Summary
O incisivo de camundongo contém valiosas células retentoras de marcação em seu nicho de células-tronco. Temos uma nova maneira de detectar e quantificar imparcialmente as células de retenção de marcação; nosso estudo utilizou marcação com EdU e uma abordagem de reconstrução 3D após a limpeza tecidual da mandíbula pelo PEGASOS.
Abstract
O incisivo murino é um órgão que cresce continuamente ao longo da vida útil do rato. As células-tronco epiteliais e mesenquimais que residem nos tecidos proximais dos incisivos dão origem à progênie que se diferenciará em ameloblastos, odontoblastos e fibroblastos pulpar. Essas células são cruciais para suportar o turnover sustentado dos tecidos incisivos, tornando o incisivo murino um excelente modelo para estudar a homeostase de células-tronco adultas. Acredita-se que as células-tronco contenham células quiescentes de vida longa que podem ser marcadas por análogos de nucleotídeos, como 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU). As células retêm esse rótulo ao longo do tempo e, consequentemente, são chamadas de células de retenção de rótulo (LRCs). Abordagens para visualização de LRCs in vivo fornecem uma ferramenta robusta para monitorar a homeostase de células-tronco. Neste estudo, descrevemos um método para visualização e análise de LRCs. Nossa abordagem inovadora apresenta LRCs em incisivos de camundongos após limpeza do tecido e coloração de EdU de montagem total, seguida de microscopia confocal e reconstrução 3D (3D) com o software de imagem. Este método permite a aquisição de imagens 3D e quantificação não enviesada em comparação com a análise tradicional de LRCs em lâminas seccionadas.
Introduction
O incisivo de camundongo em crescimento contínuo é um excelente modelo para o estudo de células-tronco adultas1. As células-tronco epiteliais (alça cervical labial e lingual) e mesenquimais (entre a alça cervical labial e lingual) que residem na face proximal do incisivo diferenciam-se em ameloblastos, odontoblastos e células da polpa dentária. Este processo único fornece uma fonte de células para compensação da perda e turnover tecidual2. Embora vários marcadores de células-tronco como Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1, etc. foram identificadas in vivo para os subgrupos de células-tronco adultas em incisivos de camundongos, que são inadequadas para representar as populações de células-tronco quando usadas isoladamente 1,3,4,5. A visualização de células quiescentes de vida longa por marcação e retenção de DNA análogo a nucleotídeos poderia fornecer detecção imparcial para a maioria dos subconjuntos de células-tronco adultas6. Além disso, essa abordagem é útil entre muitos métodos de identificação de células-tronco7 para entender o comportamento celular e a homeostase de populações de células-tronco dentárias 3,8. Enquanto as células-tronco em divisão perderiam sua marcação de DNA após uma perseguição considerável, as supostas células-tronco quiescentes retêm seu rótulo de DNA, considerando-as células retentoras de marcação (LRCs)6. A marcação e retenção do DNA por células-tronco não em divisão marcará e localizará as células-tronco adultas putativas em seus nichos.
Nos últimos anos, a marcação com 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) análogo da timidina substituiu o método pesado, demorado e incompatível de marcação de DNA 3H-timidina por microscopia de alta resolução para ensaios de proliferação celular 6,9. Nos últimos anos, a técnica de marcação com 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) tem sido cada vez mais utilizada em relação à BrdU. Esse padrão surgiu por vários motivos. Primeiro, o método BrdU é lento e trabalhoso. As condições do usuário são variáveis, e é incapaz de preservar a ultraestrutura nos espécimes (devido à desnaturação do DNA). Da mesma forma, o método BrdU perde a antigenicidade das células, tornando-o ineficiente para análises funcionais a jusante e ensaios como os experimentos de co-localização e transplante in vivo de células-tronco 3,7,9,10,11,12. O BrdU também é um teratógeno, que não é adequado para marcação de LRCs no desenvolvimento embrionário6. Além disso, o método BrdU é ineficiente quando usado em amostras de montagem inteira. As desvantagens são a baixa penetração de anticorpos na parte profunda dos espécimes ou a necessidade de um longo período de incubação de anticorpos para penetração profunda13. A marcação EdU escapa das etapas de desnaturação dos espécimes, preservando assim a ultraestrutura. Essa característica é vantajosa para análises funcionais a jusante, como experimentos de co-localização e transplante de células-tronco11,12. Além disso, a marcação EdU é altamente sensível e rápida; A penetração do espécime é alta devido ao uso de azidas fluorescentes de menor tamanho e rápida absorção para detecção de etiquetas de EdU através de uma reação de cicloadição [3 + 2] catalisada por(I) ("química de clique")14.
