahrens behandelt. Dieses Verfahren folgt den Richtlinien der Tierbetreuung unserer Institution und die Lokalkomitees (Regierungspräsidium Darmstadt, Zulassungsnummer FK/1044) genehmigt wurde.

Abbildung 1zeigt eine schematische Darstellung der Arbeitsschritte für in Vivo Durchlässigkeit Assay bei Mäusen. Die Details der einzelnen Schritte werden im folgenden beschrieben.

1. Umgang mit Tier

  1. Erstellung und Verwaltung von Tracer und Anästhetika
    1. Gewebe einbetten mindestens einen Tag vor der Durchlässigkeit Assay bereiten Sie beschrifteten Rohre und Formen vor. Pflegen Sie sterile Bedingungen im gesamten Protokoll durch die Arbeit unter sauberen Abzug und Werkzeugen mit 80 % igem Ethanol gereinigt. Verwenden Sie männlich oder weiblich-Wildtyp (WT) oder Angiopoietin-2 (Ang-2) Gain of Function (GOF) CD1 Mäuse in der reife Erwachsene Altersgruppe von 3 bis 6 Monaten für das aktuelle Protokoll. Durchführen Sie Genotypisierung der Mäuse bereits 10beschrieben.
      Hinweis: 80 % Alkohol führt nicht sterilen Instrumenten aber minimiert Kontamination der Proben vorbereitet.
    2. Verdünnen Sie der Tracer in sterilen PBS in 2 mM Aktien zu und speichern Sie die Aliquote lichtgeschützt bei-20 ° C.
    3. Tracer wie (Tetramethyl Rhodamin) TMR und wählen (Fluorescein erfolgt) FITC mit unterschiedlichen Anregung/Emissionsspektren und das Lysin feststellbar, wodurch minimale Interferenzen zwischen der Farbstoffe durch Fluoreszenz-Mikroskopie (mit der TMR oder FITC filter bzw.) und von Fluorometry in einem Teller-Reader für die Durchlässigkeit Assay.
      Hinweis: TMR Dextran 3 kD FITC-Dextran 3 kD in der Studie verwendeten beide Lysin fixierbar und sind daher auch genutzt werden für immunhistochemische Analyse nach Fixierung mit Aldehyden um regionale Unterschiede zu untersuchen.
    4. Behandeln Sie alle Tiere mit größter Sorgfalt nach den Richtlinien der institutionelle Pflege. Injizieren Sie intraperitoneal jede Maus mit 100 µL Tracer-Lösung, die bis zu 200 µL erhöht werden kann, wenn eine zusätzliche Tracer kombiniert wird mit 100 µL jeder Tracer in 1:1 Mischung10,13. Mindestens ein Tier mit PBS anstelle der Tracer als Schein-Steuerung für Autofluoreszenz Hintergrundabzug dienen allein zu injizieren.
    5. 5 min nach der Injektion des Tracers betäuben das Tier mit einer IP-Injektion von Ketamin und Xylazin (100 mg und 5 – 10 mg in 0,9 % Kochsalzlösung pro kg Körpergewicht Gewicht bzw. 150 µL des Cocktails pro 25 g-Maus).
      Hinweis: Vet Salbe wurde nicht angewendet auf Augen während des Verfahrens als der Zeitraum zwischen tierischen Anästhesie und Perfusion/Opfer kurz war (10 Minuten) wo Trocknung der Augen war nicht zu beobachten.
  2. Sammlung und Herz-Kreislauf Durchblutung
    1. Bereiten Sie die Tiere für kardiale Perfusion 10 min nach der Narkose Verabreichung. Keine Pfote zucken Antwort zu überprüfen, um sicherzustellen, dass das Tier eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht.
    2. Die Tiere auf den Rücken legen und 80 % igem Ethanol auf die Haut der Bauchbereich auftragen. Mit einer kleinen Schere, eröffnen Sie die Bauchdecke mit einem kleinen Schnitt (2 cm) unterhalb des Brustkorbs. Trennen Sie Leber von der Membran zu und schneiden Sie dann langsam durch das Diaphragma hindurch Freilegung der pleural Raum 15.
    3. Schneiden Sie den Brustkorb bilateral und beheben Sie geschnittenen Brustbein zu, um die linke Herzkammer freizulegen. Nadel 21-Gauge Schmetterling verbunden zu einem peristaltischen Perfusion System in den hinteren des linken Ventrikels.
