Imaging a cellule vive di array a cella singola (LISCA) - una tecnica versatile per quantificare la cinetica cellulare

Summary

Presentiamo un metodo per l’acquisizione di corsi di tempo reporter a fluorescenza da singole cellule utilizzando array micropatterned. Il protocollo descrive la preparazione di array a cella singola, la configurazione e il funzionamento della microscopia time-lapse di scansione a celle vive e uno strumento di analisi delle immagini open source per la preselezione automatizzata, il controllo visivo e il tracciamento dei corsi di tempo di fluorescenza integrati nelle celle per sito di adesione.

Abstract

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) è un metodo versatile per raccogliere corsi di tempo di segnali di fluorescenza da singole cellule ad alta produttività. In generale, l’acquisizione di corsi di tempo a cella singola da cellule coltivate è ostacolata dalla motilità cellulare e dalla diversità delle forme cellulari. I micro array adesivi standardizzano le condizioni a cella singola e facilitano l’analisi delle immagini. LISCA combina microarray a cella singola con microscopia time-lapse di scansione e elaborazione automatizzata delle immagini. Qui descriviamo le fasi sperimentali di prendere corsi di tempo di fluorescenza a singola cella in formato LISCA. Trasfetteiamo le cellule aderenti a un array di micropattern utilizzando la codifica mRNA per proteine fluorescenti verdi avanzate (eGFP) e monitoriamo la cinetica di espressione eGFP di centinaia di cellule in parallelo tramite microscopia time-lapse di scansione. Gli stack di dati delle immagini vengono elaborati automaticamente da un software di nuova sviluppo che integra l’intensità della fluorescenza sui contorni delle celle selezionati per generare corsi di tempo a fluorescenza a singola cella. Dimostriamo che i corsi di tempo di espressione eGFP dopo la trasfezione dell’mRNA sono ben descritti da un semplice modello di traduzione cinetica che rivela i tassi di espressione e degradazione dell’mRNA. Vengono discusse ulteriori applicazioni di LISCA per le correlazioni del tempo degli eventi di più marcatori nel contesto dell’apoptosi di segnalazione.

Introduction

Negli ultimi anni, l’importanza degli esperimenti a una cellula è diventata evidente. I dati provenienti da singole celle consentono l’analisi della variabilità da cella a cella, la risoluzione delle correlazioni dei parametri intracellulari e il rilevamento della cinetica cellulare che rimangono nascoste nelle misurazioni^{dell’insieme 1,2,3}. Al fine di studiare la cinetica cellulare di migliaia di singole cellule in parallelo, sono necessari nuovi approcci che consentano di monitorare le cellule in condizioni standardizzate per un periodo di tempo di diverse ore fino a diversi giorni seguito da un’analisi quantitativa dei dati ⁴. Qui presentiamo Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA), che combina l’uso di array microstrutturati con microscopia time-lapse e analisi automatizzata delle immagini.

Diversi metodi per generare array microstrutturati a cella singola sono stati stabiliti e pubblicati nella letteratura^5,6. Qui, descriviamo brevemente il modello proteico avviato dal plasma su microscala (μPIPP). Un protocollo dettagliato della fabbricazione di array a cella singola utilizzando μPIPP si trova anche nel riferimento⁷. L’uso di matrici a cella singola consente l’allineamento di migliaia di celle su punti di adesione standardizzati che presentano microambientati definiti per ogni cella e riduce così una fonte di variabilità sperimentale (Figura 1A). Gli array a cella singola vengono utilizzati per monitorare i corsi di tempo dei marcatori fluorescenti allo scopo di indicare una varietà di processi cellulari. La microscopia a lungo termine in modalità time-lapse di scansione consente di monitorare una vasta area degli array a singola cella e quindi di campioare i dati a cella singola in alta velocità effettiva per un tempo di osservazione di diverse ore o addirittura giorni. In questo modo vengono generati stack di immagini a linee di tempo da ogni posizione della matrice (Figura 1B). Al fine di ridurre la grande quantità di dati immagine ed estrarre i corsi di tempo di fluorescenza a singola cella desiderati in modo efficiente, è necessaria un’elaborazione automatizzata delle immagini che sfrofitti il posizionamento delle cellule (Figura 1C).

La sfida di LISCA è adattare i protocolli sperimentali e gli strumenti computazionali per formare un saggio ad alta produttività che generi dati quantitativi e riproducibili della cinetica cellulare. In questo articolo forniamo una descrizione dettagliata dei singoli metodi e di come vengono combinati in un test LISCA. Ad esempio, discutiamo il corso del tempo dell’espressione di proteina fluorescente verde migliorata (eGFP) dopo la consegna artificiale di mRNA. L’espressione eGFP dopo la consegna dell’mRNA è descritta da equazioni della velocità di reazione che modellano la traduzione e la degradazione dell’mRNA. Adattando la funzione del modello per il corso del tempo della concentrazione eGFP alla lettura LISCA dell’intensità di fluorescenza per ogni singola cella nel tempo si ottiene la migliore stima dei parametri del modello come il tasso di degradazione dell’mRNA. Come risultato rappresentativo discutiamo dell’efficienza di erogazione dell’mRNA di due diversi agenti di trasfezione a base lipidica e di come differiscono le loro distribuzioni dei parametri.

Figura 1: Rappresentazione del flusso di lavoro LISCA che combina(A) array a celle singole a micro pattern (B) microscopia time-lapse di scansione e (C) analisi automatica delle immagini delle serie di immagini registrate. Gli array a cella singola consistono in un modello bidimensionale di quadrati cell-adesivi con un interspazio repellente per cellule che porta a una disposizione delle cellule sul micropattern, come si può vedere nell’immagine a contrasto di fase e nell’immagine di fluorescenza delle cellule che esprimono eGFP (A). L’intera area microstrutturata viene immagine in modalità time-lapse di scansione che scatta ripetutamente immagini in una sequenza di posizioni (B). Le serie di immagini registrate vengono elaborate per leggere l’intensità di fluorescenza per cella nel tempo (C). Barre di scala: 500 μm(A),200 μm (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

Figura 2: Acquisizione di dati che combina microarray a cella singola (A) con microscopia time-lapse a scansione (B). Durante la preparazione dell’esperimento time-lapse, viene preparato un array a cella singola con un micropattern 2D di quadrati di adesione (1), seguito dalla semina cellulare e dall’allineamento delle cellule sul micropattern (2), nonché dalla connessione di un sistema di…

Representative Results

L’approccio LISCA consente di raccogliere in modo efficiente corsi di tempo di fluorescenza da singole cellule. Come esempio rappresentativo viene illustrato come viene applicato il metodo LISCA per misurare l’espressione eGFP a cella singola dopo la trasfezione. I dati dell’esperimento LISCA vengono utilizzati per valutare la cinetica di somministrazione dell’mRNA, che è importante per lo sviluppo di farmaci mRNA efficienti. In particolare dimostriamo il diverso impatto di due sistemi di ero…

Discussion

Qui abbiamo descritto LISCA come una tecnica versatile per seguire la cinetica cellulare delle etichette fluorescenti intracellulari a livello a singola cellula. Per eseguire un esperimento LISCA riuscito, ciascuno dei passaggi descritti della sezione del protocollo deve essere stabilito singolarmente e quindi tutti i passaggi devono essere combinati. Ognuno dei tre aspetti principali di LISCA presenta passaggi cruciali.

Fabbricazione di microarray a cella singola
La qualità del m…

Materials

Adtech Polymer Engineering PTFE Microtubing	Fisher Scientific	10178071
baking oven	Binder	9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10x	Nikon	MRH20100
Desiccator	Roth	NX07.1
Eclipse Ti-E	Nikon
eGFP mRNA	Trilink	L-7601
Female Luer to Tube Connector	MEDNET	FTL210-6005
Fetal bovine serum	Thermo Fisher	10270106
Fibronectin	Yo Proteins	663
Filter set eGFP	AHF	F46-002
Fisherbrand Translucent Platinum-Cured Silicone Tubing	Fisher Scientific	11768088
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630080
Incubation Box	Okolab	OKO-H201
incubator	Binder	9040-0012
L-15 without phenol red	Thermo Fisher	21083027
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027
Male Luer			in-house fabricated consisting of teflon
Male Luer to Tube Connector	MEDNET	MTLS210-6005	alternative to in-house fabricated male luers
NaCl (5 M)	Thermo Fisher	AM9760G
Needleless Valve to Male Luer Connector	MEDNET	NVFMLLPC
NIS Elements	Nikon		Imaging software Version 5.02.00
NOA81	Thorlabs	NOA81	Fast Curing Optical Adhesive for tube system assembly
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO	pco
Phosphate buffered saline (PBS)			in-house prepared
Plasma Cleaner	Diener Femto	Pico-BRS
PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa)	SuSoS AG
silicon wafer mit mircorstructures			in-house fabricated
Sola Light Engine	Lumencor
sticky slide VI 0.4	ibidi	80608
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	1673921
Tango 2	Märzhäuser	00-24-626-0000
Ultrapure water			in-house prepared
uncoated coverslips	ibidi	10813
Injekt-F Solo, 1 mL	Omilab	9166017V	with replacement sporn