Summary
Musens fortænder indeholder værdifulde etiketbevarende celler i sin stamcelleniche. Vi har en ny måde til upartisk at detektere og kvantificere de etiketbevarende celler; vores undersøgelse brugte EdU-mærkning og en 3D-rekonstruktionstilgang efter PEGASOS-vævsrensning af underkæben.
Abstract
Murinforænden er et organ, der vokser kontinuerligt gennem musens levetid. De epitel- og mesenkymale stamceller, der er bosiddende i forændernes proksimale væv, giver anledning til afkom, der vil differentiere sig til ameloblaster, odontoblaster og pulpfibroblaster. Disse celler er afgørende for at understøtte den vedvarende omsætning af fortændervæv, hvilket gør murinfortænderne til en fremragende model til at studere homeostase af voksne stamceller. Stamceller menes at indeholde langlevende hvilende celler, der kan mærkes med nukleotidanaloger såsom 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU). Cellerne bevarer denne etiket over tid og kaldes derfor etiketbevarende celler (LRC'er). Tilgange til visualisering af LRC'er in vivo giver et robust værktøj til overvågning af stamcellehomeostase. I denne undersøgelse beskrev vi en metode til visualisering og analyse af LRC'er. Vores innovative tilgang indeholder LRC'er i musefortænder efter vævsrensning og helmonteret EdU-farvning efterfulgt af konfokal mikroskopi og en 3-dimensionel (3D) rekonstruktion med billedbehandlingssoftwaren. Denne metode muliggør indsamling af 3D-billeddannelse og upartisk kvantificering sammenlignet med traditionel LRC-analyse på dias med sektioner.
Introduction
Den kontinuerligt voksende musefortænder er en fremragende model til at studere voksne stamceller1. Epitelial (labial og lingual cervikal loop) og mesenkymale stamceller (mellem labial og lingual cervikal loop), der befinder sig på den proksimale side af forænden, differentieres i ameloblaster, odontoblaster og tandmasseceller. Denne unikke proces giver en kilde til celler til kompensation for vævstab og omsætning2. Selvom flere stamcellemarkører som Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1 osv. er blevet identificeret in vivo for undergrupperne af voksne stamceller i musefortænder, er de utilstrækkelige til at repræsentere stamcellepopulationerne, når de anvendes alene 1,3,4,5. Visualisering af langtidslevende hvilende celler ved nukleotidanalog DNA-mærkning og tilbageholdelse kunne give upartisk detektion for de fleste undergrupper af voksne stamceller6. Endvidere er denne tilgang nyttig blandt mange stamcelleidentifikationsmetoder7 til forståelse af celleadfærd og homeostase af dentale stamcellepopulationer 3,8. Mens de delende stamceller ville miste deres DNA-mærkning efter en betydelig jagt, bevarer de formodede hvilende stamceller deres DNA-etiket og anser dem for etiketbevarende celler (LRC'er)6. DNA-mærkning og tilbageholdelse af ikke-delende stamceller vil markere og lokalisere de formodede voksne stamceller i deres nicher.
I løbet af de sidste år har thymidinanalog 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU) mærkning erstattet den besværlige, tidskrævende og højopløsningsmikroskopi-inkompatible 3H-thymidin-DNA-mærkningsmetode til celleproliferationsassays 6,9. I de senere år er 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) mærkningsteknikken i stigende grad blevet brugt over BrdU. Dette mønster opstod på grund af flere grunde. For det første er BrdU-metoden langsom og arbejdskrævende. Brugerforholdene er variable, og det er ikke i stand til at bevare ultrastrukturen i prøver (på grund af DNA-denaturering). På samme måde mister BrdU-metoden cellernes antigenicitet, hvilket gør den ineffektiv til downstream-funktionelle analyser og assays såsom co-lokaliseringseksperimenter og in vivo-stamcelletransplantation 3,7,9,10,11,12. BrdU er også et teratogen, som ikke er egnet til mærkning af LRC'er i embryonal udvikling6. BrdU-metoden er også ineffektiv, når den anvendes i helmonterede prøver. Ulemperne er lav penetration af antistoffer i den dybe del af prøver eller kravet om en lang antistofinkubationsperiode for dyb penetration13. EdU-mærkning undslipper trinene til denaturering af prøver og bevarer således ultrastrukturen. Denne funktion er fordelagtig for downstream-funktionelle analyser såsom co-lokaliseringseksperimenter og stamcelletransplantation11,12. EdU-mærkning er også meget følsom og hurtig; prøvepenetrationen er høj på grund af brugen af hurtigt absorberede og mindre fluorescerende azider til påvisning af EdU-etiketter gennem en Cu (I) -katalyseret [3 + 2] cycloadditionsreaktion ("klik" kemi)14.
En anden stadig mere anvendt DNA-mærkningsmetode er brugen af konstruerede transgene mus. Disse mus udtrykker histon 2B grønt fluorescerende protein (H2B-GFP) styret af et tetracyklinresponsivt regulatorelement 5,14. Efter fodring af mus med tetracyklinchow/vand i en 4-ugers til 4-måneders jagtperiode, vil GFP-fluorescensen falde i cykelceller, og kun LRC'er bevarer fluorescensen6. Fordelen ved denne metode er, at de mærkede LRC'er kan isoleres og forblive levedygtige til cellekultur eller downstream-funktionelle analyser 6,7. Nogle undersøgelser rapporterede unøjagtig mærkning af hvilende stamceller, når de jages til langvarig brug. Dette resultat skyldtes et utæt baggrundsudtryk fra H2B-GFP-stammen og ikke det passende tetracyklinregulerede respons15.
Desuden brugte det meste litteratur tidligere LRC'ernes detektion hovedsageligt på sektionerede dias, som er todimensionelle og ofte fejlagtigt forudindtaget i at vise den nøjagtige placering og antallet af LRC'er. Fremgangsmåden viste forkerte vinkler for sektioner af komplekse vævsstrukturer16. Den anden metode var at opnå 3D-billeder fra serielle sektioner og udføre post-image rekonstruktioner. Disse trin var unøjagtige på grund af billedforvrængning fra variationer i hvert serielt afsnit på grund af komprimerede eller strakte sektioner, hvilket resulterede i manglende information16,17,18. Metoden var også besværlig og tidskrævende.
For at lette helmonteringsbilleddannelsen af LRC'er skal prøverne gøres klare, mens fluorescensen vedligeholdes godt. Nuværende vævsrensningsteknikker kan klassificeres i tre hovedkategorier: organiske opløsningsmiddelbaserede vævsrensningsteknikker, vandige reagensbaserede vævsrensningsteknikker og hydrogelbaserede vævsrensningsteknikker17,19. Det polyethylenglycol (PEG)-associerede opløsningsmiddelsystem (PEGASOS) er for nylig blevet udviklet. Denne tilgang gør næsten alle typer væv gennemsigtige og bevarer endogen fluorescens, herunder hårdt væv som knogler og tænder20. PEGASOS-metoden har fordele i forhold til andre vævsrensningsmetoder, især ved rensning af tand- og knoglematerialer. De fleste andre metoder kunne kun delvis fjerne hårdt væv, have lange behandlingstider eller kræve dyre reagenser21. PEGASOS-metoden kan også effektivt bevare endogen fluorescens frem for andre metoder.
Denne litteratur førte os til at skabe en ny metode til celleundersøgelse. Vi kombinerede LRC's detektionsfordele ved EdU-mærkning med den mest overlegne 3D-helmonterede billeddannelse af vævsrensede prøver; Prøverne blev behandlet med avanceret polyethylenglycol (PEG)-associeret opløsningsmiddelsystem (PEGASOS) vævsrydningsteknik15. Gennemsigtighed i hårdt væv gjorde det muligt for os at rekonstruere 3D-signalet fra LRC's fluorescens in vivo uden at knække tænderne eller underkæben, hvilket skabte en mere præcis måde at visualisere og kvantificere LRC'er på.
I denne undersøgelse giver vi en innovativ guide til visualisering af LRC'er i musefortænderne. Vi lavede en visuel 3D-tilgang til at bestemme placeringen og mængden af LRC'er inden for musefortandstamcellenichen. Dette projekt brugte EdU-mærkning, PEGASOS-vævsrensningsteknikker og konfokal mikroskopi. Vores metode til EdU-mærkning af LRC'erne på helmonteret væv og brugen af en ryddet og gennemsigtig prøve overvinder både begrænsningerne ved traditionelle sektionerede dias og andre ufordelagtige DNA-mærkningsmetoder. Således vil vores teknik være velegnet til undersøgelser af stamcellehomeostase, der kræver LRC-detektion, især på hårdt væv. Protokollen kan være lige så fordelagtig for dem, der fokuserer på stamcellehomeostase i andre væv og organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) for Texas A &M University College of Dentistry.
1. Forberedelse af EdU-mærkningscocktailen
- Forbered cocktailstamopløsningerne som beskrevet i tabel 1.
- Forbered EdU-mærkningscocktailen som beskrevet i tabel 1.
2. Fremstilling af musene og EdU-opløsningen
- Forbered EdU-opløsningen. EdU opløses i DMSO ved 20 mg/ml og opbevares i fryser til -20 °C.
FORSIGTIG: EdU er et mutagen. Brugere bør bære passende personlige værnemidler (PPE) ved håndtering af dette stof. - 5 dage gamle C57BL/6J-mus injiceres med den tilberedte EdU-opløsning intraperitonealt ved 3 μL/g legemsvægt. Mus skal modtage opløsningen en gang dagligt i 7 på hinanden følgende dage. Derefter gennemgår de en jagtperiode i 6 uger, før de høstes til analyse (figur 1).
FORSIGTIG: Vær forsigtig med at undgå nålestik, når du injicerer EdU i musene. Efter injektion af EdU i 7 på hinanden følgende dage placeres musene i et nyt bur. Når musene er i deres nye hjem, skal du bortskaffe strøelsen i det gamle bur ved hjælp af passende biohazard-regler.
3. Prøveforberedelse ved transkardial perfusion (postnatale 53 dage gamle mus efter 6-ugers jagtperioden)
BEMÆRK: Museleveren skal blive bleg efter vellykket transkardial perfusion.
- Bedøv mus med en intraperitoneal injektion. De skal gives en kombination af xylazin og ketaminanæstetika (xylazin 10-12,5 mg / kg; Ketamin, 80-100 mg/kg legemsvægt).
- Vent i ~ 10 minutter, indtil musen ikke længere reagerer på smertefulde stimuli (såsom poteklemmereflekser).
- Placer musene i liggende stilling stabiliseret på isoporstøtte med nåle i hver pote.
- Udsæt brysthulen ved at åbne den overliggende hud ved hjælp af pincet og dissekere saks.
- Skær membranen op ved hjælp af en skarp saks. Pas på ikke at gennembore hjertet.
- Skær gennem brystkassen, tag fat i bunden af brystbenet med klemmesaks for at udsætte hjertet.
- Overfør musen til perfusionstrinnet nær cirkulationspumpen i en stinkhætte.
- Indsæt 25 G kanylen (fra slangen fyldt med fosfatbufret saltvand (PBS)/4% paraformaldehyd (PFA) opløsning) i toppen af venstre ventrikel. Pas på at holde spidsen af nålen i ventrikelens lumen.
FORSIGTIG: PFA er moderat giftigt og et sandsynligt kræftfremkaldende stof. Brug PPE til at håndtere PFA og klargør opløsningen under en kemisk damphætte. Affald PFA kræver korrekt bortskaffelse pr. Institutions retningslinjer. - Skær højre ventrikel ved hjælp af en skarp saks umiddelbart efter indsættelse af nålen i venstre ventrikel. Dette trin gør det muligt for blod at strømme ud af musen og dræne ind i opsamlingsskålen.
- Perfus prøverne med 50 ml PBS-opløsning ved en strømningshastighed på 7 ml/min.
- Efter PBS-perfusion skiftes stophanen for at muliggøre et flow på 20 ml 4% PFA-opløsning ved samme strømningshastighed på 5 ml/min.
- Mens cirkulationspumpen stadig er tændt, skal nålen fjernes fra venstre ventrikel.
BEMÆRK: Musen er nu fastgjort til vævsopsamling. For at bevare fluorescensen bør lyseksponering undgås, når det er muligt gennem hele protokollen. Mens vævet behandles, kan det 50 ml koniske rør med vævsprøverne dækkes med aluminiumsfolie.
4. Vævsrensning af underkæben ved hjælp af PEGASOS-teknikken
BEMÆRK: Et konisk rør på 15 ml eller 50 ml i henhold til vævsvolumen kan bruges til at holde prøverne klar til behandling i hvert trin. Prøverne behandles ved 37 °C rysteanordninger (~100 o/min) fra trin 4.2 til 4.7. Brug polypropylenbaserede plastbeholdere, der er resistente over for organiske opløsningsmidler for at undgå at smelte plasten. Alternativt kan glasvarer bruges.
FORSIGTIG: PEGASOS-vævsrensningsteknikken bruger giftige opløsninger som quadrol, polyethylenglycol (PEG), benzylbenzoat (BB), MMA500 osv. Der kræves passende PV for at undgå potentiel eksponering.
- Dissekere mandibler og yderligere fikse prøver i 4% PFA. Opbevar dem ved stuetemperatur natten over.
- Fjern musklerne fra mandiblerne og nedsænk dem i 0,5 M EDTA-opløsning (pH 8,0) for at afkalke i 4 dage. I denne periode udføres et dagligt mediumskift på en 37 °C ryster.
BEMÆRK: Det er ønskeligt at fjerne musklerne fra prøven så meget som muligt. Denne forholdsregel vil forenkle billeddannelsesprocessen og reducere autofluorescensen fra musklerne. - Affarve mandiblerne med en 25% quadrolopløsning (v / v i H2O) på en 37 ° C ryster i en dag for at fjerne den resterende blodhæm.
- Komplet hele mount EdU-farvning.
- Forbered en frisk EdU-mærkningscocktail i henhold til tabel 1.
BEMÆRK: EdU-mærkningscocktailen skal gøres frisk hver gang med frisklavet ascorbatopløsning tilsat for at opnå optimale EdU-mærkningsresultater. - Skyl underkæberne med PBST i 30 minutter på en 37 °C ryster.
- Skyl mandiblerne med PBS tre gange i 3 minutter hver gang.
- Inkuber mandiblerne i en frisklavet EdU-mærkningscocktail på en 37 °C shaker natten over.
- Skyl mandiblerne med PBS tre gange i 3 minutter hver gang.
- Forbered en frisk EdU-mærkningscocktail i henhold til tabel 1.
- Der udføres seriel delipidering i hver af følgende opløsninger i 6 timer ved 37 °C:
30% tert-butanol (tB) opløsning: 75% v / v H2O, 22% v / v tB og 3% v / v quadrol.
50% tB opløsning: 50% v/v H2O, 47% v/v tB og 3% v/v quadrol.
70% tB opløsning: 30% v/v H2O, 67% v/v tB og 3% v/v Quadrol
BEMÆRK: De-lipideringstrinnet er kritisk. Delipidering kan udføres mellem 4-6 timer i 30% og 50% tB opløsning og i 1 dag i 70% tB opløsning. - Underkæberne dehydreres i tB-PEG-opløsning i 2 dage med følgende daglige mediumændring: 75% tB, 22% v/v polyethylenglycolmethylethermethacrylat gennemsnitlig MMA500 og 3% v/v quadrol ved 37 °C.
- Ryd underkæben i benzylbenzoat (BB)-PEG-clearingmediet for at opnå brydningsindeksmatchning: 75% v/v BB, 22% v/v PEG-MMA500 og 3% quadrol, indtil gennemsigtighed er opnået.
BEMÆRK: Vi har oplysninger om brydningsindeksmatchning. De uorganiske og organiske komponenter i væv såsom vand, lipider, proteiner, mineraler, organeller osv. har et andet brydningsindeks (RI) i området fra 1,33 til 1,55. Denne RI-uoverensstemmelse mellem vævskomponenterne hindrer billeddannelsesprocessen. Gennemsigtighed kan opnås ved at eliminere RI-mismatch i vævet. Det anbefales at nedsænke de vævsrensede prøver i clearingmediet BB-PEG. Dette trin giver den ensartede interne RI på ~ 1,54 (kaldet RI-matchning) til hele prøven, hvilket letter billeddannelsesprocessen. - Bevar mandiblerne i BB-PEG-vævsrensningsmediet ved stuetemperatur til opbevaring og billeddannelse.
BEMÆRK: Det er godt at afslutte billeddannelsen så hurtigt som muligt for at undgå gradvist tab af fluorescerende reportere. PEGASOS-metoden vil dog holde fluorescensjournalister velbevaret, selv efter flere ugers opbevaring20,21. Til langtidsopbevaring kan prøverne også opbevares ved 4 °C.
5. Konfokal billeddannelse af den vævsrensede underkæbe
- Monter vævet ryddet hele underkæben på mærkehulrumsglas i BB-PEG-clearingmediet og dæk med glasdæksel. Undgå bobler.
- Udfør billedoptagelse med et passende laserscanningskonfokalmikroskop. Vælg Hent og indstil parametrene for billedoptagelse til 512 x 512 pixel opløsning og 400 Hz optagelseshastighed. Disse indstillinger findes i menuen til anskaffelsestilstand for softwaren, der styrer mikroskopet.
- I panelet til fluorescerende excitation skal du aktivere den krævede laser (TRITC) for optimalt at excitere fluoroforer (sonden, vi brugte til LRC's visualisering, har fluorescerende egenskaber såsom Cy3 med excitation ved 548 nm og emission ved 563 nm laserbølgelængde).
- I panelet til fluorescerende detektion skal du flytte skyderen for at vælge de bølgelængder, der skal måles (for eksempel mellem 555 og 625 nm for en Cy3-lignende fluorofor).
- Placer den monterede underkæbe på mikroskoptrinnet for at visualisere og finde prøven ved hjælp af hvidt lys og et lavere forstørrelsesmål (2-10x).
- Tilføj en dråbe nedsænkningsolie med et brydningsindeks på 1,52 oven på dæksedlen for at matche brydningsindekset for glasdækslet og målet.
BEMÆRK: Match brydningsindekset for mål, billedmedier og væv så tæt som muligt for at minimere introduktionen af optiske forvrængninger under billedoptagelse. - Tænd lysstofrørene, og vælg et passende forstørrelsesmål for at afbilde områder af interesse. Vi brugte et 20x objektivobjektiv med en numerisk blænde på 0,9 med en arbejdsafstand på 1,95 mm. En linse med længere arbejdsafstand kan være påkrævet ved billeddannelse af større vævsprøver i konfokalmikroskopet. Alternativt kan billeddannelse let udføres ved hjælp af et lysarkmikroskop til større vævsprøver.
- På den konfokale billedbehandlingssoftware skal du trykke på Live-knappen for at starte live-scanningstilstand. For at maksimere billedernes dynamiske område og undgå pixelmætning skal du justere forstærkningen og laserintensiteten for den valgte kanal.
- Identificer synsfeltet for at visualisere hele underkæbens område i X- og Y-dimensionerne. Indstil de øvre og nedre Z-trins erhvervelsesparametre, der nøjagtigt dækker volumenet af stamcellenichen i musenes fortænder. Brug en Z-trinstørrelse på 2 μm eller efter dine krav. De nyere versioner af konfokale mikroskoper skal automatisk kunne erhverve z-stakke af de forskellige overlappende regioner.
- Hent og gem Z-stack-billedfiler i .lif-format.
BEMÆRK: .lif-fluerne kan konverteres til .tiff filer og bruges til anden 3D-analysesoftware.
6. Billedbehandling, 3D-billedrekonstruktion og kvantificering af etiketbevarende celler ved at skabe en overflade, segmentering af interesseområdet (ROI), maskere ROI og skabe pletter
BEMÆRK: Vi brugte Imaris (Bitplane 9.0.1) til billedbehandling og 3D-rekonstruktion, men lignende billedbehandlingstrin kan udføres ved hjælp af andre softwarepakker (f.eks. ImageJ / Fiji, 3D-slicer, Avizo, Arivis, Amira osv.).
- Klik på knappen Arena i billedbehandlingssoftwaren, og vælg derefter Billede. Vælg den originale . lif-fil, og vælg flettet fil , billederne importeres til billedbehandlingssoftwaren.
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge en billedbehandlingssoftwarefilkonverter til at konvertere Z-stakbilledfil til den oprindelige formatfiltype for softwaren. For eksempel: konverter .lif-filerne til .ims-filer ved hjælp af Imaris File Converter, og åbn .ims-filerne i billedbehandlingssoftwaren. Konvertering af data til softwarens oprindelige filformat muliggør hurtig filkonvertering og minimerer fejl. - Dobbeltklik på den importerede fil for at åbne billeddatasættet.
- Besøg panelet Skærmjustering , klik på navnet på kanalen. Det er normalt mærket som rødt i standardtilstand.
- I vinduet Billedegenskaber skal du klikke på fanen Tilknyttet farve . I indstillingen Farvetabelfil skal du vælge Fire Flow og derefter klikke på OK. Displayfarven vælges normalt for at skelne baggrundsfluorescensen og den positive fluorescens fra prøven.
- I øverste venstre side af skærmen i ruden Scene – Egenskaber skal du klikke på det blå ikon mærket Tilføj ny overflade. Fjern markeringen af lydstyrkeikonet , som fjerner det meste af baggrundsfluorescensen, og den positive fluorescens er tydeligt synlige (se trin 6.4.2).
- Start processen med manuel segmentering af interesseområde (ROI) ved at klikke på fanen Opret og vælge fanen Spring automatisk oprettelse over, Rediger manuelt . I guiden til manuel overfladeoprettelse skal du klikke på fanen Kontur for at vælge retningen (XY eller YZ eller XZ) baseret på prøverne for nemt at konturere ROI. Her vælger vi XY-orientering.
- Sørg derefter for, at markørmenuen i højre hjørne er i Vælg tilstand. Juster udsnitspositionen for at finde investeringsafkastet i vævet. Du vil bemærke, at det meste af baggrundsfluorescensen er blevet fjernet med tydelig positiv fluorescens som nævnt i trin 6.4. Klik på knappen Tegn og tegn et foreløbigt område af interesse. Vælg indstillingen Synlighed til ingen for at undgå interferens fra andre områder end ROI.
- Gentag trin 6.4.2. Udsnit for skive for at tegne hele interesseområdet.
- Når ROI-tegningen er færdig, skal du klikke på Opret Surface for at få en 3D-geometri af ROI.
- Klik på knappen Rediger i guiden til manuel oprettelse af overflade, og vælg Mask alle.
- I vinduet Mask Channel (Mask Channel) vises i vinduet Maskekanal , og vælg Kanal 1 i indstillingerne for kanalvalg. Vælg derefter Dupliker kanal, før du anvender masken. I maskeindstillingerne skal du vælge Konstant indvendig/udvendig og indstille voxelens udvendige overflade til 0.
- I ruden Sceneegenskaber skal du fravælge overfladeobjektet og vælge volumenobjektet. I skærmjusteringen skal du fravælge den oprindelige "røde" kanal og vælge kanalen Maskeret rød og justere farveintensiteterne for at få det ønskede 3D-gengivne og positivt mærkede fluorescens-ROI.
- Opret et nyt staffageobjekt. Begynd med at klikke på ikonet Tilføj på pletter for at kvantificere de 3D-gengivne LRC'er ved at oprette 3D-pletter, der sammenligneligt overlapper 3D-gengivne LRC'er. Brug de nederste pile til at flytte mellem trinnene i guiden til oprettelse af staffage.
- I guiden til oprettelse af spot vil der være fire sekventielle trin med instruktioner til automatisk oprettelse af pletter med softwaren. Sørg for, at indstillingen Segmentér kun et interesseområde er valgt i første trin. Klik på ikonet Næste .
- I det andet trin vil der være en "XYZ 3D-boks". Juster XYZ-boksen for at dække ROI. Klik på ikonet Næste .
- I det tredje trin skal du gå til indstillingerne for kildekanal . Vælg den maskerede røde kanal; Indtast den estimerede XY-spotdiameter, der er sammenlignelig med at passe og overlappe prøvefluorescenspunkterne. Klik på ikonet Næste .
- I det fjerde trin skal du tilføje filtertypen "Kvalitet" og justere den nedre intensitetstærskel ved at flytte glidevinduet hen over histogrammet "Kvalitet", indtil størstedelen af identificerbare LRC'er er mærket.
BEMÆRK: Segmenteringen og derfor statistiske aflæsninger (eksempel: antal celler) afhænger meget af intensitetstærskelværdierne. Vær omhyggelig med præcist at indstille de relevante tærskelværdier. - Klik på knappen Udfør , og vælg knappen Statistik . Vælg fanen Samlet for at finde værdien for det samlede antal pletter i billedet.
- Eksporter statistik ved at klikke på knappen Vis faneblad til fil og modtag resultaterne i en .xls fil.
- Brug et passende diagram til at præsentere kvantificeringsresultaterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter EdU-mærkning og PEGASOS-vævsrensningsprocessen (figur 2) blev den gennemsigtige underkæbe opnået som vist på vores billede (figur 3B). Vi sammenlignede den modificerede prøve med en normal underkæbe uden en vævsrensningsproces (figur 3A). Den gennemsigtige underkæbe (figur 3B) med EdU-mærkning blev udsat for konfokal billeddannelse. Vi fokuserede på fortænderspidsen, der viser stamcellenichen som vist i (supplerende figur 1). Den optiske del af fortænderne viste LRC'er i stamcellenichen i fortandspidsen i XY-planet (figur 4A). Vi rekonstruerede et 3D-billede af en fortandspids, der viser EdU + etiketbevarende hvilende stamceller i både epitelstamcellenichen (grøn) og mesenkymal (rød) (figur 4B). EdU + celler blev overført til pletter til kvantificering, der sammenligneligt overlappede med de mesenkymale LRC'er (figur 4C). Figur 4D viser de pletter, der kun er oprettet for mesenkymale LRC'er. Figur 4E viser de pletter, der kun er oprettet for epitel-LRC'er. Vi afsluttede derefter kvantificeringen af epitel- og mesenkymale LRC'er (figur 4F).
Figur 1: EdU-injektionsprotokol til mærkning af LRC'er. Vildtypemus (WT) blev injiceret med EdU startende ved P5. Injektionerne varede i 7 på hinanden følgende dage indtil P11. Derefter gennemgik musene en jagtperiode på 6 uger. Vi høstede dem på postnatal dag 53. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Protokollens arbejdsgang. Mus blev injiceret med EdU i 7 på hinanden følgende dage og derefter anbragt i en jagtperiode i 6 uger. Underkæberne blev høstet og fastgjort efter transkardial perfusion. Derefter blev mandiblerne afkalket og udsat for vævsrensningstrinnene ved afkalkning, affarvning, helmonteret EdU-farvning, delipidering, dehydrering og brydningsindeks (RI) matchning. Billeddannelsen for de ryddede mandibler blev udført under et konfokalmikroskop efterfulgt af dataanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Billeder af en postnatal 53 dage gammel WT-museunderkæbe før vævsrensning (A) og efter vævsrensning (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Et optisk udsnit af fortænderne, der viser LRC'er i stamcellenichen i fortandspidsen i XY-planet (A). En 3D-billedrekonstruktion af epitel- og mesenkymale LRC'er i musemandibulære fortænder mod toppen (B). Overlappende mesenkymale LRC'er (rød) med oprettede 3D-pletter (grå) (C). Pletter oprettet kun til mesenkymale LRC'er (D). Pletter, der kun er oprettet til epitel-LRC'er (E). Kvantificeringsresultater for epitel- og mesenkymale LRC'er (F). Bar: 300 μm i A og 150 μm i B-E. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Forberedelse af EdU-mærkningscocktail |
| Fremstilling af stamopløsninger (vandige) |
| TBS (10x) 1 M, pH 7,6 |
| CuSO4 (100x), 0,4 m |
| Sulfa-cyanin 3 azid (100x), 300 μM i DMSO |
| Natriumascorbat (10x), 0,2 g/ml iH2O |
| PBST (0,1% Triton X-100 i PBS, v/v) |
| Forberedelse af EdU-mærkningscocktail |
| Følgende reagenser tilsættes i rækkefølge: |
| Tris-bufret saltvand (100 mM finale, pH 7,6) |
| CuSO 4 (4 mM finale) |
| Sulfa-cyanin 3 azid (3 μM final) |
| Natriumascorbat (100 mM endelig, frisklavet til hver brug) |
Tabel 1: Forberedelse af EdU-mærkningscocktail
Supplerende figur: Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere doser injektioner (BrdU, EdU) bruges normalt på voksende neonatale mus til at mærke prolifererende celler så meget som muligt 1,6,13. Jagtperioden betragtes som et kritisk skridt med hensyn til fornyelseshastigheden af væv 6,13. Musens fortænder fornyer sig rundt hver måned. Dette træk giver forskere mulighed for at indstille jagtperioden til 4 uger eller længere 4,5,22. Vores 6-ugers jagtperiode kunne mærke stamcellerne i mesenkymale og epitelielle (labial og lingual cervikal loop) rum. Dette område omfattede nogle af stampopulationerne i TAC'er (transitforstærkende celler) fra både epitel- og mesenkymale segmenter. En længere jagtperiode ville være ønskelig for at vise ægte etiketbevarende celler, der udelukkende befinder sig i epitel- og mesenkymale stamcellenicher.
Der er flere kritiske trin i vævsbehandlings- og clearingfaserne for denne protokol. Den første note er til vævsperfusions- og fikseringstrinnet. Mus forænder indeholder pulpvæv, der har en rig forsyning af blodkar og indeholder en høj mængde blodvæv. Således bør heparin PBS-perfusionen startes så hurtigt som muligt, efter at musene er dybt bedøvet og fastholdt. Årsagen er at undgå dannelse af blodpropper, der fører til autofluorescens19. Der bør udvises forsigtighed for at undgå overfiksering med PFA, som kan føre til utilstrækkelig gennemsigtighed og gullig misfarvning af vævet efter rensning. Overdreven misfarvning sænker signalkvaliteten i prøverne under billeddannelse19. Det aktive transkardiale perfusionstrin foretrækkes frem for passiv nedsænkningsfiksering af organer / væv, som hurtigt vil fiksere vævene for at undgå tab af endogen fluorescens i vævsrensningstrinnene. Ved passiv fiksering kan områderne dybere i vævet forblive mindre gennemsigtige; Prøverne har muligvis ikke tilfredsstillende billeddannelsesresultater19. Korrekt fjernelse af muskler fra mandiblerne giver mulighed for korrekt visualisering af strukturer, der interesserer forskere. Desuden forhindrer effektiv fjernelse autofluorescensforstyrrelser i at påvirke muskelvæv. Korrekt afkalkning er uundværlig ved rensning af hårdt væv. Der skal udvises forsigtighed for at afkalke væv tilstrækkeligt ved at justere EDTA-nedsænkningstiden i henhold til prøvernes størrelse og mineralindhold. EDTA-koncentration er afgørende for at undgå overkrympning af vævene. Derfor bør koncentrationen vælges i henhold til prøverne og forsøgene i spørgsmål16,19. Ligeledes er et affarvningstrin afgørende for tilstrækkeligt at fjerne den resterende hæm for at reducere autofluorescensen. Utilstrækkelig de-lipideringstid kan resultere i mindre gennemsigtigt væv og anbefales ikke. Generelt kan delipidering for hårdt væv såsom musemandibler udføres fra 4-6 timer i 30% og 50% tB-opløsning og i 1 dag i 70% tB-opløsning20. Inkubationstiden afhænger af prøvens størrelse og dens lipidindhold. Tiden kan forlænges for at sikre fuldstændig delipidering19,20. Individuelle laboratorier kan justere timingen efter deres krav uden at mindske den minimale tid, der kræves til delipidering.
Det mest almindelige problem i vævsrensningsteknikker involverer utilstrækkelig gennemsigtighed af væv forårsaget af forkert vævsbehandling og rensningstrin. Denne situation fører til vanskeligheder med at opnå klare billeder, hvilket forhindrer korrekt visualisering af de fluorescerende mærkede cellulære eller subcellulære strukturer. Fejlfinding af utilstrækkeligt gennemsigtigt væv bør udføres ved at sikre, at hvert kritisk trin udføres korrekt. Denne praksis bør starte fra vævsperfusion og fikseringstrin til vævsrensningstrinnene. Egenskaberne af hvert væv eller organ er forskellige. Vævsbehandlings- og udrensningstrinnene bør derfor optimeres for at opnå tilfredsstillende clearingresultater19.
Billeddannelsen af rensede vævsprøver kan suppleres med et konfokal laserscanningsmikroskop (CLSM) eller et lysarkfluorescensmikroskop (LSFM) afhængigt af kravene og eksperimentelle spørgsmål og tilgængeligheden af udstyret17. Vi brugte CLSM til billeddannelse af underkæben, hvilket giver billeddannelse med højere opløsning ved højere forstørrelse, men tager længere tid sammenlignet med LSFM17,20. Når høj opløsning og højere forstørrelse ikke er et krav, kan det hurtige lysarkfluorescensmikroskop (LSFM) være ønskeligt19. LSFM er dyrt og er muligvis ikke let tilgængeligt for almindelige laboratorier. For konfokal mikroskopi er valg af de rigtige objektivlinser med den rigtige numeriske blænde afgørende for god billeddannelse19,20. For store vævsprøver kan lavere forstørrelsesmål såsom 10x med en lille numerisk blænde og en større arbejdsafstand være passende19,21. For mindre vævsprøver kan højere forstørrelsesmål såsom 20x med en høj numerisk blænde og en mindre arbejdsafstand være ønskelige. Brug af en nedsænkningsolie med et matchende brydningsindeks til clearingmediet og et objektivobjektiv er også afgørende for at undgå billedforvrængning og opnå klarhed17,19. Til billedbehandling er der flere billedbehandlings- og analysesoftwarepakker tilgængelige. Mens nogle af softwarepakkerne er gratis, er andre dyre og kan være uoverkommelige for individuelle laboratorier. Disse billedbehandlingsplatforme genererer massive filer (i gigabyte), der kræver avancerede computerarbejdsstationer til datavisualisering og kvantificering 17,20,21.
Selvom det er hurtigere og lettere at udføre end andre DNA-mærkningsmetoder som BrdU, er der begrænsninger for at detektere LRC'er gennem EdU-mærkning in vivo sammenlignet med mærkning af LRC'er med H2B-GFP transgene mus. For det første er det vanskeligt at skelne mellem LRC'erne af epiteloprindelse eller mesenkymal oprindelse. H2B-GFP-mærkning kan anvendes i en vævsspecifik, promotordrevet, tetracyclinaktivator, der specifikt kan mærke de hvilende stamceller i forskellige væv. I tilfælde af musefortænder kan H2B-GFP-metoden specifikt mærke stamcellerne fra epitelet eller mesenchymet 4,22. Imidlertid gælder vævsrensnings- og 3D-billedkonstruktionsmetoderne beskrevet i denne protokol også for H2B-GFP-fluorescensmærkede LRC'er, hvilket giver fleksibilitet og en række muligheder. Vores arbejde muliggør mærkning og karakterisering af LRC'er i henhold til videnskabelige behov. H2B-GFP-metoden kræver transgen museproduktion og krydsning med andre stammer, hvilket er tidskrævende og dyrere end EdU-mærkning. Den anden begrænsning af EdU-mærkning med vævsrensningsmetoden er, at prøverne ikke kan bruges yderligere til nedstrøms funktionelle analyser.
Denne protokol er fordelagtig for efterforskere, der ikke kræver vævsspecifik mærkning og ønsker hurtigere resultater fra mærkning af hvilende stamceller. Denne metode kan ændres til brug for sporing af celleafstamning; når den inkorporeres med Cre-drevet fluorescensmærkning af stamceller / stamceller, får vores metode flere detaljer om afkoms placering og mere nøjagtig kvantificering / bidrag23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Meghann K. Holt for at redigere manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af NIH / NIDCR-tilskud DE026461 og DE028345 og opstartsfinansiering fra Texas A &M School of Dentistry til Dr. Xiaofang Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. eLife. 6, 24712 (2017).
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. Label retaining cells and cutaneous stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).
- de Miguel-Gomez, L., et al. Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models. Cells. 10 (3), 595 (2021).
- Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling. Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).
- Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).
- Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview. The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).
- Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).
- Lin, G., et al. Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU. Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Challen, G. A., Goodell, M. A. Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells. PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).
- Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy. Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging. BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).