    4. Punktion der rechten Vorhof und schnell (innerhalb von 10 s) 200-300 µL Blut in die Brusthöhle mit 1 mL Pipettenspitzen (mit Ende Cut-off) veröffentlicht im Serum Röhrchen sammeln und speichern es auf dem Eis.
      Hinweis: Dieses Verfahren Perfusion ist nicht überleben.
    5. Sobald das Blut gesammelt wird, schalten Sie die Perfusion System (10-12 u/min, 5 mL/min) und durchspülen der Tier 3 min mit warmen (RT) 1 X PBS (frei von Ca2 + /Mg2 + -Ionen).
      Hinweis:PBS mit Ca 2 +/Mg2 + -Ionen können für bessere Herztätigkeit während der Perfusion genutzt werden. Der Gesamtbetrag der PBS zur Perfusion liegt im Bereich von 15-20 mL.
    6. Perfusion Qualität zu bewerten, mit der Feststellung, der Farbe der Leber, Nieren, die nach Perfusion weiß/blass erscheinen.
      Hinweis: Niere oder Leber Perfusion nicht notwendigerweise Brain Perfusion als die Arterien (a. carotis/Wirbelkörper) zu erreichen, die das Gehirn von Aorta während der Vorbereitung in Schritt 3 vor allem während der atrialen Punktion gerissen bekommen könnte.

(2) Gewebe Verarbeitung

  1. Orgel-Datenerhebung und-Speicherung
    1. Bestätigen Sie am Ende der Durchblutung Tod des Tieres durch zervikale Dislokation und Ernte Gehirn und Nieren. Überprüfen Sie Gehirn Durchblutung durch die Farbe des Gehirns (ohne sichtbare Blut in Blutgefäßen der Hirnhäute), um die Tiere von der Durchlässigkeit Analyse auszuschließen, wenn Perfusion Qualität nicht gut ist. Trennen Sie das Gehirn in 2 Hemibrains mit einem Skalpell (Abbildung 1).
    2. Mit einem Skalpell ein Hemibrain frei von olfaktorischen Lappen und Kleinhirn zu sezieren Sie und übertragen Sie der Hemicerebrum auf einen 2-mL-Tube. Speichern Sie Hemi-Kleinhirn in eine Hilfsrohr, ggf. für zerebelläre Durchlässigkeit Bewertung.
    3. Übertragen Sie eine einzelne Niere auf ein weiteres 2-mL-Tube. Speichern Sie die Proben sofort auf Trockeneis.
    4. Betten Sie die verbleibende Niere und Hemi-Gehirn (bestehend aus dem Kleinhirn und olfaktorischen Lappen) in Tissue-Tek optimale Arbeitstemperatur (O.C.T) Verbindung auf Trockeneis nativ.
    5. Zentrifugieren Sie schlussendlich die Blutproben auf Eis im Serum Röhrchen bei 10 000 g, 10 min bei 4 ° c gelagert Übertragen Sie Serum Überstände auf 1,5 mL Röhrchen und legen Sie sie in der Trockeneis-Container.
    6. Übertragen Sie alle Proben auf Trockeneis-80 ° C Gefrierschrank bis Weiterverarbeitung gesammelt.
      Hinweis: Es ist wichtig, die Proben vor der Homogenisierung Schritte als Homogenisierung Effizienzsteigerungen nach Einfrieren als Einfrieren Auftauen.
  2. Homogenisierung und Zentrifugation
    1. Tauen Sie die Hemi-Großhirn und Niere Proben nach unten bei-80 ° C eingefroren auf Eis auf und wiegen Sie die Rohre mit den Organen. Subtrahieren Sie von diesen Gewichten den Mittelwert aus mehreren leere Rohre (ca. 20), die Gewebe zu bekommen. Fügen Sie 300 µL und 200 µL der Kälte 1 X PBS an den Rohren mit Niere und Hemi-Großhirn, beziehungsweise.
      Hinweis: für geringere Mengen von Gewebe (wie Hemi-Kleinhirn, unter 100 mg) wiegen die einzelnen Rohre wird empfohlen.
