Summary
Der Schneidezahn der Maus enthält in seiner Stammzellnische wertvolle markierungshaltende Zellen. Wir haben eine neuartige Methode, um die markierungserhaltenden Zellen unvoreingenommen zu erkennen und zu quantifizieren. Unsere Studie verwendete eine EdU-Markierung und einen 3D-Rekonstruktionsansatz nach der PEGASOS-Gewebereinigung des Unterkiefers.
Abstract
Der murine Schneidezahn ist ein Organ, das während der gesamten Lebensdauer der Maus kontinuierlich wächst. Die epithelialen und mesenchymalen Stammzellen, die sich im proximalen Gewebe der Schneidezähne befinden, führen zu Nachkommen, die sich in Ameloblasten, Odontoblasten und Pulpa-Fibroblasten differenzieren. Diese Zellen sind entscheidend für die Unterstützung des anhaltenden Umsatzes von Schneidezähnengewebe, was den murinen Schneidezahn zu einem hervorragenden Modell für die Untersuchung der Homöostase adulter Stammzellen macht. Es wird angenommen, dass Stammzellen langlebige ruhende Zellen enthalten, die durch Nukleotidanaloga wie 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU) markiert werden können. Die Zellen behalten diese Markierung im Laufe der Zeit bei und werden dementsprechend als Markierungszellen (LRCs) bezeichnet. Ansätze zur Visualisierung von LRCs in vivo bieten ein robustes Werkzeug zur Überwachung der Stammzellhomöostase. In dieser Studie haben wir eine Methode zur Visualisierung und Analyse von LRCs beschrieben. Unser innovativer Ansatz umfasst LRCs in Mausschneidezähnen nach Gewebereinigung und EdU-Färbung mit ganzer Mount, gefolgt von konfokaler Mikroskopie und einer 3-dimensionalen (3D) Rekonstruktion mit der Bildgebungssoftware. Diese Methode ermöglicht eine 3D-Bildgebung und eine unverzerrte Quantifizierung im Vergleich zur herkömmlichen LRC-Analyse auf Schnittobjektträgern.
Introduction
Der kontinuierlich wachsende Schneidezahn der Maus ist ein hervorragendes Modell für die Untersuchung adulter Stammzellen1. Die epithelialen (labiale und linguale zervikale Schleife) und mesenchymalen Stammzellen (zwischen der labialen und lingualen zervikalen Schleife), die sich auf der proximalen Seite des Schneidezahns befinden, differenzieren sich in Ameloblasten, Odontoblasten und Zahnpulpazellen. Dieser einzigartige Prozess bietet eine Zellquelle zur Kompensation von Gewebeverlust und -umsatz2. Obwohl mehrere Stammzellmarker wie Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 usw. in vivo für die Untergruppen adulter Stammzellen in Schneidezähnen von Mäusen identifiziert wurden, sind sie bei alleiniger Anwendung nicht ausreichend, um die Stammzellpopulationen darzustellen 1,3,4,5. Die Visualisierung langlebiger ruhender Zellen durch nukleotidanaloge DNA-Markierung und -Retention könnte einen unverzerrten Nachweis für die meisten Untergruppen adulter Stammzellen ermöglichen6. Darüber hinaus ist dieser Ansatz unter vielen Stammzellidentifikationsmethoden7 nützlich, um das Zellverhalten und die Homöostase von dentalen Stammzellpopulationenzu verstehen 3,8. Während die sich teilenden Stammzellen nach einer längeren Verfolgungsjagd ihre DNA-Markierung verlieren würden, behalten die mutmaßlich ruhenden Stammzellen ihre DNA-Markierung bei, was sie als markierungserhaltende Zellen (LRCs) bezeichnet6. Die DNA-Markierung und -Retention durch sich nicht teilende Stammzellen markiert und lokalisiert die mutmaßlichen adulten Stammzellen in ihren Nischen.
In den letzten Jahren ersetzte die Markierung mit dem Thymidin-Analogon 5-Brom-2′-Desoxyuridin (BrdU) die umständliche, zeitaufwändige und hochauflösende, mikroskopisch inkompatible 3H-Thymidin-DNA-Markierungsmethode für Zellproliferationsassays 6,9. In den letzten Jahren wurde die 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EdU)-Markierungstechnik zunehmend über BrdU verwendet. Dieses Muster entstand aus mehreren Gründen. Erstens ist die BrdU-Methode langsam und arbeitsintensiv. Die Benutzerbedingungen sind variabel, und es ist nicht in der Lage, die Ultrastruktur in Proben zu erhalten (aufgrund der DNA-Denaturierung). Ebenso verliert die BrdU-Methode die Antigenität von Zellen, was sie für nachgelagerte funktionelle Analysen und Assays wie die Co-Lokalisationsexperimente und die In-vivo-Stammzelltransplantation ineffizient macht 3,7,9,10,11,12. BrdU ist auch ein Teratogen, das nicht für die Markierung von LRCs in der Embryonalentwicklung geeignet ist6. Außerdem ist die BrdU-Methode ineffizient, wenn sie in den Proben mit ganzer Montage verwendet wird. Die Nachteile sind eine geringe Penetration von Antikörpern im tiefen Teil der Proben oder die Notwendigkeit einer langen Antikörperinkubationszeit für eine tiefe Penetration13. Die EdU-Markierung entgeht den Schritten der Denaturierung von Proben, wodurch die Ultrastruktur erhalten bleibt. Diese Eigenschaft ist vorteilhaft für nachgelagerte funktionelle Analysen wie Co-Lokalisationsexperimente und Stammzelltransplantationen11,12. Außerdem ist die EdU-Kennzeichnung hochempfindlich und schnell; Die Probenpenetration ist aufgrund der Verwendung von schnell absorbierten und kleineren fluoreszierenden Aziden zum Nachweis von EdU-Markierungen durch eine Cu(I)-katalysierte [3 + 2] Cycloadditionsreaktion ("Klick"-Chemie) hoch14.
Eine weitere zunehmend angewandte DNA-Markierungsmethode ist die Verwendung von gentechnisch veränderten transgenen Mäusen. Diese Mäuse exprimieren das grün fluoreszierende Histon-2B-Protein (H2B-GFP), das durch ein Tetracyclin-responsives Regulatorelement 5,14 gesteuert wird. Nach der Fütterung von Mäusen mit Tetracyclin-Futter/Wasser für eine 4-wöchige bis 4-monatige Jagdperiode nimmt die GFP-Fluoreszenz in zyklischen Zellen ab und nur LRCs behalten die Fluoreszenz6. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die markierten LRCs isoliert werden können und für Zellkulturen oder nachgeschaltete funktionelle Analysen lebensfähig bleiben 6,7. Einige Studien berichteten über eine ungenaue Markierung ruhender Stammzellen, wenn sie für den Langzeitgebrauch gejagt wurden. Dieses Ergebnis war auf eine undichte Hintergrundexpression des H2B-GFP-Stammes und nicht auf die entsprechende Tetracyclin-regulierte Reaktionzurückzuführen 15.
Darüber hinaus wurde in der Literatur in der Vergangenheit die LRC-Erkennung hauptsächlich auf Schnittobjektträgern verwendet, die zweidimensional sind und oft fälschlicherweise die genaue Position und Anzahl der LRCs anzeigen. Der Ansatz zeigte falsche Winkel für Schnitte komplexer Gewebestrukturen16. Die andere Methode bestand darin, 3D-Bilder aus seriellen Schnitten zu erhalten und Rekonstruktionen nach dem Bild durchzuführen. Diese Schritte waren aufgrund von Bildverzerrungen durch Variationen in jedem seriellen Abschnitt aufgrund komprimierter oder gestreckter Abschnitte ungenau, was zu fehlenden Informationen führte16,17,18. Die Methode war auch mühsam und zeitaufwändig.
Um die Whole-Mount-Bildgebung von LRCs zu erleichtern, müssen die Proben klar gemacht werden, während die Fluoreszenz gut erhalten bleibt. Aktuelle Gewebereinigungstechniken können in drei Hauptkategorien eingeteilt werden: Gewebereinigungstechniken auf der Basis organischer Lösungsmittel, Gewebereinigungstechniken auf der Basis von wässrigen Reagenzien und Gewebereinigungstechniken auf Hydrogelbasis17,19. Das Polyethylenglykol (PEG)-assoziierte Lösungsmittelsystem (PEGASOS) wurde kürzlich entwickelt. Dieser Ansatz macht nahezu alle Arten von Geweben transparent und bewahrt die endogene Fluoreszenz, einschließlich harter Gewebe wie Knochen und Zähne20. Die PEGASOS-Methode hat Vorteile gegenüber anderen Gewebereinigungsmethoden, insbesondere bei der Reinigung von Zahn- und Knochenmaterialien. Die meisten anderen Methoden konnten hartes Gewebe nur teilweise entfernen, haben lange Verarbeitungszeiten oder erfordern kostspielige Reagenzien21. Außerdem kann die PEGASOS-Methode die endogene Fluoreszenz gegenüber anderen Methoden effizient erhalten.
Diese Literatur führte uns dazu, eine neue Methode für die Zellstudie zu entwickeln. Wir kombinierten die LRC-Detektionsvorteile der EdU-Markierung mit der überlegensten 3D-Ganzkörperbildgebung von gewebegereinigten Proben. Die Proben wurden mit der fortschrittlichen Gewebereinigungstechnik des Polyethylenglykol (PEG)-assoziierten Lösungsmittelsystems (PEGASOS) verarbeitet15. Die Transparenz von Hartgewebe ermöglichte es uns, das 3D-Signal der LRC-Fluoreszenz in vivo zu rekonstruieren, ohne die Zähne oder den Unterkiefer zu brechen, wodurch eine genauere Methode zur Visualisierung und Quantifizierung von LRCs geschaffen wurde.
In dieser Studie bieten wir einen innovativen Leitfaden zur Visualisierung von LRCs im Mausschneidezahn. Wir haben einen visuellen 3D-Ansatz entwickelt, um die Position und Menge der LRCs in der Stammzellnische der Mausschneidezähne zu bestimmen. In diesem Projekt wurden EdU-Markierung, PEGASOS-Gewebereinigungstechniken und konfokale Mikroskopie verwendet. Unsere Methode der EdU-Markierung der LRCs auf Whole-Mount-Gewebe und die Verwendung einer gereinigten und transparenten Probe überwindet sowohl die Einschränkungen herkömmlicher Objektträger als auch anderer nachteiliger DNA-Markierungsmethoden. Daher eignet sich unsere Technik für Studien zur Stammzellhomöostase, die den Nachweis von LRCs erfordern, insbesondere an hartem Gewebe. Das Protokoll kann für diejenigen, die sich auf die Stammzellhomöostase in anderen Geweben und Organen konzentrieren, gleichermaßen vorteilhaft sein.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) für das Texas A&M University College of Dentistry genehmigt.
1. Zubereitung des EdU-Etikettiercocktails
- Bereiten Sie die Cocktailstocklösungen wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
- Bereiten Sie den EdU-Etikettierungscocktail wie in Tabelle 1 beschrieben vor.
2. Vorbereitung der Mäuse und EdU-Lösung
- Bereiten Sie die EdU-Lösung vor. EdU in DMSO mit 20 mg/ml auflösen und in einem Gefrierschrank von -20 °C lagern.
ACHTUNG: EdU ist ein Mutagen. Benutzer sollten beim Umgang mit diesem Stoff eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) tragen. - 5 Tage alten C57BL/6J-Mäusen wird die vorbereitete EdU-Lösung intraperitoneal mit 3 μl/g Körpergewicht injiziert. Mäuse müssen die Lösung einmal täglich an 7 aufeinanderfolgenden Tagen erhalten. Als nächstes durchlaufen sie eine Verfolgungsjagd für 6 Wochen, bevor sie zur Analyse geerntet werden (Abbildung 1).
VORSICHT: Achten Sie darauf, ein Nadelstechen zu vermeiden, wenn Sie EdU in die Mäuse injizieren. Nachdem Sie EdU an 7 aufeinanderfolgenden Tagen injiziert haben, setzen Sie die Mäuse in einen neuen Käfig. Nachdem die Mäuse in ihrem neuen Zuhause sind, entsorgen Sie die Einstreu im alten Käfig unter Verwendung der entsprechenden Regeln für biologische Gefahren.
3. Probenvorbereitung durch transkardiale Perfusion (postnatale 53 Tage alte Mäuse nach der 6-wöchigen Chase-Periode)
HINWEIS: Die Leber der Maus sollte nach erfolgreicher transkardialer Perfusion blass werden.
- Anästhesieren Sie Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion. Sie müssen eine Kombination aus Xylazin- und Ketamin-Anästhetika (Xylazin 10-12,5 mg/kg; Ketamin, 80-100 mg/kg Körpergewicht).
- Warten Sie ~10 Minuten, bis die Maus nicht mehr auf schmerzhafte Reize reagiert (z. B. Pfotenklemmreflexe).
- Platzieren Sie die Mäuse in Rückenlage, stabilisiert auf Styroporträger mit Nadeln in jeder Pfote.
- Legen Sie die Brusthöhle frei, indem Sie die darüber liegende Haut mit einer Pinzette öffnen und eine Schere sezieren.
- Schneiden Sie die Membran mit einer scharfen Schere auf. Achten Sie darauf, das Herz nicht zu durchbohren.
- Schneiden Sie durch den Brustkorb und greifen Sie mit einer Klemmschere nach der Basis des Brustbeins, um das Herz freizulegen.
- Bringen Sie die Maus in die Perfusionsstufe in der Nähe der Umwälzpumpe in einem Abzug.
- Führen Sie die 25-G-Nadel (aus dem Schlauch, der mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)/4% Paraformaldehyd (PFA)-Lösung gefüllt ist) in die Spitze des linken Ventrikels ein. Achten Sie darauf, die Nadelspitze im Lumen des Ventrikels zu halten.
VORSICHT: PFA ist mäßig giftig und wahrscheinlich krebserregend. Verwenden Sie PSA, um PFA zu handhaben, und bereiten Sie die Lösung unter einem chemischen Abzug vor. Abfall PFA erfordert eine ordnungsgemäße Entsorgung gemäß den Richtlinien der Institution. - Schneiden Sie den rechten Ventrikel unmittelbar nach dem Einführen der Nadel in den linken Ventrikel mit einer scharfen Schere ab. Dieser Schritt ermöglicht es dem Blut, aus der Maus zu fließen und in die Auffangschale abzufließen.
- Perfundieren Sie die Proben mit 50 ml PBS-Lösung bei einer Flussrate von 7 ml/min.
- Schalten Sie nach der PBS-Perfusion den Absperrhahn um, um einen Durchfluss von 20 ml 4%iger PFA-Lösung bei gleicher Durchflussrate von 5 ml/min zu ermöglichen.
- Entfernen Sie bei eingeschalteter Umwälzpumpe die Nadel aus dem linken Ventrikel.
HINWEIS: Die Maus ist jetzt für die Gewebeentnahme fixiert. Um die Fluoreszenz zu erhalten, sollte die Lichtexposition während des gesamten Protokolls nach Möglichkeit vermieden werden. Während der Verarbeitung des Gewebes kann das konische 50-ml-Röhrchen mit den Gewebeproben mit Aluminiumfolie abgedeckt werden.
4. Gewebereinigung des Unterkiefers mit der PEGASOS-Technik
HINWEIS: Ein konisches 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen je nach Gewebevolumen kann verwendet werden, um die Proben in jedem Schritt für die Behandlung bereit zu halten. Die Proben werden in den Schritten 4,2 bis 4,7 bei 37 °C (~100 U/min) verarbeitet. Verwenden Sie Kunststoffbehälter auf Polypropylenbasis, die gegen organische Lösungsmittel beständig sind, um ein Schmelzen des Kunststoffs zu vermeiden. Alternativ können Glaswaren verwendet werden.
VORSICHT: Die PEGASOS-Gewebereinigungstechnik verwendet toxische Lösungen wie Quadrol, Polyethylenglykol (PEG), Benzylbenzoat (BB), MMA500 usw. Eine geeignete PSA ist erforderlich, um mögliche Expositionen zu vermeiden.
- Sezieren Sie die Mandibeln und fixieren Sie die Proben weiter in 4% PFA. Bewahren Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur auf.
- Entfernen Sie die Muskeln von den Mandibeln und tauchen Sie sie in 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0), um sie 4 Tage lang zu entkalken. Führen Sie während dieser Zeit einen täglichen Medienwechsel an einem 37 °C heißen Shaker durch.
HINWEIS: Es ist wünschenswert, die Muskeln so weit wie möglich aus der Probe zu entfernen. Diese Vorsichtsmaßnahme vereinfacht den Bildgebungsprozess und reduziert die Autofluoreszenz der Muskeln. - Entfärben Sie die Mandibeln einen Tag lang mit einer 25%igen Quadrol-Lösung (v/v in H2O) auf einem 37 °C heißen Shaker, um das restliche Bluthäm zu entfernen.
- Vollständige EdU-Färbung der gesamten Halterung.
- Bereiten Sie einen frischen Cocktail mit EdU-Etikettierung gemäß Tabelle 1 zu.
HINWEIS: Der EdU-Etikettiercocktail muss jedes Mal frisch zubereitet werden, wobei frisch zubereitete Ascorbatlösung zugesetzt wird, um optimale EdU-Etikettierungsergebnisse zu erzielen. - Spülen Sie die Mandibeln 30 Minuten lang mit PBST auf einem 37 °C heißen Schüttler ab.
- Spülen Sie die Mandibeln dreimal für jeweils 3 Minuten mit PBS aus.
- Inkubieren Sie die Mandibeln in einem frisch zubereiteten EdU-Etikettierungscocktail über Nacht auf einem 37 °C heißen Shaker.
- Spülen Sie die Mandibeln dreimal für jeweils 3 Minuten mit PBS aus.
- Bereiten Sie einen frischen Cocktail mit EdU-Etikettierung gemäß Tabelle 1 zu.
- Führen Sie eine serielle Entfettung in jeder der folgenden Lösungen für 6 h bei 37 °C durch:
30%ige tert-Butanol (tB)-Lösung: 75% v/vH2O, 22% v/v tB und 3% v/v Quadrol.
50% tB-Lösung: 50% v/v H2O, 47% v/v tB und 3% v/v Quadrol.
70 % tB-Lösung: 30 % v/v H2O, 67 % v/v tB und 3 % v/v Quadrol
HINWEIS: Der Entlipidierungsschritt ist kritisch. Die Entlipidierung kann zwischen 4-6 h in 30% iger und 50% iger tB-Lösung und für 1 Tag in 70% iger tB-Lösung durchgeführt werden. - Dehydrieren Sie die Mandibeln in tB-PEG-Lösung für 2 Tage mit dem folgenden täglichen Medienwechsel: 75% tB, 22% v/v Polyethylenglykolmethylethermethacrylat durchschnittlich MMA500 und 3% v/v Quadrol bei 37 °C.
- Reinigen Sie den Unterkiefer in Benzylbenzoat (BB)-PEG-Clearingmedium, um eine Brechungsindexanpassung zu erhalten: 75 % v/v BB, 22 % v/v PEG-MMA500 und 3 % Quadrol, bis die Transparenz erreicht ist.
HINWEIS: Wir haben Informationen zum Brechungsindexabgleich. Die anorganischen und organischen Bestandteile in Geweben wie Wasser, Lipide, Proteine, Mineralien, Organellen usw. haben einen anderen Brechungsindex (RI) im Bereich von 1,33 bis 1,55. Diese RI-Diskrepanz zwischen den Gewebekomponenten behindert den Bildgebungsprozess. Transparenz kann erreicht werden, indem RI-Fehlanpassungen innerhalb des Gewebes beseitigt werden. Es wird empfohlen, die gewebegereinigten Proben in das Reinigungsmedium von BB-PEG einzutauchen. In diesem Schritt erhält die gesamte Probe einen einheitlichen internen RI von ~1,54 (RI-Matching genannt), wodurch der Bildgebungsprozess vereinfacht wird. - Bewahren Sie die Mandibeln im BB-PEG-Gewebereinigungsmedium bei Raumtemperatur zur Lagerung und Bildgebung auf.
HINWEIS: Es ist gut, die Bildgebung so schnell wie möglich abzuschließen, um den allmählichen Verlust von Fluoreszenzreportern zu vermeiden. Mit der PEGASOS-Methode bleiben die Fluoreszenzreporter jedoch auch nach mehrwöchiger Lagerung gut erhalten20,21. Für die Langzeitlagerung können die Proben auch bei 4°C gelagert werden.
5. Konfokale Bildgebung des gewebegereinigten Unterkiefers
- Montieren Sie den gewebegereinigten ganzen Unterkiefer auf Marken-Hohlraum-Objektträger im BB-PEG-Reinigungsmedium und decken Sie ihn mit Glas-Deckfolien ab. Vermeiden Sie Blasen.
- Führen Sie die Bildaufnahme mit einem geeigneten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durch. Wählen Sie Erfassen und stellen Sie die Bildaufnahmeparameter auf eine Auflösung von 512 x 512 Pixel und eine Aufnahmegeschwindigkeit von 400 Hz ein. Diese Einstellungen finden Sie im Erfassungsmodus-Menü der Software, die das Mikroskop steuert.
- Aktivieren Sie im Panel für die Fluoreszenzanregung den erforderlichen Laser (TRITC), um Fluorophore optimal anzuregen (die Sonde, die wir für die Visualisierung von LRCs verwendet haben, hat fluoreszierende Eigenschaften wie Cy3 mit Anregung bei 548 nm und Emission bei 563 nm Laserwellenlänge).
- Bewegen Sie im Bereich für die Fluoreszenzdetektion den Schieberegler, um die zu messenden Wellenlängen auszuwählen (z. B. zwischen 555 und 625 nm für einen Cy3-ähnlichen Fluorophor).
- Legen Sie den montierten Unterkiefer auf den Mikroskoptisch, um die Probe mit weißem Licht und einem Objektiv mit geringerer Vergrößerung (2-10x) zu visualisieren und zu finden.
- Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl mit einem Brechungsindex von 1,52 auf das Deckglas, um dem Brechungsindex des Glasdeckglases und des Objektivs zu entsprechen.
HINWEIS: Passen Sie den Brechungsindex von Objektiven, Bildgebungsmedien und Gewebe so genau wie möglich an, um die Einführung optischer Verzerrungen während der Bildaufnahme zu minimieren. - Schalten Sie die Leuchtstofflampen ein und wählen Sie ein geeignetes Vergrößerungsobjektiv, um interessante Bereiche abzubilden. Wir haben ein 20-fach Objektiv mit einer numerischen Apertur von 0,9 und einem Arbeitsabstand von 1,95 mm verwendet. Ein Objektiv mit größerem Arbeitsabstand kann erforderlich sein, wenn größere Gewebeproben im konfokalen Mikroskop abgebildet werden. Alternativ kann die Bildgebung bei größeren Gewebeproben problemlos mit einem Lichtblattmikroskop durchgeführt werden.
- Drücken Sie in der konfokalen Bildgebungssoftware die Live-Taste, um den Live-Scan-Modus zu starten. Um den Dynamikumfang der Bilder zu maximieren und eine Pixelsättigung zu vermeiden, passen Sie die Verstärkung und Laserintensität für den ausgewählten Kanal an.
- Identifizieren Sie das Sichtfeld, um den gesamten Bereich des Unterkiefers in den X- und Y-Dimensionen zu visualisieren. Stellen Sie die oberen und unteren Erfassungsparameter der Z-Stufe ein, die das Volumen der Stammzellnische im Schneidezahn der Maus genau abdecken. Verwenden Sie eine Z-Schrittweite von 2 μm oder nach Ihren Anforderungen. Die neueren Versionen der konfokalen Mikroskope sollten in der Lage sein, automatisch Z-Stapel der verschiedenen überlappenden Bereiche zu erfassen.
- Erfassen und speichern Sie Z-Stack-Bilddateien im .lif-Format.
HINWEIS: Die .lif-Fliegen können in .tiff-Dateien konvertiert und für andere 3D-Analysesoftware verwendet werden.
6. Bildverarbeitung, 3D-Bildrekonstruktion und Quantifizierung von markierungserhaltenden Zellen durch Erstellen einer Oberfläche, Segmentierung der Region of Interest (ROI), Maskierung des ROI und Erstellen von Spots
HINWEIS: Wir haben Imaris (Bitplane 9.0.1) für die Bildverarbeitung und 3D-Rekonstruktion verwendet, aber ähnliche Bildverarbeitungsschritte können mit anderen Software-Suiten (z. B. ImageJ / Fiji, 3D-Slicer, Avizo, Arivis, Amira usw.) durchgeführt werden.
- Klicken Sie in der Bildbearbeitungssoftware auf die Schaltfläche " Arena " und wählen Sie dann "Bild". Wählen Sie die ursprüngliche .lif-Datei aus und wählen Sie die zusammengeführte Datei, die Bilder werden in die Imaging-Software importiert.
HINWEIS: Verwenden Sie alternativ einen Dateikonverter für Imaging-Software, um die Z-Stack-Image-Datei in den Dateityp des nativen Formats für die Software zu konvertieren. Zum Beispiel: Konvertieren Sie die .lif-Dateien mit dem Imaris File Converter in .ims-Dateien und öffnen Sie die .ims-Dateien in der Imaging-Software. Die Konvertierung von Daten in das native Dateiformat der Software ermöglicht eine schnelle Dateikonvertierung und minimiert Fehler. - Doppelklicken Sie auf die importierte Datei, um den Bilddatensatz zu öffnen.
- Besuchen Sie das Anzeigeanpassungsfenster und klicken Sie auf den Namen des Kanals. Im Standardmodus wird es normalerweise als Rot gekennzeichnet.
- Klicken Sie im Fenster Bildeigenschaften auf die Registerkarte Zugeordnete Farbe . Wählen Sie in der Option Farbtabellendatei die Option Fire Flow und klicken Sie dann auf OK. Die Anzeigefarbe wird normalerweise gewählt, um die Hintergrundfluoreszenz und die positive Fluoreszenz von der Probe zu unterscheiden.
- Klicken Sie oben links auf dem Bildschirm im Bereich Szene – Eigenschaften auf das blaue Symbol mit der Bezeichnung Neue Oberfläche hinzufügen. Deaktivieren Sie das Lautstärkesymbol , wodurch der größte Teil der Hintergrundfluoreszenz entfernt wird, und die positive Fluoreszenz ist deutlich sichtbar (siehe Schritt 6.4.2).
- Starten Sie den Prozess der manuellen Segmentierung der Region of Interest (ROI), indem Sie auf die Registerkarte Erstellen klicken und die Registerkarte Automatische Erstellung überspringen, Manuell bearbeiten auswählen. Klicken Sie im manuellen Flächenerstellungsassistenten auf die Registerkarte Kontur , um die Ausrichtung (XY, YZ oder XZ) basierend auf den Proben auszuwählen und den ROI einfach zu konturieren. Hier wählen wir die XY-Ausrichtung.
- Stellen Sie als Nächstes sicher, dass sich das Zeigermenü in der rechten Ecke im Auswahlmodus befindet. Passen Sie die Slice-Position an, um den ROI im Gewebe zu lokalisieren. Sie werden feststellen, dass der größte Teil der Hintergrundfluoreszenz mit deutlicher positiver Fluoreszenz entfernt wurde, wie in Schritt 6.4 erwähnt. Klicken Sie auf die Schaltfläche Zeichnen und zeichnen Sie einen vorläufigen Bereich von Interesse. Wählen Sie die Option Sichtbarkeit auf keine , um Interferenzen aus anderen Bereichen als ROI zu vermeiden.
- Wiederholen Sie Schritt 6.4.2. Scheibe für Scheibe, um den gesamten interessierenden Bereich zu zeichnen.
- Nachdem die ROI-Zeichnung fertig ist, klicken Sie auf Oberfläche erstellen , um eine 3D-Geometrie des ROI zu erhalten.
- Klicken Sie im manuellen Assistenten zur Flächenerstellung auf die Schaltfläche Bearbeiten und wählen Sie Alle maskieren.
- Wählen Sie im ausgeklappten Fenster "Kanal maskieren" in den Kanalauswahloptionen Kanal 1 aus. Wählen Sie anschließend Kanal duplizieren, bevor Sie die Maske anwenden. Wählen Sie in den Maskeneinstellungen Konstante Innen/Außen und setzen Sie das Voxel Außenfläche auf 0.
- Deaktivieren Sie im Bereich Szeneneigenschaften das Oberflächenobjekt , und wählen Sie das Volumenobjekt aus. Deaktivieren Sie in der Anzeigeanpassung den ursprünglichen "Rot"-Kanal, wählen Sie den maskierten Rotkanal aus und passen Sie die Farbintensitäten an, um den gewünschten 3D-gerenderten und positiv markierten Fluoreszenz-ROI zu erhalten.
- Erstellen Sie ein neues Spot-Objekt. Klicken Sie zunächst auf das Symbol "Spots hinzufügen", um die 3D-gerenderten LRCs zu quantifizieren, indem Sie 3D-Spots erstellen, die sich vergleichbar mit 3D-gerenderten LRCs überlappen. Verwenden Sie die unteren Pfeile, um zwischen den Schritten im Spot-Erstellungsassistenten zu wechseln.
- Im Spot-Erstellungsassistenten gibt es vier aufeinanderfolgende Schritte von Anweisungen, um Spots automatisch mit der Software zu erstellen. Stellen Sie sicher, dass im ersten Schritt die Option Nur eine Region von Interesse segmentieren ausgewählt ist. Klicken Sie auf das Symbol Weiter .
- Im zweiten Schritt wird es eine "XYZ 3D-Box" geben. Passen Sie das Feld XYZ an, um den ROI abzudecken. Klicken Sie auf das Symbol Weiter .
- Gehen Sie im dritten Schritt zu den Optionen für den Quellkanal . Wählen Sie den maskierten roten Kanal; Geben Sie den geschätzten XY-Punktdurchmesser ein, der mit der Anpassung und Überlappung der Probenfluoreszenzpunkte vergleichbar ist. Klicken Sie auf das Symbol Weiter .
- Fügen Sie im vierten Schritt den Filtertyp "Qualität" hinzu und passen Sie den unteren Intensitätsschwellenwert an, indem Sie das Schiebefenster über das Histogramm "Qualität" bewegen, bis die Mehrheit der identifizierbaren LRCs beschriftet ist.
HINWEIS: Die Segmentierung und damit die statistischen Messwerte (Beispiel: Anzahl der Zellen) hängen sehr stark von den Intensitätsschwellenwerten ab. Achten Sie darauf, die entsprechenden Schwellenwerte genau einzustellen. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig stellen und wählen Sie die Schaltfläche Statistik aus. Wählen Sie die Registerkarte Gesamt aus, um den Wert für die Gesamtzahl der Punkte im Bild zu ermitteln.
- Exportieren Sie Statistiken, indem Sie auf die Schaltfläche Registerkarte In Datei anzeigen klicken, und erhalten Sie die Ergebnisse in einer .xls Datei.
- Verwenden Sie ein geeignetes Diagramm, um die Quantifizierungsergebnisse darzustellen.
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Representative Results
Nach der EdU-Markierung und dem PEGASOS-Gewebereinigungsprozess (Abbildung 2) wurde der transparente Unterkiefer erhalten, wie in unserem Bild gezeigt (Abbildung 3B). Wir verglichen die modifizierte Probe mit einem normalen Unterkiefer ohne Gewebereinigungsprozess (Abbildung 3A). Der transparente Unterkiefer (Abbildung 3B) mit EdU-Markierung wurde einer konfokalen Bildgebung unterzogen. Wir konzentrierten uns auf die Schneidezahnspitze, die die Stammzellnische zeigt, wie in (Ergänzende Abbildung 1) gezeigt. Der optische Schnitt des Schneidezahns zeigte LRCs in der Stammzellnische der Schneidezahnspitze in der XY-Ebene (Abbildung 4A). Wir rekonstruierten ein 3D-Bild einer Schneidezahnspitze, das EdU+ -Markierungs-haltende ruhende Stammzellen sowohl in der epithelialen (grün) als auch in der mesenchymalen (rot) Stammzellnische zeigt (Abbildung 4B). EdU+ -Zellen wurden zur Quantifizierung an Stellen übertragen, die sich vergleichbar mit den mesenchymalen LRCs überlappten (Abbildung 4C). Abbildung 4D zeigt die Flecken, die nur für mesenchymale LRCs erzeugt wurden. Abbildung 4E zeigt die Flecken , die nur für epitheliale LRCs erzeugt wurden. Anschließend haben wir die Quantifizierung von epithelialen und mesenchymalen LRCs abgeschlossen (Abbildung 4F).
Abbildung 1: EdU-Injektionsprotokoll zur Kennzeichnung von LRCs. Wildtyp-Mäusen (WT) wurde EdU ab P5 injiziert. Die Injektionen dauerten 7 aufeinanderfolgende Tage bis P11. Als nächstes durchliefen die Mäuse eine Verfolgungsphase von 6 Wochen. Wir haben sie am 53. Tag nach der Geburt geerntet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Workflow des Protokolls. Mäusen wurde an 7 aufeinanderfolgenden Tagen EdU injiziert und dann 6 Wochen lang in eine Verfolgungsphase gebracht. Die Mandibeln wurden nach transkardialer Perfusion entnommen und fixiert. Als nächstes wurden die Mandibeln entkalkt und den Gewebereinigungsschritten der Entkalkung, Entfärbung, EdU-Färbung der ganzen Halterung, der Entlipidierung, der Dehydratisierung und der Anpassung des Brechungsindex (RI) unterzogen. Die Bildgebung für die gereinigten Mandibeln wurde unter einem konfokalen Mikroskop durchgeführt, gefolgt von einer Datenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Bilder eines postnatalen 53 Tage alten WT-Mausunterkiefers vor der Gewebereinigung (A) und nach der Gewebereinigung (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Ein optischer Schnitt des Schneidezahns mit LRCs in der Stammzellnische der Schneidezahnspitze in der XY-Ebene (A). Eine 3D-Bildrekonstruktion von epithelialen und mesenchymalen LRCs in den Unterkieferschneidezähnen der Maus in Richtung der Spitze (B). Überlappende mesenchymale LRCs (rot) mit erzeugten 3D-Flecken (grau) (C). Flecken, die nur für mesenchymale LRCs (D) erstellt wurden. Spots, die nur für epitheliale LRCs (E) erstellt wurden. Quantifizierungsergebnisse für epitheliale und mesenchymale LRCs (F). Bar: 300 μm in A und 150 μm in B-E. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Zubereitung des EdU-Etikettiercocktails |
| Herstellung von Stammlösungen (wässrig) |
| TBS (10x) 1 M, pH 7,6 |
| CuSO 4 (100x),0,4 M |
| Sulfa-Cyanin-3-Azid (100x), 300 μM in DMSO |
| Natriumascorbat (10x), 0,2 g/ml in H2O |
| PBST (0,1% Triton X-100 in PBS, v/v) |
| Zubereitung des EdU-Etikettiercocktails |
| Fügen Sie die folgenden Reagenzien der Reihe nach hinzu: |
| Tris-gepufferte Kochsalzlösung (100 mM final, pH 7,6) |
| CuSO 4 (4 mM final) |
| Sulfa-Cyanin-3-Azid (3 μM final) |
| Natriumascorbat (100 mM final, frisch hergestellt für jeden Gebrauch) |
Tabelle 1: Zubereitung des EdU-Etikettiercocktails
Ergänzende Abbildung: Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Mehrfachdosen von Injektionen (BrdU, EdU) werden normalerweise bei wachsenden neugeborenen Mäusen verwendet, um proliferierende Zellen so weit wie möglich zu markieren 1,6,13. Die Chasing-Periode gilt als kritischer Schritt in Bezug auf die Erneuerungsrate von Geweben 6,13. Der Schneidezahn der Maus erneuert sich etwa jeden Monat. Diese Eigenschaft ermöglicht es Forschern, die Jagdzeit auf 4 Wochen oder länger festzulegen 4,5,22. Unsere 6-wöchige Chase-Periode konnte die Stammzellen in mesenchymalen und epithelialen Kompartimenten (labiale und linguale zervikale Schleife) markieren. Dieser Bereich umfasste einige der Vorläuferpopulationen in TACs (Transit-Amplifying Cells) sowohl aus epithelialen als auch aus mesenchymalen Kompartimenten. Eine längere Chase-Periode wäre wünschenswert, um echte markierungserhaltende Zellen zu zeigen, die sich ausschließlich in den epithelialen und mesenchymalen Stammzellnischen befinden.
Es gibt mehrere kritische Schritte in den Gewebeverarbeitungs- und Clearing-Phasen für dieses Protokoll. Die erste Anmerkung bezieht sich auf den Schritt der Gewebeperfusion und -fixierung. Mäuseschneidezähne enthalten Pulpagewebe, das reich an Blutgefäßen ist und eine hohe Menge an Blutgewebe enthält. Daher sollte die Heparin-PBS-Perfusion so schnell wie möglich begonnen werden, nachdem die Mäuse tief betäubt und zurückgehalten wurden. Der Grund dafür ist, die Bildung von Blutgerinnseln zu vermeiden, die zur Autofluoreszenzführen 19. Es sollte darauf geachtet werden, eine Überfixierung mit PFA zu vermeiden, die nach dem Reinigen zu unzureichender Transparenz und gelblicher Verfärbung des Gewebes führen kann. Übermäßige Verfärbungen verringern die Signalqualität in den Proben während der Bildgebung19. Der aktive transkardiale Perfusionsschritt wird der passiven Immersionsfixierung von Organen/Geweben vorgezogen, wodurch das Gewebe schnell fixiert wird, um einen Verlust der endogenen Fluoreszenz in den Gewebereinigungsschritten zu vermeiden. Bei der passiven Fixierung können die tieferen Bereiche im Gewebe weniger transparent bleiben; Die Proben haben möglicherweise keine zufriedenstellenden Bildgebungsergebnisse19. Die richtige Entfernung von Muskeln aus den Mandibeln ermöglicht die richtige Visualisierung von Strukturen, die für Forscher von Interesse sind. Darüber hinaus verhindert eine effektive Entfernung, dass Autofluoreszenzstörungen das Muskelgewebe beeinträchtigen. Eine ordnungsgemäße Entkalkung ist bei der Hartgewebsreinigung unabdingbar. Es sollte darauf geachtet werden, das Gewebe angemessen zu entkalken, indem die EDTA-Eintauchzeit entsprechend der Größe und dem Mineralgehalt der Proben angepasst wird. Die EDTA-Konzentration ist entscheidend, um ein übermäßiges Schrumpfen des Gewebes zu vermeiden. Daher sollte die Konzentration gemäß den fraglichen Proben und Experimenten16,19 gewählt werden. Ebenso ist ein Entfärbungsschritt entscheidend, um das verbleibende Häm adäquat zu entfernen und die Autofluoreszenz zu reduzieren. Eine unzureichende Entlipidierungszeit kann zu weniger transparentem Gewebe führen und wird nicht empfohlen. Im Allgemeinen kann die Entlipidierung für Hartgewebe wie Unterkiefer von Mäusen von 4-6 h in 30% iger und 50% tB-Lösung und für 1 Tag in 70% tB-Lösung20 durchgeführt werden. Die Inkubationszeit hängt von der Größe der Probe und ihrem Lipidgehalt ab. Die Zeit kann verlängert werden, um eine vollständige Entfettung zu gewährleisten19,20. Einzelne Labore können das Timing an ihre Anforderungen anpassen, ohne die Mindestzeit für die Entlipidierung zu verkürzen.
Das häufigste Problem bei Gewebereinigungstechniken ist die unzureichende Transparenz des Gewebes, die durch unsachgemäße Gewebeverarbeitungs- und -reinigungsschritte verursacht wird. Diese Situation führt zu Schwierigkeiten bei der Erzielung klarer Bilder, was die korrekte Visualisierung der fluoreszenzmarkierten zellulären oder subzellulären Strukturen behindert. Die Fehlerbehebung bei unzureichend transparenten Geweben sollte erfolgen, indem sichergestellt wird, dass jeder kritische Schritt korrekt ausgeführt wird. Diese Praxis sollte von den Schritten der Gewebeperfusion und -fixierung bis hin zu den Schritten zur Gewebereinigung beginnen. Die Eigenschaften jedes Gewebes oder Organs sind unterschiedlich. Daher sollten die Gewebeverarbeitungs- und Clearing-Schritte optimiert werden, um zufriedenstellende Clearing-Ergebnisse zu erzielen19.
Die Bildgebung von geklärten Gewebeproben kann mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (CLSM) oder einem Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (LSFM) abgeschlossen werden, abhängig von den Anforderungen und der experimentellen Fragestellung und der Verfügbarkeit der Ausrüstung17. Wir haben CLSM für die Bildgebung des Unterkiefers verwendet, was eine Bildgebung mit höherer Auflösung bei höherer Vergrößerung ermöglicht, aber im Vergleich zu LSFM17,20 länger dauert. Wenn eine hohe Auflösung und eine höhere Vergrößerung nicht erforderlich sind, kann das schnelle Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop (LSFM) wünschenswert sein19. LSFM ist teuer und für reguläre Labore möglicherweise nicht leicht verfügbar. Für die konfokale Mikroskopie ist die Wahl der richtigen Objektive mit der richtigen numerischen Apertur entscheidend für eine gute Bildgebung19,20. Für große Gewebeproben können Objektive mit geringerer Vergrößerung wie 10x mit einer kleinen numerischen Apertur und einem größeren Arbeitsabstand geeignet sein 19,21. Für kleinere Gewebeproben können Objektive mit höherer Vergrößerung wie z.B. 20x mit einer hohen numerischen Apertur und einem kleineren Arbeitsabstand wünschenswert sein. Auch die Verwendung eines Immersionsöls mit einem an das Klärmedium angepassten Brechungsindex und einer Objektivlinse ist entscheidend, um Bildverzerrungen zu vermeiden und Klarheit zu erlangen17,19. Für die Bildverarbeitung stehen verschiedene Bildverarbeitungs- und Analysesoftware-Suiten zur Verfügung. Während einige der Software-Suiten kostenlos sind, sind andere teuer und für einzelne Labore möglicherweise unerschwinglich. Diese Imaging-Plattformen erzeugen riesige Dateien (in Gigabyte), die High-End-Computerarbeitsplätze für die Datenvisualisierung und -quantifizierung erfordern 17,20,21.
Obwohl sie schneller und einfacher durchzuführen sind als andere DNA-Markierungsmethoden wie BrdU, gibt es Einschränkungen beim Nachweis von LRCs durch EdU-Markierung in vivo im Vergleich zur Markierung von LRCs mit H2B-GFP-transgenen Mäusen. Erstens ist es schwierig, die LRCs des epithelialen Ursprungs oder des mesenchymalen Ursprungs zu unterscheiden. Die H2B-GFP-Markierung kann in einem gewebespezifischen, promotorgesteuerten Tetracyclin-Aktivator verwendet werden, der die ruhenden Stammzellen in verschiedenen Geweben spezifisch markieren kann. Bei Mäuseschneidezähnen können mit der H2B-GFP-Methode die Stammzellen aus dem Epithel oder Mesenchymspezifisch markiert werden 4,22. Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden zur Gewebereinigung und 3D-Bildkonstruktion gelten jedoch auch für H2B-GFP-Fluoreszenz-markierte LRCs und bieten Flexibilität und eine Vielzahl von Optionen. Unsere Arbeit ermöglicht die Markierung und Charakterisierung von LRCs nach wissenschaftlichen Bedürfnissen. Die H2B-GFP-Methode erfordert die Produktion transgener Mäuse und die Kreuzung mit anderen Stämmen, was zeitaufwändig und kostspieliger ist als die EdU-Markierung. Die andere Einschränkung der EdU-Markierung mit der Gewebereinigungsmethode besteht darin, dass die Proben nicht weiter für nachgelagerte Funktionsanalysen verwendet werden können.
Dieses Protokoll ist vorteilhaft für Forscher, die keine gewebespezifische Markierung benötigen und schnellere Ergebnisse bei der Markierung ruhender Stammzellen wünschen. Diese Methode kann modifiziert werden, um sie für die Rückverfolgung von Zelllinien zu verwenden. In Verbindung mit der Cre-gesteuerten Fluoreszenzmarkierung von Stamm-/Vorläuferzellen erhält unsere Methode mehr Details über die Lokalisierung der Nachkommen und eine genauere Quantifizierung/Beiträge23.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Meghann K. Holt für die Bearbeitung des Manuskripts. Diese Studie wurde durch die NIH/NIDCR-Zuschüsse DE026461 und DE028345 sowie durch die Anschubfinanzierung der Texas A&M School of Dentistry an Dr. Xiaofang Wang unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
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