Summary
El incisivo del ratón contiene valiosas células que retienen etiquetas en su nicho de células madre. Tenemos una forma novedosa de detectar y cuantificar de manera imparcial las células que retienen la etiqueta; nuestro estudio utilizó el etiquetado EdU y un enfoque de reconstrucción 3D después de la limpieza del tejido PEGASOS de la mandíbula.
Abstract
El incisivo murino es un órgano que crece continuamente a lo largo de la vida útil del ratón. Las células madre epiteliales y mesenquimales que residen en los tejidos proximales de los incisivos dan lugar a una progenie que se diferenciará en ameloblastos, odontoblastos y fibroblastos pulpares. Estas células son cruciales para apoyar la renovación sostenida de los tejidos incisivos, lo que hace que el incisivo murino sea un excelente modelo para estudiar la homeostasis de las células madre adultas. Se cree que las células madre contienen células quiescentes de larga vida que pueden ser marcadas por análogos de nucleótidos como 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU). Las celdas conservan esta etiqueta a lo largo del tiempo y, en consecuencia, se denominan células de retención de etiquetas (LRC). Los enfoques para visualizar las LRC in vivo proporcionan una herramienta sólida para monitorear la homeostasis de las células madre. En este estudio, describimos un método para visualizar y analizar las LRC. Nuestro enfoque innovador presenta LRC en incisivos de ratón después de la limpieza del tejido y la tinción EdU de montaje completo, seguida de microscopía confocal y una reconstrucción tridimensional (3D) con el software de imágenes. Este método permite la adquisición de imágenes 3D y la cuantificación no sesgada en comparación con el análisis tradicional de LRC en diapositivas seccionadas.
Introduction
El incisivo de ratón en continuo crecimiento es un excelente modelo para estudiar células madre adultas1. Las células madre epiteliales (asa cervical labial y lingual) y mesenquimales (entre el asa cervical labial y lingual) que residen en el lado proximal del incisivo se diferencian en ameloblastos, odontoblastos y células de la pulpa dental. Este proceso único proporciona una fuente de células para compensar la pérdida y el recambio tisular2. Aunque varios marcadores de células madre como Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, etc. se han identificado in vivo para los subconjuntos de células madre adultas en incisivos de ratón, son inadecuadas para representar las poblaciones de células madre cuando se usan solas 1,3,4,5. La visualización de células quiescentes de larga vida mediante el etiquetado y la retención de ADN análogo de nucleótidos podría proporcionar una detección imparcial para la mayoría de los subconjuntos de células madre adultas6. Además, este enfoque es útil entre muchos métodos de identificación de células madre7 para comprender el comportamiento celular y la homeostasis de las poblaciones de células madre dentales 3,8. Mientras que las células madre en división perderían su etiquetado de ADN después de una persecución considerable, las células madre quiescentes putativas conservan su etiqueta de ADN, considerándolas células de retención de etiquetas (LRC)6. El etiquetado y la retención del ADN por células madre no divididas marcarán y localizarán las células madre adultas putativas en sus nichos.
En los últimos años, el etiquetado análogo de timidina 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) reemplazó el engorroso, lento y de alta resolución método de marcado de ADN 3H-timidina incompatible con microscopía para ensayos de proliferación celular 6,9. En los últimos años, la técnica de etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) se ha utilizado cada vez más sobre BrdU. Este patrón surgió debido a varias razones. En primer lugar, el método BrdU es lento y requiere mucha mano de obra. Las condiciones del usuario son variables, y es incapaz de preservar la ultraestructura en las muestras (debido a la desnaturalización del ADN). Del mismo modo, el método BrdU pierde la antigenicidad de las células, lo que lo hace ineficiente para análisis funcionales posteriores y ensayos, como los experimentos de colocalización y el trasplante de células madre in vivo 3,7,9,10,11,12. BrdU es también un teratógeno, que no es adecuado para el etiquetado de LRC en el desarrollo embrionario6. Además, el método BrdU es ineficiente cuando se utiliza en las muestras de montaje completo. Las desventajas son la baja penetración de anticuerpos en la parte profunda de las muestras o la necesidad de un largo período de incubación de anticuerpos para la penetración profunda13. El etiquetado EdU escapa a los pasos de desnaturalización de las muestras, preservando así la ultraestructura. Esta característica es ventajosa para los análisis funcionales posteriores, como los experimentos de colocalización y el trasplante de células madre11,12. Además, el etiquetado EdU es altamente sensible y rápido; La penetración de la muestra es alta debido al uso de azidas fluorescentes de absorción rápida y de menor tamaño para detectar etiquetas de EdU a través de una reacción de cicloadición catalizada por Cu(I) [3 + 2] (química "click")14.
Otro método de etiquetado de ADN cada vez más aplicado es el uso de ratones transgénicos modificados. Estos ratones expresan la proteína fluorescente verde histona 2B (H2B-GFP) controlada por un elemento regulador sensible a la tetraciclina 5,14. Después de alimentar a los ratones con tetraciclina durante un período de persecución de 4 semanas a 4 meses, la fluorescencia GFP disminuirá en las células cíclicas y solo las LRC retendrán la fluorescencia6. La ventaja de este método es que las LRC marcadas pueden aislarse y permanecer viables para cultivos celulares o análisis funcionales posteriores 6,7. Algunos estudios informaron un etiquetado inexacto de las células madre quiescentes cuando se persiguieron para su uso a largo plazo. Este resultado se debió a una expresión de fondo con fugas de la cepa H2B-GFP y no a la respuesta apropiada regulada por tetraciclina15.
Además, la mayoría de la literatura en el pasado utilizó la detección de LRC principalmente en diapositivas seccionadas, que son bidimensionales y a menudo erróneamente sesgadas al mostrar la ubicación precisa y el número de LRC. El enfoque mostró ángulos incorrectos para secciones de estructuras tisulares complejas16. El otro método era obtener imágenes 3D de secciones seriales y realizar reconstrucciones posteriores a la imagen. Estos pasos fueron inexactos debido a la distorsión de la imagen debido a las variaciones en cada sección serie debido a secciones comprimidas o estiradas, lo que resultó en información faltante16,17,18. El método también era laborioso y consumía mucho tiempo.
Para facilitar la obtención de imágenes de montaje completo de los LRC, las muestras deben ser claras mientras que la fluorescencia debe mantenerse bien. Las técnicas actuales de depuración tisular pueden clasificarse en tres grandes categorías: técnicas de depuración tisular a base de disolventes orgánicos, técnicas de depuración tisular a base de reactivos acuosos y técnicas de depuración tisular basadas en hidrogel17,19. El sistema de disolvente asociado al polietilenglicol (PEG) (PEGASOS) se ha desarrollado recientemente. Este enfoque hace que casi todos los tipos de tejidos sean transparentes y preserva la fluorescencia endógena, incluidos los tejidos duros como el hueso y los dientes20. El método PEGASOS tiene ventajas sobre otros métodos de limpieza de tejidos, especialmente en la limpieza de materiales dentales y óseos. La mayoría de los otros métodos sólo podían eliminar parcialmente los tejidos duros, tener largos tiempos de procesamiento o requerir reactivos costosos21. Además, el método PEGASOS puede preservar eficientemente la fluorescencia endógena sobre otros métodos.
Esta literatura nos llevó a crear un nuevo método para el estudio celular. Combinamos las ventajas de detección de LRC del etiquetado EdU con las imágenes 3D de montaje completo más superiores de muestras limpiadas con tejido; las muestras se procesaron con la técnica avanzada de limpieza de tejidos del sistema de disolvente asociado al polietilenglicol (PEG) (PEGASOS)15. La transparencia del tejido duro nos permitió reconstruir la señal 3D de la fluorescencia de las LRC in vivo sin romper los dientes o la mandíbula, creando una forma más precisa de visualizar y cuantificar las LRC.
En este estudio, proporcionamos una guía innovadora para visualizar las LRC en el incisivo del ratón. Hicimos un enfoque visual 3D para determinar la ubicación y cantidad de LRC dentro del nicho de células madre incisivas de ratón. Este proyecto utilizó el etiquetado EdU, técnicas de limpieza de tejidos PEGASOS y microscopía confocal. Nuestro método de etiquetado EdU de los LRC en tejido de montaje completo y el uso de una muestra transparente y transparente supera tanto las limitaciones de los portaobjetos seccionados tradicionales como otros métodos desventajosos de etiquetado de ADN. Por lo tanto, nuestra técnica será adecuada para estudios sobre homeostasis de células madre que requieran detección de LRC, especialmente en tejidos duros. El protocolo puede ser igualmente ventajoso para aquellos que se centran en la homeostasis de las células madre en otros tejidos y órganos.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Odontología de la Universidad de Texas A&M.
1. Preparación del cóctel de etiquetado EdU
- Prepare las soluciones de caldo de cóctel como se describe en la Tabla 1.
- Prepare el cóctel de etiquetado EdU como se describe en la Tabla 1.
2. Preparación de la solución de ratones y EdU
- Prepare la solución EdU. Disolver EdU en DMSO a 20 mg/ml y almacenar en un congelador a -20 °C.
PRECAUCIÓN: EdU es un mutágeno. Los usuarios deben usar equipo de protección individual (EPP) adecuado cuando manipulen esta sustancia. - Inyecte ratones C57BL/6J de 5 días de edad con la solución de EdU preparada por vía intraperitoneal a 3 μL/g de peso corporal. Los ratones deben recibir la solución una vez al día durante 7 días consecutivos. A continuación, se someten a un período de persecución durante 6 semanas antes de ser cosechados para su análisis (Figura 1).
PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de evitar pinchazos con agujas al inyectar EdU en los ratones. Después de inyectar EdU durante 7 días consecutivos, coloque los ratones en una jaula nueva. Después de que los ratones estén en su nuevo hogar, deseche la ropa de cama en la jaula vieja utilizando las reglas apropiadas de riesgo biológico.
3. Preparación de la muestra por perfusión transcardíaca (ratones postnatales de 53 días de edad después del período de persecución de 6 semanas)
NOTA: El hígado del ratón debe ponerse pálido después de una perfusión transcardíaca exitosa.
- Anestesiar ratones con una inyección intraperitoneal. Deben recibir una combinación de anestésicos de xilazina y ketamina (xilazina 10-12,5 mg/kg; Ketamina, 80-100 mg/kg de peso corporal).
- Espere ~ 10 minutos hasta que el ratón ya no responda a estímulos dolorosos (como reflejos de pellizco de la pata).
- Coloque los ratones en una posición supina estabilizada sobre el soporte de espuma de poliestireno con agujas en cada pata.
- Exponga la cavidad torácica abriendo la piel suprayacente con pinzas y tijeras de disección.
- Abra el diafragma con unas tijeras afiladas. Tenga cuidado de no perforar el corazón.
- Corte a través de la caja torácica, agarrando la base del esternón con tijeras de abrazadera para exponer el corazón.
- Transfiera el ratón a la etapa de perfusión cerca de la bomba de circulación en una campana extractora.
- Inserte la aguja de 25 G (del tubo lleno de solución salina tamponada con fosfato (PBS)/solución de paraformaldehído al 4% (PFA)) en el ápice del ventrículo izquierdo. Tenga cuidado de mantener la punta de la aguja en la luz del ventrículo.
PRECAUCIÓN: El PFA es moderadamente tóxico y un probable carcinógeno. Use EPP para manipular PFA y prepare la solución bajo una campana extractora de humos químicos. La PFA de residuos requiere una eliminación adecuada según las pautas de la institución. - Corte el ventrículo derecho con una tijera afilada inmediatamente después de insertar la aguja en el ventrículo izquierdo. Este paso permite que la sangre fluya fuera del ratón y drene en el plato colector.
- Perfundir las muestras con 50 ml de solución de PBS a un caudal de 7 mL/min.
- Después de la perfusión de PBS, cambie la llave de paso para permitir un flujo de 20 ml de solución de PFA al 4% al mismo caudal de 5 ml / min.
- Mientras la bomba de circulación todavía está encendida, retire la aguja del ventrículo izquierdo.
NOTA: El ratón ahora está fijado para la recolección de tejido. Para preservar la fluorescencia, la exposición a la luz debe evitarse siempre que sea posible durante todo el protocolo. Mientras se procesa el tejido, el tubo cónico de 50 ml con las muestras de tejido puede cubrirse con papel de aluminio.
4. Depuración tisular de la mandíbula mediante la técnica PEGASOS
NOTA: Se puede usar un tubo cónico de 15 ml o 50 ml según el volumen de tejidos para mantener las muestras listas para el tratamiento en cada paso. Las muestras se procesan a agitadores de 37 °C (~100 rpm) de los pasos 4.2 a 4.7. Use recipientes de plástico a base de polipropileno que sean resistentes a los solventes orgánicos para evitar que el plástico se derrita. Alternativamente, se puede utilizar cristalería.
PRECAUCIÓN: La técnica de limpieza de tejidos PEGASOS utiliza soluciones tóxicas como Quadrol, polietilenglicol (PEG), benzoato de bencilo (BB), MMA500, etc. Se requiere un EPP adecuado para evitar posibles exposiciones.
- Diseccionar las mandíbulas y fijar las muestras en PFA al 4%. Manténgalos a temperatura ambiente durante la noche.
- Retire los músculos de las mandíbulas y sumérjalos en una solución de EDTA 0,5 M (pH 8,0) para descalcificar durante 4 días. Durante este período, realizar un cambio medio diario en una agitadora a 37 °C.
NOTA: Es deseable eliminar los músculos de la muestra tanto como sea posible. Esta precaución simplificará el proceso de obtención de imágenes y reducirá la autofluorescencia de los músculos. - Decolorar las mandíbulas con una solución de Quadrol al 25% (v/v enH2O) en un agitador a 37 °C durante un día para eliminar el hemo sanguíneo restante.
- Tinción completa de EdU de montaje completo.
- Prepare un cóctel fresco de etiquetado EdU de acuerdo con la Tabla 1.
NOTA: El cóctel de etiquetado EdU debe hacerse fresco cada vez con una solución de ascorbato recién preparada agregada para obtener resultados óptimos de etiquetado EdU. - Enjuagar las mandíbulas con PBST durante 30 min en una agitación a 37 °C.
- Enjuague las mandíbulas con PBS tres veces durante 3 minutos cada vez.
- Incubar las mandíbulas en un cóctel de etiquetado EdU recién hecho en una coctelera de 37 °C durante la noche.
- Enjuague las mandíbulas con PBS tres veces durante 3 minutos cada vez.
- Prepare un cóctel fresco de etiquetado EdU de acuerdo con la Tabla 1.
- Realizar la deslipidación seriada en cada una de las siguientes soluciones durante 6 h a 37 °C:
Solución de terc-butanol (tB) al 30%: 75% v/v H2 O,22% v/v tB y 3% v/v Quadrol.
Solución al 50% tB: 50% v/vH2O, 47% v/v tB y 3% v/v Quadrol.
Solución de 70% tB: 30% v/vH2O, 67% v/v tB y 3% v/v Quadrol
NOTA: El paso de deslipidación es crítico. La deslipidación se puede hacer entre 4-6 h en solución de 30% y 50% de TB y durante 1 día en solución de 70% de TB. - Deshidratar las mandíbulas en solución de tB-PEG durante 2 días con el siguiente cambio medio diario: 75% tB, 22% v/v polietilenglicol metil-éter metacrilato promedio MMA500 y 3% v/v Quadrol a 37 °C.
- Limpie la mandíbula en medio de limpieza de benzoato de bencilo (BB)-PEG para obtener coincidencia del índice de refracción: 75% v / v BB, 22% v / v PEG-MMA500 y 3% Quadrol hasta que se logre la transparencia.
NOTA: Tenemos información sobre la coincidencia del índice de refracción. Los componentes inorgánicos y orgánicos en tejidos como agua, lípidos, proteínas, minerales, orgánulos, etc. tienen un índice de refracción (IR) diferente en el rango de 1,33 a 1,55. Este desajuste de RI entre los componentes del tejido dificulta el proceso de obtención de imágenes. La transparencia se puede lograr eliminando el desajuste de RI dentro del tejido. Se recomienda sumergir las muestras limpiadas de tejido en el medio de limpieza de BB-PEG. Este paso dará el RI interno uniforme de ~ 1.54 (llamado coincidencia de RI) a toda la muestra, facilitando el proceso de obtención de imágenes. - Preservar las mandíbulas en el medio de limpieza de tejido BB-PEG a temperatura ambiente para su almacenamiento e imágenes.
NOTA: Es bueno completar la imagen lo antes posible para evitar la pérdida gradual de reporteros fluorescentes. Sin embargo, el método PEGASOS mantendrá los reporteros de fluorescencia bien conservados incluso después de varias semanas de almacenamiento20,21. Para el almacenamiento a largo plazo, las muestras también se pueden almacenar a 4 ° C.
5. Imágenes confocales de la mandíbula despejada con tejido
- Monte la mandíbula entera despejada en portaobjetos de cavidad de marca en el medio de limpieza BB-PEG y cúbrala con portaobjetos de cubierta de vidrio. Evite cualquier burbuja.
- Realice la adquisición de imágenes con un microscopio confocal de escaneo láser adecuado. Seleccione Adquirir y establezca los parámetros de adquisición de imagen en una resolución de 512 x 512 píxeles y una velocidad de adquisición de 400 Hz. Estos ajustes se encuentran en el menú del modo de adquisición del software que controla el microscopio.
- En el panel para excitación fluorescente, active el láser requerido (TRITC) para excitar de manera óptima los fluoróforos (la sonda que utilizamos para la visualización de LRC tiene propiedades fluorescentes como Cy3 con excitación a 548 nm y emisión a 563 nm de longitud de onda del láser).
- En el panel para la detección de fluorescentes, mueva el control deslizante para seleccionar las longitudes de onda que se medirán (por ejemplo, entre 555 y 625 nm para un fluoróforo similar a Cy3).
- Coloque la mandíbula montada en la etapa del microscopio para visualizar y encontrar la muestra usando luz blanca y un objetivo de aumento más bajo (2-10x).
- Agregue una gota de aceite de inmersión con un índice de refracción de 1.52 en la parte superior del cubreobjetos para que coincida con el índice de refracción del cubreobjetos de vidrio y el objetivo.
NOTA: Haga coincidir el índice de refracción de los objetivos, los medios de imagen y el tejido lo más cerca posible para minimizar la introducción de distorsiones ópticas durante la adquisición de imágenes. - Encienda las lámparas fluorescentes y elija un objetivo de ampliación apropiado para obtener imágenes de las regiones de interés. Utilizamos un objetivo 20x con una apertura numérica de 0,9 con una distancia de trabajo de 1,95 mm. Es posible que se requiera una lente de distancia de trabajo más larga cuando se obtienen imágenes de muestras de tejido más grandes en el microscopio confocal. Alternativamente, las imágenes se pueden hacer fácilmente usando un microscopio de hoja de luz para muestras de tejido más grandes.
- En el software de imágenes confocales, presione el botón Live para iniciar el modo de escaneo en vivo. Para maximizar el rango dinámico de las imágenes y evitar la saturación de píxeles, ajuste la ganancia y la intensidad del láser para el canal seleccionado.
- Identificar el campo de visión para visualizar toda la región de la mandíbula en las dimensiones X e Y. Establezca los parámetros de adquisición de la etapa Z superior e inferior que cubran con precisión el volumen del nicho de células madre en el incisivo de los ratones. Utilice un tamaño de paso Z de 2 μm o según sus requisitos. Las versiones más recientes de microscopios confocales deberían poder adquirir automáticamente pilas z de las diversas regiones superpuestas.
- Adquiera y guarde archivos de imagen Z-stack en formato .lif.
NOTA: Las moscas .lif se pueden convertir en archivos .tiff y se pueden utilizar para otro software de análisis 3D.
6. Procesamiento de imágenes, reconstrucción de imágenes 3D y cuantificación de celdas de retención de etiquetas mediante la creación de una superficie, segmentación de la región de interés (ROI), enmascaramiento del ROI y creación de puntos
NOTA: Utilizamos Imaris (Bitplane 9.0.1) para el procesamiento de imágenes y la reconstrucción 3D, pero se pueden realizar pasos similares de procesamiento de imágenes utilizando otros conjuntos de software (por ejemplo, ImageJ / Fiji, 3D slicer, Avizo, Arivis, Amira, etc.).
- En el software de imágenes, haga clic en el botón Arena y, a continuación, seleccione Imagen. Seleccione el archivo . lif original y elija el archivo combinado, las imágenes se importarán al software de imágenes.
NOTA: Alternativamente, utilice un convertidor de archivos de software de imágenes para convertir el archivo de imagen de pila Z al tipo de archivo de formato nativo para el software. Por ejemplo: convierta los archivos .lif en archivos .ims utilizando el convertidor de archivos Imaris y abra los archivos .ims en el software de imágenes. La conversión de datos al formato de archivo nativo del software permitirá una rápida conversión de archivos y minimizará los errores. - Haga doble clic en el archivo importado para abrir el conjunto de datos de imagen.
- Visite el panel Ajuste de pantalla , haga clic en el nombre del canal. Por lo general, se etiqueta como rojo en el modo predeterminado.
- En la ventana Propiedades de imagen , haga clic en la pestaña Color asignado . En la opción Color Table File (Archivo de tabla de colores ), elija Fire Flow (Flujo de fuego) y, a continuación, haga clic en OK. El color de la pantalla se elige normalmente para distinguir la fluorescencia de fondo y la fluorescencia positiva de la muestra.
- En la parte superior izquierda de la pantalla, en el panel Escena – Propiedades , haga clic en el icono azul con la etiqueta Agregar nueva superficie. Anule la selección del icono de volumen que eliminará la mayor parte de la fluorescencia de fondo y la fluorescencia positiva son claramente visibles (consulte el paso 6.4.2).
- Inicie el proceso de segmentación manual de la región de interés (ROI) haciendo clic en la pestaña Crear y seleccionando la pestaña Omitir creación automática, editar manualmente . En el asistente de creación manual de superficies, haga clic en la pestaña Contorno para elegir la orientación (XY, YZ o XZ) en función de las muestras para contornear fácilmente el ROI. Aquí, elegimos la orientación XY.
- A continuación, asegúrese de que el menú del puntero en la esquina derecha esté en modo Seleccionar . Ajuste la posición del corte para localizar el ROI en el tejido. Notará que la mayor parte de la fluorescencia de fondo se ha eliminado con fluorescencia positiva distinta como se menciona en el Paso 6.4. Haga clic en el botón Dibujar y dibuje una región tentativa de interés. Seleccione la opción Visibilidad a ninguna para evitar interferencias de otras áreas que no sean ROI.
- Repita el paso 6.4.2. Rebanada por rebanada para dibujar toda la región de interés.
- Una vez finalizado el dibujo del ROI, haga clic en Crear superficie para obtener una geometría 3D del ROI.
- Haga clic en el botón Editar del asistente de creación manual de superficies y seleccione Enmascarar todo.
- En la ventana emergente Canal de máscara , seleccione Canal 1 en las opciones de selección de canales. Después, seleccione Duplicar canal antes de aplicar la máscara. En la configuración de la máscara, seleccione Constante interior/ exterior y establezca la superficie exterior del vóxel en 0.
- En el panel Propiedades de escena, anule la selección del objeto de superficie y seleccione el objeto de volumen. En el Ajuste de pantalla, anule la selección del canal "Rojo" original y seleccione el canal Rojo enmascarado y ajuste las intensidades de color para obtener el ROI de fluorescencia 3D renderizado y etiquetado positivamente deseado.
- Cree un nuevo objeto de spot. Comience haciendo clic en el icono Agregar puntos para cuantificar los LRC renderizados en 3D creando puntos 3D que se superpongan de manera comparable con los LRC renderizados en 3D. Utilice las flechas inferiores para desplazarse entre los pasos del asistente para la creación de spots.
- En el asistente de creación de spots, habrá cuatro pasos secuenciales de instrucciones para crear spots automáticamente con el software. Asegúrese de que la opción Segmentar solo una región de interés esté seleccionada en el primer paso. Haga clic en el icono Siguiente .
- En el segundo paso, habrá una "caja XYZ 3D". Ajuste la casilla XYZ para cubrir el ROI. Haga clic en el icono Siguiente .
- En el tercer paso, vaya a las opciones del canal de origen . Elija el canal rojo enmascarado; introduzca el diámetro de punto XY estimado comparable para ajustar y superponer los puntos de fluorescencia de la muestra. Haga clic en el icono Siguiente .
- En el cuarto paso, agregue el tipo de filtro "Calidad" y ajuste el umbral de intensidad inferior moviendo la ventana deslizante a través del histograma "Calidad" hasta que la mayoría de los LRC identificables estén etiquetados.
NOTA: La segmentación y, por lo tanto, las lecturas estadísticas (ejemplo: número de celdas) dependen en gran medida de los valores umbral de intensidad. Tenga cuidado de establecer con precisión los valores de umbral apropiados. - Haga clic en el botón Finalizar y seleccione el botón Estadística . Seleccione la pestaña General para encontrar el valor del número total de puntos de la imagen.
- Exporte estadísticas haciendo clic en el botón Pestaña Mostrar a archivo y reciba los resultados en un archivo .xls.
- Utilice un diagrama adecuado para presentar los resultados de la cuantificación.
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Representative Results
Después del etiquetado de EdU y el proceso de limpieza de tejido PEGASOS (Figura 2), se obtuvo la mandíbula transparente como se muestra en nuestra imagen (Figura 3B). Comparamos la muestra modificada con una mandíbula normal sin un proceso de limpieza tisular (Figura 3A). La mandíbula transparente (Figura 3B) con etiquetado EdU se sometió a imágenes confocales. Nos centramos en el ápice incisivo que muestra el nicho de células madre como se muestra en (Figura suplementaria 1). La sección óptica del incisivo mostró LRC en el nicho de células madre del ápice incisivo en el plano XY (Figura 4A). Reconstruimos una imagen en 3D de un ápice incisivo que muestra células madre quiescentes que retienen la etiqueta EdU + tanto en el nicho de células madre epiteliales (verde) como mesenquimales (rojo) (Figura 4B). Las células EdU+ se transfirieron a puntos para su cuantificación que se superponían de manera comparable con los LRC mesenquimales (Figura 4C). La Figura 4D muestra las manchas creadas solo para las LRC mesenquimales. La Figura 4E muestra las manchas creadas solo para las LRC epiteliales. Luego completamos la cuantificación de las LRC epiteliales y mesenquimales (Figura 4F).
Figura 1: Protocolo de inyección de EdU para etiquetar LRC. Los ratones de tipo salvaje (WT) fueron inyectados con EdU a partir de P5. Las inyecciones duraron 7 días consecutivos hasta P11. A continuación, los ratones se sometieron a un período de persecución de 6 semanas. Los cosechamos en el día postnatal 53. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Flujo de trabajo del protocolo. Los ratones fueron inyectados con EdU durante 7 días consecutivos, y luego colocados en un período de persecución durante 6 semanas. Las mandíbulas fueron recolectadas y fijadas después de la perfusión transcardíaca. A continuación, las mandíbulas se descalcificaron y se sometieron a los pasos de limpieza del tejido de descalcificación, decoloración, tinción de EdU de montaje completo, deslipidación, deshidratación y coincidencia del índice de refracción (RI). Las imágenes de las mandíbulas despejadas se realizaron bajo un microscopio confocal seguido de un análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes de una mandíbula postnatal de ratón WT de 53 días de edad antes de la limpieza del tejido (A) y después de la limpieza del tejido (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Una sección óptica del incisivo que muestra las LRC en el nicho de células madre del ápice incisivo en el plano XY (A). Una reconstrucción de imagen 3D de LRC epiteliales y mesenquimales en incisivos mandibulares de ratón hacia el ápice (B). LRC mesenquimales superpuestas (rojo) con manchas 3D creadas (gris) (C). Manchas creadas solo para LRC mesenquimales (D). Manchas creadas solo para LRC epiteliales (E). Resultados de cuantificación para LRC epiteliales y mesenquimales (F). Bar: 300 μm en A y 150 μm en B-E. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Preparación del cóctel de etiquetado EdU |
| Preparación de soluciones madre (acuosas) |
| TBS (10x) 1 M, pH 7.6 |
| CuSO 4 (100x),0,4 m |
| Sulfa-cianina 3 azida (100x), 300 μM en DMSO |
| Ascorbato de sodio (10x), 0.2 g/mL enH2O |
| PBST (0,1% Triton X-100 en PBS, v/v) |
| Preparación del cóctel de etiquetado EdU |
| Agregue los siguientes reactivos en orden: |
| Solución salina tamponada con tris (100 mM final, pH 7.6) |
| CuSO 4 (4 mM final) |
| Sulfa-Cyanine 3 Azida (3 μM final) |
| Ascorbato de sodio (100 mM final, recién hecho para cada uso) |
Tabla 1: Preparación del cóctel de etiquetado EdU
Figura suplementaria: Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Las dosis múltiples de inyecciones (BrdU, EdU) se utilizan generalmente en ratones neonatales en crecimiento para etiquetar las células proliferantes tanto como sea posible 1,6,13. El período de persecución es considerado un paso crítico con respecto a la tasa de renovación de los tejidos 6,13. El incisivo del ratón se renueva cada mes. Este rasgo permite a los investigadores establecer el período de persecución en 4 semanas o más 4,5,22. Nuestro período de persecución de 6 semanas podría etiquetar las células madre en compartimentos mesenquimales y epiteliales (asa cervical labial y lingual). Esta área incluía algunas de las poblaciones progenitoras en TACs (Transit-Amplifying Cells) de compartimentos epiteliales y mesenquimales. Un período de persecución más largo sería deseable para mostrar verdaderas células de retención de etiquetas que residen exclusivamente en los nichos de células madre epiteliales y mesenquimales.
Hay múltiples pasos críticos en las etapas de procesamiento y limpieza de tejidos para este protocolo. La primera nota es para la etapa de perfusión y fijación del tejido. Los incisivos de ratones contienen tejidos pulpares que tienen un rico suministro de vasos sanguíneos y contienen una gran cantidad de tejidos sanguíneos. Por lo tanto, la perfusión PBS de heparina debe iniciarse tan pronto como sea posible después de que los ratones estén profundamente anestesiados y restringidos. La razón es evitar la formación de coágulos de sangre que conducen a la autofluorescencia19. Se debe tener cuidado para evitar la fijación excesiva con PFA, que puede conducir a una transparencia insuficiente y decoloración amarillenta del tejido después de la limpieza. La decoloración excesiva disminuye la calidad de la señal en las muestras durante la obtención de imágenes19. Se prefiere el paso de perfusión transcardíaca activa sobre la fijación por inmersión pasiva de órganos/tejidos, que fijará rápidamente los tejidos para evitar la pérdida de fluorescencia endógena en los pasos de limpieza de tejidos. En la fijación pasiva, las áreas más profundas en el tejido pueden permanecer menos transparentes; Las muestras pueden no tener resultados de imagen satisfactorios19. La eliminación adecuada de los músculos de las mandíbulas permite una visualización adecuada de las estructuras que interesan a los investigadores. Además, la eliminación efectiva evita que las alteraciones de la autofluorescencia afecten los tejidos musculares. La descalcificación adecuada es indispensable en la limpieza de tejidos duros. Se debe tener cuidado de descalcificar adecuadamente los tejidos ajustando el tiempo de inmersión con EDTA según el tamaño y el contenido mineral de las muestras. La concentración de EDTA es crítica para evitar la contracción excesiva de los tejidos. Por lo tanto, la concentración debe elegirse según las muestras y experimentos en la pregunta16,19. Del mismo modo, un paso de decoloración es crítico para eliminar adecuadamente el hemo restante para reducir la autofluorescencia. Un tiempo de deslipidación inadecuado puede resultar en un tejido menos transparente y no se recomienda. En general, la deslipidación para tejidos duros como las mandíbulas de ratones se puede hacer de 4-6 h en solución de 30% y 50% de TB y durante 1 día en solución de 70% de TB20. El tiempo de incubación depende del tamaño de la muestra y de su contenido lipídico. El tiempo puede prolongarse para asegurar la deslipidación completa19,20. Los laboratorios individuales pueden ajustar el tiempo según sus requisitos sin disminuir el tiempo mínimo requerido para la deslipidación.
El problema más común en las técnicas de limpieza de tejidos implica la transparencia inadecuada del tejido causada por el procesamiento inadecuado del tejido y los pasos de limpieza. Esta situación conduce a la dificultad para obtener imágenes claras, lo que dificulta la visualización adecuada de las estructuras celulares o subcelulares marcadas con fluorescencia. La solución de problemas de los tejidos inadecuadamente transparentes debe hacerse asegurándose de que cada paso crítico se realice correctamente. Esta práctica debe comenzar desde los pasos de perfusión tisular y fijación hasta los pasos de limpieza del tejido. Las propiedades de cada tejido u órgano son diferentes. Por lo tanto, los pasos de procesamiento y limpieza de tejidos deben optimizarse para obtener resultados satisfactoriosde limpieza 19.
La obtención de imágenes de muestras de tejido despejadas puede completarse con un microscopio de barrido láser confocal (CLSM) o un microscopio de fluorescencia de lámina de luz (LSFM) dependiendo de los requisitos y la pregunta experimental y la disponibilidad del equipo17. Se utilizó CLSM para obtener imágenes de la mandíbula, lo que proporciona imágenes de mayor resolución con mayor aumento, pero lleva más tiempo en comparación con LSFM17,20. Cuando la alta resolución y el aumento más alto no son un requisito, el microscopio de fluorescencia de lámina de luz rápida (LSFM) puede ser deseable19. LSFM es caro y puede no estar fácilmente disponible para los laboratorios regulares. Para la microscopía confocal, elegir las lentes de objetivo correctas con la apertura numérica correcta es fundamental para una buena imagen19,20. Para muestras de tejido grandes, pueden ser apropiados objetivos de aumento más bajos, como 10x con una apertura numérica pequeña y una distancia de trabajo mayor19,21. Para muestras de tejido más pequeñas, pueden ser deseables objetivos de aumento más altos, como 20x con una apertura numérica alta y una distancia de trabajo más pequeña. Además, el uso de un aceite de inmersión con un índice de refracción correspondiente al medio de limpieza y una lente de objetivos es fundamental para evitar la distorsión de la imagen y ganar claridad17,19. Para imágenes, hay disponibles varios paquetes de software de procesamiento y análisis de imágenes. Si bien algunos de los paquetes de software son gratuitos, otros son caros y pueden ser inasequibles para laboratorios individuales. Estas plataformas de imágenes generan archivos masivos (en gigabytes) que requieren estaciones de trabajo informáticas de gama alta para la visualización y cuantificación de datos 17,20,21.
Aunque es más rápido y fácil de realizar que otros métodos de marcado de ADN como BrdU, existen limitaciones para detectar LRC a través del etiquetado EdU in vivo en comparación con el etiquetado de LRC con ratones transgénicos H2B-GFP. En primer lugar, es difícil distinguir las LRC de origen epitelial u origen mesenquimal. El etiquetado H2B-GFP se puede usar en un activador de tetraciclina específico del tejido, impulsado por el promotor, que puede etiquetar específicamente las células madre quiescentes en varios tejidos. En el caso de los incisivos de ratones, el método H2B-GFP puede etiquetar específicamente las células madre del epitelio o mesénquima 4,22. Sin embargo, los métodos de limpieza de tejidos y construcción de imágenes 3D descritos en este protocolo también se aplican a los LRC marcados con fluorescencia H2B-GFP, lo que proporciona flexibilidad y una variedad de opciones. Nuestro trabajo permite el etiquetado y caracterización de los LRC de acuerdo con las necesidades científicas. El método H2B-GFP requiere la producción de ratones transgénicos y el cruce con otras cepas, lo que requiere mucho tiempo y es más costoso que el etiquetado de EdU. La otra limitación del etiquetado de EdU con el método de limpieza de tejidos es que las muestras no se pueden utilizar más para análisis funcionales posteriores.
Este protocolo es ventajoso para los investigadores que no requieren etiquetado específico del tejido y desean resultados más rápidos del etiquetado de células madre quiescentes. Este método se puede modificar para su uso en el rastreo del linaje celular; cuando se incorpora con el etiquetado de fluorescencia impulsada por Cre de células madre/progenitoras, nuestro método obtiene más detalles sobre la ubicación de la progenie y cuantificaciones/contribuciones más precisas23.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Meghann K. Holt por editar el manuscrito. Este estudio fue apoyado por las subvenciones DE026461 y DE028345 de los NIH / NIDCR y el financiamiento inicial de la Facultad de Odontología de Texas A&M al Dr. Xiaofang Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
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