    2. Jede Probe in der ursprünglichen Eppendorf Tube zu homogenisieren, Polytetrafluorethylen (PTFE) zerstoßen eine elektrische Überkopf-Rührer (1, 000 u/min) mit ca. 15 Hübe ausführen befestigt (1 Hub = 1 nach oben und 1 unten). Spülen Sie der Stößel mit PBS zwischen Proben und trocknen Sie, bevor Sie fortfahren, die nächste Probe.
      Hinweis: Die Verwendung von Reinigungsmitteln während der Homogenisierung konnte aufgrund möglicher Interferenzen mit Fluorometry vermieden werden. Intrazelluläre Tracer ist jedoch auch in diesem Protokoll erkannt, da das Gewebe gründlich homogenisiert ist, das ist effizienter, nachdem eine Runde Einfrieren Auftauen.
    3. Speichern Sie die homogenisierten Proben auf Eis geschützt vor Licht und Zentrifuge alle zusammen am Ende 15.000 g, 20 min, 4 ° C in einer Tischplatte Zentrifuge. Übertragen Sie Überstände auf eine neue 1,5 mL-Tuben auf Eis für sofortige Fluorometry oder bei-80 ° C, später analysiert werden.
  3. Fluoreszenzmessung und Quantifizierung
    1. Wenn am Ende des vorherigen Schrittes eingefroren, auf Eis Auftauen der Überstand und Serum Gewebeproben bei-80 ° c schützt sie vor Licht mit der Folie gelagert.
    2. Pipette 50 µL verdünnter Serum (30 µL 1 X PBS + 20 µL Serum) oder Gewebe Überstände (wie) in eine schwarze 384-Well-Platte. Gehören Sie mindestens eine Probe von Sham Tier für Serum und Gewebe Überstände um sicherzustellen korrekte Hintergrundabzug dieses Gewebe Homogenat Hintergrund normalerweise höher als die von PBS als das Verdünnungsmittel verwendet wird.
      Hinweis: Durchschnittlich 3 Schein Tiere Autofluoreszenz einsetzbar obwohl eine sehr wenig Variabilität in Sham Autofluoreszenz Werte (Daten nicht gezeigt) beobachtet wurde. Die Menge des Serums verwendet kann reduziert werden, durch das verdünnen es mit PBS, wodurch auch der Signal-Rausch-Verhältnis für Proben mit geringer Fluoreszenz wie die Gehirn-Muster erhöht werden kann. Bis zu 10 µL Serum wurde getestet mit 40 µL PBS verdünnen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in die Brunnen vorhanden sind.
    3. Stecken Sie die schwarze 384-Well Platte in der Platte Leser und öffnen Sie ein neues Skript Fluoreszenzmessung auswählen.
    4. Stellen Sie Gain auf optimale und Erregung / (nm) Emissionswerte von 550/580 oder 490/520 für TMR oder FITC Dyee bzw. und starten Sie die Messung um die rohen Fluoreszenz-Einheiten (Verwendungsempfehlungen) zu erhalten.
    5. Verwenden Sie roh Fluoreszenz-Einheiten (Verwendungsempfehlungen) aus dem Teller-Leser, um den Durchlässigkeit-Index (PI) nach Abzug der entsprechenden Schein-Werte zu berechnen.
      1. * Durchlässigkeit Index (mL/g) = (Gewebe Verwendungsempfehlungen/g Gewebe Gewicht) / (Serum Verwendungsempfehlungen/mL Serum)
    6. Beispielrechnung für Gehirn-Durchlässigkeit-Index (PI) des Tieres GOF1 (Tabelle 1):
      1. GOF1 des Gehirns Verwendungsempfehlungen - SHAM Gehirn Verwendungsempfehlungen = 154-22,5 = 131,5
      2. GOF1 Serum Verwendungsempfehlungen - SHAM Serum Verwendungsempfehlungen = 38305-27 = 38278
      3. Gehirn-Gewicht (g) = 0.195
      4. Serum-Volumen (ml) = 0,02
      5. Gehirn-Durchlässigkeit Index (10-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
        Hinweis: Die Durchlässigkeit Index Berechnungen liefern Werte, die absolute und zwischen Experimenten und Gewebetypen vergleichbar sind. Diese können jedoch als Kennzahlen für einfachen Vergleich zwischen 2 Gruppen 12präsentiert. Dies kann erreicht werden, indem man die PI jedes Tieres in beiden Gruppen mit der mittleren PI der Kontrollgruppe, fahren die Mittel der Kontrolle-Gruppe durch 1 noch halten die Inter-Tier-Variation in der Kontrollgruppe. Diese Transformation stellt Werte für die experimentelle Gruppe (oder Gruppen) im Vergleich zu der Kontrollgruppe auf 1 gesetzt.
  4. Immunfluoreszenz-Visualisierung von tracer
    1. Schneiden Sie die Niere/Hemi-Gehirn-Blöcke 10 µm Abschnitte auf einem Kryostat auf-20 ° C eingestellt und übertragen Sie die Abschnitte auf Folien platziert bei Raumtemperatur nativ in Tissue-Tek Verbindung (O.C.T) (Schritt 2.1) integriert. Sobald die Abschnitte (ca. 30 min) getrocknet werden, übertragen Sie Folien auf-80 ° C Gefrierschrank bis zur Verwendung.
    2. Am Tag der Färbung tauen Sie die Folien bei 37 ° C für 10 min auf, und befestigen Sie die Abschnitte mit 4 % Paraformaladehyde (PFA) für 10 min bei Raumtemperatur, gefolgt von schnellen waschen mit PBS-Puffer.
    3. Inkubieren Sie in den Abschnitten Permeabilisierung/blockieren Puffer gemacht von sterilen PBS mit 1 % BSA und 0,5 % Triton x-100 pH 7,5 für 1 h bei Raumtemperatur.
    4. Folien für 1,5 h bei Raumtemperatur mit CD31 Primärantikörper inkubieren (0,5 mg/ml, Klonen MEC 13,3), in 1: 100 im Puffer mit sterilen PBS, 0,5 % BSA, 0,25 % Triton x-100 (pH 7,2) gefolgt von drei 5 min waschen in PBS verdünnt.
    5. Führen Sie Sekundärantikörper Inkubation in der oben genannten Puffer für 1 h bei Raumtemperatur mit artspezifischen Eindringmittel beschriftet Antikörper verdünnt 1: 500 (2 mg/mL). Für CD31 Ziege Anti-Ratte Alexa 568 oder Alexa 488 bei einer Verdünnung von 1: 500 einsetzbar. DAPI gehören (300 µM) in der Sekundärantikörper mischen (1:1, 000 Verdünnung aus dem Bestand) um für die Kerne färben.
    6. Montieren Sie die gefärbten Abschnitte mit Aqua Polymount und lasse es über Nacht für die Polymerisation bei Raumtemperatur in Dunkelheit.
    7. Erwerben Sie Bilder mit eine spektrale Bildgebung konfokale Laser-scanning Mikroskopsystem. Analysieren von Bildern durch NIS-Elemente-Software (Version 4.3). Software wie Photoshop kann zur Erzeugung von Montage Zahlen verwendet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wir haben kürzlich gezeigt, dass Angiopoietin-2 (Ang-2) Gain of Function (GOF) Mäuse höhere Gehirn vaskulären Permeabilität als Kontroll-Mäusen unter gesunden Bedingungen10 haben. Bei Schlaganfall-induzierte Mäusen war es auch zeigt, dass die GOF-Mäuse Infarkt größer und größere Durchlässigkeit als Kontrolle Wurfgeschwistern hatten. Diese Ergebnisse zeigen eine kritische Rolle von Ang-2 in Durchlässigkeit an der BBB. Das Protokoll daher verwendet die GOF-Mäuse und verglichen sie um Wurfgeschwistern um zu beschreiben, die in Vivo Durchlässigkeit Assay zu steuern. Aber diese Methode kann angewendet werden, um jede Krankheit Modell, transgenen Mausmodell oder medikamentöse Behandlungen, die die BBB Permeabilität zu verändern, wie wir 10,11,12,13 zuvor.

Eine kurze Zirkulation Zeit (15 min) für Durchlässigkeit Analyse wird vorgeschlagen, wie längere Zirkulation Zeiten zu eine größere Bodenfreiheit aus dem vaskulären Fach führt, die auch in früheren Studien16beobachtet wurde. Die Clearance von 3 kD FITC-Dextran um 2 h ()Abbildung 2 C, D) ist viel größer als 15 min. ()Abbildung 2 A, B) in der Niere sowie im Hirngewebe. Im Gehirn gibt es sehr wenig extravascular Tracer durch intakte Blut - Hirn-Schranke in diesen Erwachsenen WT-Mäusen (Abbildung B, D). Anwendung dieser Methode, die Durchlässigkeit der Tracer in Ang-2 GOF mit WT Wurfgeschwistern verglichen. Die Ergebnisse in Tabellenform (Tabelle 1) zeigen höhere Tracer Ansammlung in den Gehirnen von GOF Mäuse im Vergleich zu WT Mäuse. Die Niere Fluoreszenz wird jedoch nicht zwischen diesen Gruppen verändert. Immunfluoreszenz Bilder bestätigen die Zunahme extravascular Tracer bei GOF Mäusen ()Abbildung 3 B, D) im Vergleich zu WT Mäuse ()Abbildung 3 A, C) wo die Tracer auf vaskuläre Fach beschränkt ist.

