Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

التغليف السريع للهيكل الخلوي المعاد تشكيله داخل حويصلات يونيلاميلار العملاقة

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63332
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1,4,5,6
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 2John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, 3Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, 6Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor
* These authors contributed equally

Summary

تقدم هذه المقالة طريقة بسيطة للإنتاج السريع لحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة مع البروتينات الهيكلية الخلوية المغلفة. تثبت هذه الطريقة أنها مفيدة لإعادة تشكيل الهياكل الخلوية الهيكلية من أسفل إلى أعلى في الحبس والتفاعلات بين الهيكل الخلوي والغشاء.

Abstract

كثيرا ما تستخدم الحويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) كنماذج للأغشية البيولوجية ، وبالتالي فهي أداة رائعة لدراسة العمليات الخلوية المتعلقة بالأغشية في المختبر. في السنوات الأخيرة ، أثبت التغليف داخل GUVs أنه نهج مفيد لتجارب إعادة التشكيل في بيولوجيا الخلية والمجالات ذات الصلة. إنه يحاكي بشكل أفضل ظروف الحبس داخل الخلايا الحية ، بدلا من إعادة التكوين الكيميائي الحيوي التقليدي. غالبا ما لا يكون من السهل تنفيذ طرق التغليف داخل GUVs ، ويمكن أن تختلف معدلات النجاح اختلافا كبيرا من مختبر إلى آخر. إحدى التقنيات التي أثبتت نجاحها في تغليف أنظمة البروتين الأكثر تعقيدا تسمى تغليف واجهة القطيرات المستمرة (cDICE). هنا ، يتم تقديم طريقة قائمة على cDICE لتغليف البروتينات الهيكلية الخلوية بسرعة في GUVs مع كفاءة تغليف عالية. في هذه الطريقة ، أولا ، يتم إنشاء قطرات أحادية الطبقة من الدهون عن طريق استحلاب محلول بروتيني ذي أهمية في خليط من الدهون / الزيت. بعد إضافتها إلى غرفة دوارة مطبوعة 3D ، تمر هذه القطرات أحادية الطبقات الدهنية عبر طبقة أحادية دهنية ثانية في واجهة مائية / زيتية داخل الغرفة لتشكيل GUVs التي تحتوي على نظام البروتين. تبسط هذه الطريقة الإجراء العام للتغليف داخل GUVs وتسرع العملية ، وبالتالي تسمح لنا بحصر ومراقبة التطور الديناميكي لتجميع الشبكة داخل الحويصلات ثنائية الطبقة الدهنية. هذه المنصة مفيدة لدراسة ميكانيكا تفاعلات غشاء الهيكل الخلوي في الحبس.

Introduction

تستخدم مقصورات الدهون ثنائية الطبقة كخلايا اصطناعية نموذجية لدراسة التفاعلات العضوية المغلقة والعمليات القائمة على الأغشية أو كوحدات حاملة في تطبيقات توصيل الأدوية 1,2. تتطلب البيولوجيا من أسفل إلى أعلى مع المكونات النقية الحد الأدنى من الأنظمة التجريبية لاستكشاف الخصائص والتفاعلات بين الجزيئات الحيوية ، مثل البروتينات والدهون 3,4. ومع ذلك ، مع تقدم هذا المجال ، هناك حاجة متزايدة لأنظمة تجريبية أكثر تعقيدا تقلد بشكل أفضل الظروف في الخلايا البيولوجية. التغليف في GUVs هو نهج عملي يمكن أن يوفر بعض هذه الخصائص الشبيهة بالخلايا من خلال توفير طبقة ثنائية من الدهون قابلة للتشوه ونفاذية بشكل انتقائي ومساحة تفاعل ضيقة. على وجه الخصوص ، في المختبر إعادة تشكيل الأنظمة الهيكلية الخلوية ، كنماذج للخلايا الاصطناعية ، يمكن أن تستفيد من التغليف في مقصورات الغشاء5. ترتبط العديد من البروتينات الهيكلية الخلوية وتتفاعل مع غشاء الخلية. نظرا لأن معظم التجميعات الهيكلية الخلوية تشكل هياكل تمتد عبر كامل الخلية ، يتم تحديد شكلها بشكل طبيعي بواسطة الحبس بحجم الخلية6.

يتم استخدام طرق مختلفة لتوليد GUVs ، مثل التورم 7,8 ، واندماج الحويصلة الصغيرة9,10 ، ونقل المستحلب11,12 ، والنفث النبضي 13 ، وغيرها من طرق الموائع الدقيقة 14,15. على الرغم من أن هذه الأساليب لا تزال تستخدم ، إلا أن لكل منها حدودها. وبالتالي ، فإن اتباع نهج قوي ومباشر مع غلة عالية من تغليف GUV أمر مرغوب فيه للغاية. على الرغم من أن تقنيات مثل التورم التلقائي والتورم الكهربائي معتمدة على نطاق واسع لتشكيل GUVs ، إلا أن هذه الطرق متوافقة في المقام الأول مع تركيبات الدهون المحددة16 ، والمخازن المؤقتة منخفضة تركيز الملح 17 ، والحجم الجزيئي المغلف الأصغر18 ، وتتطلب حجما كبيرا من الكفائف. إن دمج العديد من الحويصلات الصغيرة في GUV غير موات بطبيعته ، مما يتطلب خصوصية في تركيبات الدهون المشحونة9 و / أو العوامل الخارجية المسببة للاندماج ، مثل الببتيدات19 أو غيرها من المواد الكيميائية. من ناحية أخرى ، قد يتطلب نقل المستحلب وطرق الموائع الدقيقة تثبيت القطيرات من خلال إزالة الفاعل بالسطح والمذيبات بعد تكوين الطبقة الثنائية ، على التوالي18,20. يفرض تعقيد الإعداد التجريبي والجهاز في تقنيات الموائع الدقيقة مثل النفث النبضي تحديا إضافيا21. cDICE هي طريقة قائمة على المستحلب مشتقة من مبادئ مماثلة تحكم نقل المستحلب22,23. يتم تقسيم المحلول المائي (المحلول الخارجي) وخليط الدهون والزيت إلى طبقات بواسطة قوى الطرد المركزي في غرفة أسطوانية دوارة (غرفة cDICE) تشكل واجهة مشبعة بالدهون. يؤدي نقل قطرات مائية أحادية الطبقة من الدهون إلى غرفة cDICE الدوارة إلى سحاب طبقة ثنائية الطبقة حيث تعبر القطرات الواجهة المشبعة بالدهون إلى المحلول المائي الخارجي22,24. نهج cDICE هو تقنية قوية لتغليف GUV. مع الطريقة المعدلة المقدمة ، لا يتم تحقيق غلة الحويصلة العالية النموذجية ل cDICE مع وقت تغليف أقصر بكثير (بضع ثوان) فحسب ، بل يتم تقليل وقت توليد GUV الذي يسمح بمراقبة العمليات المعتمدة على الوقت (على سبيل المثال ، تكوين شبكة actin cytoskeletal network) بشكل كبير. يستغرق البروتوكول حوالي 15-20 دقيقة من البداية إلى جمع GUV وتصويرها. هنا ، يتم وصف توليد GUV باستخدام طريقة cDICE المعدلة لتغليف الأكتين والبروتينات المرتبطة بالأكتين (ABPs). ومع ذلك ، فإن التقنية المقدمة قابلة للتطبيق لتغليف مجموعة واسعة من التفاعلات البيولوجية والتفاعلات الغشائية ، من تجميع البوليمرات الحيوية إلى التعبير عن البروتين الخالي من الخلايا إلى نقل البضائع القائمة على الاندماج الغشائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد خليط الزيت والدهون

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوة في غطاء الدخان باتباع جميع إرشادات السلامة للتعامل مع الكلوروفورم.

  1. خذ 0.5 مل من الكلوروفورم في قارورة زجاجية سعة 15 مل. أضف 88 ميكرولتر من 25 ملغم / مل من ثنائي oleoyl-phosphocholine (DOPC) ، و 9.3 ميكرولتر من 50 ملغ / مل من الكوليسترول ، و 5 ميكرولتر من 1 ملغ / مل من ديولويل - فوسفويثانولامين - ليسامين رودامين B (رودامين PE) (انظر جدول المواد) إلى القارورة الزجاجية سعة 15 مل.
    ملاحظة: أجزاء الخلد النهائية من DOPC والكوليسترول في زيت السيليكون / الزيت المعدني هي 69.9٪ و 30٪ على التوالي. ثبت أن 20-30 مول ٪ من الكوليسترول هو تركيز محسن لسيولة الغشاء واستقرار GUVs المتولدة باستخدام التقنية المقدمة25,26. من الناحية الفسيولوجية ، هذه القيم تقع ضمن نطاق تركيز الكوليسترول الموجود في أغشية بلازما خلايا الثدييات6. يتم الحصول على مخزونات الدهون كحلول في الكلوروفورم وتخزينها في -20 درجة مئوية. يجب أن تتأقلم قوارير مخزون الدهون مع درجة حرارة الغرفة قبل فتحها.
  2. ماصة 7.2 مل من زيت السيليكون و 1.8 مل من الزيت المعدني في قارورة ثانية سعة 15 مل (انظر جدول المواد). بشكل عام ، يجب القيام بذلك في صندوق قفازات منخفض الرطوبة ، خاصة إذا تم إعادة استخدام الزيت المعدني.
  3. امزج الزيوت عن طريق الدوامة بسرعة دوران قصوى (3200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 ثوان ، وأضف الخليط إلى القارورة التي تحتوي على خليط الدهون في الكلوروفورم وضعه على الفور على خلاط الدوامة. دوامة لمدة 10-15 ثانية عند أقصى سرعة دوران (3200 دورة في الدقيقة). يجب أن يكون مزيج الدهون في الزيت الناتج غائما قليلا ، حيث لا يتم إذابة الدهون بالكامل في الزيت ولكن يتم تشتيتها على شكل مجاميع صغيرة24.
  4. ضع تشتت الدهون في الزيت في سونيكتور الحمام (انظر جدول المواد) بقوة بالموجات فوق الصوتية تبلغ 80 واط وتردد تشغيل 40 كيلو هرتز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. استخدم الخليط على الفور أو خزنه على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أقصاها 24 ساعة.

2. توليد الحويصلة

  1. قم بتركيب العمود المطبوع ثلاثي الأبعاد (الملف التكميلي 1) المصنوع من الراتنج الأسود (انظر جدول المواد) على لوحة التحريك على الطاولة واضبط سرعة الدوران على 1200 دورة في الدقيقة.
  2. قم بتركيب غرفة cDICE المطبوعة ثلاثية الأبعاد (الملف التكميلي 2) المصنوعة من راتنج شفاف (انظر جدول المواد) على العمود (الشكل 1A ، B).
  3. تحضير محاليل الأكتين والبروتينات المرتبطة بالأكتين (ABP) بشكل منفصل في حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر.
    1. تحضير 1-10 ميكرومتر من الأكتين في المخزن المؤقت الكروي للأكتين (G-buffer)، بما في ذلك 10٪ ATTO 488 أكتين (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت G-1x من 5 ملليمتر من Tris-HCl والرقم الهيدروجيني 8.0 و0.2 ملليمتر من CaCl2.
    2. أضف المخزن المؤقت لبلمرة الأكتين الخيطية (F-buffer) لبدء بلمرة الأكتين على الجليد. احتفظ بالمحاليل على الجليد لإبطاء بلمرة الأكتين قبل إضافة رابط متقاطع.
      ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت F-1x على 50 ملليمتر من KCl و2 ملليمتر من MgCl2 و3 ملليمتر من ATP في 10 ملليمتر من Tris، والرقم الهيدروجيني 7.5.
    3. انتظر لمدة 15 دقيقة للسماح ببدء بلمرة الأكتين على الجليد قبل إضافة روابط متقاطعة ذات أهمية عند النسبة المولية المطلوبة. احتفظ بالمحلول على الجليد حتى تغليفه.
    4. تحضير البروتينات المرتبطة بالأكتين (ABPs) بشكل منفصل في أنبوب دقيق (الشكل 1C).
      ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة عندما يتم تغليف مجموعة من ABPs (على سبيل المثال ، myosin ، α-actinin ، fascin ، Arp2/3 complex) مع actin25,26,27. وفي مثل هذه الحالات، تسحب الكمية المطلوبة من كل برنامج من برامج الجسر الأكاديمي من مخزونها وتضاف إلى الأنبوب الدقيق المخصص لبرامج الجسر الأكاديمي. وبما أن الحل الكلي يجب أن يكون 20 ميكرولتر، يجب تحضير الحصص المخزونية من ABPs بحيث لا تتجاوز الكمية المطلوبة من خليط ABP الكلي 5-6 ميكرولتر. وبرنامج الجسر الأكاديمي الوحيد المستخدم في النتائج التمثيلية هنا هو الافتتان، الذي يرد أدناه ذكر إعداده.
      1. Aliquot 1.57 ميكرولتر من اللفافة من 1.75 ملغم / مل من مخزون اللفافة (انظر جدول المواد) ، وإضافة مباشرة إلى محلول الأكتين في الخطوة 2.7. هذا يتوافق مع 2.5 ميكرومتر من اللفافة في المحلول.
  4. أضف 7.5٪ من وسط تدرج الكثافة (انظر جدول المواد) إلى محلول الأكتين لإنشاء تدرج كثافة بين الطور المائي الخارجي والداخلي لتسهيل ترسيب GUV.
  5. استغني عن 700 ميكرولتر من المحلول الخارجي البالغ 200 مللي متر من الجلوكوز في الغرفة (الشكل 1D ، إلى اليسار).
    ملاحظة: تحدد الأسمولية للمحلول الداخلي تركيز الجلوكوز. بالنسبة لهذه التجارب ، تبلغ أسمولية المحلول الداخلي ~ 200 mOsm ، لذلك يتم استخدام محلول الجلوكوز 200 mM كمحلول خارجي.
  6. أضف كمية كافية من خليط زيت الدهون (>3 مل بناء على حجم الغرفة) إلى الغرفة حتى يتم ملء 60٪ -80٪ من الغرفة (الشكل 1D ، يمين). سيتم تشكيل واجهة بين خليط الدهون والزيت والمحلول الخارجي.
  7. نقل ABPs (المعدة في الخطوة 2.3.4) إلى محلول الأكتين. باستخدام ماصة منتظمة 100-1000 ميكرولتر ، انقل على الفور 700 ميكرولتر من خليط زيت الدهون إلى خليط الأكتين - ABP (الشكل 1E ، اليسار). ماصة لأعلى ولأسفل 8 مرات لتوليد قطرات أحادية الطبقة من الدهون بحجم الخلية بقطر يتراوح بين 7-100 ميكرومتر (الشكل 1E ، الوسط).
    ملاحظة: يجب إكمال الخطوة 2.7 في بضع ثوان لتجنب أي تجميع لشبكة actin قبل التغليف. وبالتالي ، قبل تنفيذ الخطوة ، تأكد من إدخال أطراف الماصة بالفعل في الماصات وجاهزة لنقل الخلائط.
  8. باستخدام نفس الماصة 100-1000 ميكرولتر ، قم على الفور بتوزيع المستحلب بأكمله في الغرفة الدوارة. ستحصل القطرات على نشرة ثانية من الدهون عن طريق عبور الطبقة الأحادية الدهنية في واجهة المحلول الخارجي للزيت ، وبالتالي تشكيل GUVs (الشكل 1E ، إلى اليمين).
  9. قم بإزالة الغرفة من لوحة التحريك وتخلص من معظم خليط الزيت الدهني عن طريق إمالة الغرفة في حاوية النفايات بحيث يتم تصريف جزء كبير من خليط زيت الدهون من الفتحة الكبيرة في وسط الغرفة.
    ملاحظة: بهذه الطريقة ، يتم سحب خليط زيت الدهون خارج الغرفة ، وتجنب خلط خليط الدهون والزيت مع المحلول الخارجي في الخطوة التالية.
  10. أمسك الغرفة مع توجيه غطائها نحو المستخدم. افتح غطاء الغرفة وقم بإمالة الغرفة قليلا نحو المستخدم. يمكن رؤية الواجهة بين المحلول الخارجي الذي يحتوي على GUVs وخليط زيت الدهون من فتحة الغرفة (حيث يوجد الغطاء).
  11. باستخدام ماصة ، قم بجمع ما يكفي من المحلول الخارجي الذي يحتوي على GUVs وتوزيع 50-300 ميكرولتر من المحلول الخارجي في صفيحة 96 بئرا للحصول على كثافة مناسبة من GUVs.
    ملاحظة: بعد هذا البروتوكول ، يتم إطلاق ما مجموعه حوالي 2 × 105 GUVs في المحلول الخارجي داخل الغرفة. ولم يتم تحديد تشتت الاتحاد العام الفنزويلي الموحد؛ ومع ذلك ، فإن قطر حوالي 90 ٪ من GUVs في حدود 12-30 ميكرومتر. اعتمادا على وسط تدرج الكثافة المغلف ، وحجم GUV ، وعمق المحلول في لوحة البئر ، يستغرق الأمر من 2 إلى 15 دقيقة حتى تستقر GUVs على السطح. يبلغ عائد GUVs مع حزم الأكتين المعاد تشكيلها حوالي 90٪.

3. التصوير وإعادة بناء الصورة ثلاثية الأبعاد

  1. قم بإعداد لوحة البئر 96 على مسرح مجهر مقلوب مجهز بقرص دوار (أو مسح ضوئي بالليزر) وحدة بؤرية ، وكاميرا EMCCD أو كاميرا sCMOS ، وعدسة موضوعية لغمر الزيت 60x (انظر جدول المواد).
  2. ركز على أي منطقة ذات أهمية (ROI) والتقط تسلسل صور z-stack من عائد الاستثمار مع فاصل زمني z-step يبلغ 0.5 ميكرومتر.
    ملاحظة: نظرا لأن GUVs يمكن إزاحتها قليلا على السطح بمرور الوقت ، فمن المستحسن التقاط مجموعة متعددة الأطوال الموجية من الصور في كل مستوى z إذا تم تصوير العديد من الفلوروفورات ، أي التقاط مجموعة من صور 561 نانومتر و 488 نانومتر في كل حارة z في وقت واحد لالتقاط صور ATTO 488 actin و Rhod PE.
  3. احفظ كل تسلسل صور z-stack بتنسيق .tiff.
  4. افتح تسلسل صور ذي أهمية في برنامج معالجة صور (ImageJ/Fiji). حدد الصورة بأعلى كثافة. اضغط باستمرار على "ctrl + shift + c" لفتح نافذة السطوع والتباين وانقر فوق إعادة تعيين.
  5. من قائمة ImageJ/Fiji، انتقل إلى تحليل > تعيين المقياس وأدخل المسافة الفعلية المعروفة ووحدتها لكل بكسل صورة.
  6. من القائمة ImageJ/Fiji، انتقل إلى Image > Stacks > 3D لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد من المكدس z. قم بتعيين "طريقة الإسقاط" كنقطة سطوع، و"تباعد الشرائح (μm)" ك 0.5، ووضع علامة اختيار Interpolate. يمكن استخدام الخيارات الافتراضية لبقية الإعدادات.
    ملاحظة: قد لا تتم معايرة الفواصل الزمنية z في بعض المجاهر ، وقد تختلف الحركة الفعلية في اتجاه z اختلافا طفيفا عن الفاصل الزمني z الذي تم إدخاله (أي 0.5 ميكرومتر). في مثل هذه الحالات ، يمكن استخدام عينة معايرة 3D مثل المجهر الفلورسنت بقطر معروف للحصول على الفاصل الزمني z الفعلي. وبالتالي سيتم استخدام هذه القيمة ك "تباعد الشرائح (μm)" للإسقاط 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لإثبات النجاح في توليد GUVs الهيكلية الخلوية باستخدام البروتوكول الحالي ، أعيد تشكيل هياكل حزم fascin-actin في GUVs. Fascin هو رابط متقاطع قصير من خيوط الأكتين التي تشكل حزم أكتين متوازية صلبة ويتم تنقيتها من E. coli كبروتين اندماج Glutathione-S-Transferase (GST)26. تم إعادة تشكيل 5 ميكرومتر من الأكتين لأول مرة ، بما في ذلك 0.53 ميكرومتر من الأكتين ATTO488 في المخزن المؤقت لبلمرة الأكتين و 7.5٪ من وسط تدرج الكثافة. عند إضافة اللفافة بتركيز 2.5 ميكرومتر وتغليف خليط الأكتين الفاشي ، تم تشكيل هياكل حزمة الأكتين في GUVs. تم التقاط تسلسلات الصور البؤرية Z-stack لهياكل حزمة الأكتين المغلفة في GUVs المسماة ب PE rhodamine بعد 1 ساعة من التغليف (الشكل 2A). باستخدام هذا البروتوكول ، تم إثبات المنافسة المتأصلة وفرز روابط الأكتين المتقاطعة المغلفة ، α-actinin ، و fascin ، والتي ، معا ، تشكل أنماطا مختلفة من حزم الأكتين بطريقة تعتمد على حجم GUV ، في السابق26.

مثل نهج المستحلب المقلوب المعدل المقدم هنا ، تولد عملية cDICE التقليدية GUVs ذات الهيكل الخلوي ذات العائد العالي ولكنها تتطلب مضخة حقنة وإعداد أنابيب للحقن المتحكم فيه لمحلول البروتين في الغرفة الدوارة بمعدلات تدفق منخفضة بترتيب نانولتر في الثانية22,28. في هذا النهج ، يتم إنشاء المستحلب مباشرة في غرفة cDICE الدوارة ؛ يتم إدخال الشعيرات الدموية رقيقة في مرحلة الزيت. يتم حقن محلول البروتين من خلال مضخة حقنة. تتشكل القطرات ويتم قصها عند الطرف الشعري قبل أن تنتقل نحو المرحلة الخارجية المائية ، حيث تتحول إلى GUVs ، على غرار الطريقة الموضحة أعلاه. ويبين الشكل 2 باء الحويصلات التي تغلف خليط التفاعل باستخدام هذا النهج. يحتوي مزيج التفاعل على 6 ميكرومتر من الأكتين الذي يتم تجميعه بواسطة 0.9 ميكرومتر من الفاكن. هنا ، لا تتم مقارنة الطريقتين ونتائجهما ولكن لاحظ أنهما يولدان عائدا عاليا من GUVs.

Figure 1
الشكل 1: الإعداد التجريبي لتوليد GUVs . (أ) العرض العلوي وعرض القسم الجانبي لغرفة cDICE. (ب) صور الإعداد لغرفة الغزل. (ج-هاء) الرسوم التوضيحية التخطيطية للإجراءات التدريجية لتوليد المركبات متعددة الرسومات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تغليف هياكل حزمة الأكتين. (أ) تظهر الصور شرائح متحدة البؤرة التألق التمثيلية من الكائنات متعددة الاستخدامات (يسار) وإسقاطات قصوى لكومة z-stack متحدة البؤرة من قنوات الأكتين والدهون (يمين). اللفافة ، 2.5 ميكرومتر ؛ الأكتين ، 5 ميكرومتر (بما في ذلك 10 ٪ ATTO 488 أكتين). شريط المقياس = 10 ميكرومتر (B) تغليف هياكل حزمة الأكتين باستخدام cDICE التقليدي. تظهر الصورة إسقاطا أقصى تمثيليا لصور التألق البؤري لحزم الأكتين المغلفة التي تشكلت في وجود الفاكن. اللفافة ، 0.9 ميكرومتر ؛ Actin, 6 μM. Scale bar = 10 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملف تكميلي 1: تصميم رمح مطبوع 3D. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: تصميم غرفة cDICE المطبوعة ثلاثية الأبعاد. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم استكشاف طرق مختلفة لتوليد GUVs لإنشاء خلايا اصطناعية ومع ذلك ، فإن تعقيد الإجراءات ، والوقت الممتد لتحقيق التغليف ، وتقييد أنواع الدهون والتركيب الجزيئي للغلاف ، والحاجة إلى مواد كيميائية غير فسيولوجية لتسهيل التغليف ، وانخفاض إنتاجية GUV ، وعدم الاتساق في كفاءة التغليف لا تزال تشكل تحديا للباحثين في هذا المجال. وبالنظر إلى المجموعة الواسعة من الدراسات المحتملة التي يمكن الشروع فيها في البيولوجيا التركيبية من القاعدة إلى القمة، فإن نهج تغليف GUV عالي الإنتاجية السلس والمتوافق مع تركيبات الدهون المختلفة ويمكن أن يغلف أي جزيئات بغض النظر عن حجمها قد يحفز فرصا جديدة لدراسة الأنظمة الاصطناعية المعقدة التي تحاكي أحياء. لقد أزالت طريقة cDICE معظم التحديات والقيود المتأصلة في طرق توليد GUV السابقة.

النهج والمبادئ الحاكمة لتوليد GUVs باستخدام طريقة cDICE تسبق النظام الأساسي وتم تنفيذها في تقنيات سابقة مثل نقل المستحلب المقلوب12. ومع ذلك ، فإن طريقة نقل المستحلب المقلوب لها قيود مثل انخفاض إنتاجية الحويصلة وعدم تجانس الحويصلات. بالنسبة لطريقة cDICE المعروضة هنا ، يتم تشتيت الدهون في الزيت في شكل مجاميع من عشرات النانومترات (يعتمد حجم ركام الدهون على التركيز الكلي للدهون)24. تشتت الدهون هو في اثنين من الزيوت القابلة للامتزاج ، حيث واحد (الزيوت المعدنية) يمكن أن تذوب الدهون والثاني النفط (زيت السيليكون) غير قابل للامتزاج مع الدهون. هذا يخلق coacervates الكلي الدهون عن طريق تحويل المذيبات29. يسهل نهج التشتت الخاص هذا التشبع الفوري أحادي الطبقة للقطرات المائية والتجديد الأسرع للدهون في الواجهة المائية للزيت حيث تعبر القطرات المائية باستمرار الواجهة المائية المشبعة بالزيت المشبعة بالدهون. هذا أيضا يحسن لاحقا من سحاب الطبقة المزدوجة لتشكيل GUVs ويزيد من إنتاجية GUV. تعد قوى الطرد المركزي الناتجة عن الغرفة الدوارة مثالية لنقل القطرات متعددة التشتت عبر الواجهة المشبعة بالدهون. تستخدم النسخة الأصلية من طريقة cDICE فوهة شعرية دقيقة لحقن المحلول الداخلي في خليط الزيت والدهون. في هذا النهج ، تولد قوى القص الناتجة عن خليط الزيت والدهون الدوار قطرات مائية ، وتتحول في النهاية إلى GUVs كما هو موضح. ومع ذلك ، بقصد تقليل الوقت المستغرق لإعداد منصة الحقن ، وخاصة الحرجة للتفاعلات السريعة ، مثل تجميع شبكة الأكتين والانسداد المحتمل للشعيرات الدموية الدقيقة ، يتم الآن توليد قطرات مائية ذات طبقات أحادية الدهون عن طريق إضافة خليط الزيت والدهون مباشرة إلى المحلول الداخلي والسحب لأعلى ولأسفل. هذا النهج يلغي الفارق الزمني في تغليف GUV لتجربة رد فعل سريع.

من بين التحديات التي تسببها طرق توليد GUV السابقة هو تقييد أنواع الدهون (شحنة الدهون ومرحلة الدهون) اعتمادا على تقنية توليد GUV. تم اختبار أنواع متعددة من الدهون ، بما في ذلك DOPC ، و dioleoyl-glycero-hosphoserine (DOPS) ، و dioleoyl-glycero-succinate (DGS) ، و dimyristoyl-glycero-phosphocholine (DMPC) ، ومجموعات من الدهون المختلفة والكوليسترول بتركيزات مختلفة. بالنسبة لجميع الظروف ، تظهر طريقة cDICE لتشكيل GUVs بكفاءة تغليف عالية بعائد GUV مرتفع باستمرار. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أيضا أن طريقة cDICE تغلف المكونات الخلوية المختلفة بشكل فعال ، بما في ذلك البروتينات الهيكلية الخلوية ، وتفاعلات التعبير الخالية من الخلايا ، وعوامل الازدحام ، والأصباغ ، والجزيئات الخلوية الأخرى ذات الأحجام المختلفة دون فقدان كفاءة التغليف أو انخفاض الإنتاجية. علاوة على ذلك ، مثل طرق نقل المستحلب المقلوب العادية30 ، يمكن أن يسمح cDICE المعدل بتوليد GUVs غير متماثلة للعمل في المستقبل. يمكن استخدام تركيبات دهنية مختلفة للنشرة الداخلية والنشرة الخارجية حيث يتم تشكيل قطرات أحادية الطبقة بشكل منفصل (داخل أنبوب دقيق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل) قبل ضغط الطبقة الثنائية داخل غرفة cDICE. لوحظ ترسيب الدهون عندما يتم الاحتفاظ بخليط الدهون والزيت لفترة طويلة ؛ ومع ذلك ، يمكن للمرء ببساطة دوامة خليط الدهون والزيت قبل التغليف لإعادة تشتيت مجاميع الدهون. من المهم ملاحظة أن جودة التغليف يمكن أن تتعرض للخطر عندما يتم الاحتفاظ بمخاليط الدهون والزيوت لفترة أطول ، كما هو موضح في مجاميع الدهون الأكثر أهمية من المعتاد في مزيج الدهون والزيت. على الرغم من عدم اختبارها ، إلا أن هذه المجاميع يمكن أن تؤدي إلى نقص في سحاب الطبقة الثنائية ، وقد ينتهي الأمر أيضا بتغليف الركام بمحلول داخلي يعرض البيئة الكيميائية المطلوبة للخطر.

الحد من النهج المعدل المقدم لتشكيل قطرات مائية هو في توليد التوحيد في حجم القطرات. على الرغم من أنه يمكن تحسين ذلك باستخدام الحقن الشعري الدقيق للمحلول الداخلي بمعدلات تدفق مختلفة لتنظيم أحجام GUV ، إلا أنه من غير المرغوب فيه مراقبة التفاعلات السريعة مثل تجميع الأكتين في GUVs المغلفة. من خلال صنع قطرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل مما يؤدي إلى أحجام GUV مختلفة ، يمكن للمرء تحليل مجموعات الحويصلات ذات الحجم المماثل. وتعوق المخاوف بشأن احتمال الاحتفاظ بالزيت في الطبقات الثنائية اعتماد معظم تقنيات توليد المركبات متعددة الرسومات، بما في ذلك تقنيات توليد ال GUV القائمة على المستحلب مثل cDICE21. ومع ذلك ، يمكن تقليل كمية الزيت المتبقية في الغشاء باستخدام عوامل عضوية مثل 1-octanol ، والتي يمكن إزالتها بعد توليد الحويصلات31,32. ويلزم التحقيق في التعديلات المستقبلية على هذه الطريقة، ربما عن طريق تغيير تكوين المذيبات.

هناك العديد من المجالات في البيولوجيا التركيبية من القاعدة إلى القمة التي لم يتم التحقيق فيها بعد وربما تتطلب قيودا تحاكي الخلايا في GUVs. تتطلب هذه المساعي التجريبية منصات توليد GUV مثل cDICE لتوليد GUVs بقوة مع تغليف جزيئات مختلفة ذات أهمية بكفاءة. تحدث العديد من العمليات الخلوية بشكل أسرع من الوقت الذي يستغرقه تغليف الجزيئات باستخدام تقنيات توليد GUV السابقة. كما هو موضح هنا ، يتم تغليف محاليل الأكتين بسرعة كافية لمراقبة تشوه الحويصلة الناتج عن تجميع شبكة الأكتين. وقد كشفت هذه الخلايا الاصطناعية مع الهيكل الخلوي الأكتين المعاد تشكيله عن ميزات تنظيم شبكة الأكتين في وجود روابط متقاطعة مختلفة5،25،33 وإعادة تشكيل الغشاء 25،27،28. وسوف تلهم العمل المستقبلي لإنشاء خلايا اصطناعية أكثر تطورا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تعترف APL بالدعم المقدم من زمالة Humboldt Research للباحثين ذوي الخبرة ومن المؤسسة الوطنية للعلوم (1939310 و 1817909) والمعاهد الوطنية للصحة (R01 EB030031).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18:1 Liss Rhod PE lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 810150C
96 Well Optical Btm Pit PolymerBase ThermoFisher Scientific 165305
Actin from rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99-A
ATTO 488-actin from rabbit skeletal muscle Hypermol 8153-01
Axygen microtubes (200 µL) Fisher Scientific 14-222-262 for handling ABPs
Black resin Formlabs RS-F2-GPBK-04
Cholesterol (powder) Avanti Polar Lipids 700100P
Choloroform Sigma Aldrich 67-66-3
Clear resin Formlabs RS-F2-GPCL-04
CSU-X1 Confocal Scanner Unit YOKOGAWA CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep) Sigma-Aldrich D1556
DOPC lipid in chloroform Avanti Polar Lipids 850375C
Fascin homemade N/A
F-buffer homemade N/A
Fisherbrand microtubes (1.5 mL) Fisher Scientific 05-408-129
FS02 Sonicator Fischer Scientific FS20
G-buffer homemade N/A
Glucose Sigma-Aldrich 158968
iXon X3 camera Andor DU-897E-CS0
Mineral oil Acros Organics 8042-47-5
Olympus IX81 Inverted Microscope Olympus IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective Olumpus 1-U2B933
Silicone oil Sigma-Aldrich 317667

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (3), 1685 (2021).
  2. Diltemiz, S. E., et al. Use of artificial cells as drug carriers. Materials Chemistry Frontiers. 5, 6672-6692 (2021).
  3. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  4. Ganzinger, K. A., Schwille, P. More from less - bottom-up reconstitution of cell biology. Journal of Cell Science. 132 (4), 227488 (2019).
  5. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  6. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. Physiol reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81, 303-311 (1986).
  8. Tsumoto, K., Matsuo, H., Tomita, M., Yoshimura, T. Efficient formation of giant liposomes through the gentle hydration of phosphatidylcholine films doped with sugar. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 68 (1), 98-105 (2009).
  9. Bailey, A. L., Cullis, P. R. Membrane fusion with cationic liposomes: Effects of target membrane lipid composition. Biochemistry. 36 (7), 1628-1634 (1997).
  10. Haluska, C. K., Riske, K. A., Marchi-Artzner, V., Lehn, J. M., Lipowsky, R., Dimova, R. Time scales of membrane fusion revealed by direct imaging of vesicle fusion with high temporal resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (43), 15841-15846 (2006).
  11. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. Journal of Colloid and Interface Science. 376 (1), 119-125 (2012).
  12. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Liu, A. P., Parekh, S. H., Fletcher, D. A. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  15. Ho, K. K. Y., Murray, V. L., Liu, A. P. Engineering artificial cells by combining HeLa-based cell-free expression and ultrathin double emulsion template. Methods in Cell Biology. , 303-318 (2015).
  16. Akashi, K., Miyata, H., Itoh, H., Kinosita, K. Preparation of giant liposomes in physiological conditions and their characterization under an optical microscope. Biophysical Journal. 71 (6), 3242-3250 (1996).
  17. Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation: From lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  18. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  19. Pécheur, E. I., Martin, I., Ruysschaert, J. M., Bienvenüe, A., Hoekstra, D. Membrane fusion induced by 11-mer anionic and cationic peptides: A structure− function study. Biochemistry. 37 (8), 2361-2371 (1998).
  20. Morigaki, K., Walde, P. Giant vesicle formation from oleic acid/sodium oleate on glass surfaces induced by adsorbed hydrocarbon molecules. Langmuir. 18 (26), 10509-10511 (2002).
  21. Majumder, S., Wubshet, N., Liu, A. P. Encapsulation of complex solutions using droplet microfluidics towards the synthesis of artificial cells. Journal of Micromechanics and Microengineering. 29 (8), 83001 (2019).
  22. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  23. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  24. Claudet, C., In, M., Massiera, G. Method to disperse lipids as aggregates in oil for bilayers production. The European Physical Journal E. 39 (1), 1-6 (2016).
  25. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N. H., Liu, A. P. Confinement Geometry tunes fascin-actin bundle structures and consequently the shape of a lipid bilayer vesicle. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 610277 (2020).
  26. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Communications Biology. 4, 1136 (2021).
  27. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. bioRxiv. , (2021).
  28. Litschel, T., et al. Reconstitution of contractile actomyosin rings in vesicles. Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).
  29. Vitale, S. A., Katz, J. L. Liquid droplet dispersions formed by homogeneous liquid− liquid nucleation:"The Ouzo effect.". Langmuir. 19 (10), 4105-4110 (2003).
  30. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  31. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  32. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  33. Wubshet, N. H., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Fascin-induced actin protrusions are suppressed by dendritic networks in GUVs. Molecular Biology of the Cell. 32 (18), 1634-1640 (2021).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 177 ، نقل المستحلب ، cDICE ، GUVs ، إعادة التشكيل من أسفل إلى أعلى ، actin ، fascin
التغليف السريع للهيكل الخلوي المعاد تشكيله داخل حويصلات يونيلاميلار العملاقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bashirzadeh, Y., Wubshet, N.,… More

Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (177), e63332, doi:10.3791/63332 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter