Summary
Резец мыши содержит ценные клетки, удерживающие метки, в нише стволовых клеток. У нас есть новый способ объективного обнаружения и количественной оценки клеток, удерживающих метки; в нашем исследовании использовалась маркировка EdU и подход к 3D-реконструкции после очистки ткани нижней челюсти PEGASOS.
Abstract
Резец мыши — это орган, который непрерывно растет на протяжении всей жизни мыши. Эпителиальные и мезенхимальные стволовые клетки, находящиеся в проксимальных тканях резцов, дают начало потомству, которое дифференцируется в амелобласты, одонтобласты и фибробласты пульпы. Эти клетки имеют решающее значение для поддержания устойчивого оборота тканей резцов, что делает резец мыши отличной моделью для изучения гомеостаза взрослых стволовых клеток. Считается, что стволовые клетки содержат долгоживущие спокойные клетки, которые могут быть помечены нуклеотидными аналогами, такими как 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU). Клетки сохраняют эту метку с течением времени и, соответственно, называются клетками, удерживающими метки (LRC). Подходы к визуализации LRC in vivo обеспечивают надежный инструмент для мониторинга гомеостаза стволовых клеток. В этом исследовании мы описали метод визуализации и анализа ЦУР. Наш инновационный подход включает LRC в резцах мыши после очистки тканей и окрашивания EdU с последующим конфокальной микроскопией и 3-мерной (3D) реконструкцией с помощью программного обеспечения для визуализации. Этот метод позволяет получать 3D-изображения и несмещенное количественное определение по сравнению с традиционным анализом LRC на секционных слайдах.
Introduction
Непрерывно растущий резец мыши является отличной моделью для изучения взрослых стволовых клеток1. Эпителиальные (губная и язычная шейная петля) и мезенхимальные стволовые клетки (между лабиальной и язычной шейной петлей), которые находятся на проксимальной стороне резца, дифференцируются в амелобласты, одонтобласты и клетки пульпы зуба. Этот уникальный процесс обеспечивает источник клеток для компенсации потери и обновления тканей2. Хотя несколько маркеров стволовых клеток, таких как Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1 и т. Д. были идентифицированы in vivo для подмножеств взрослых стволовых клеток в резцах мышей, они неадекватны в представлении популяций стволовых клеток при использовании только 1,3,4,5. Визуализация долгоживущих спокойных клеток с помощью нуклеотидной аналоговой маркировки и удержания ДНК может обеспечить объективное обнаружение для большинства подмножеств взрослых стволовых клеток6. Кроме того, этот подход полезен среди многих методов идентификации стволовых клеток7 для понимания поведения клеток и гомеостаза популяций стволовых клетокзубов 3,8. В то время как делящиеся стволовые клетки теряют свою маркировку ДНК после значительной погони, предполагаемые спокойные стволовые клетки сохраняют свою метку ДНК, считая их клетками, сохраняющими метки (LRC)6. Маркировка и удержание ДНК неделящимися стволовыми клетками пометит и обнаружит предполагаемые взрослые стволовые клетки в их нишах.
За последние годы маркировка аналогом тимидина 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) заменила громоздкий, трудоемкий и несовместимый с микроскопией высокого разрешения метод маркировки ДНК 3H-тимидина для анализов пролиферации клеток 6,9. В последние годы метод маркировки 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) все чаще используется в BrdU. Такая закономерность возникла по нескольким причинам. Во-первых, метод BrdU медленный и трудоемкий. Условия использования варьируются, и он не может сохранить ультраструктуру в образцах (из-за денатурации ДНК). Аналогичным образом, метод BrdU теряет антигенность клеток, что делает его неэффективным для последующих функциональных анализов и анализов, таких как эксперименты по совместной локализации и трансплантация стволовых клеток in vivo 3,7,9,10,11,12. BrdU также является тератогеном, который не подходит для маркировки LRC в эмбриональном развитии6. Кроме того, метод BrdU неэффективен при использовании в образцах с цельным креплением. Недостатками являются низкое проникновение антител в глубокую часть образцов или требование длительного инкубационного периода антител для глубокого проникновения13. Маркировка EdU избегает этапов денатурации образцов, тем самым сохраняя ультраструктуру. Эта особенность выгодна для последующих функциональных анализов, таких как эксперименты по совместной локализации и трансплантация стволовых клеток11,12. Кроме того, маркировка EdU очень чувствительна и быстра; Проникновение образцов является высоким из-за использования быстро поглощаемых и меньших по размеру флуоресцентных азидов для детектирования меток EdU через катализируемую Cu (I) [3 + 2] реакцию циклоприсоединения («клик»)14.
Другим все более применяемым методом маркировки ДНК является использование сконструированных трансгенных мышей. Эти мыши экспрессируют зеленый флуоресцентный белок гистона 2B (H2B-GFP), контролируемый чувствительным к тетрациклину регуляторным элементом 5,14. После кормления мышей тетрациклиновым кормом / водой в течение периода преследования от 4 недель до 4 месяцев флуоресценция GFP будет уменьшаться в циклических клетках, и только LRC сохранят флуоресценцию6. Преимущество этого метода заключается в том, что меченые LRC могут быть выделены и остаются жизнеспособными для культивирования клеток или последующего функционального анализа 6,7. В некоторых исследованиях сообщалось о неточной маркировке стволовых клеток, находящихся в состоянии покоя, при длительном использовании. Этот результат был обусловлен негерметичной фоновой экспрессией штамма H2B-GFP, а не соответствующим тетрациклин-регулируемым ответом15.
Более того, в большинстве литературы в прошлом детектирование ЦУР использовалось в основном на секционных слайдах, которые являются двумерными и часто ошибочно предвзятыми в показе точного местоположения и количества ЦУР. Подход показал неправильные углы для срезов сложных тканевых структур16. Другой метод заключался в получении 3D-изображений из серийных срезов и выполнении реконструкций после изображения. Эти шаги были неточными из-за искажения изображения из-за вариаций в каждой последовательной секции из-за сжатых или растянутых секций, что привело к отсутствию информации16,17,18. Метод также был трудоемким и длительным.
Чтобы облегчить визуализацию LRC во всей монтировке, образцы должны быть четкими, а флуоресценция должна поддерживаться в хорошем состоянии. Современные методы очистки тканей можно разделить на три основные категории: методы очистки тканей на основе органических растворителей, методы очистки тканей на основе водных реагентов и методы очистки тканей на основе гидрогеля17,19. Недавно была разработана система растворителей, связанная с полиэтиленгликолем (ПЭГ) (PEGASOS). Этот подход делает почти все типы тканей прозрачными и сохраняет эндогенную флуоресценцию, включая твердые ткани, такие как кости и зубы20. Метод PEGASOS имеет преимущества перед другими методами очистки тканей, особенно при очистке зубных и костных материалов. Большинство других методов могут лишь частично очищать твердые ткани, иметь длительное время обработки или требовать дорогостоящих реагентов21. Кроме того, метод PEGASOS может эффективно сохранять эндогенную флуоресценцию по сравнению с другими методами.
Эта литература привела нас к созданию нового метода исследования клеток. Мы объединили преимущества маркировки EdU для обнаружения LRC с наиболее превосходной 3D-визуализацией образцов, очищенных от ткани; образцы обрабатывали с использованием усовершенствованной технологии очистки тканей с помощью системы растворителей, связанной с полиэтиленгликолем (ПЭГ) (PEGASOS)15. Прозрачность твердых тканей позволила нам реконструировать 3D-сигнал флуоресценции LRC in vivo без разрушения зубов или нижней челюсти, создав более точный способ визуализации и количественной оценки LRC.
В этом исследовании мы представляем инновационное руководство по визуализации LRC в резце мыши. Мы использовали 3D-визуальный подход для определения местоположения и количества LRC в нише стволовых клеток резцов мыши. В этом проекте использовалась маркировка EdU, методы очистки тканей PEGASOS и конфокальная микроскопия. Наш метод маркировки EdU LRC на цельной ткани и использование очищенного и прозрачного образца преодолевает как ограничения традиционных секционных слайдов, так и другие невыгодные методы маркировки ДНК. Таким образом, наша методика будет пригодна для исследований гомеостаза стволовых клеток, требующих обнаружения ЛРК, особенно на твердых тканях. Протокол может быть одинаково полезен для тех, кто фокусируется на гомеостазе стволовых клеток в других тканях и органах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) для Стоматологического колледжа Техасского университета A&M.
1. Приготовление коктейля с маркировкой EdU
- Приготовьте растворы для коктейлей, как описано в таблице 1.
- Приготовьте коктейль с маркировкой EdU, как описано в таблице 1.
2. Приготовление мышей и раствора EdU
- Приготовьте раствор EdU. Растворите EdU в ДМСО в дозе 20 мг/мл и храните в морозильной камере при температуре -20 °C.
ВНИМАНИЕ: EdU является мутагеном. Пользователи должны носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) при работе с этим веществом. - Внутрибрюшинно вводите 5-дневным мышам C57BL/6J приготовленный раствор EdU в дозе 3 мкл / г массы тела. Мыши должны получать раствор один раз в сутки в течение 7 дней подряд. Затем они проходят период погони в течение 6 недель, прежде чем будут собраны для анализа (рис. 1).
ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать укола иглой при введении EdU мышам. После инъекции EdU в течение 7 дней подряд поместите мышей в новую клетку. После того, как мыши окажутся в своем новом доме, утилизируйте подстилку в старой клетке, используя соответствующие правила биологической опасности.
3. Подготовка образцов методом транскардиальной перфузии (постнатальные 53-дневные мыши после 6-недельного периода погони)
ПРИМЕЧАНИЕ: Печень мыши должна побледнеть после успешной транссердечной перфузии.
- Обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией. Им необходимо давать комбинацию ксилазина и кетаминовых анестетиков (ксилазин 10-12,5 мг / кг; Кетамин, 80-100 мг/кг массы тела).
- Подождите ~ 10 минут, пока мышь не перестанет реагировать на болевые раздражители (например, рефлексы ущипывания лап).
- Поместите мышей в лежачее положение, стабилизированное на опоре из пенополистирола с иглами в каждой лапе.
- Обнажите грудную полость, открыв вышележащую кожу с помощью пинцета и рассекающих ножниц.
- Разрежьте диафрагму острыми ножницами. Следите за тем, чтобы не проткнуть сердце.
- Разрезают грудную клетку, захватывая ножницами основание грудины, чтобы обнажить сердце.
- Переведите мышь на перфузионную стадию рядом с циркуляционным насосом в вытяжном шкафу.
- Вставьте иглу 25 G (из трубки, заполненной фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS)/4% раствором параформальдегида (PFA)) в верхушку левого желудочка. Следите за тем, чтобы кончик иглы оставался в просвете желудочка.
ВНИМАНИЕ: PFA умеренно токсичен и является вероятным канцерогеном. Используйте СИЗ для обработки PFA и приготовления раствора под химическим вытяжным шкафом. Отходы PFA требуют надлежащей утилизации в соответствии с руководящими принципами учреждения. - Разрежьте правый желудочек с помощью острых ножниц сразу после введения иглы в левый желудочек. Этот шаг позволяет крови вытекать из мыши и стекать в чашку для сбора.
- Перфузируют образцы 50 мл раствора PBS со скоростью потока 7 мл / мин.
- После перфузии PBS переключите запорный кран, чтобы обеспечить поток 20 мл 4% раствора PFA при той же скорости потока 5 мл / мин.
- Пока циркуляционный насос все еще включен, извлеките иглу из левого желудочка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь теперь закреплена для сбора тканей. Чтобы сохранить флуоресценцию, следует по возможности избегать воздействия света на протяжении всего протокола. Во время обработки ткани коническая пробирка объемом 50 мл с образцами ткани может быть покрыта алюминиевой фольгой.
4. Очистка тканей нижней челюсти по методике PEGASOS
ПРИМЕЧАНИЕ: Коническая пробирка объемом 15 мл или 50 мл в зависимости от объема тканей может использоваться для поддержания образцов готовыми к обработке на каждом этапе. Образцы обрабатываются при шейкерах при 37 °C (~100 об/мин) с этапов 4.2 по 4.7. Используйте пластиковые контейнеры на основе полипропилена, устойчивые к органическим растворителям, чтобы избежать плавления пластика. В качестве альтернативы можно использовать стеклянную посуду.
ВНИМАНИЕ: В методе очистки тканей PEGASOS используются токсичные растворы, такие как квадрол, полиэтиленгликоль (ПЭГ), бензилбензоат (BB), MMA500 и т. Д. Во избежание потенциального воздействия требуются соответствующие СИЗ.
- Препарируют нижние челюсти и дополнительно фиксируют образцы в 4% ПФА. Держите их при комнатной температуре в течение ночи.
- Удалите мышцы с нижней челюсти и погрузите их в 0,5 М раствор ЭДТА (рН 8,0) для декальцинации в течение 4 дней. В течение этого периода выполняйте ежедневную смену среды на шейкере с температурой 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Желательно максимально удалить мышцы из образца. Эта мера предосторожности упростит процесс визуализации и уменьшит аутофлуоресценцию мышц. - Обесцвечивайте мандибулы 25% раствором квадрола (v/v in H2O) на шейкере при 37 °C в течение одного дня, чтобы удалить оставшийся гем крови.
- Завершите окрашивание всего крепления EdU.
- Приготовьте свежий коктейль с маркировкой EdU в соответствии с таблицей 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коктейль для маркировки EdU необходимо каждый раз делать свежим с добавлением свежеприготовленного раствора аскорбата для получения оптимальных результатов маркировки EdU. - Промойте нижние челюсти PBST в течение 30 минут на шейкере при температуре 37 °C.
- Промойте мандибулы PBS три раза в течение 3 минут каждый раз.
- Инкубируйте челюсти в свежеприготовленном коктейле с маркировкой EdU на шейкере при температуре 37 °C в течение ночи.
- Промойте мандибулы PBS три раза в течение 3 минут каждый раз.
- Приготовьте свежий коктейль с маркировкой EdU в соответствии с таблицей 1.
- Проводят серийную делипидизацию в каждом из следующих растворов в течение 6 ч при 37 °C:
30% раствор трет-бутанола (тБ): 75% об./об. Н2О, 22% об./об. тБ и 3% об./об. Квадрола.
50% раствор тБ: 50% об./об. H2O, 47% v/v tB и 3% v/v Quadrol.
70% раствор тБ: 30% об./об. H2O, 67% v/v tB и 3% v/v Quadrol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этап делипидизации имеет решающее значение. Делипидизацию можно проводить между 4-6 ч в 30% и 50% тБ растворе и в течение 1 дня в 70% тБ растворе. - Обезвоживают мандибулы в растворе тБ-ПЭГ в течение 2 дней со следующей суточной сменой среды: 75% тБ, 22% метакрилата метилового эфира полиэтиленгликоля в среднем MMA500 и 3% об./об. Квадрола при 37 ° C.
- Очистите нижнюю челюсть в очищающей среде бензилбензоата (BB)-ПЭГ, чтобы получить соответствие показателя преломления: 75% об./об. BB, 22% об./об. PEG-MMA500 и 3% квадрола до достижения прозрачности.
ПРИМЕЧАНИЕ: У нас есть информация о согласовании показателя преломления. Неорганические и органические компоненты в тканях, такие как вода, липиды, белки, минералы, органеллы и т. Д. имеют разный показатель преломления (RI) в диапазоне от 1,33 до 1,55. Это несоответствие RI между тканевыми компонентами затрудняет процесс визуализации. Прозрачность может быть достигнута путем устранения несоответствия RI внутри ткани. Рекомендуется погружать очищенные от тканей образцы в очищающую среду BB-PEG. Этот шаг даст равномерный внутренний RI ~ 1,54 (называемый соответствием RI) для всего образца, что облегчит процесс визуализации. - Сохраняйте мандибулы в среде для очистки тканей BB-PEG при комнатной температуре для хранения и визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо завершить визуализацию как можно скорее, чтобы избежать постепенной потери флуоресцентных репортеров. Тем не менее, метод PEGASOS сохранит флуоресцентные репортеры хорошо сохраниться даже после нескольких недель хранения20,21. Для длительного хранения образцы также могут храниться при температуре 4 ° C.
5. Конфокальная визуализация очищенной ткани нижней челюсти
- Установите очищенную ткань целиком нижней челюсти на фирменные половые стекла в очищающей среде BB-PEG и накройте стеклянными предметными стеклами. Избегайте пузырьков.
- Выполните получение изображения с помощью подходящего лазерного сканирующего конфокального микроскопа. Выберите «Получить » и установите параметры получения изображения с разрешением 512 x 512 пикселей и скоростью захвата 400 Гц. Эти настройки находятся в меню режима сбора данных программного обеспечения, управляющего микроскопом.
- В панели флуоресцентного возбуждения активируйте необходимый лазер (TRITC) для оптимального возбуждения флуорофоров (зонд, который мы использовали для визуализации LRC, обладает флуоресцентными свойствами, такими как Cy3 с возбуждением при 548 нм и излучением при длине волны лазера 563 нм).
- На панели для флуоресцентного обнаружения переместите ползунок, чтобы выбрать длины волн, которые будут измеряться (например, от 555 до 625 нм для флуорофора, подобного Cy3).
- Поместите установленную нижнюю челюсть на столик микроскопа, чтобы визуализировать и найти образец с помощью белого света и объектива с меньшим увеличением (2-10x).
- Добавьте каплю иммерсионного масла с показателем преломления 1,52 поверх покровного стекла, чтобы оно соответствовало показателю преломления стеклянного покровного стекла и объектива.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как можно точнее сопоставьте показатель преломления объективов, носителей изображения и тканей, чтобы свести к минимуму появление оптических искажений во время получения изображения. - Включите люминесцентные лампы и выберите подходящий объектив увеличения для интересующих областей изображения. Мы использовали объектив 20x с числовой апертурой 0,9 и рабочим расстоянием 1,95 мм. Линза с большим рабочим расстоянием может потребоваться при визуализации больших образцов тканей в конфокальном микроскопе. В качестве альтернативы, визуализация может быть легко выполнена с использованием светового микроскопа для более крупных образцов тканей.
- В программном обеспечении для конфокальной визуализации нажмите кнопку Live , чтобы запустить режим сканирования в реальном времени. Чтобы максимально увеличить динамический диапазон изображений и избежать насыщенности пикселей, отрегулируйте усиление и интенсивность лазера для выбранного канала.
- Определите поле зрения, чтобы визуализировать всю область нижней челюсти в измерениях X и Y. Установите верхние и нижние параметры сбора Z-стадии, которые точно покрывают объем ниши стволовых клеток в резце мышей. Используйте размер шага Z 2 мкм или в соответствии с вашими требованиями. Новые версии конфокальных микроскопов должны иметь возможность автоматически получать z-стеки различных перекрывающихся областей.
- Получение и сохранение файлов изображений Z-stack в формате .lif.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи .lif могут быть преобразованы в файлы .tiff и использованы для другого программного обеспечения для 3D-анализа.
6. Обработка изображений, реконструкция 3D-изображений и количественная оценка ячеек, удерживающих метки, путем создания поверхности, сегментации интересующей области (ROI), маскировки ROI и создания пятен
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали Imaris (Bitplane 9.0.1) для обработки изображений и 3D-реконструкции, но аналогичные этапы обработки изображений могут быть выполнены с использованием других программных пакетов (например, ImageJ/Fiji, 3D slicer, Avizo, Arivis, Amira и т.д.).
- В программном обеспечении для обработки изображений нажмите кнопку « Арена », затем выберите «Изображение». Выберите исходный файл . lif и выберите объединенный файл , изображения будут импортированы в программное обеспечение для обработки изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте конвертер файлов программного обеспечения для обработки изображений для преобразования файла изображения стека Z в собственный тип файла формата для программного обеспечения. Например: преобразуйте файлы .lif в файлы .ims с помощью конвертера файлов Imaris и откройте файлы .ims в программном обеспечении для обработки изображений. Преобразование данных в собственный формат файла программного обеспечения позволит быстро преобразовать файлы и свести к минимуму ошибки. - Дважды щелкните импортированный файл, чтобы открыть набор данных изображения.
- Посетите панель «Настройка дисплея », щелкните название канала. Обычно он помечается как красный в режиме по умолчанию.
- В окне « Свойства изображения » перейдите на вкладку «Сопоставленный цвет ». В опции « Файл таблицы цветов » выберите «Огненный поток» и нажмите « ОК». Цвет дисплея обычно выбирается таким образом, чтобы отличить фоновую флуоресценцию и положительную флуоресценцию образца.
- В верхнем левом углу экрана на панели « Сцена — свойства » нажмите на синий значок с надписью « Добавить новую поверхность». Снимите флажок « Громкость », чтобы удалить большую часть фоновой флуоресценции, и положительная флуоресценция отчетливо видна (см. Этап 6.4.2).
- Запустите процесс ручной сегментации интересующего региона (ROI), щелкнув вкладку « Создать » и выбрав вкладку « Пропустить автоматическое создание», «Редактировать вручную ». В мастере ручного создания поверхности щелкните вкладку «Контур », чтобы выбрать ориентацию (XY, YZ или XZ) на основе образцов, чтобы легко очертить рентабельность инвестиций. Здесь мы выбираем ориентацию XY.
- Затем убедитесь, что меню указателя в правом углу находится в режиме выбора . Отрегулируйте положение среза , чтобы определить рентабельность инвестиций в ткани. Вы заметите, что большая часть фоновой флуоресценции была удалена с отчетливой положительной флуоресценцией, как упоминалось на шаге 6.4. Нажмите кнопку «Нарисовать » и нарисуйте ориентировочную область интереса. Выберите параметр « Видимость » для «Нет », чтобы избежать помех из других областей, кроме ROI.
- Повторите шаг 6.4.2. Срез за срезом, чтобы нарисовать всю интересующую область.
- После завершения чертежа ROI нажмите « Создать поверхность », чтобы получить 3D-геометрию ROI.
- Нажмите кнопку « Изменить » в мастере ручного создания поверхностей и выберите «Маскировать все».
- Во всплывающем окне « Канал маски » выберите «Канал 1 » в параметрах выбора канала. После этого выберите «Дублировать канал перед применением маски». В настройках маски выберите «Константа внутри/снаружи » и установите воксельную внешнюю поверхность на 0.
- В области « Сцена-Свойства » снимите выбор с объекта Surface и выберите объект «Объем». В разделе «Настройка дисплея» отмените выбор исходного «красного» канала и выберите замаскированный красный канал и отрегулируйте интенсивность цвета, чтобы получить желаемую рентабельность инвестиций в флуоресценцию с 3D-рендерингом и положительной меткой.
- Создайте новый точечный объект. Начните с нажатия на значок «Добавить пятна», чтобы количественно оценить LRC с 3D-рендерингом, создав 3D-пятна, которые сравнительно перекрываются с LRC с 3D-рендерингом. Используйте нижние стрелки для перемещения между шагами в мастере создания точек.
- В мастере создания пятен будет четыре последовательных шага инструкций для автоматического создания пятен с помощью программного обеспечения. Убедитесь, что на первом шаге выбран параметр «Сегментировать только область интереса». Нажмите на значок «Далее ».
- На втором этапе будет «XYZ 3D box». Отрегулируйте поле XYZ, чтобы покрыть рентабельность инвестиций. Нажмите на значок «Далее ».
- На третьем шаге перейдите к параметрам исходного канала . Выберите замаскированный красный канал; введите расчетный диаметр пятна XY, сравнимый с подгонкой и перекрытием точек флуоресценции образца. Нажмите на значок «Далее ».
- На четвертом шаге добавьте тип фильтра «Качество» и отрегулируйте нижний порог интенсивности, перемещая скользящее окно по гистограмме «Качество» до тех пор, пока не будет помечено большинство идентифицируемых LRC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сегментация и, следовательно, статистические показания (например, количество ячеек) очень сильно зависят от пороговых значений интенсивности. Будьте внимательны, чтобы точно установить соответствующие пороговые значения. - Нажмите кнопку « Готово» и выберите кнопку «Статистика ». Перейдите на вкладку «Общие », чтобы найти значение общего количества пятен на изображении.
- Экспортируйте статистику, нажав на кнопку Tab Display to File , и получите результаты в .xls файле.
- Используйте подходящую диаграмму для представления результатов количественной оценки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После маркировки EdU и процесса очистки тканей PEGASOS (рис. 2) была получена прозрачная нижняя челюсть, как показано на нашем изображении (рис. 3B). Мы сравнили модифицированный образец с нормальной нижней челюстью без процесса очистки тканей (рис. 3А). Прозрачная нижняя челюсть (рис. 3B) с маркировкой EdU была подвергнута конфокальной визуализации. Мы сосредоточились на верхушке резца, показывающей нишу стволовых клеток, как показано на (дополнительный рисунок 1). Оптический срез показал LRC в нише стволовых клеток верхушки резца в плоскости XY (рис. 4A). Мы реконструировали 3D-изображение верхушки резца, показывающее сохраняющие метку EdU + в спокойной стволовой клетке как в эпителиальной (зеленой), так и в мезенхимальной (красной) нише стволовых клеток (рис. 4B). Клетки EdU+ были перенесены в пятна для количественного определения, которые сравнительно перекрывались с мезенхимальными LRC (рис. 4C). На рисунке 4D показаны пятна, созданные только для мезенхимальных ЛРК. На рисунке 4E показаны пятна, созданные только для эпителиальных ЛРК. Затем мы завершили количественную оценку эпителиальных и мезенхимальных ЛРК (рис. 4F).
Рисунок 1: Протокол инъекции EdU для маркировки LRC. Мышам дикого типа (WT) вводили EdU, начиная с P5. Инъекции продолжались в течение 7 дней подряд до P11. Затем мыши подверглись периоду погони в течение 6 недель. Мы собрали их на 53-й день после рождения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Рабочий процесс протокола. Мышам вводили EdU в течение 7 дней подряд, а затем помещали в период преследования на 6 недель. Мандибулы были собраны и зафиксированы после транссердечной перфузии. Затем мандибулы декальцинировали и подвергали этапам очистки тканей: декальцификации, обесцвечивания, окрашивания EdU в целом, делипидизации, обезвоживания и сопоставления показателя преломления (RI). Визуализация очищенных челюстей проводилась под конфокальным микроскопом с последующим анализом данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Изображения нижней челюсти мыши WT в возрасте 53 дней до очистки тканей (A) и после очистки тканей (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Оптический срез резца, показывающий LRC в нише стволовых клеток верхушки резца в плоскости XY (A). Реконструкция 3D-изображения эпителиальных и мезенхимальных ЛРК в нижнечелюстных резцах мыши по направлению к вершине (B). Перекрывающиеся мезенхимальные ЗРК (красный) с созданными 3D-пятнами (серый) (C). Пятна, созданные только для мезенхимальных ЛРК (D). Пятна, созданные только для эпителиальных LRC (E). Результаты количественной оценки эпителиальных и мезенхимальных ЛРК (F). Бар: 300 мкм в A и 150 мкм в B-E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Приготовление коктейля для маркировки EdU |
| Приготовление исходных растворов (водных) |
| TBS (10x) 1 М, pH 7,6 |
| CuSO 4 (100x),0,4 м |
| Сульфаниламидоциан 3 азид (100x), 300 мкМ в ДМСО |
| Аскорбат натрия (10x), 0,2 г / мл в H2O |
| PBST (0,1% Triton X-100 в PBS, об./об.) |
| Приготовление коктейля для маркировки EdU |
| Добавьте следующие реагенты по порядку: |
| Трис-буферный физиологический раствор (100 мМ конечный, рН 7,6) |
| CuSO 4 (финал4 мМ) |
| Азид сульфаниламид-цианина 3 (конечный 3 мкМ) |
| Аскорбат натрия (окончательный 100 мМ, свежеприготовленный для каждого использования) |
Таблица 1: Приготовление коктейля для маркировки EdU
Дополнительный рисунок: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Многократные дозы инъекций (BrdU, EdU) обычно используются на растущих новорожденных мышах, чтобы максимально маркировать пролиферирующие клетки 1,6,13. Период погони считается критическим шагом в отношении скорости обновления тканей 6,13. Резец мыши обновляется примерно каждый месяц. Этот признак позволяет исследователям установить период погони на 4 недели или дольше 4,5,22. Наш 6-недельный период преследования может маркировать стволовые клетки в мезенхимальных и эпителиальных (губная и язычная шейная петля) отсеках. Эта область включала некоторые популяции-предшественники в TAC (транзитно-амплифицирующих клетках) как из эпителиальных, так и из мезенхимальных компартментов. Более длительный период преследования был бы желателен для показа истинных клеток, сохраняющих метки, которые находятся исключительно в нишах эпителиальных и мезенхимальных стволовых клеток.
Существует несколько важных этапов обработки и очистки тканей для этого протокола. Первое замечание относится к этапу перфузии и фиксации тканей. Резцы мышей содержат ткани пульпы, которые имеют богатый запас кровеносных сосудов и содержат большое количество тканей крови. Таким образом, перфузию гепарина PBS следует начинать как можно скорее после того, как мыши будут глубоко анестезированы и сдержаны. Причина в том, чтобы избежать образования тромбов, которые приводят к автофлуоресценции19. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать чрезмерной фиксации PFA, которая может привести к недостаточной прозрачности и желтоватому обесцвечиванию ткани после очистки. Чрезмерное обесцвечивание снижает качество сигнала в образцах во время визуализации19. Активная транссердечная перфузия предпочтительнее пассивной иммерсионной фиксации органов/тканей, которая быстро фиксирует ткани, чтобы избежать потери эндогенной флуоресценции на этапах очистки тканей. При пассивной фиксации участки, расположенные глубже в ткани, могут оставаться менее прозрачными; Образцы могут не иметь удовлетворительных результатов визуализации19. Правильное удаление мышц из нижней челюсти позволяет правильно визуализировать структуры, которые интересуют исследователей. Кроме того, эффективное удаление предотвращает воздействие нарушений аутофлуоресценции на мышечные ткани. Правильная декальцинация необходима при очистке твердых тканей. Следует позаботиться о том, чтобы адекватно декальцинировать ткани, регулируя время погружения ЭДТА в соответствии с размером и содержанием минералов в образцах. Концентрация ЭДТА имеет решающее значение, чтобы избежать чрезмерной усадки тканей. Следовательно, концентрацию следует выбирать в соответствии с образцами и экспериментами в вопросе16,19. Точно так же этап обесцвечивания имеет решающее значение для адекватного удаления оставшегося гема для уменьшения автофлуоресценции. Недостаточное время делипидизации может привести к менее прозрачной ткани и не рекомендуется. Как правило, делипидирование твердых тканей, таких как мандибулы мышей, можно проводить от 4 до 6 ч в 30% и 50% тБ растворе и в течение 1 дня в 70% тБ растворе20. Время инкубации зависит от размера образца и содержания в нем липидов. Время может быть увеличено, чтобы обеспечить полную делипидацию19,20. Отдельные лаборатории могут регулировать сроки в соответствии со своими требованиями, не уменьшая минимального времени, необходимого для делипидизации.
Наиболее распространенная проблема в методах очистки тканей связана с недостаточной прозрачностью ткани, вызванной неправильной обработкой тканей и этапами очистки. Эта ситуация приводит к трудностям в получении четких изображений, препятствуя правильной визуализации флуоресцентно меченных клеточных или субклеточных структур. Устранение неполадок с недостаточно прозрачными тканями должно быть выполнено правильно, убедившись, что каждый критический шаг выполнен правильно. Эта практика должна начинаться с этапов перфузии и фиксации тканей до этапов очистки тканей. Свойства каждой ткани или органа различны. Следовательно, этапы обработки и очистки тканей должны быть оптимизированы для получения удовлетворительных результатов очистки19.
Визуализация очищенных образцов тканей может быть завершена с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM) или флуоресцентного микроскопа со световым листом (LSFM) в зависимости от требований, экспериментального вопроса и наличия оборудования17. Мы использовали CLSM для визуализации нижней челюсти, что дает изображение с более высоким разрешением при большем увеличении, но занимает больше времени по сравнению с LSFM17,20. Когда высокое разрешение и большее увеличение не являются обязательными, может быть желателен быстрый флуоресцентный микроскоп со световым листом (LSFM)19. LSFM стоит дорого и может быть нелегко доступен для обычных лабораторий. Для конфокальной микроскопии выбор правильных линз объектива с правильной числовой апертурой имеет решающее значение для хорошего изображения19,20. Для больших образцов тканей могут быть уместны объективы с меньшим увеличением, такие как 10x с малой числовой апертурой и большим рабочим расстоянием19,21. Для небольших образцов тканей могут быть желательны объективы с более высоким увеличением, такие как 20-кратное с высокой числовой апертурой и меньшим рабочим расстоянием. Кроме того, использование иммерсионного масла с показателем преломления, соответствующим очищающей среде, и линзы объектива имеет решающее значение для предотвращения искажения изображения и получения четкости17,19. Для визуализации доступно несколько пакетов программного обеспечения для обработки и анализа изображений. В то время как некоторые из пакетов программного обеспечения бесплатны, другие дороги и могут быть недоступны для отдельных лабораторий. Эти платформы обработки изображений генерируют массивные файлы (в гигабайтах), для которых требуются высокопроизводительные компьютерные рабочие станции для визуализации и количественной оценки данных 17,20,21.
Несмотря на то, что они быстрее и проще в выполнении, чем другие методы мечения ДНК, такие как BrdU, существуют ограничения на обнаружение LRC с помощью маркировки EdU in vivo по сравнению с маркировкой LRC трансгенными мышами H2B-GFP. Во-первых, трудно отличить ЛРК эпителиального происхождения от мезенхимального. Маркировка H2B-GFP может быть использована в тканеспецифическом, управляемом промотором, активаторе тетрациклина, который может специфически маркировать спокойные стволовые клетки в различных тканях. В случае резцов мышей метод H2B-GFP может специфически маркировать стволовые клетки эпителия или мезенхимы 4,22. Тем не менее, методы очистки тканей и построения 3D-изображений, описанные в этом протоколе, также применимы к меченным флуоресценцией H2B-GFP LRC, обеспечивая гибкость и разнообразие вариантов. Наша работа позволяет маркировать и характеризовать ЦУРы в соответствии с научными потребностями. Метод H2B-GFP требует производства трансгенных мышей и скрещивания с другими штаммами, что отнимает много времени и дороже, чем маркировка EdU. Другим ограничением маркировки EdU методом очистки тканей является то, что образцы не могут быть использованы в дальнейшем для последующего функционального анализа.
Этот протокол выгоден для исследователей, которые не требуют тканеспецифической маркировки и хотят получить более быстрые результаты от маркировки спокойных стволовых клеток. Этот метод может быть модифицирован для использования для отслеживания клеточного происхождения; при сочетании с флуоресцентной маркировкой стволовых/прогениторных клеток, основанной на Cre, наш метод позволяет получить более подробную информацию о местонахождении потомства и более точное количественное определение/вклад23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Мы благодарим Меган К. Холт за редактирование рукописи. Это исследование было поддержано грантами NIH / NIDCR DE026461 и DE028345 и финансированием стартапа от Техасской школы стоматологии A&M доктору Сяофан Вану.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. eLife. 6, 24712 (2017).
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15 (7), 846-852 (2013).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Terskikh, V. V., Vasiliev, A. V., Vorotelyak, E. A. Label retaining cells and cutaneous stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 414-425 (2012).
- de Miguel-Gomez, L., et al. Stem cells and the endometrium: From the discovery of adult stem cells to pre-clinical models. Cells. 10 (3), 595 (2021).
- Ishikawa, Y., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. Quiescent adult stem cells in murine teeth are regulated by Shh signaling. Cell and Tissue Research. 369 (3), 497-512 (2017).
- Chehrehasa, F., Meedeniya, A. C., Dwyer, P., Abrahamsen, G., Mackay-Sim, A. EdU, a new thymidine analogue for labelling proliferating cells in the nervous system. Journal of Neuroscience Methods. 177 (1), 122-130 (2009).
- Solius, G. M., Maltsev, D. I., Belousov, V. V., Podgorny, O. V. Recent advances in nucleotide analogue-based techniques for tracking dividing stem cells: An overview. The Journal of Biological Chemistry. 297 (5), 101345 (2021).
- Ning, H., Albersen, M., Lin, G., Lue, T. F., Lin, C. S. Effects of EdU labeling on mesenchymal stem cells. Cytotherapy. 15 (1), 57-63 (2013).
- Lin, G., et al. Labeling and tracking of mesenchymal stromal cells with EdU. Cytotherapy. 11 (7), 864-873 (2009).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Challen, G. A., Goodell, M. A. Promiscuous expression of H2B-GFP transgene in hematopoietic stem cells. PLoS One. 3 (6), 2357 (2008).
- Kopecky, B. J., Duncan, J. S., Elliott, K. L., Fritzsch, B. Three-dimensional reconstructions from optical sections of thick mouse inner ears using confocal microscopy. Journal of Microscopy. 248 (3), 292-298 (2012).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Fink, J., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K. Adult stem cell lineage tracing and deep tissue imaging. BMB Reports. 48 (12), 655-667 (2015).