Figure 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung des Workflows für die in Vivo Durchlässigkeit-Assay mit fluoreszierenden Tracer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Tracer Abfertigung an kurzen und langen Zirkulation Zeiten. Um die Tracer Zirkulation Zeit für die Durchlässigkeit Assay, einer kurzen Umlauf-Zeit von 15 min zu schaffen wurde (A, B) zu einer langen Umlauf 2 h (C, D) Post-Tracer-Injektion verglichen. Die länger der Zirkulation von 2 h führte zu sehr geringe Mengen an Tracer Akkumulation in der Niere (C) wo die basalen Durchlässigkeit hoch ist im Vergleich zu eine kurze 15 Minuten Zirkulation Zeit (A) möglicherweise durch eine sehr hohe Bodenfreiheit der FITC-Dextran-3 kD (grün (Kanal) aus dem Kreislauf Fach. Dieser Effekt war sogar noch dramatischer im Gehirn zeichnet sich durch enge Blut - Hirn-Schranke (B, D). CD31 Färbung (Rot-Kanal) bestätigte das Vorhandensein der Schiffe in der Region von Interesse. Repräsentative Bilder von einem einzigen Tier aus 2 Wildtyp Erwachsener CD1 Mäuse injiziert mit dem Tracer für jeden Zeitpunkt und Tiere geopfert wurden, ohne Vorrichtung, um den intravaskulären Tracer zu visualisieren. Die Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Immunfluoreszenz-Färbung für Tracer Durchlässigkeit Gehirnveränderungen bei GOF Mäusen beurteilen. Erhöhte Durchlässigkeit der 3 kD TMR-Dextran Tracer (in rot) in Ang-2 GOF Mäuse (B, D) im Vergleich zu WT Wurfgeschwistern (A, C) in der Region der Hirnrinde visualisiert werden kann. Bei WT Tieren ist die Tracer beschränkt sich auf die Gefäße (A, C), während extravascular Tracer bei GOF Mäusen (weisse Pfeile B, D) beobachtet werden kann. Färbung für CD31 (in blau) in den fusionierten Bildern bestätigt (A-D) das Vorhandensein von Schiffen. Abbildung zeigt repräsentative Bilder von 2 WT und 2 GOF Mäuse injiziert mit Tracer i.p und 15 min Post Injektion mit Perfusion geopfert. Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tier-ID Gehirn-Gewicht (g) Niere-Gewicht (g) Serum-Volumen (mL) Serum RFU Niere RFU Gehirn RFU Perm. Index (10 ^-3 ml/g)
Niere Gehirn
GOF 1 0.195 0.252 0.02 38305 31051 154 64,4 0.352
GOF 2 0,177 0.249 0.02 42001 31411 126 60 0.278
WT 1 0,167 0.301 0.02 40904 31591 64 51,2 0,122
WT 2 0.146 0.294 0.02 39502 31768 70 54,8 0,164
SHAM 0,155 0,27 0.02 27 36 22.5 NA NA

Tabelle 1. Gewebe Durchlässigkeit Berechnungen. Permeabilität-Index, die Berechnungen für Ang-2 Gain of Function (GOF) und Wildtyp Wurfgeschwistern (WT) Mäuse zeigen deutlich größer (ca. 2-fach) brain Durchlässigkeit bei GOF Mäusen im Vergleich zum WT-Mäuse. Die Niere-Durchlässigkeit ist jedoch in der Größenordnung zwischen den 2 Gruppen. Die basalen Niere Durchlässigkeit ist viel größer im Vergleich zum Gehirn erwartungsgemäß aufgrund gefensterten Endothels in Niere, die keine enge Barriere bilden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Funktionsstörung der Blut - Hirn-Schranke ist verbunden mit einer Reihe von neurologischen Erkrankungen, einschließlich primäre und sekundäre Hirntumoren oder Schlaganfall. BBB Aufschlüsselung ist häufig verbunden mit lebensbedrohlichen CNS Ödem. Daher ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die die Öffnung auslösen oder Schließung der BBB therapeutische Bedeutung bei neurologischen Erkrankungen und häufig von Forschern untersucht. BBB Permeabilität in Vivo in der Literatur beschrieben sind Methoden zu untersuchen, oft verbunden mit technischen Schwierigkeiten, die davon, mühsam und subjektive Quantifizierung der Fluoreszenz Bilder17,18 