Outro método de marcação de DNA cada vez mais aplicado é o uso de camundongos transgênicos modificados. Esses camundongos expressam a proteína fluorescente verde da histona 2B (H2B-GFP) controlada por um elemento regulador responsivo à tetraciclina 5,14. Depois de alimentar camundongos com ração/água de tetraciclina por um período de perseguição de 4 semanas a 4 meses, a fluorescência da GFP diminuirá nas células cicladoras e apenas as LRCs reterão a fluorescência6. A vantagem desse método é que as LRCs marcadas podem ser isoladas e permanecem viáveis para cultura celular ou análises funcionais a jusante 6,7. Alguns estudos relataram marcação imprecisa de células-tronco quiescentes quando perseguidas para uso a longo prazo. Esse resultado foi devido a uma expressão de fundo vazada da cepa H2B-GFP e não à resposta apropriada regulada por tetraciclina15.
Além disso, a maioria da literatura no passado usava a detecção de LRCs principalmente em lâminas seccionadas, que são bidimensionais e muitas vezes erroneamente enviesadas para mostrar a localização precisa e o número de LRCs. A abordagem mostrou ângulos incorretos para cortes de estruturas teciduais complexas16. O outro método foi obter imagens 3D a partir de cortes seriados e realizar reconstruções pós-imagem. Esses passos foram imprecisos devido à distorção da imagem a partir de variações em cada corte seriado devido a cortes comprimidos ou esticados, resultando em informações ausentes16,17,18. O método também era trabalhoso e demorado.
Para facilitar a obtenção de imagens de montagem completa de LRCs, as amostras precisam ser esclarecidas enquanto a fluorescência é bem mantida. As técnicas atuais de limpeza de tecidos podem ser classificadas em três grandes categorias: técnicas de limpeza de tecidos à base de solventes orgânicos, técnicas de limpeza de tecidos à base de reagentes aquosos e técnicas de limpeza de tecidos à base de hidrogel17,19. O sistema solvente associado ao polietilenoglicol (PEG) (PEGASOS) foi recentemente desenvolvido. Essa abordagem torna quase todos os tipos de tecidos transparentes e preserva a fluorescência endógena, incluindo tecidos duros, como osso e dentes20. O método PEGASOS apresenta vantagens sobre outros métodos de limpeza tecidual, especialmente na limpeza de materiais dentários e ósseos. A maioria dos outros métodos poderia limpar apenas parcialmente tecidos duros, ter longos tempos de processamento ou exigir reagentes dispendiosos21. Além disso, o método PEGASOS pode preservar eficientemente a fluorescência endógena em relação a outros métodos.
Essa literatura nos levou a criar um novo método para o estudo celular. Combinamos as vantagens de detecção de LRCs da marcação de EdU com a imagem 3D de montagem completa mais superior de espécimes desembaraçados de tecido; amostras foram processadas com técnica avançada de limpeza tecidual do sistema solvente associado ao polietilenoglicol (PEG) (PEGASOS)15. A transparência do tecido duro nos permitiu reconstruir o sinal 3D da fluorescência das LRCs in vivo sem quebrar os dentes ou a mandíbula, criando uma maneira mais precisa de visualizar e quantificar as LRCs.
Neste estudo, fornecemos um guia inovador para visualização de LRCs no incisivo de camundongos. Fizemos uma abordagem visual 3D para determinar a localização e a quantidade de LRCs dentro do nicho de células-tronco incisivas de camundongos. Este projeto utilizou marcação com EdU, técnicas de limpeza tecidual PEGASOS e microscopia confocal. Nosso método de marcação de EdU as LRCs em tecido montado inteiro e o uso de um espécime limpo e transparente superam as limitações das lâminas seccionadas tradicionais e outros métodos desvantajosos de marcação de DNA. Assim, nossa técnica será adequada para estudos sobre homeostase de células-tronco que necessitem de detecção de LRCs, especialmente em tecidos duros. O protocolo pode ser igualmente vantajoso para aqueles que enfocam a homeostase de células-tronco em outros tecidos e órgãos.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) para a Texas A&M University College of Dentistry.
1. Preparação do coquetel de rotulagem EdU
- Preparar as soluções de coquetel conforme descrito na Tabela 1.
- Preparar o coquetel de rotulagem da EdU conforme descrito na Tabela 1.
2. Preparação dos ratos e da solução de EdU
- Prepare a solução EdU. Dissolver EdU em DMSO a 20 mg/mL e armazenar em freezer a -20 °C.
CUIDADO: EdU é um agente mutagênico. Os utilizadores devem utilizar equipamento de protecção individual (EPI) adequado ao manusear esta substância. - Injetar camundongos C57BL/6J de 5 dias de idade com a solução de EdU preparada por via intraperitoneal a 3 μL/g de peso corporal. Os ratos devem receber a solução uma vez por dia durante 7 dias consecutivos. Em seguida, passam por um período de perseguição de 6 semanas antes de serem colhidos para análise (Figura 1).
CUIDADO: Tenha cuidado para evitar picadas de agulha ao injetar EdU nos ratos. Depois de injetar EdU por 7 dias consecutivos, coloque os camundongos em uma nova gaiola. Depois que os ratos estiverem em sua nova casa, elimine a cama na gaiola velha usando regras apropriadas de risco biológico.
3. Preparo da amostra por perfusão transcardíaca (camundongos pós-natais de 53 dias após o período de perseguição de 6 semanas)
NOTA: O fígado de camundongo deve ficar pálido após a perfusão transcardíaca bem-sucedida.
- Anestesiar camundongos com uma injeção intraperitoneal. Eles precisam receber uma combinação de anestésicos de xilazina e cetamina (Xilazina 10-12,5 mg/kg; Cetamina, 80-100 mg/kg de peso corporal).
- Aguarde ~10 min até que o mouse não responda mais a estímulos dolorosos (como reflexos de pinça da pata).
- Coloque os camundongos em decúbito dorsal estabilizado em suporte de isopor com agulhas em cada pata.
- Expor a cavidade torácica abrindo a pele sobrejacente usando pinças e tesouras dissecantes.
- Abra o diafragma usando uma tesoura afiada. Tome cuidado para não perfurar o coração.
- Corte a caixa torácica, agarrando a base do esterno com uma tesoura de fixação para expor o coração.
- Transfira o rato para o estágio de perfusão perto da bomba de circulação num exaustor.
- Insira a agulha de 25 G (do tubo preenchido com solução salina tamponada com fosfato (PBS)/solução de paraformaldeído a 4% (PFA)) no ápice do ventrículo esquerdo. Tome cuidado para manter a ponta da agulha no lúmen do ventrículo.
CUIDADO: O PFA é moderadamente tóxico e um provável carcinógeno. Use EPI para manusear PFA e preparar a solução sob um exaustor de fumaça química. O PFA de resíduos requer destinação adequada de acordo com as diretrizes da instituição. - Cortar o ventrículo direito usando uma tesoura afiada imediatamente após inserir a agulha no ventrículo esquerdo. Esta etapa permite que o sangue flua para fora do rato e drene para a placa coletora.
- Perfundir as amostras com 50 mL de solução de PBS a uma vazão de 7 mL/min.
- Após a perfusão com PBS, trocar a torneira para permitir um fluxo de 20 mL de solução de PFA a 4% na mesma taxa de fluxo de 5 mL/min.
- Enquanto a bomba de circulação ainda estiver ligada, remova a agulha do ventrículo esquerdo.
NOTA: O rato está agora fixo para a recolha de tecidos. Para preservar a fluorescência, a exposição à luz deve ser evitada sempre que possível durante todo o protocolo. Enquanto o tecido está sendo processado, o tubo cônico de 50 mL com as amostras de tecido pode ser coberto com papel alumínio.
4. Limpeza tecidual da mandíbula pela técnica PEGASOS
NOTA: Um tubo cônico de 15 mL ou 50 mL de acordo com o volume de tecidos pode ser usado para manter as amostras prontas para o tratamento em cada etapa. As amostras são processadas a agitadores de 37 °C (~100 rpm) das etapas 4.2 a 4.7. Use recipientes plásticos à base de polipropileno resistentes a solventes orgânicos para evitar o derretimento do plástico. Alternativamente, podem ser usados utensílios de vidro.
CUIDADO: A técnica de limpeza de tecidos PEGASOS utiliza soluções tóxicas como Quadrol, polietilenoglicol (PEG), benzoato de benzila (BB), MMA500, etc. São necessários EPI adequados para evitar potenciais exposições.
- Dissecar mandíbulas e fixar amostras em PFA 4%. Mantenha-os à temperatura ambiente durante a noite.
- Retire os músculos das mandíbulas e mergulhe-os em solução de EDTA 0,5 M (pH 8,0) para descalcificar por 4 dias. Durante este período, efectuar uma mudança média diária num agitador a 37 °C.
NOTA: É desejável remover os músculos da amostra tanto quanto possível. Essa precaução simplificará o processo de imagem e reduzirá a autofluorescência dos músculos. - Descolorir as mandíbulas com uma solução de Quadrol a 25% (v/v em H2O) em agitador a 37 °C durante um dia para remover o heme sanguíneo restante.
- Coloração completa de montagem EdU.
- Prepare um coquetel de rotulagem EdU fresco de acordo com a Tabela 1.
NOTA: O cocktail de rotulagem EdU tem de ser feito fresco cada vez com solução de ascorbato recém-preparada adicionada para obter os melhores resultados de rotulagem EdU. - Enxaguar as mandíbulas com PBST por 30 min em um agitador de 37 °C.
- Enxaguar as mandíbulas com PBS três vezes por 3 min cada vez.
- Incube as mandíbulas em um coquetel de rotulagem EdU feito na hora em uma coqueteleira de 37 °C durante a noite.
- Enxaguar as mandíbulas com PBS três vezes por 3 min cada vez.
- Prepare um coquetel de rotulagem EdU fresco de acordo com a Tabela 1.
- Efectuar a deslipidação em série em cada uma das seguintes soluções durante 6 h a 37 °C:
Solução de terc-butanol (tB) a 30%: 75% v/v H2O, 22% v/v tB e 3% v/v Quadrol.
Solução de 50% tB: 50% v/v H2O, 47% v/v tB e 3% v/v Quadrol.
Solução de 70% tB: 30% v/v H2O, 67% v/v tB e 3% v/v Quadrol
NOTA: A etapa de deslipidação é crítica. A deslipidação pode ser feita entre 4-6 h em solução tB a 30% e 50% e durante 1 dia em solução tB a 70%. - Desidratar as mandíbulas em solução de tB-PEG por 2 dias com a seguinte troca diária do meio: 75% tB, polietilenoglicol metil-éter metacrilato 22% v/v médio MMA500 e 3% v/v Quadrol a 37 °C.
- Limpar a mandíbula em meio de compensação benzoato de benzila (BB)-PEG para obter índices de refração correspondentes: 75% v/v BB, 22% v/v PEG-MMA500 e 3% Quadrol até que a transparência seja alcançada.
NOTA: Temos informações sobre a correspondência de índice de refração. Os componentes inorgânicos e orgânicos nos tecidos como água, lipídios, proteínas, minerais, organelas, etc. têm índice de refração (IR) diferente na faixa de 1,33 a 1,55. Essa incompatibilidade entre os componentes teciduais dificulta o processo de imageamento. A transparência pode ser alcançada eliminando a incompatibilidade do IR dentro do tecido. Recomenda-se a imersão das amostras limpas no meio de limpeza do BB-PEG. Esta etapa dará o IR interno uniforme de ~1,54 (chamado RI matching) para todo o espécime, facilitando o processo de imagem. - Preservar as mandíbulas no meio de limpeza de tecido BB-PEG à temperatura ambiente para armazenamento e obtenção de imagens.
NOTA: É bom concluir a imagem o mais rápido possível para evitar a perda gradual de repórteres fluorescentes. No entanto, o método PEGASOS manterá os repórteres de fluorescência bem preservados mesmo após várias semanas de armazenamento20,21. Para armazenamento a longo prazo, as amostras também podem ser armazenadas a 4°C.
5. Imagem confocal da mandíbula desobstruída por tecido
- Monte o tecido limpo de toda a mandíbula em lâminas de cavidade da marca no meio de limpeza BB-PEG e cubra com lâminas de cobertura de vidro. Evite bolhas.
- Realizar a aquisição das imagens com microscópio confocal de varredura a laser adequado. Selecione Adquirir e defina os parâmetros de aquisição de imagem com resolução de 512 x 512 pixels e velocidade de aquisição de 400 Hz. Essas configurações são encontradas no menu do modo de aquisição do software que controla o microscópio.
- No painel para excitação fluorescente, ative o laser necessário (TRITC) para excitar fluoróforos de forma otimizada (a sonda que usamos para visualização de LRCs tem propriedades fluorescentes como Cy3 com excitação a 548 nm e emissão a 563 nm de comprimento de onda do laser).
- No painel para detecção de fluorescência, mova o controle deslizante para selecionar os comprimentos de onda que serão medidos (por exemplo, entre 555 e 625 nm para um fluoróforo semelhante ao Cy3).
- Coloque a mandíbula montada no palco do microscópio para visualizar e encontrar a amostra usando luz branca e uma objetiva de aumento menor (2-10x).
- Adicione uma gota de óleo de imersão com um índice de refração de 1,52 sobre a lamínula para corresponder ao índice de refração da tampa de vidro e objetiva.
NOTA: Combine o índice de refração das objetivas, meios de imagem e tecido o mais próximo possível para minimizar a introdução de distorções ópticas durante a aquisição da imagem. - Ligue as lâmpadas fluorescentes e escolha uma objetiva de ampliação apropriada para as regiões de interesse da imagem. Utilizou-se uma objetiva de 20x com abertura numérica de 0,9 mm e distância de trabalho de 1,95mm. Uma lente de maior distância de trabalho pode ser necessária ao obter imagens de amostras de tecido maiores no microscópio confocal. Alternativamente, a imagem pode ser feita facilmente usando um microscópio de folha de luz para amostras de tecido maiores.
- No software de imagem confocal, pressione o botão Ao vivo para iniciar o modo de varredura ao vivo . Para maximizar o alcance dinâmico das imagens e evitar a saturação de pixels, ajuste o ganho e a intensidade do laser para o canal selecionado.
- Identificar o campo de visão para visualizar toda a região da mandíbula nas dimensões X e Y. Defina os parâmetros de aquisição do estágio Z superior e inferior que cobrem com precisão o volume do nicho de células-tronco no incisivo de camundongos. Use um tamanho de passo Z de 2 μm ou de acordo com suas necessidades. As versões mais recentes de microscópios confocais devem ser capazes de adquirir automaticamente pilhas z das várias regiões sobrepostas.
- Adquira e salve arquivos de imagem Z-stack no formato .lif.
NOTA: As moscas .lif podem ser convertidas em arquivos .tiff e usadas para outros softwares de análise 3D.
6. Processamento de imagens, reconstrução de imagens 3D e quantificação de células de retenção de etiquetas através da criação de uma superfície, segmentação da Região de Interesse (ROI), mascaramento da ROI e criação de spots
NOTA: Usamos o Imaris (Bitplane 9.0.1) para processamento de imagens e reconstrução 3D, mas etapas semelhantes de processamento de imagens podem ser conduzidas usando outros pacotes de software (por exemplo, ImageJ/Fiji, segmentação de dados 3D, Avizo, Arivis, Amira, etc.).
- No software de geração de imagens, clique no botão Arena e escolha Imagem. Selecione o arquivo . lif original e escolha o arquivo mesclado, as imagens serão importadas para o software de imagem.
NOTA: Como alternativa, use um conversor de arquivo de software de imagem de imagem para converter o arquivo de imagem de pilha Z para o tipo de arquivo de formato nativo para o software. Por exemplo: converta os arquivos .lif em .ims usando o Imaris File Converter e abra os arquivos .ims no software de imagem. A conversão de dados para o formato de arquivo nativo do software permitirá a conversão rápida de arquivos e minimizará erros. - Clique duas vezes no arquivo importado para abrir o conjunto de dados da imagem.
- Visite o painel Ajuste de Vídeo , clique no nome do canal. Geralmente é rotulado como vermelho no modo padrão.
- Na janela Propriedades da imagem , clique na guia Cor mapeada . Na opção Arquivo de tabela de cores , escolha Fluxo de fogo e clique em OK. A cor do visor é normalmente escolhida para distinguir a fluorescência de fundo e a fluorescência positiva da amostra.
- No lado superior esquerdo da tela, no painel Cena – Propriedades , clique no ícone azul rotulado Adicionar Nova Superfície. Desmarque o ícone Volume que removerá a maior parte da fluorescência de fundo e a fluorescência positiva estiver claramente visível (consulte a Etapa 6.4.2).
- Inicie o processo de segmentação manual da região de interesse (ROI) clicando na guia Criar e selecionando a guia Ignorar Criação Automática, Editar Manualmente . No assistente de criação manual de superfície, clique na guia Contorno para escolher a orientação (XY, YZ ou XZ) com base nas amostras para contornar facilmente o ROI. Aqui, escolhemos a orientação XY.
- Em seguida, verifique se o menu de ponteiro no canto direito está no modo Selecionar . Ajuste a posição de corte para localizar a ROI no tecido. Você notará que a maioria da fluorescência de fundo foi removida com fluorescência positiva distinta, conforme mencionado na Etapa 6.4. Clique no botão Desenhar e desenhe uma região provisória de interesse. Selecione a opção Visibilidade para nenhum para evitar interferência de outras áreas além do ROI.
- Repita a etapa 6.4.2. fatia por fatia para desenhar toda a região de interesse.
- Depois que o desenho do ROI for concluído, clique em Criar superfície para obter uma geometria 3D do ROI.
- Clique no botão Editar no assistente de criação de superfície manual e selecione Mascarar tudo.
- Na janela pop-out Canal de máscara , selecione Canal 1 nas opções de seleção de canal. Depois, selecione Duplicar canal antes de aplicar a máscara. Nas configurações da máscara, selecione Constante Dentro/Fora e defina a superfície externa do voxel como 0.
- No painel Propriedades da Cena , desmarque o Objeto de Superfície e selecione o Objeto de Volume. No Ajuste de Exibição, desmarque o canal "Vermelho" original e selecione o canal Vermelho mascarado e ajuste as intensidades de cor para obter o ROI de fluorescência renderizado em 3D e rotulado positivamente desejado.
- Crie um novo objeto spot. Comece clicando no ícone Adicionar pontos para quantificar os LRCs renderizados em 3D criando pontos 3D que se sobrepõem comparativamente aos LRCs renderizados em 3D. Use as setas inferiores para se mover entre as etapas no assistente de criação de spot.
- No assistente de criação de spots, haverá quatro etapas sequenciais de instruções para criar spots automaticamente com o software. Verifique se a opção Segmentar somente uma região de interesse está selecionada na primeira etapa. Clique no ícone Avançar .
- Na segunda etapa, haverá uma "caixa 3D XYZ". Ajuste a caixa XYZ para cobrir o ROI. Clique no ícone Avançar .
- Na terceira etapa, vá para as opções do Canal de Origem . Escolha o canal vermelho mascarado; insira o diâmetro estimado do ponto XY comparável ao ajuste e à sobreposição dos pontos de fluorescência da amostra. Clique no ícone Avançar .
- Na quarta etapa, adicione o tipo de filtro "Qualidade" e ajuste o limite de intensidade mais baixo movendo a janela deslizante pelo histograma "Qualidade" até que a maioria dos LRCs identificáveis seja rotulada.
NOTA: A segmentação e, portanto, as leituras estatísticas (exemplo: número de células) dependem muito dos valores de limite de intensidade. Tenha cuidado para definir com precisão os valores de limite apropriados. - Clique no botão Concluir e selecione o botão Estatística . Selecione a guia Geral para localizar o valor do número total de pontos na imagem.
- Exporte estatísticas clicando no botão Tab Display to File e receba os resultados em um arquivo .xls.
- Use um diagrama adequado para apresentar os resultados da quantificação.
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Representative Results
Após a marcação da EdU e o processo de limpeza tecidual PEGASOS (Figura 2), a mandíbula transparente foi obtida como mostrado em nossa imagem (Figura 3B). Comparamos a amostra modificada com uma mandíbula normal sem processo de limpeza tecidual (Figura 3A). A mandíbula transparente (Figura 3B) com marcação de EdU foi submetida a imagens confocais. Focamos no ápice do incisivo mostrando o nicho de células-tronco como mostrado na (Figura 1 Suplementar). O corte óptico do incisivo mostrou LRCs no nicho de células-tronco do ápice do incisivo no plano XY (Figura 4A). Reconstruímos uma imagem 3D de um ápice incisivo mostrando células-tronco quiescentes retentoras de EdU+ no nicho de células-tronco epiteliais (verde) e mesenquimais (vermelho) (Figura 4B). As células EdU+ foram transferidas para pontos de quantificação que se sobrepunham comparativamente às LRCs mesenquimais (Figura 4C). A Figura 4D mostra as manchas criadas apenas para LRCs mesenquimais. A Figura 4E mostra as manchas criadas apenas para LRCs epiteliais. Concluímos então a quantificação das LRCs epiteliais e mesenquimais (Figura 4F).
Figura 1: Protocolo de injeção de EdU para rotular LRCs. Camundongos selvagens (WT) foram injetados com EdU a partir de P5. As injeções duraram 7 dias consecutivos até P11. Em seguida, os camundongos passaram por um período de perseguição de 6 semanas. Colhemos no 53º dia pós-natal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho do protocolo. Os camundongos foram injetados com EdU por 7 dias consecutivos e, em seguida, colocados em um período de perseguição por 6 semanas. As mandíbulas foram retiradas e fixadas após perfusão transcardíaca. Em seguida, as mandíbulas foram descalcificadas e submetidas às etapas de limpeza tecidual de descalcificação, descoloração, coloração de EdU total, deslipidação, desidratação e pareamento pelo índice de refração (IR). As imagens das mandíbulas desobstruídas foram realizadas em microscópio confocal seguido de análise dos dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens da mandíbula de camundongos WT com 53 dias de idade pós-natal antes da limpeza do tecido (A) e após a limpeza do tecido (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Corte óptico do incisivo mostrando LRCs no nicho de células-tronco do ápice do incisivo no plano XY (A). Reconstrução em 3D de LRCs epiteliais e mesenquimais em incisivos inferiores de camundongos em direção ao ápice (B). LRCs mesenquimais sobrepostas (vermelho) com manchas 3D criadas (cinza) (C). Manchas criadas apenas para LRCs mesenquimais (D). Manchas criadas apenas para LRCs epiteliais (E). Resultados de quantificação de LRCs epiteliais e mesenquimais (F). Bar: 300 μm em A e 150 μm em B-E. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Preparação do Coquetel de Rotulagem EdU |
| Preparação de soluções-mãe (aquosas) |
| TBS (10x) 1 M, pH 7,6 |
| CuSO4 (100x), 0,4 m |
| Sulfa-cianina 3 azida (100x), 300 μM em DMSO |
| Ascorbato de sódio (10x), 0,2 g/mL em H2O |
| PBST (0,1% Triton X-100 em PBS, v/v) |
| Preparação do Coquetel de Rotulagem EdU |
| Adicione os seguintes reagentes na ordem: |
| Solução salina tamponada com tris (100 mM final, pH 7,6) |
| CuSO 4 (4 mM final) |
| Sulfa-cianina 3 azida (3 μM final) |
| Ascorbato de sódio (100 mM final, acabado de fazer para cada uso) |
Quadro 1: Preparação do cocktail de rotulagem da EdU
Figura suplementar: Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Doses múltiplas de injeções (BrdU, EdU) são geralmente usadas em camundongos neonatais em crescimento para marcar ao máximo as células em proliferação 1,6,13. O período de perseguição é considerado uma etapa crítica em relação à taxa de renovação dos tecidos 6,13. O incisivo do rato renova-se todos os meses. Essa característica permite que os pesquisadores estabeleçam o período de perseguição para 4 semanas ou mais4,5,22. Nosso período de perseguição de 6 semanas poderia marcar as células-tronco nos compartimentos mesenquimal e epitelial (alça cervical labial e lingual). Esta área incluiu algumas das populações progenitoras em TACs (Transit-Amplifying Cells) de ambos os compartimentos epitelial e mesenquimal. Um período de perseguição mais longo seria desejável para mostrar células retentoras de marcação verdadeiras que residem exclusivamente nos nichos de células-tronco epiteliais e mesenquimais.
Existem várias etapas críticas nas etapas de processamento e limpeza de tecidos para este protocolo. A primeira nota é para a etapa de perfusão e fixação tecidual. Os incisivos de camundongos contêm tecidos pulpares que têm um rico suprimento de vasos sanguíneos e contêm uma alta quantidade de tecidos sanguíneos. Assim, a perfusão da heparina PBS deve ser iniciada o mais rápido possível após os camundongos estarem profundamente anestesiados e contidos. O motivo é evitar a formação de coágulos sanguíneos que levam à autofluorescência19. Deve-se tomar cuidado para evitar a fixação excessiva com PFA, que pode levar a transparência insuficiente e descoloração amarelada do tecido após a limpeza. A descoloração excessiva diminui a qualidade do sinal nas amostras durante a aquisição de imagens19. A etapa de perfusão transcardíaca ativa é preferida em relação à fixação passiva por imersão de órgãos/tecidos, que fixará rapidamente os tecidos para evitar a perda de fluorescência endógena nas etapas de limpeza tecidual. Na fixação passiva, as áreas mais profundas no tecido podem permanecer menos transparentes; As amostras podem não apresentar resultados de imagemsatisfatórios19. A remoção adequada dos músculos das mandíbulas permite a visualização adequada das estruturas que interessam aos pesquisadores. Além disso, a remoção eficaz evita que distúrbios de autofluorescência afetem os tecidos musculares. A descalcificação adequada é indispensável na limpeza de tecidos duros. Deve-se tomar cuidado para descalcificar adequadamente os tecidos, ajustando o tempo de imersão em EDTA de acordo com o tamanho e o conteúdo mineral das amostras. A concentração de EDTA é crítica para evitar o encolhimento excessivo dos tecidos. Portanto, a concentração deve ser escolhida de acordo com as amostras e experimentos em questão16,19. Da mesma forma, uma etapa de descoloração é fundamental para remover adequadamente o heme remanescente para reduzir a autofluorescência. O tempo inadequado de deslipidação pode resultar em tecido menos transparente e não é aconselhado. Geralmente, a deslipidação para tecidos duros, como mandíbulas de camundongos, pode ser feita a partir de 4-6 h em solução de 30% e 50% de tB e por 1 dia em solução de 70% de tB20. O tempo de incubação depende do tamanho da amostra e do seu teor lipídico. O tempo pode ser prolongado para garantir a completa deslipidação19,20. Laboratórios individuais podem ajustar o tempo de acordo com suas necessidades sem diminuir o tempo mínimo necessário para a deslipidação.
O problema mais comum nas técnicas de limpeza de tecidos envolve a transparência inadequada do tecido causada por etapas inadequadas de processamento e limpeza de tecidos. Essa situação dificulta a obtenção de imagens nítidas, dificultando a visualização adequada das estruturas celulares ou subcelulares marcadas com fluorescência. A solução de problemas dos tecidos inadequadamente transparentes deve ser feita garantindo que cada etapa crítica seja feita corretamente. Essa prática deve começar desde as etapas de perfusão e fixação tecidual até as etapas de limpeza tecidual. As propriedades de cada tecido ou órgão são diferentes. Assim, as etapas de processamento e clareamento tecidual devem ser otimizadas para a obtenção de resultados satisfatórios de clareamento19.
As imagens de amostras de tecido liberadas podem ser completadas com um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) ou um microscópio de fluorescência de lâmina de luz (LSFM), dependendo das necessidades, questões experimentais e disponibilidade do equipamento17. Utilizamos o CLSM para obtenção de imagens da mandíbula, que fornece imagens de maior resolução em maior aumento, mas leva um tempo maior em comparação com o LSFM17,20. Quando alta resolução e maior magnificação não são uma exigência, o microscópio rápido de fluorescência de folhas de luz (LSFM) pode ser desejável19. O LSFM é caro e pode não estar facilmente disponível para laboratórios regulares. Para a microscopia confocal, a escolha das objetivas corretas com a abertura numérica correta é fundamental para uma boa aquisição de imagens19,20. Para grandes amostras de tecido, objetivas de aumento menores, como 10x com pequena abertura numérica e maior distância de trabalho, podem ser apropriadas19,21. Para amostras de tecido menores, objetivos de ampliação mais altos, como 20x com uma alta abertura numérica e uma distância de trabalho menor, podem ser desejáveis. Além disso, o uso de um óleo de imersão com índice de refração compatível com o meio de clareamento e uma lente objetiva é fundamental para evitar a distorção da imagem e ganhar clareza17,19. Para geração de imagens, vários pacotes de software de processamento e análise de imagens estão disponíveis. Enquanto alguns dos pacotes de software são gratuitos, outros são caros e podem ser inacessíveis para laboratórios individuais. Essas plataformas de geração de imagens geram arquivos massivos (em gigabytes) que requerem estações de trabalho computacionais de última geração para visualização e quantificação dos dados 17,20,21.
Embora mais rápido e fácil de executar do que outros métodos de marcação de DNA, como BrdU, há limitações para detectar LRCs através da marcação de EdU in vivo em comparação com a marcação de LRCs com camundongos transgênicos H2B-GFP. Primeiro, é difícil distinguir as LRCs de origem epitelial ou origem mesenquimal. A marcação com H2B-GFP pode ser usada em um ativador de tetraciclina específico para tecido, impulsionado por promotores, que pode marcar especificamente as células-tronco quiescentes em vários tecidos. No caso de incisivos de camundongos, o método H2B-GFP pode marcar especificamente as células-tronco do epitélio ou mesênquima 4,22. No entanto, os métodos de limpeza de tecido e construção de imagens 3D descritos neste protocolo também se aplicam a LRCs marcadas com fluorescência H2B-GFP, proporcionando flexibilidade e uma variedade de opções. Nosso trabalho possibilita a rotulagem e caracterização de LRCs de acordo com as necessidades científicas. O método H2B-GFP requer a produção de camundongos transgênicos e cruzamento com outras cepas, o que é demorado e mais caro do que a marcação de EdU. A outra limitação da marcação da EdU com o método de limpeza de tecidos é que os espécimes não podem ser usados mais para análises funcionais a jusante.
Esse protocolo é vantajoso para pesquisadores que não necessitam de marcação específica de tecidos e desejam resultados mais rápidos da marcação de células-tronco quiescentes. Este método pode ser modificado para uso no rastreamento de linhagens celulares; quando incorporado com a marcação por fluorescência Cre-driven de células-tronco/progenitoras, nosso método obtém mais detalhes sobre a localização da progênie e quantificação/contribuições mais precisas23.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Meghann K. Holt pela edição do manuscrito. Este estudo foi apoiado pelos subsídios do NIH/NIDCR DE026461 e DE028345 e o financiamento inicial da Faculdade de Odontologia do Texas A&M ao Dr. Xiaofang Wang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
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