Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.
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Methodenartikel
Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine spezialisierte Barriere, die das Gehirn Mikroumgebung von Giftstoffen und Krankheitserregern in der Zirkulation schützt und pflegt Gehirn Homöostase. Die wichtigsten Sehenswürdigkeiten der Barriere sind Endothelzellen der Gehirn-Kapillaren ergibt sich deren Barrierefunktion aus enge interzelluläre Verbindungen und Efflux-Transporter über die Plasmamembran zum Ausdruck gebracht. Diese Funktion wird durch Perizyten und Astrozyten, die zusammen die neurovaskuläre Einheit (NVU bilden) geregelt. Verschiedene neurologische Erkrankungen wie Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit (AD), Hirntumoren eine Beeinträchtigung der BBB Funktion zugeordnet sind. Bewertung der BBB Permeabilität ist daher entscheidend bei der Bewertung der Schwere der neurologischen Erkrankung und den Erfolg der Behandlungsstrategien eingesetzt.
Wir präsentieren hier eine einfache, aber robuste Durchlässigkeit Assay, die auf mehrere Maus erfolgreich angewendet wurden sowohl genetische als auch experimentelle Modelle. Die Methode ist höchst quantitative und Objektive im Vergleich zu den Tracer Fluoreszenzanalyse Mikroskopie, die häufig angewendet wird. Bei dieser Methode werden Mäusen intraperitoneal mit einer Mischung aus wässrigen inert Fluoreszenz Tracer gefolgt von betäuben die Mäuse injiziert. Kardiale Perfusion der Tiere erfolgt vor der Ernte, Gehirn, Nieren oder anderen Organen. Organe sind homogenisiert und zentrifugiert, gefolgt von Fluoreszenzmessung von überstand. Blut aus der Herzpunktion kurz vor Perfusion dient zur Normalisierung soll das vaskuläre Fach. Die Gewebe-Fluoreszenz ist normiert auf die nassen Gewicht und Serum Fluoreszenz zu einer quantitativen Tracer Durchlässigkeit Index. Für zusätzliche Bestätigung sowohl der kontralateralen Hemi-Hirn für Immunohistochemistry bewahrt Tracer Fluoreszenz Visualisierung Zwecke einsetzbar.
Einleitung
Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) besteht aus der mikrovaskulären Endothelzellen (ECs) unterstützt durch eng Perizyten (PCs), sind Ensheathed in der Basallamina und Astrozyten (ACs), die die Basalmembran mit den End-Füßen1 umhüllen ,2. ECs mit mehreren Zelltypen, die unterstützen und regulieren die Barrierefunktion, in erster Linie ACs und PCs interagieren und auch Neuronen und Mikroglia, alle zusammen die neurovaskuläre Einheit (NVU bilden). Die NVU ist entscheidend für die Funktion der BBB, was den Transport von Blut übertragene Giftstoffe und Erreger in das Gehirn gelangen begrenzt. Diese Funktion ist ein Erg....
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Protokoll
Alle Tiere wurden mit größter Sorgfalt, die Minimierung von Schmerzen oder Beschwerden während des Verfahrens behandelt. Dieses Verfahren folgt den Richtlinien der Tierbetreuung unserer Institution und die Lokalkomitees (Regierungspräsidium Darmstadt, Zulassungsnummer FK/1044) genehmigt wurde.
Abbildung 1zeigt eine schematische Darstellung der Arbeitsschritte für in Vivo Durchlässigkeit Assay bei Mäusen. Die Details der einzelnen Schritte werden im folgenden beschrieben.
1. Umgang mit Tier
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Erstellung und Verwaltung von Tracer und Anästhetika
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Ergebnisse
Wir haben kürzlich gezeigt, dass Angiopoietin-2 (Ang-2) Gain of Function (GOF) Mäuse höhere Gehirn vaskulären Permeabilität als Kontroll-Mäusen unter gesunden Bedingungen10 haben. Bei Schlaganfall-induzierte Mäusen war es auch zeigt, dass die GOF-Mäuse Infarkt größer und größere Durchlässigkeit als Kontrolle Wurfgeschwistern hatten. Diese Ergebnisse zeigen eine kritische Rolle von Ang-2 in Durchlässigkeit an der BBB. Das Protokoll daher verwendet die GOF-Mäuse und .......
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Diskussion
Funktionsstörung der Blut - Hirn-Schranke ist verbunden mit einer Reihe von neurologischen Erkrankungen, einschließlich primäre und sekundäre Hirntumoren oder Schlaganfall. BBB Aufschlüsselung ist häufig verbunden mit lebensbedrohlichen CNS Ödem. Daher ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die die Öffnung auslösen oder Schließung der BBB therapeutische Bedeutung bei neurologischen Erkrankungen und häufig von Forschern untersucht. BBB Permeabilität in Vivo in der Literatur beschrieben sind Methoden zu u.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Danksagungen
Die Autoren möchten Sphingonet Konsortium finanziert von der Leduq-Stiftung für die Unterstützung dieser Arbeit anerkennen. Diese Arbeit wurde auch von den Sonderforschungsbereich "vaskuläre Differenzierung und Umbau" unterstützt (CRC / Transregio23, Projekt C1) und durch die 7. FP, COFUND, Goethe International Postdoc-Programm GO-IN, Nr. 291776 Finanzierung. Wir erkennen weiter Kathleen Sommer für ihre technische Unterstützung mit Mäusen, Handhabung und Genotypisierung.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Tetramethylrhodamin (TMR) Dextran 3kD | Thermosfisher | D3308 | |
| Fluorescein isothiocyanat (FITC) Dextran 3kD | Thermosfisher | D3306 | |
| Ketamin (Ketavet) | Zoetis | ||
| Xylazin (Rompun) | Bayer | ||
| 0,9% Kochsalzlösung | Fresenius Kabi Deutschland GmbH | ||
| 1X PBS | Gibco | 10010-015 | |
| Tissue-tek O.C.T Verbindung | Sakura Finetek | 4583 | |
| 37% Formaldhehyde Lösung | Sigma | 252549-1L | Herstellen einer 4% igen Lösung |
| Rinderserum Albumin, Fraktion V | Roth | 8076.3 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Ratte Anti CD31 Antikörper, Klon MEC 13.3 | BD Pharmingen | 553370 | |
| Anti-Ratte für Ziegen Alexa 568 | Molekulare Sonden | A-11077 | |
| Anti-Ratte für Ziegen Alexa 488 | Molekulare Sonden | A-11006 | |
| DAPI | Molekulare Sonden | D1306 | |
| Aqua Polymount | Polyscience Inc | 18606 | |
| 21-Gauge-Schmetterlingsnadel | BD | 387455 | |
| Serum Sammelröhrchen | Sarstedt | 41.1500.005 | |
| 2mL Eppendorf Röhrchen | Sarstedt | 72.695.500 | |
| Kimtech Präzisionstücher | Tissuewischer Kimberley-Clark Professional | 05511 | |
| 384-Well-Schwarzplatte | Greiner | 781086 | |
| Objektträger Superfrost plus | Thermoscientific | J1800AMNZ | |
| PTFE-Stößel | Wheaton | 358029 | |
| elektrisches Überkopfrührgerät | VWR | VWR VOS 14 | |
| Plattenleser | Tecan | Infinite M200 | |
| Kryostat | Microm GmbH | HM 550 | |
| Nikon C1 Spectral Imaging konfokales Laser-Scanning-Mikroskopsystem Nikon | |||
| peristaltisches Perfusionssystem | BVK Ismatec | ||
| Mikrozentrifuge | Eppendorf | 5415R |
Referenzen
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M.
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Nachdrucke und Genehmigungen