abhängen , 19. Darüber hinaus sind einige der Methoden ganze Gehirn Fluoreszenz-Bildgebung, die trügerisch, als es mehr Durchlässigkeit des oberflächlichen Gehirngefäße bezeichnend ist, die keine enge Barriere bilden. Auch wenn Quantifizierung durchgeführt wurde basierend auf der objektiven Gehirn Gewebe Extinktion (z. B. Evans blau Durchlässigkeit Assessment) die Tiere oft nicht durchblutet werden, führt zu fehlerhaften Auslegung aufgrund der erheblichen Blut Bruchteil. Gehirn wiegt eine andere Variable, die ist oft nicht im Durchlässigkeit Berechnungen enthalten, sondern muss sein wie Ödeme infolge vaskulären Permeabilität kann das Gewicht erhöhen und verändern die net Durchlässigkeit. Darüber hinaus können Sex und Gehirn von Tier zu Tier Gewicht Variationen Durchlässigkeit Unterschiede Wolke. Radioaktiver Tracer wie 14C Saccharose und [3 H] Inulin wurde erfolgreich beantragt haben Gehirn Durchlässigkeit Index aber bieten die breite Palette von Größe und Ladung Durchlässigkeit Untersuchung als Eindringmittel markierte Tracer20Basis.

Aus den genannten Gründen haben wir eine Methode, die einfach, objektiven und quantitativen bei der Abschätzung der Blut - Hirn-Schranke Permeabilität in Vivo in Mäusen mit Gewebekulturen beschrifteten Taster ist angenommen. Dextrans sind hydrophil Polysaccharide zeichnet sich durch ihre Moderate bis hohe Molekulargewicht (3-200 kD) und erhalten Sie als geladenen oder ungeladenen Molekülen aufgrund konjugierte Fluorophor. Endothelialen tight Junctions aus hauptsächlich Adhäsionsproteine (1, 3, 5 und 12) und occludin, zusammen die parazellulär Größe bestimmen und berechnen Selektivität durch die Ladung Pore Rückstände auf ihren ersten extrazellulären Schleife (rezensiert in21) vorhanden. Durchlässigkeit in Blut - Hirn-Schranke in Vivo ist auch abhängig von der Glycocalyx und Basallamina, zwei Strukturen, die auf beiden Seiten der BBB22,23vorhanden sind. Luminally vorliegenden Glycocalyx ist ein Gel wie Struktur von negativ geladenen Oligosaccharide (Heparin Sulfate) gebildet, das auch als ein Hindernis für Blut übertragbare Makromoleküle wie Albumin dient. Änderungen der Glycocalyx Dicke und Zusammensetzung sind auch mit vaskulären Permeabilität Veränderungen verbunden, wie wir Angiopoietin-2 Gain Funktion Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen10beobachtet. Die Basalmembran ist auf der anderen Seite auf der abluminalen Seite der Endothelzellen bestehend aus sowohl der vaskulären Basalmembran, hergestellt von Endothelzellen und Perizyten parenchymatösen Basalmembran oder astrocytic Basalmembran von Astrozyten. Diese Keller-Membranen sind auch negativ geladen und haben daher auch als kostenlos Barrieren dienen. In dieser Hinsicht bieten konjugierte Dextrans Untersuchung von Größe und Ladung-basierte Durchlässigkeit. TMR-Dextran 3 kD ist z. B. anionischen während TXR-Dextran 3 kD neutral, ist die Kombination eines diese Tracer mit konjugierten hohem Molekulargewicht Dextran wie FITC-Dextran 70 kD in der gleichen Mischung injiziert, die Mäuse, man könnte die Größe-basierte Durchlässigkeit beurteilen. Weiter nutzen wir die Lysin-fixierbar Natur der Leuchtstofflampen-mit der Bezeichnung Dextrans, die regionale Unterschiede in der Durchlässigkeit in standard Immunfluoreszenz-Färbung zu erkunden. Dextrans auch in der Regel weisen niedrige Immunogenität und dienen damit als gute Tracer. Luzifer gelb, Cadaverin, Fluorescein-5-Thiosemicarbazide (FTSC), sind unter anderen Tracer, die im Bereich von niedermolekularen sind (0,4-0,8 kD) und reparierbar sind.

In unserer Methode der Tracer wurden durch IP Route gefolgt von Vorrichtung die Mäuse injiziert und erhalten die Fluoreszenz des Gehirns Homogenates normiert auf das Frischgewicht und die Serum-Fluoreszenz. Dies ist eine einfache, aber höchst quantitative und objektive Methode, da gibt es keine Auswahl der Abschnitte/Bilder wie bei der Quantifizierung von Immunfluoreszenztest Methode, klassisch. Wir nutzen nur eine Hemi-Hirn für die Durchlässigkeit Assay und nutzen Sie die anderen Hemibrain für die Immunfluoreszenz-Färbung durch die Analyse der sagittalen Abschnitte bieten regionale Unterschiede beim gleichen Tier. Die Verwendung von jeder Hemi-Gehirn für verschiedene gleichzeitige Messungen ist einer der wichtigsten Vorteile in unserem Protokoll. Durchlässigkeit anderer Organe wie Nieren, Leber usw. dient auch, als eine gute interne Kontrolle, da die basalen Durchlässigkeit hoch in diesen Organen ist. Um 2 Gruppen zu vergleichen, müsste man zuerst das Schein Tier subtrahieren (das keine Tracer Injektion erhielten) Autofluoreszenz von den Tieren in beiden Gruppen und das Gewebe (Niere, Gehirn und Serum) für jede Tracer-Typen und gehen Sie dann zu normalisierte Vergleich von 2 Gruppen Berechnungen. Der Durchlässigkeit-Index (PI) präsentiert, die als Verhältnis des Gewebes zu Serum Fluoreszenz normiert auf Gewicht und Serum Gewebevolumens abgerufen wird. Unsere Berechnungen ergeben einen absoluten Wert für die Tracer-Durchlässigkeit, die zwischen Experimenten und Gewebetypen verglichen werden kann. Diese Werte können jedoch leicht ausgedrückt werden, als Verhältnisse oder Prozent zwischen den 2 Gruppen verglichen wie wir12zuvor auch getan haben. Dies kann erreicht werden, indem man die PI jedes Tieres in beiden Gruppen mit der mittleren PI aller Tiere in der Kontrollgruppe. Dies würde die Kontrollgruppe PI durch 1 fahren, noch halten die Fehler zwischen den Tieren und für die experimentelle Gruppe geben Werte, die bezogen auf die Mittel der Kontrolle-Gruppe 1 sind.

Injektion von Tracer von IP ist einfacher, aber Kosten intensiver im Vergleich zu IV Injektion, da die Menge des Tracers muss erhöht werden. Unsere Daten (nicht dargestellt) in diesem Zusammenhang weist darauf hin, dass fast 2-fach höheren Betrag in der Tracer ist durch IP-Injektion im Vergleich zu IV erforderlich, um ähnliche Serum Fluoreszenz-Werte zu erhalten. Außerdem ist die Zeit der Zirkulation höhere IP Route im Vergleich zur IV aufgrund der Zeitaufwand für die Tracer-Absorption in den Blutkreislauf. In diesem Zusammenhang Serum Fluoreszenz Werte 15 min Post IP Injektion waren vergleichbar mit 5 min Post IV Injektion für Tracer im Bereich von niedrigen und mittleren Molekulargewicht zwischen 0,4-4 kD (Daten nicht gezeigt). Wir empfehlen eine kurze Zirkulation Zeit weil parazellulär Durchlässigkeit linear ist und wenn erhebliche Gewebe Fluoreszenz erkannten Post Perfusion nach einer kurzen Umlauf-Zeit (15 min) handelt, es bereits einen Durchlässigkeit Phänotyp, gibt wie wir, in berichtet haben unserer Frühere Publikationen10,12,13,14. Doch zur gleichen Zeit könnte man für die Normalisierung die Serum-Fluoreszenz erhalten. Bei längeren Zirkulation Zeiten ist Gewebe Abstand beträchtlich, die Serum-Fluoreszenz deutlich reduziert und somit Durchlässigkeit Werte normiert auf Serum auswirken könnte. Während der Zeit der Zirkulation in Bezug auf die Größe/Ladung des Tracers hat für jedes Szenario optimiert werden, empfehlen wir eine kurze Zirkulation Zeit als Ausgangspunkt. Dies gilt auch für höheren Molekulargewicht solute wie Plasma IgGs und Fibrinogen (150-400 kD), deren Durchlässigkeit Eigenschaften im Gegensatz zu träge Dextran Tracer aufgrund ihrer extrem großen Größe und spezifische Wechselwirkung mit zellulären Rezeptoren wie Fc sind, Rezeptoren, die ihre Halbwertszeit24ändern. Dextrans auf der anderen Seite müssen speziellen Transportsystem nicht an der endothelialen Level25 und als Gehirn endothelial Zellen nicht Pinozytose, signifikante Mengen aufgrund sehr unterziehen niedrige Konzentrationen von Plasmalemma Vesikel verbundenen Protein (PLVAP)26 , der wichtigsten Transportweg des Dextrans ist parazellulär. Wir haben die oben beschriebene Methode erfolgreich in mehreren Szenarien angewendet, wie z. B. Durchlässigkeit bei transgenen Mäusen im Vergleich zu Wildtyp Wurfgeschwistern und auch Durchlässigkeit Änderungen in Wildtyp-Mäusen nach therapeutischen Intervention10, bewertet 12 , 13 , 14. Zusammenfassend, kombiniert mit der Immunfluoreszenz-Färbung, der hier beschriebenen Durchlässigkeit-Assay ist ein einfaches und eine robuste Methode, um die Durchlässigkeit der Mäuse in Vivo zu bewerten, auch die anderen kleinen Tieren angewendet werden können.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Sphingonet Konsortium finanziert von der Leduq-Stiftung für die Unterstützung dieser Arbeit anerkennen. Diese Arbeit wurde auch von den Sonderforschungsbereich "vaskuläre Differenzierung und Umbau" unterstützt (CRC / Transregio23, Projekt C1) und durch die 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc-Programm GO-IN, Nr. 291776 Finanzierung. Wir erkennen weiter Kathleen Sommer für ihre technische Unterstützung mit Mäusen, Handhabung und Genotypisierung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD Thermosfisher D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD Thermosfisher D3306
Ketamine (Ketavet) Zoetis
Xylazine (Rompun) Bayer
0.9% Saline Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS Gibco 10010-015
Tissue-tek O.C.T compound Sakura Finetek 4583
37% Formaldhehyde solution Sigma 252549-1L prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V Roth 8076.3
Triton X-100 Sigma T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3 BD Pharmingen 553370
goat anti rat alexa 568 Molecular Probes A-11077
goat anti rat alexa 488 Molecular Probes A-11006
DAPI Molecular Probes D1306
Aqua polymount Polyscience Inc 18606
21-gauge butterfly needle BD 387455
serum collection tube Sarstedt 41.1500.005
2mL eppendorf tubes Sarstedt 72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers Kimberley-Clark Professional 05511
384-well black plate Greiner 781086
slides superfrost plus Thermoscientific J1800AMNZ
PTFE pestle Wheaton 358029
electric overhead stirrer VWR VWR VOS 14
plate reader Tecan Infinite M200
Cryostat Microm GmbH HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System Nikon
peristaltic perfusion system BVK Ismatec
microcentrifuge eppendorf 5415R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  2. Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
  3. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  4. Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
  7. Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
  8. Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
  9. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  10. Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
  11. Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
  12. Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
  13. Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
  14. Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
  16. Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
  17. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  19. Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
  20. Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
  21. Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
  22. Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
  23. Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
  24. Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
  25. Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
  26. Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).

Tags

Neurowissenschaften Ausgabe 132 Blut - Hirn-Schranke BBB in Vivo Durchlässigkeit quantitative fluoreszierende Tracer Endothelzellen Mikrogefäßen Kapillaren intraperitoneal Durchblutung
Eine <em>In Vivo</em> Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Devraj, K., Guérit, S., Macas,… More

Devraj, K., Guérit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. J. Vis. Exp. (132), e57038, doi:10.3791/57038 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter