Wir stellen eine Methode zur Erfassung von Fluoreszenz-Reporter-Zeitkursen aus einzelnen Zellen mit mikrostrukturierten Arrays vor. Das Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Einzelzellarrays, den Aufbau und Betrieb der Live-Cell-Scanning-Zeitraffermikroskopie und ein Open-Source-Bildanalyse-Tool zur automatisierten Vorauswahl, visuellen Kontrolle und Verfolgung von zellintegrierten Fluoreszenzzeitverläufen pro Adhäsionsstelle.
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Methodenartikel
Live-Cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - eine vielseitige Technik zur Quantifizierung der zellulären Kinetik
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) ist eine vielseitige Methode, um Zeitverläufe von Fluoreszenzsignalen einzelner Zellen bei hohem Durchsatz zu sammeln. Im Allgemeinen wird der Erwerb von Einzelzellzeitverläufen aus kultivierten Zellen durch die Zellmotilität und die Vielfalt der Zellformen behindert. Adhäsive Mikroarrays standardisieren Einzelzellbedingungen und erleichtern die Bildanalyse. LISCA kombiniert Einzelzell-Microarrays mit Rasterzeitraffermikroskopie und automatisierter Bildverarbeitung. Hier beschreiben wir die experimentellen Schritte der Teilnahme an einzelligen Fluoreszenzzeitkursen im LISCA-Format. Wir transfizieren Zellen, die an einem mikrostrukturierten Array haften, indem wir mRNA verwenden, das für ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) kodiert, und überwachen die eGFP-Expressionskinetik von Hunderten von Zellen parallel mittels Rasterzeitraffermikroskopie. Die Bilddatenstapel werden automatisch von einer neu entwickelten Software verarbeitet, die die Fluoreszenzintensität über ausgewählte Zellkonturen integriert, um Einzelzell-Fluoreszenzzeitverläufe zu erzeugen. Wir zeigen, dass eGFP-Expressionszeitkurse nach der mRNA-Transfektion durch ein einfaches kinetisches Translationsmodell gut beschrieben werden, das Expressions- und Abbauraten von mRNA aufdeckt. Weitere Anwendungen von LISCA für Ereigniszeitkorrelationen multipler Marker im Kontext der Signalapoptose werden diskutiert.
Einleitung
In den letzten Jahren hat sich die Bedeutung von Einzelzellexperimenten gezeigt. Daten aus einzelnen Zellen ermöglichen die Untersuchung der Zell-zu-Zell-Variabilität, die Auflösung intrazellulärer Parameterkorrelationen und die Detektion zellulärer Kinetik, die in Ensemblemessungen verborgen bleiben1,2,3. Um die zelluläre Kinetik von Tausenden von Einzelzellen parallel zu untersuchen, bedarf es neuer Ansätze, die es ermöglichen, die Zellen unter standardisierten Bedingungen über einen Zeitraum von mehreren Stunden bis zu mehreren Tagen zu überwachen, gefolgt von einer quanti....
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Protokoll
Abbildung 2: Datenerfassung bei der Einzelzell-Microarrays (A) mit Rasterzeitraffermikroskopie (B) kombiniert werden. Zur Vorbereitung des Zeitrafferexperiments wird ein Einzelzellarray mit einem 2D-Mikromuster aus Adhäsionsquadrats vorbereitet (1), gefolgt von der Zellaussaat und der Ausrichtung der Zellen auf dem Mikromuster (2) sowie dem Anschluss eines Perfusionssystems an den Sechskanal-Objektträger, der ein Liquid Handling während der Zeitraffermessung ermöglicht (3). Ein Rasterzeitrafferexperiment....
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Ergebnisse
Der LISCA-Ansatz ermöglicht es, Fluoreszenzzeitkurse von einzelnen Zellen effizient zu erfassen. Als repräsentatives Beispiel skizzieren wir, wie die LISCA-Methode zur Messung der einzelligen eGFP-Expression nach der Transfektion angewendet wird. Die Daten des LISCA-Experiments werden verwendet, um die mRNA-Abgabekinetik zu bewerten, die für die Entwicklung effizienter mRNA-Medikamente wichtig ist.
Insbesondere zeigen wir die unterschiedlichen Auswirkungen zweier lipidbasierter mRNA-Abgabesyst.......
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Diskussion
Hier beschrieben wir LISCA als eine vielseitige Technik, um die zelluläre Kinetik intrazellulärer fluoreszierender Markierungen auf Einzelzellebene zu verfolgen. Um ein erfolgreiches LISCA-Experiment durchführen zu können, muss jeder der beschriebenen Schritte des Protokollabschnitts einzeln festgelegt und dann alle Schritte kombiniert werden. Jeder der drei Hauptaspekte von LISCA zeichnet sich durch entscheidende Schritte aus.
Einzelzell-Microarray-Herstellung
Die Qualität des Mic.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) zum Sonderforschungsbereich (SFB) 1032 unterstützt. Die Unterstützung durch das Bundesministerium für Bildung, Forschung und Technologie (BMBF) im Rahmen des Kooperationsprojekts 05K2018-2017-06716 Medisoft sowie eine Förderung durch die Bayerische Forschungsstiftung werden dankbar gewürdigt. Anita Reiser wurde durch ein DFG-Fellowship der Graduate School of Quantitative Biosciences Munich (QBM) gefördert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Adtech Polymer Engineering PTFE Mikroschläuche | Fisher Scientific | 10178071 | |
| Backofen | Binder | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| Exsikkator | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Buchse Luer auf Tubus Verbinder | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Fötales Rinderserum | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronektin | Yo Proteine | 663 | |
| Filterset eGFP | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand Transluzenter, platingehärteter Silikonschlauch | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 m) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Inkubationsbox | Okolab | OKO-H201 | |
| Inkubator | Binder | 9040-0012 | |
| L-15 ohne Phenolrot | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | ||
| Luer-Stecker | aus eigener Fertigung, bestehend aus Teflon-Stecker | ||
| Luer-zu-Rohr-Verbinder | MEDNET | MTLS210-6005 | Alternative zu hausgefertigten Luer-Steckern |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| nadelloses Ventil auf männlicher Luer-Anschluss | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Imaging Software Version 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Fast Curing Optischer Klebstoff für die Montage von Röhrchensystemen |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | hauseigens hergestellter | ||
| Plasmareiniger | Diener Femto | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| Siliziumwafer mit Mikrostrukturen | inhouse fabricated | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| sticky slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Silikon Elastomer Kit | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Mä rzhä Benutzer | 00-24-626-0000 | |
| Reinstwasser | hauseigens hergestellte | ||
| ungestrichene Deckgläser | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | mit Ersatzsporn |
Referenzen
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).....
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Nachdrucke und Genehmigungen
