Summary
マウス切歯には、幹細胞ニッチに貴重なラベル保持細胞が含まれています。私たちは、ラベル保持細胞を偏りなく検出して定量化する新しい方法を持っています。私たちの研究では、下顎骨のPEGASOS組織除去後のEdU標識と3D再構成アプローチを使用しました。
Abstract
マウス切歯は、マウスの寿命を通して継続的に成長する器官です。切歯の近位組織に存在する上皮幹細胞および間葉系幹細胞は、アメロブラスト、歯芽細胞、および歯髄線維芽細胞に分化する子孫を生じさせる。これらの細胞は、切歯組織の持続的なターンオーバーをサポートする上で非常に重要であり、マウス切歯を成体幹細胞の恒常性を研究するための優れたモデルにします。幹細胞は、5−エチニル−2'−デオキシウリジン(EdU)などのヌクレオチド類似体によって標識することができる長寿命の静止細胞を含むと考えられている。細胞は長期にわたってこのラベルを保持し、それに応じてラベル保持細胞(LRC)と呼ばれます。 LRCをin vivoで 可視化するアプローチは、幹細胞の恒常性をモニタリングするための堅牢なツールを提供します。本研究では、LRCを可視化・解析する手法について述べる。私たちの革新的なアプローチは、組織透明化後のマウス切歯のLRCとホールマウントEdU染色、それに続く共焦点顕微鏡検査、およびイメージングソフトウェアによる3次元(3D)再構成を特徴としています。この方法では、セクション化されたスライドでの従来のLRC分析と比較して、3Dイメージングの取得とバイアスのない定量が可能になります。
Introduction
継続的に成長するマウス切歯は、成体幹細胞を研究するための優れたモデルです1。切歯の近位側に存在する上皮(唇と舌の頸部ループ)と間葉系幹細胞(唇と舌の頸部ループの間)は、アメロブラスト、歯芽細胞、歯髄細胞に分化します。このユニークなプロセスは、組織の喪失と代謝回転を補償するための細胞の供給源を提供します2。Sox2、Gli1、Thy1 / CD90、Bmi1などのいくつかの幹細胞マーカーですが。マウス切歯における成体幹細胞のサブセットについてインビボで同定されているが、それらは単独で使用した場合の幹細胞集団を表すには不十分である1、3、4、5。ヌクレオチド類似体DNAの標識と保持によって長寿命の静止細胞を可視化することで、成体幹細胞のほとんどのサブセットを偏りなく検出できます6。さらに、このアプローチは、多くの幹細胞同定方法7の中で、歯科幹細胞集団の細胞挙動および恒常性を理解するために有用である3、8。分裂した幹細胞は、かなりの追跡の後にDNA標識を失いますが、推定静止幹細胞はDNA標識を保持し、ラベル保持細胞(LRC)と見なします6。非分裂幹細胞によるDNA標識と保持は、推定成体幹細胞をニッチにマークして配置します。
過去数年間、チミジン類似体5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)標識は、細胞増殖アッセイ用の面倒で時間のかかる高解像度顕微鏡法に適合しない3H-チミジンDNA標識法に取って代わりました6,9。近年、5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)標識技術がBrdUよりもますます使用されています。このパターンはいくつかの理由で現れました。まず、BrdU法は遅く、労働集約的です。使用条件はさまざまであり、検体の微細構造を保存することはできません(DNA変性のため)。同様に、BrdU法は細胞の抗原性を失うため、共局在実験やin vivo幹細胞移植などの下流の機能解析やアッセイには非効率的になります3、7、9、10、11、12。BrdUは催奇形性物質でもあり、胚発生におけるLRCの標識には適していません6。また、BrdU法は、ホールマウント試験片に使用すると非効率的です。欠点は、検体の深部での抗体の浸透性が低いこと、または深部浸透のために抗体のインキュベーション期間が長いことです13。EdU標識は、試料を変性させるステップを回避し、微細構造を保存します。この特徴は、共局在実験や幹細胞移植などの下流の機能解析に有利です11,12。また、EdUラベリングは非常に感度が高く迅速です。Cu(I)触媒による[3 + 2]環化付加反応(「クリック」化学)を介してEdU標識を検出するために、急速に吸収され、より小さなサイズの蛍光アジドを使用しているため、試料の浸透率は高くなります14。
ますます適用されている別のDNA標識法は、操作されたトランスジェニックマウスの使用です。これらのマウスは、テトラサイクリン応答性調節因子5,14によって制御されるヒストン2B緑色蛍光タンパク質(H2B-GFP)を発現する。マウスにテトラサイクリンチャウ/水を4週間から4ヶ月の追跡期間与えた後、GFP蛍光はサイクリング細胞で減少し、LRCのみが蛍光を保持します6。この方法の利点は、標識されたLRCを単離し、細胞培養または下流の機能解析のために生存し続けることができることです6,7。いくつかの研究は、長期使用のために追いかけられたときの静止幹細胞の不正確な標識を報告した。この結果は、H2B-GFP株からの漏出したバックグラウンド発現によるものであり、適切なテトラサイクリン調節応答によるものではなかった15。
さらに、過去のほとんどの文献では、LRCの検出を主に切片化されたスライドで使用していましたが、これは2次元であり、LRCの正確な位置と数を示すのに誤って偏っていることがよくあります。アプローチは、複雑な組織構造の切片に対して誤った角度を表示しました16。もう一つは、連続切片から3D画像を取得し、ポスト画像再構成を行う方法であった。これらのステップは、圧縮または引き伸ばされたセクションによる各シリアルセクションの変動による画像の歪みのために不正確であり、その結果、情報が欠落した16、17、18。この方法はまた、面倒で時間がかかりました。
LRCのホールマウントイメージングを容易にするには、蛍光を十分に維持しながらサンプルを透明化する必要があります。現在の組織透明化技術は、3つの主要なカテゴリーに分類することができる:有機溶媒ベースの組織透明化技術、水性試薬ベースの組織透明化技術、およびヒドロゲルベースの組織透明化技術17,19。ポリエチレングリコール(PEG)関連溶剤系(PEGASOS)が最近開発されました。このアプローチは、ほぼすべてのタイプの組織を透明にし、骨や歯などの硬組織を含む内因性蛍光を維持します20。PEGASOS法は、特に歯や骨の材料の除去において、他の組織透明化方法よりも優れています。他のほとんどの方法は、硬組織を部分的にしか除去できず、処理時間が長く、または高価な試薬を必要とする21。また、PEGASOS法は、他の方法よりも内因性蛍光を効率的に保存することができます。
この文献により、細胞研究のための新しい方法を作成しました。EdU標識のLRC検出の利点と、組織クリア標本の最も優れた3Dホールマウントイメージングを組み合わせました。サンプルは、高度なポリエチレングリコール(PEG)関連溶媒システム(PEGASOS)組織透明化技術15で処理されました。硬組織の透明性により、歯や下顎骨を壊すことなく、 in vivoで LRCの蛍光の3Dシグナルを再構築することができ、LRCをより正確に視覚化および定量する方法を作成しました。
この研究では、マウス切歯のLRCを視覚化するための革新的なガイドを提供します。マウス切歯幹細胞ニッチ内のLRCの位置と量を決定するために、3D視覚的アプローチを行いました。このプロジェクトでは、EdUラベリング、PEGASOS組織透明化技術、および共焦点顕微鏡を使用しました。ホールマウント組織上のLRCをEdU標識する方法と、透明で透明な標本を使用することで、従来の切片スライドの制限やその他の不利なDNA標識方法の両方を克服します。したがって、私たちの技術は、LRCの検出を必要とする幹細胞恒常性、特に硬組織の研究に適しています。このプロトコルは、他の組織や臓器における幹細胞の恒常性に焦点を当てている人にとっても同様に有利であり得る。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、テキサスA&M大学歯学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. EdUラベリングカクテルの準備
- 表1に記載のようにカクテルストック溶液を調製する。
- 表1に記載されているようにEdUラベリングカクテルを準備します。
2. マウスおよびEdU溶液の調製
- EdU ソリューションを準備します。EdUを20 mg/mLのDMSOに溶解し、-20°Cの冷凍庫に保管します。
注意:EdUは変異原です。この物質を取り扱うときは、ユーザーは適切な個人用保護具(PPE)を着用する必要があります。 - 5日齢のC57BL/6Jマウスに、調製したEdU溶液を腹腔内に3 μL/g体重で注射します。マウスは7日間連続して1日1回溶液を受け取らなければならない。次に、分析のために収穫される前に、6週間の追跡期間を経ます(図1)。
注意: マウスにEdUを注射するときは、針を刺さないように注意してください。EdUを7日間連続して注射した後、マウスを新しいケージに入れる。マウスが新しい家に入ったら、適切なバイオハザードルールを使用して古いケージの寝具を処分します。
3.経心臓灌流によるサンプル調製(6週間の追跡期間後の生後53日齢マウス)
注:マウスの肝臓は、経心臓灌流が成功すると青白くなるはずです。
- 腹腔内注射でマウスを麻酔する。彼らはキシラジンとケタミン麻酔薬の組み合わせを与えられる必要があります(キシラジン10-12.5 mg / kg;ケタミン、80-100 mg / kg体重)。
- マウスが痛みを伴う刺激(足のピンチ反射など)に反応しなくなるまで、~10分間待ちます。
- マウスを発泡スチロール支持体上で安定した仰臥位に置き、各足に針を刺します。
- ピンセットとはさみを使用して上にある皮膚を開くことにより、胸腔を露出させます。
- 鋭利なハサミを使用してダイヤフラムを切り開きます。心臓を突き刺さないように注意してください。
- 胸郭を切り裂き、胸骨の付け根をクランプハサミでつかんで心臓を露出させます。
- マウスをヒュームフードの循環ポンプ近くの灌流ステージに移します。
- 25 Gの針(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)/ 4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で満たされたチューブから)を左心室の頂点に挿入します。針の先端を心室の内腔に保つように注意してください。
注意: PFAは中程度の毒性があり、発がん性の可能性があります。PPEを使用してPFAを処理し、化学ヒュームフードの下で溶液を調製します。廃棄物PFAは、施設のガイドラインに従って適切な処分を必要とします。 - 針を左心室に挿入した直後に鋭利なハサミを使用して右心室を切断します。このステップにより、血液がマウスから流出し、収集皿に排出されます。
- サンプルを50 mLのPBS溶液で7 mL/分の流速で灌流します。
- PBS灌流後、活栓を切り替えて、5 mL/分の同じ流量で20 mLの4%PFA溶液の流れを可能にします。
- 循環ポンプがまだオンの状態で、左心室から針を外します。
注意: マウスは組織収集用に固定されました。蛍光を維持するために、プロトコル全体を通して可能な限り光への曝露を避ける必要があります。組織の処理中、組織サンプルを含む50mLのコニカルチューブをアルミホイルで覆うことができます。
4.ペガソス法を使用した下顎骨の組織除去
注:組織の体積に応じて15 mLまたは50 mLのコニカルチューブを使用して、各ステップでサンプルを処理できるようにしておくことができます。サンプルは、ステップ4.2から4.7まで37°Cの振とう機(~100 rpm)で処理されます。プラスチックが溶けないように、有機溶剤に耐性のあるポリプロピレンベースのプラスチック容器を使用してください。あるいは、ガラス製品を使用することもできます。
注意: ペガソスの組織透明化技術は、クアドロール、ポリエチレングリコール(PEG)、安息香酸ベンジル(BB)、MMA500などの有毒溶液を使用します。潜在的な曝露を避けるために、適切なPPEが必要です。
- 下顎骨を解剖し、さらに4%PFAでサンプルを固定します。室温で一晩保管してください。
- 下顎骨から筋肉を取り除き、0.5 M EDTA溶液(pH 8.0)に浸して4日間脱灰します。この間、37°Cの振とう機で毎日培地交換を行います。
注:サンプルから筋肉をできるだけ取り除くことが望ましいです。この予防措置により、イメージングプロセスが簡素化され、筋肉からの自家蛍光が減少します。 - 下顎骨を37°Cの振とう機で25%クアドロール溶液(H2O中でv/v)で1日間脱色し、残りの血液ヘムを除去します。
- 完全なホールマウントEdU染色。
- 表1に従って、新鮮なEdUラベリングカクテルを準備します。
注:最適なEdUラベリング結果を得るには、EdUラベリングカクテルを毎回新鮮にして、作りたてのアスコルビン酸塩溶液を追加する必要があります。 - 下顎骨をPBSTで37°Cのシェーカーで30分間すすぎます。
- 下顎骨をPBSで毎回3分間3回すすぎます。
- 下顎骨を37°Cのシェーカーで一晩作りたてのEdUラベリングカクテルでインキュベートします。
- 下顎骨をPBSで毎回3分間3回すすぎます。
- 表1に従って、新鮮なEdUラベリングカクテルを準備します。
- 以下の各溶液で37°Cで6時間連続脱脂を行います。
30%tert-ブタノール(tB)溶液:75%v/v H2O、22% v/v tB、および3%v/vクアドロール。
50%tB溶液:50%v/v H2O、47%v/v tB、および3%v/vクアドロール。
70% tB ソリューション: 30% v/v H2O、67% v/v tB、および 3% v/v クアドロール
注:脱脂質化ステップは重要です。脱脂質化は、30%および50%tB溶液中で4〜6時間、および70%tB溶液中で1日間行うことができる。 - 下顎骨をtB-PEG溶液で2日間脱水し、次の毎日の培地交換を行います:75%tB、22%v/vポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート平均MMA500、および3%v/vクアドロールを37°Cで。
- 安息香酸ベンジル(BB)-PEG透明媒体で下顎骨をクリアして、屈折率マッチングを取得します:透明度が達成されるまで、75%v / v BB、22%v / v PEG-MMA500、および3%クアドロール。
注:屈折率マッチングに関する情報があります。水、脂質、タンパク質、ミネラル、細胞小器官などの組織内の無機および有機成分。1.33〜1.55の範囲で異なる屈折率(RI)を有する。組織成分間のこのRIミスマッチは、イメージングプロセスを妨げる。透明性は、組織内のRIミスマッチを排除することによって達成できます。組織透明化サンプルをBB-PEGの透明化媒体に浸すことをお勧めします。このステップにより、標本全体に~1.54の均一な内部RI(RIマッチングと呼ばれる)が得られ、イメージングプロセスが容易になります。 - 下顎骨をBB-PEG組織透明化培地に室温で保存し、保存およびイメージングを行います。
注意: 蛍光レポーターが徐々に失われないように、できるだけ早くイメージングを完了することをお勧めします。ただし、PEGASOS法は、数週間の保存後でも蛍光レポーターをよく保存します20,21。長期保存の場合、サンプルは4°Cで保存することもできます。
5.組織クリア下顎骨の共焦点イメージング
- BB-PEG透明化培地のブランドキャビティスライドに下顎骨全体を組織で取り除き、ガラスカバースライドで覆います。気泡を避けてください。
- 適切なレーザー走査型共焦点顕微鏡で画像取得を行います。[取得]を選択し、画像 取得 パラメータを512 x 512ピクセル解像度と400Hz取得速度に設定します。これらの設定は、顕微鏡を制御するソフトウェアの取得モードメニューにあります。
- 蛍光励起パネルでは、蛍光色素を最適に励起するために必要なレーザー(TRITC)を活性化します(LRCの可視化に使用したプローブは、548 nmでの励起と563 nmのレーザー波長での発光を伴うCy3などの蛍光特性を持っています)。
- 蛍光検出パネルで、スライダーを動かして測定する波長を選択します(たとえば、Cy3様蛍光色素の場合は555〜625 nm)。
- 取り付けた下顎骨を顕微鏡ステージに置き、白色光と低倍率の対物レンズ(2〜10倍)を使用してサンプルを視覚化して見つけます。
- ガラスカバーガラスと対物レンズの屈折率に合わせて、カバーガラスの上に屈折率1.52の液浸油を一滴加えます。
注意: 対物レンズ、イメージングメディア、および組織の屈折率をできるだけ一致させて、画像取得中の光学的歪みの発生を最小限に抑えます。 - 蛍光灯をオンにし、関心領域を画像化するための適切な倍率対物レンズを選択します。口径0.9、作動距離1.95mmの20倍対物レンズを使用しました。共焦点顕微鏡でより大きな組織サンプルをイメージングする場合は、より長い作動距離レンズが必要になる場合があります。あるいは、より大きな組織サンプルに対しては、ライトシート顕微鏡を使用して簡単にイメージングを行うことができます。
- 共焦点イメージングソフトウェアで、ライブボタンを押して ライブ スキャンモードを開始します。画像のダイナミックレンジを最大化し、ピクセルの飽和を回避するには、選択したチャンネルのゲインとレーザー強度を調整します。
- 視野を特定して、下顎骨の領域全体をX次元とY次元で視覚化します。マウス切歯の幹細胞ニッチの体積を正確にカバーする上下のZステージ取得パラメータを設定します。2 μmのZステップサイズを使用するか、要件に応じて使用してください。新しいバージョンの共焦点顕微鏡は、さまざまな重なり合う領域のzスタックを自動的に取得できるはずです。
- Zスタック画像ファイルを.lif形式で取得して保存します。
注:.lifハエは.tiffファイルに変換して、他の3D解析ソフトウェアに使用できます。
6. 表面の作成、関心領域(ROI)のセグメンテーション、ROIのマスキング、スポットの作成によるラベル保持細胞の画像処理、3D画像再構成、定量化
注:画像処理と3D再構成にはImaris(ビットプレーン9.0.1)を使用しましたが、他のソフトウェアスイート(ImageJ / Fiji、3Dスライサー、Avizo、Arivis、Amiraなど)を使用して同様の画像処理手順を実行できます。
- イメージングソフトウェアで、「 アリーナ 」ボタンをクリックしてから、「 イメージ」を選択します。元の .lifファイルを選択し、マージされた ファイル を選択すると、画像がイメージングソフトウェアにインポートされます。
注: または、イメージング ソフトウェア ファイル コンバータを使用して、Z スタック イメージ ファイルをソフトウェアのネイティブ形式のファイル タイプに変換します。たとえば、Imaris ファイル コンバータを使用して .lif ファイルを .ims ファイルに変換し、イメージング ソフトウェアで .ims ファイルを開きます。データをソフトウェアのネイティブファイル形式に変換すると、迅速なファイル変換が可能になり、エラーが最小限に抑えられます。 - インポートしたファイルをダブルクリックして、画像データセットを開きます。
- ディスプレイ調整パネルにアクセスし、チャンネルの名前をクリックします。通常、デフォルトモードでは赤とラベル付けされます。
- [画像のプロパティ]ウィンドウで、[マップされた色]タブをクリックします。カラーテーブルファイルオプションで、ファイアフローを選択し、OKをクリックします。表示色は通常、サンプルからのバックグラウンド蛍光と陽性蛍光を区別するために選択されます。
- 画面の左上の [シーン – プロパティ ] ペインで、[ 新しいサーフェスの追加] というラベルの付いた青いアイコンをクリックします。 ボリューム アイコンの選択を解除すると、バックグラウンド蛍光のほとんどが削除され、陽性蛍光がはっきりと表示されます(ステップ6.4.2を参照)。
- 関心領域(ROI)の手動セグメンテーションのプロセスを開始するには、[作成]タブをクリックし、[自動作成をスキップして手動で編集]タブを選択します。手動サーフェス作成ウィザードで、[コンター]タブをクリックして、サンプルに基づいて方向(XY、YZ、またはXZ)を選択し、ROIを簡単にコンター化します。ここでは、XY方向を選択します。
- 次に、右隅のポインタメニューが選択モードになっていることを確認します。スライス位置を調整して、組織内のROIを見つけます。ステップ6.4で述べたように、バックグラウンド蛍光のほとんどが明確な正の蛍光で除去されていることに気付くでしょう。[描画]ボタンをクリックして、一時的な関心領域を描画します。ROI 以外の領域からの干渉を避けるために、[可視性] オプションを [なし] に選択します。
- 手順 6.4.2 を繰り返します。スライスごとに、関心領域全体を描画します。
- ROIの描画が完了したら、[ サーフェスの作成 ]をクリックしてROIの3Dジオメトリを取得します。
- 手動サーフェス作成ウィザードの「 編集」(Edit ) ボタンをクリックし、「 すべてマスク」(Mask All) を選択します。
- ポップアウトされた マスク チャンネルウィンドウで、チャンネル選択オプションで チャンネル 1を選択します。その後、[ マスクを適用する前にチャンネルを複製]を選択します。マスク設定で、[ 内側/外側に一定 ]を選択し、ボクセルの外側サーフェスを 0 に設定します。
- [シーン プロパティ]ペインで、[サーフェス オブジェクト]の選択を解除し、[ボリューム]オブジェクトを選択します。ディスプレイ調整で、元の「赤」チャンネルの選択を解除し、マスクされた赤チャンネルを選択して色の強度を調整し、目的の3Dレンダリングおよびポジティブラベルの蛍光ROIを取得します。
- 新しいスポットオブジェクトを作成します。まず、[スポット に追加 ] アイコンをクリックして、3D レンダリングされた LRC と比較的重なる 3D スポットを作成して、3D レンダリングされた LRC を定量化します。 下の矢印を使用して、スポット作成ウィザードのステップ間を移動します。
- スポット作成ウィザードには、ソフトウェアを使用してスポットを自動的に作成するための4つの連続した手順があります。最初のステップで [関心領域のみをセグメント化] オプションが選択されていることを確認します。 [次へ ]アイコンをクリックします。
- 2番目のステップでは、「XYZ 3Dボックス」があります。ROIをカバーするようにXYZボックスを調整します。 [次へ ]アイコンをクリックします。
- 3番目のステップで、[ ソースチャネル ]オプションに移動します。マスクされた赤いチャンネルを選択します。サンプル蛍光ドットにフィットして重ね合うように推定XYスポット径を入力する。 [次へ ]アイコンをクリックします。
- 4番目のステップでは、「品質」フィルタータイプを追加し、識別可能なLRCの大部分にラベルが付けられるまで「品質」ヒストグラム上でスライディングウィンドウを移動して、低強度しきい値を調整します。
注:セグメンテーション、したがって統計的読み出し(例:セル数)は、強度のしきい値に大きく依存します。適切なしきい値を正確に設定するように注意してください。 - [ 完了 ]ボタンをクリックし、[ 統計 ]ボタンを選択します。 [全体] タブを選択して、画像内のスポットの総数の値を見つけます。
- [ファイルに表示]タブボタンをクリックして統計をエクスポートし、結果を.xlsファイルで受け取ります。
- 適切な図を使用して、定量結果を提示します。
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Representative Results
EdU標識とPEGASOS組織透明化プロセス(図2)の後、画像(図3B)に示すように透明な下顎骨が得られました。修正されたサンプルを、組織クリアリングプロセスのない通常の下顎骨と比較しました(図3A)。EdU標識を施した透明下顎骨(図3B)を共焦点イメージングに供した。我々は、(補足図1)に示すように幹細胞ニッチを示す切歯頂点に着目した。切歯の光学切片は、XY平面における切歯頂部の幹細胞ニッチにLRCを示した(図4A)。上皮(緑)と間葉系(赤)の両方の幹細胞ニッチにEdU+ ラベルを保持する静止幹細胞を示す切歯頂点の3D画像を再構築しました(図4B)。EdU+ 細胞は、間葉系LRCとほぼ重なる定量のためにスポットに移されました(図4C)。図 4D は、間葉系LRCに対してのみ作成されたスポットを示し、 図4E は上皮性LRCに対してのみ作成されたスポットを示す。その後、上皮および間葉系LRCの定量を完了しました(図4F)。
図1:LRCを標識するためのEdUインジェクションプロトコル。 野生型(WT)マウスに、P5から開始してEdUを注射した。注射はP11まで7日間連続して続いた。次に、マウスは6週間の追跡期間を受けた。生後53日目に収穫しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:プロトコルのワークフロー。 マウスにEdUを7日間連続して注射し、次いで6週間の追跡期間に置いた。下顎骨は、経心臓灌流後に採取および固定されました。次に、下顎骨を脱灰し、脱灰、脱色、ホールマウントEdU染色、脱脂質化、脱水、屈折率(RI)マッチングの組織透明化ステップにかけました。透明化された下顎骨のイメージングは、共焦点顕微鏡下で実行され、その後データ分析が行われました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:生後53日齢のWTマウス下顎骨の画像(組織透明化前(A)および組織透明化後(B)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:XY平面における切歯頂点の幹細胞ニッチにおけるLRCsを示す切歯の光学切片(A)。 マウス下顎切歯の上皮および間葉系LRCの頂点に向かっての3D画像再構成(B)。間葉系LRC(赤)と作成された3Dスポット(灰色)(C)を重ねます。間葉系LRCのためだけに作成されたスポット(D)。上皮LRCに対してのみ作成されたスポット(E)。上皮および間葉系LRC(F)の定量結果。バー:Aで300μm、B-Eで150μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| EdUラベリングカクテルの調製 |
| 原液の調製(水性) |
| TBS (10倍) 1 M, pH 7.6 |
| CuSO4 (100x), 0.4 M |
| スルファシアニン3アジド(100x)、DMSO溶液300 μM |
| アスコルビン酸ナトリウム (10x), 0.2 g/mL H2O 溶液 |
| PBST (0.1% Triton X-100 PBS 中, v/v) |
| EdUラベリングカクテルの調製 |
| 以下の試薬を順番に追加します。 |
| トリス緩衝生理食塩水(最終100 mM、pH 7.6) |
| CuSO 4 (4 mM ファイナル) |
| スルファシアニン3アジド(3 μMファイナル) |
| アスコルビン酸ナトリウム(最終100mM、用途ごとに作りたて) |
表1:EdUラベリングカクテルの調製
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Discussion
複数回投与の注射(BrdU、EdU)は、通常、増殖細胞を可能な限り標識するために、成長中の新生児マウスに使用されます1、6、13。追跡期間は、組織の再生率に関する重要なステップと見なされます6,13。マウス切歯は毎月更新されます。この特性により、研究者は追跡期間を4週間以上に設定できます4,5,22。私たちの6週間の追跡期間は、間葉系および上皮(唇および舌頸部ループ)コンパートメントの幹細胞を標識することができました。この領域には、上皮コンパートメントと間葉系コンパートメントの両方からのTAC(トランジット増幅細胞)の前駆細胞の一部が含まれていました。より長い追跡期間は、上皮および間葉系幹細胞ニッチにのみ存在する真のラベル保持細胞を示すために望ましいであろう。
このプロトコルの組織処理およびクリアリング段階には、複数の重要なステップがあります。最初の注意点は、組織の灌流と固定のステップです。マウスの切歯は、血管の豊富な供給を有し、大量の血液組織を含む歯髄組織を含む。したがって、ヘパリンPBS灌流は、マウスが深く麻酔され拘束された後、できるだけ早く開始する必要があります。その理由は、自家蛍光19につながる血栓形成を避けるためです。透明化後の組織の不十分な透明性および黄色がかった変色につながる可能性のあるPFAによる過剰固定を避けるように注意する必要があります。過度の変色は、イメージング19中のサンプルの信号品質を低下させる。能動的経心臓灌流ステップは、臓器/組織の受動的浸漬固定よりも好まれ、組織クリアリングステップでの内因性蛍光の損失を回避するために組織を迅速に固定します。受動的固定では、組織のより深い領域は透明度の低いままである可能性があります。サンプルは満足のいく画像化結果を有しない可能性がある19。下顎骨から筋肉を適切に除去することで、研究者が興味を持つ構造を適切に視覚化することができます。さらに、効果的な除去は、自己蛍光障害が筋肉組織に影響を与えるのを防ぎます。硬組織の透明化には適切な脱灰が不可欠です。サンプルのサイズとミネラル含有量に応じてEDTA浸漬時間を調整することにより、組織を適切に脱灰するように注意する必要があります。EDTA濃度は、組織の過剰な収縮を避けるために重要です。したがって、濃度は質問16,19のサンプルと実験に従って選択する必要があります。同様に、脱色ステップは、自家蛍光を低減するために残りのヘムを適切に除去するために重要です。不十分な脱脂質化時間は、組織の透明性を低下させる可能性があるため、お勧めしません。一般に、マウス下顎骨などの硬組織に対する脱脂質化は、30%および50%tB溶液中で4〜6時間、および70%tB溶液中で1日間行うことができる20。インキュベーション時間は、サンプルのサイズとその脂質含有量によって異なります。完全な脱脂を確実にするために時間を延長することができる19,20。個々のラボは、脱脂質化に必要な最小時間を短縮することなく、要件に応じてタイミングを調整できます。
組織透明化技術における最も一般的な問題は、不適切な組織処理および透明化ステップによって引き起こされる組織の不十分な透明性を含む。この状況は、鮮明な画像を得ることを困難にし、蛍光標識された細胞または細胞内構造の適切な可視化を妨げる。透明性が不十分な組織のトラブルシューティングは、各重要なステップが正しく行われていることを確認することによって行う必要があります。この練習は、組織の灌流と固定のステップから組織の除去ステップまで始める必要があります。各組織または臓器の特性は異なります。したがって、組織処理および透明化ステップは、満足のいく透明化結果を得るために最適化されるべきである19。
透明化された組織サンプルの画像化は、装置の要件および実験上の質問および可用性に応じて、共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)またはライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)を用いて完了することができる17。下顎骨のイメージングにはCLSMを使用しましたが、LSFM17,20と比較して、より高い倍率で高解像度のイメージングが可能ですが、時間がかかります。高解像度と高倍率が要件でない場合は、高速ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)が望ましい場合があります19。LSFMは高価であり、通常のラボでは簡単に利用できない場合があります。共焦点顕微鏡では、適切な開口数を備えた適切な対物レンズを選択することが、良好なイメージングに不可欠です19,20。大きな組織サンプルの場合、開口数が少なく作動距離が大きい10倍などの低倍率の対物レンズが適切な場合があります19,21。より小さな組織サンプルの場合、高い開口数とより短い作動距離を備えた20倍などのより高い倍率の対物レンズが望ましい場合があります。また、透明媒体と対物レンズに一致する屈折率を有する液浸油を使用することは、画像の歪みを回避し、明瞭さを得る上で重要である17,19。イメージングには、いくつかの画像処理および解析ソフトウェアスイートが利用可能です。一部のソフトウェアスイートは無料ですが、他のソフトウェアスイートは高価であり、個々のラボでは手ごろな価格ではない場合があります。これらのイメージングプラットフォームは、データの視覚化と定量化のためにハイエンドのコンピュータワークステーションを必要とする大量のファイル(ギガバイト単位)を生成します17,20,21。
BrdUなどの他のDNA標識法よりも迅速かつ簡単に実行できますが、H2B-GFPトランスジェニックマウスでLRCを標識する場合と比較して、in vivoでのEdU標識によるLRCの検出には限界があります。第一に、上皮起源または間葉系起源のLRCを区別することは困難である。H2B-GFP標識は、さまざまな組織の静止幹細胞を特異的に標識できる、組織特異的なプロモーター駆動型テトラサイクリンアクチベーターに使用できます。マウス切歯の場合、H2B-GFP法は、上皮または間葉からの幹細胞を特異的に標識することができる4,22。ただし、このプロトコルに記載されている組織透明化および3D画像構築方法は、H2B-GFP蛍光標識LRCにも適用され、柔軟性とさまざまなオプションを提供します。私たちの研究は、科学的ニーズに応じてLRCの標識と特性評価を可能にします。H2B-GFP法は、トランスジェニックマウスの作製と他の系統との交雑が必要であり、これはEdU標識よりも時間と費用がかかります。組織透明化法によるEdU標識のもう1つの制限は、検体を下流の機能分析にさらに使用できないことです。
このプロトコルは、組織特異的標識を必要とせず、静止幹細胞の標識によるより迅速な結果を望む研究者にとって有利です。この方法は、細胞系譜追跡に使用するように変更することができます。幹細胞/前駆細胞のCre駆動蛍光標識を組み込むと、私たちの方法は子孫の位置に関する詳細とより正確な定量/寄与を取得します23。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
原稿を編集してくれたメーガン・K・ホルトに感謝します。この研究は、NIH / NIDCR助成金DE026461およびDE028345、およびテキサスA&M歯学部からXiaofang Wang博士へのスタートアップ資金によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
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