Summary
Her præsenteres en reproducerbar, overkommelig og robust metode til isolering og udvidelse af primære bronchiale epitelceller til langsigtet biobank og generering af differentierede epitelceller ved dyrkning ved luft-væske-grænsefladen.
Abstract
Luftvejsepitelcellelaget danner den første barriere mellem lungevæv og det ydre miljø og udsættes derved konstant for indåndede stoffer, herunder smitsomme agenser og luftforurenende stoffer. Luftvejsepitellaget spiller en central rolle i en lang række akutte og kroniske lungesygdomme, og forskellige behandlinger rettet mod dette epitel administreres ved indånding. At forstå epithelets rolle i patogenese, og hvordan det kan målrettes mod terapi, kræver robuste og repræsentative modeller. In vitro epitelkulturmodeller anvendes i stigende grad og giver fordelen ved at udføre eksperimenter i et kontrolleret miljø, der udsætter cellerne for forskellige former for stimuli, toksiske stoffer eller infektiøse stoffer. Anvendelsen af primære celler i stedet for udødeliggjorte eller tumorcellelinjer har den fordel, at disse celler differentierer i kultur til et pseudostratificeret polariseret epitelcellelag med en bedre repræsentation af epitelet sammenlignet med cellelinjer.
Præsenteret her er en robust protokol, der er blevet optimeret i løbet af de sidste årtier, til isolering og dyrkning af luftvejsepitelceller fra lungevæv. Denne procedure muliggør vellykket isolering, ekspansion, dyrkning og mucociliær differentiering af primære bronchiale epitelceller (PBEC'er) ved dyrkning ved luft-væske-grænsefladen (ALI) og inkluderer en protokol til biobanking. Desuden beskrives karakteriseringen af disse kulturer ved hjælp af cellespecifikke markørgener. Disse ALI-PBEC-kulturer kan bruges til en række applikationer, herunder udsættelse for hel cigaretrøg eller inflammatoriske mediatorer og co-kultur / infektion med vira eller bakterier.
Protokollen i dette manuskript, der illustrerer proceduren trin for trin, forventes at danne grundlag og/eller reference for dem, der er interesseret i at implementere eller tilpasse sådanne kultursystemer i deres laboratorium.
Introduction
Luftvejsepitelets rolle i en række akutte og kroniske lungesygdomme er blevet beskrevet i forskellige anmeldelser 1,2,3,4,5,6,7. Veldifferentierede kulturer af luftvejsepitelceller er et vigtigt redskab til at opklare luftvejsepitelets rolle. Air-fluid interface (ALI) luftvejsepitelcellekultur anvendes bredt til at fremme differentieringen af luftvejs basale epitelceller og derved studere luftvejsepitelet pålideligt in vitro 8,9. I de seneste år er brugen af sådanne modeller steget yderligere som følge af nye forskningsinitiativer i forbindelse med covid-19-pandemien og en verdensomspændende overgang til dyrefri forskning. Derfor understreger den øgede brug af denne modelcellelinje behovet for at dele procedurer og erfaringer for at opnå robuste resultater. Dette vil også gøre det muligt at sammenligne resultater mellem forskergrupper. Procedurens robusthed er det vigtigste kendetegn og skal derfor underkastes kvalitetskontrol. Flere laboratorier har investeret i at udvikle protokoller til dyrkning af primære luftvejsepitelceller på ALI. Tiden, indsatsen og det nødvendige budget kan reduceres, når disse procedurer deles i detaljer. Disse detaljer omfatter for eksempel valget af cellekulturplast og medier leveret af forskellige producenter, da dette viste sig at påvirke egenskaberne ved de opnåede kulturer10,11,12. Dette understreger vigtigheden af at dele erfaringer og detaljer om kulturprocedurer, da resultaterne kan blive påvirket, og/eller valideringsindsatsen på tværs af forskellige laboratorier kan blive hæmmet i mangel af en sådan indsigt.
Det menneskelige lungeepitel omfatter forskellige celletyper, herunder hovedtyper såsom basalceller, cilierede celler, bægerceller og klubceller. For pålideligt at efterligne epitelcellelaget i luftvejene in vitro skal disse celletyper være repræsenteret i dyrkningsmodellerne, og deres polarisering og funktion opretholdes13,14,15,16. Erkendelsen af, at donorkarakteristika (herunder sygdomstilstand) og cellernes anatomiske oprindelse (dvs. nasal, trakeal, store og små luftveje) kan påvirke cellekulturens cellulære sammensætning og funktionelle reaktioner, er lige så vigtig. Relevant ekspertise og praksis er en forudsætning for succesfuldt at dyrke primære luftvejsepitelceller og vurdere kulturens kvalitet både intuitivt (ved visuel inspektion under kultur) og kvantificerbart. Formålet med dette bidrag er at tilvejebringe en omkostnings- og tidseffektiv metode til isolering og dyrkning af primære humane bronchiale epitelceller (PBEC'er), som også kan anvendes til dyrkning af trakeale og små luftvejsepitelceller. Ud over at beskrive en metode til isolering af sådanne celler fra resekteret lungevæv, præsenteres og diskuteres en metode til ekspansion og biobanking, og endelig til etablering og karakterisering af en veldifferentieret ALI-kultur inden for en rimelig pris og tidsperiode.
Protocol
Celler blev isoleret fra makroskopisk normalt lungevæv opnået fra patienter, der gennemgår resektionsoperation for lungekræft på Leiden University Medical Center, Holland. Patienter, hvorfra dette lungevæv blev udvundet, blev indskrevet i biobanken via et ikke-indsigelsessystem til kodet anonym videre anvendelse af sådant væv (www.coreon.org). Siden 01-09-2022 har patienter imidlertid været tilmeldt biobanken ved hjælp af aktivt informeret samtykke i overensstemmelse med lokale regler fra LUMC biobanken med godkendelse af den institutionelle medicinske etiske komité (B20.042/Ab/ab og B20.042/Kb/kb).
BEMÆRK: Alle procedurer udføres i et biologisk sikkerhedsskab i henhold til lokale biologiske sikkerhedsregler og under sterile arbejdsforhold, mens du bærer kirurgiske handsker og en laboratoriefrakke, medmindre andet er angivet. For alle medier, reagenser og andre opløsninger, der anvendes i protokollen, se venligst materialetabellen og tillægstabel 1. Se figur 1 for detaljerede protokoltrin
1. Dyrkning af bronchiale epitelceller fra humant lungevæv
BEMÆRK: For at opnå en optimal succesrate for bronchial epitelcelleisolering skal den udskårne bronchiale ring holdes nedsænket ved 4 °C i maksimalt 24 timer i fosfatbufret saltvand (PBS) tilsat primocin.
- Forberedelser inden procedurens begyndelse
- Der fremstilles en overfladebehandlingsopløsning i PBS som beskrevet i supplerende tabel 1, og der belægges et passende antal plader med 6 huller med 1,5 ml belægningsopløsning pr. hul. Der inkuberes i 2 timer i en cellekulturkuvøse ved 37 °C og 5 % CO2.
BEMÆRK: Antallet af brønde, der skal belægges, afhænger af størrelsen af det udskårne væv. Som en grov retningslinje er fire 6-brøndsplader belagt, når den udskårne bronchiale ring er 10 mm i diameter og 4 mm i bredden. - Der fremstilles et komplet keratinocytserumfrit substrat (c-KSFM) som beskrevet i supplerende tabel 1. Brug 2 ml af mediet pr. hul på en 6-brønds plade.
BEMÆRK: Denne c-KSFM kan opbevares ved 4 °C i 7 dage. c-KSFM er et lavkalciummedium, der anvendes til udvidelse af luftvejsepitelceller, samtidig med at væksten af forurenende fibroblaster hæmmes.
- Der fremstilles en overfladebehandlingsopløsning i PBS som beskrevet i supplerende tabel 1, og der belægges et passende antal plader med 6 huller med 1,5 ml belægningsopløsning pr. hul. Der inkuberes i 2 timer i en cellekulturkuvøse ved 37 °C og 5 % CO2.
- Rengør bronkieringen ved forsigtigt at skylle ringen i 10 ml steril PBS i en 10 cm petriskål. Brug pincet til forsigtigt at holde ringen (rør kun udenfor) og en lille saks til at fjerne overskydende bindevæv og blodrester. Til videre behandling skæres ringen i to.
BEMÆRK: Alle værktøjer, der anvendes i processen, skal steriliseres før brug. - De to halvdele af bronchialringen nedsænkes i 10 ml af en forvarmet opløsning af protease XIV (1,8 mg/ml) i Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS), herunder Primocin, i en lukket steril beholder, og der inkuberes i nøjagtig 2 timer ved 37 °C i en cellekulturkuvøse.
BEMÆRK: HBSS anvendes som fortyndingsmiddel til protease XIV til at løsne cellerne fra vævet i løbet af en 2 timers inkubationsperiode. HBSS er en afbalanceret isotonisk opløsning, der muliggør opretholdelse af cellelevedygtighed under kortvarige inkubationer. - Efter inkubationen overføres vævsstykkerne til en petriskål med 10 ml varm PBS og skraber indersiden af ringen ved hjælp af bøjet pincet for at opnå en celleopløsning.
BEMÆRK: Vævet fremstår blødere og noget udvidet. - Kassér ringen, overfør celleopløsningen til et 50 ml rør, og tilsæt varm PBS for at opnå et endeligt volumen på 50 ml. Centrifuger i 7 minutter ved 230 x g og ved stuetemperatur (RT).
- Supernatanten suges til syn, og pelletsen opslæmmes igen i 10 ml varm PBS. Yderligere fyldes volumen op til 50 ml med varm PBS. Centrifuger i 7 min ved 230 x g ved RT.
- Supernatanten suges til syn, og cellepelletsen resuspenderes i en passende mængde varm c-KSFM indeholdende primocin.
BEMÆRK: Primocin bruges i mindst 7 dage til at fjerne bakterier, svampe eller (vigtigere) mycoplasma, der kan have været til stede i vævet; Efter 7 dage er tilsætning af kun penicillin/streptomycin til mediet tilstrækkelig. - Opsug belægningsopløsningen fra pladerne med 6 huller, og tilsæt 2 ml cellesuspension pr. hul.
- Lad cellerne vokse, indtil 80% til 90% sammenløb er nået, og skift medium tre gange om ugen (f.eks. Hver mandag, onsdag og fredag). Den ønskede grad af sammenløb nås normalt mellem 7 og 14 dage; Hvis den tid, der kræves for at nå den ønskede sammenløb, overstiger 14 dage, kasseres cellerne.
BEMÆRK: I de første par dage begynder kun et lille antal celler at proliferere; Grupper af celler er mærkbare efter et par dage.
2. Kryopræservering af humane primære bronchiale epitelceller (PBEC'er)
BEMÆRK: Ved arbejde med temperaturer på -80 °C og -196 °C anvendes kryohandsker til beskyttelse, og pincet bruges til at overføre frosne hætteglas. Ved arbejde med flydende nitrogen anvendes kryohandsker og ansigtsskærm til personlig beskyttelse.
- Opsug mediet og vask brøndene en gang med 2 ml varm PBS pr. Brønd.
- Trypsiniser cellerne ved at tilsætte 0,5 ml blødt trypsin pr. hul (se supplerende tabel 1 for sammensætning af den bløde trypsinopløsning). Inkuber cellerne i 5 til højst 10 minutter ved 37 °C. Hvirvl trypsinopløsningen i pladen og slip cellerne ved forsigtigt at banke på pladen.
- Overfør de løsrevne celler til et 50 ml centrifugerør indeholdende 1,1 mg / ml sojabønnetrypsinhæmmer (SBTI; for at hæmme trypsinaktivitet) opløst i KSFM med penicillin / streptomycin. Volumenet af SBTI skal være dobbelt så stort som det samlede volumen af blødt trypsin (dvs. 1 ml pr. hul).
BEMÆRK: Tilføj ikke SBTI direkte til hullerne, da cellerne fastgøres igen inden for få minutter. - Centrifuger røret i 7 minutter ved 230 x g ved RT.
- Supernatanten kasseres, og pelleterede celler resuspenderes i 10 ml RT KSFM indeholdende penicillin/streptomycin, men ingen andre tilsætningsstoffer. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer eller automatiseret celletæller. Udfør en levende / død celletælling ved at tilføje trypanblå i forholdet 1: 1, eller brug en alternativ levende / død celletællingsprocedure.
- Kryopræserver cellerne i en koncentration på 400.000 celler pr. ml frysemedium (se supplerende tabel 1 for sammensætning), og tilsæt 1 ml af denne suspension pr. kryovirus. Kryoialerne overføres til en kølecellebeholder og anbringes ved -80 °C. Efter 24 timer overføres hætteglassene til -196 °C flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
BEMÆRK: To muligheder er mulige for at overføre cellerne til frysemedium, som begge fungerer godt: 1) Pellet cellerne igen ved centrifugering og resuspender i koldfrysemedium ved den krævede cellekoncentration; eller 2) tilsæt koldfrysemedium og juster koncentrationen af kryopræservanen (dimethylsulfoxid [DMSO]) baseret på mængden af KSFM, hvori cellerne er til stede.
3. Optøning af kryopræserverede PBEC'er og dyrkning af dem til dyrkning på skær
- Overtræk en T75-cellekulturkolbe natten over med 10 ml belægningsopløsning i PBS med lågene tæt lukket. Kolben inkuberes i en cellekulturkuvøse ved 37 °C og 5% CO2.
- Før optøning af de kryopræserverede PBEC'er fjernes belægningsopløsningen fra kolben og fyldes med 10 ml c-KSFM. Lad det varme op til 37 °C i en cellekulturkuvøse med let åbne låg for at lade inkubatoren komme ind.
- Cellerne tøs hurtigt op i et 37 °C vand- eller perlebad.
BEMÆRK: Et perlebad foretrækkes frem for et vandbad på grund af den lavere risiko for forurening og lavere energiforbrug. - Det komplette indhold af kryovial tilsættes til den forvarmede T75-kolbe med medium (trin 3.2), og cellerne fordeles jævnt.
BEMÆRK: Centrifuger ikke cellerne på dette stadium, da de ikke overlever centrifugeringstrinnet. - Efter ca. 4 timer skal du sikre dig, at cellerne er tilstrækkeligt fastgjort. Udskift mediet med 10 ml frisk, varm c-KSFM.
BEMÆRK: På denne måde fjernes DMSO'en fra frysemediet. Dette trin skal finde sted mellem 4 timer og 24 timer efter såning af cellerne i kolben. - Dyrk cellerne, indtil 80% til 90% sammenløb er nået, skift mediet hver mandag, onsdag og fredag.
4. Etablering af en luft-væske-grænsefladekultur med primære bronchiale epitelceller (ALI-PBEC)
BEMÆRK: Følgende procedure er for dyrkning af PBEC'er på skær med en indvendig diameter på 11,9 mm.
- Overtræk et passende antal cellekulturindsatser med 0,4 ml belægningsopløsning pr. indsats. Der inkuberes natten over ved 37 °C i en cellekulturkuvøse.
- Der fremstilles et komplet BD-substrat (cBD-medium) som beskrevet i supplerende tabel 1.
BEMÆRK: cBD-substrat er et sammensat medium (se supplerende tabel 1), der er formuleret til at understøtte væksten af bronchiale epitelceller i længere perioder, samtidig med at det tillader deres differentiering efter en stigning i retinsyre (RA) (eller en analog af RA som anvendt i denne protokol) koncentration og kultur ved ALI, som beskrevet i trin 4.10. - PBEC'erne trypsiniseres i T75-kolben ved hjælp af 2 ml blød trypsin pr. kolbe. Inkuber cellerne i 5 til 10 minutter for at lade cellerne løsne sig (baseret på visuel inspektion). Efter 5 minutters inkubation lettes frigørelsen af cellerne ved at hvirvle trypsinet i kolben og forsigtigt banke på kolben (gentag om nødvendigt).
- Der tilsættes 4 ml SBTI til kolben, og cellesuspensionen overføres direkte til et 25 ml centrifugeglas.
BEMÆRK: Cellerne fastgøres igen inden for få minutter. Når der arbejdes med mere end én kolbe, skal cellesuspensionen opnået i trin 4.4 derfor overføres direkte til et centrifugeglas, før SBTI tilsættes til en anden kolbe. I proceduren behandles højst fem kolber samtidigt. - Centrifuger glassene i 7 minutter ved 230 x g ved RT.
- Resuspender cellerne i 6 ml cBD-medium og tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer eller automatiseret celletæller. Udfør en levende/død celletælling ved f.eks. at tilføje trypanblå i forholdet 1:1 eller ved hjælp af en anden procedure for optælling af levende/døde celler.
- Fjern belægningsopløsningen fra cellekulturindsatserne.
- Cellesuspensionen, der genereres i trin 4.6, fortyndes med cBD-medium suppleret med 1 nM EC 23 til en koncentration på 80.000 celler pr. ml, og der tilsættes 0,5 ml på toppen af membranen i indsatsen. Der tilsættes 1,5 ml cBD-medium suppleret med 1 nM EC 23 til brønden under indsatsen.
- Mediet skiftes ud med cBD-substrat suppleret med 1 nM EC 23 tre gange om ugen, indtil kulturerne er klar til lufteksponering (dvs. 2 dage efter 100 % sammenløb er nået). Hver gang tilsættes 0,5 ml af mediet inde i indsatsen (på cellerne), og 1,5 ml tilsættes til bundrummet (brønden).
BEMÆRK: Generelt når cellelaget 100% sammenløb ca. 5 dage efter såning af PBEC'erne på indsatserne. Baseret på den visuelle inspektion af cellernes sammenløb træffes beslutningen om at overføre cellerne til ALI-trinnet 2 dage senere. - Når cellerne er klar til overførsel til ALI (dvs. 2 dage efter at have nået 100% sammenløb), fjernes mediet fra indsatserne og brønden, tilsættes ikke nyt medium inde i indsatsen, og der tilsættes kun nyt medium (1 ml cBD-medium suppleret med 50 nM EC 23) til brønden. Skift mediet i brøndene tre gange om ugen.
- For at fjerne overskydende slim og celleaffald tilsættes forsigtigt 200 μL varm PBS på den apikale side af cellelaget inde i indsatsen (helst via siden af indsatsen og ikke ved direkte pipettering på cellerne) og inkuberes i 10 minutter i en cellekulturkuvøse ved 37 °C. Derefter aspirere PBS for at fjerne overskydende slim og cellulære affald.
BEMÆRK: Fra dette tidspunkt og fremefter (start af ALI-kultur), før du skifter medium i det nederste rum, vask den apikale side af cellerne med PBS hver gang. - Dyrk cellerne på ALI i mindst 2 uger for at sikre, at alle de vigtigste celletyper er repræsenteret.
5. Etablering af en ALI-PBEC-kultur fra en blandet donorpopulation
- Brug celler fra op til fem individuelle donorer til at starte PBEC-kulturer fra en blandet befolkning.
- Bland et lige antal celler pr. donor ved hjælp af de celler, der genereres i trin 4.7, for at nå op på i alt 150.000 celler pr. indsats (dvs. 30.000 celler pr. donor, når der bruges fem donorer). Dette vil sikre, at spredning i indsatsen holdes på et minimum, og at der er lige mange celler fra de enkelte donorer til stede i kulturen.
- Fortsæt ALI-PBEC-kulturen som beskrevet i trin 4.9-4.12.
6. Kvalitetskontrol af ALI-PBEC-kulturen
- Overvågning af transepitelial elektrisk modstand (TEER) under cellekultur
BEMÆRK: Den elektriske modstandsmåling, baseret på brug af et voltohmmeter, kan udføres til enhver tid under ALI-PBEC-kultur og udføres hver gang i henhold til den samme protokol under de samme betingelser, da den elektriske modstandsmåling påvirkes af forskellige variabler, herunder elektrodeposition, temperatur, medium og håndtering. TEER kan beregnes ved hjælp af den målte elektriske modstand ved at anvende følgende formel baseret på Ohms lov:
, hvor Rm er den målte elektriske modstand, Rb er den grundlæggende elektriske modstand for en indsats uden belægning og celler, og SA er overfladearealet af membranen i indsatsen17.- Tilsæt forsigtigt 200 μL varm PBS til den apikale side af cellelaget for at fjerne slim og snavs på cellerne. Skæret inkuberes i 10 minutter i en cellekulturkuvøse ved 37 °C, og PBS fjernes igen.
- Der tilsættes forsigtigt 700 μL varm PBS til den apikale side af cellelaget, og skæret inkuberes i 10 minutter ved RT for at muliggøre stabilisering af temperaturen til målinger.
- Kalibrer voltohmmeteret ved hjælp af 1.000 Ω testmodstanden, indstil voltohmmeteret til at måle ohm, og brug en skruetrækker til at justere "R ADJ" kalibreringsskruen, indtil den er indstillet til 1.000 Ω.
- Skyl elektroden ved at bevæge den op og ned et par gange i sterilt vand (RT) og derefter i sterilt PBS (RT).
- Mål cellelagets elektriske modstand i indsatserne. Til dette formål placeres elektroden lodret i brønden med elektrodens lange arm, der berører bunden af pladen. På denne måde er den korte arm over cellelaget inde i indsatsen. Aflæs den værdi, der vises på voltohmmeteret.
BEMÆRK: Den viste værdi stabiliseres ikke helt; Læs værdien i det øjeblik, værdien er uregelmæssig. - Mellem målingerne rengøres elektroden ved at bevæge den op og ned et par gange i steril PBS (RT).
- Rens elektroden, når målingerne er færdig, ved at bevæge den op og ned et par gange i sterilt vand (RT), sterilt PBS (RT) og 70% ethanol (RT). Opbevar elektroden tør.
- Udfør en baseline-måling af et skær (uden belægning) og celler ved at tilføje 700 μL varm PBS inde i skæret og 1 ml varm PBS til brønden og måle den elektriske modstand sammen med de andre skær.
- Evaluering af den cellulære sammensætning af ALI-PBEC-kulturen
- Under ALI-fasen skal du kontrollere differentieringen ved visuelt at vurdere slå cilia. Disse kan observeres via standard brightfield mikroskopi så tidligt som 9 dage efter lufteksponering på den apikale side af cellerne.
BEMÆRK: Slå cilia er bedst synlige direkte efter vask af den apikale overflade. Bægerceller producerer slim, og derfor er tilstedeværelsen af slim, som observeret under vask af den apikale overflade, et tegn på, at bægerceller dannes. Imidlertid er niveauet af bægerceller og mængden af produceret slim meget donorafhængigt. Tilstedeværelsen af slim kan ses ved opsugning af PBS efter vask af den apikale overflade af cellelaget i indsatsen; i dette tilfælde er den aspirerede PBS mere viskøs, og slimtråde kan observeres under aspirering. - Evaluering af den cellulære sammensætning ved hjælp af immunfarvninger og fluorescerende mikroskopi eller fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) eller genekspressionsanalyse ved realtidskvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) giver vigtig information om kulturens differentieringstilstand, men dens beskrivelse ligger uden for rammerne af dette bidrag.
- Under ALI-fasen skal du kontrollere differentieringen ved visuelt at vurdere slå cilia. Disse kan observeres via standard brightfield mikroskopi så tidligt som 9 dage efter lufteksponering på den apikale side af cellerne.
Figur 1: Skematisk oversigt over isolations-, ekspansions- og dyrkningsproceduren for primære bronchiale epitelceller . (A) Lungevæv opnås under kræftresektionskirurgi, og patologen udskærer bronchialt ringvæv, der er makroskopisk normalt og tumorfrit. (B) Bronkialringen renses og udsættes for enzymatisk behandling for at løsne og dissociere cellelaget. (C) Den udtagne cellesuspension vaskes, og cellerne fordeles i brønde på en 6-brønds plade til ekspansion. (D) Efter tilstrækkelig udvidelse af de isolerede celler i c-KSFM med primocin dissocieres cellelag ved trypsinisering, og celler resuspenderes i frysemedium til kryopræservering. Når det er nødvendigt, optøs kryopræserverede celler og udvides igen ved hjælp af c-KSFM med penicillin/streptomycin i cellekulturkolber. Efter ekspansion podes de i cBD-medium på cellekulturindsatser; (Ea) ALI-PBEC-kulturen finder sted i to hovedfaser: det neddykkede stadium i cBD-medium suppleret med 1 nM EC 23, indtil cellerne når fuld sammenløb, efterfulgt af fjernelse af apikale medier og kultur ved ALI for at muliggøre differentiering; i denne ALI-fase dyrkes cellerne i cBD-medium suppleret med 50 nM EC 23. (Eb) Grafisk repræsentation af basale celler, der dækker indsatsen under nedsænket kultur. (EF) Grafisk gengivelse af det differentierede epitelcellelag opnået efter dyrkning ved ALI i nærvær af øgede koncentrationer af EC 23. Klik her for at se en større version af denne figur.
Representative Results
Ekspansion ved hjælp af nedsænket kultur
Ved hjælp af den her beskrevne metode kan der i gennemsnit opnås otte kryoialer med 400.000 celler/kryoviale fra en 6-brønds plade til langtidsopbevaring i flydende nitrogen (figur 2A). For at opnå dette dyrkes isolerede PBEC'er i plader med 6 huller i mindst 7 dage og højst 14 dage (figur 2B) i nærvær af Primocin for at udelukke mikrobiel (især mycoplasma) kontaminering. Figur 2A, B giver indsigt i de opnåede celletal og krævet dyrkningstid blandt forskellige isolationer fra forskellige donorer. Før cellerne høstes ved trypsinisering til opbevaring i flydende nitrogen, skal sammenløbet være over 80%. Hvis dette ikke opnås inden for 14 dage, bør cellerne ikke kryopræserveres. Det er vigtigt, at cellelagets sammenløb ikke overstiger ~ 95% ved høst til opbevaring og passaging (figur 2C). Efter opbevaring i flydende nitrogen kan cellerne optøes og dyrkes til ekspansion, indtil der opnås tilstrækkelige celletal til ALI-kulturer. Mediet, der anvendes til udvidelse af cellerne på dette stadium, er c-KSFM, svarende til under den indledende kultur efter høst fra bronchialringen18. Der er dog ikke behov for Primocin på nuværende tidspunkt, da risikoen for yderligere mikrobiel kontaminering fra lungevævet er fraværende, og derfor kan Primocin ændres til penicillin/streptomycin. Dette medium favoriserer epitelceller frem for fibroblaster og forhindrer derfor mulig overvækst af kulturen ved hurtigere prolifererende fibroblaster 19,20,21. Ved hjælp af c-KSFM-medium spredes cellerne ud i kolben og forbinder ikke hinanden, hvilket er markant forskelligt fra morfologien af dyrkede celler nedsænket på dette stadium i cBD-medium (figur 2D, E). Efter 5 eller 6 dages dyrkning af de optøede celler i en T75-kolbe skal cellelaget være 80% -95% sammenflydende, hvilket svarer til ca. 3 x 106 celler i alt (figur 2F). Ud fra dette kan der genereres ca. 75 skær (pladestørrelse med 12 brønde) til ALI-kultur.
Den metode til isolering og dyrkning, der er beskrevet i dette bidrag, kan også tilpasses til brug med bronchiale biopsier eller bronchiale børster som udgangsmateriale.
Figur 2: Basalcelleudvidelse før og efter kryopræservering. Celler blev isoleret i henhold til den beskrevne protokol og dyrket under anvendelse af c-KSFM. Antallet af celler, der blev genereret pr. donor, blev overvåget, de levende celletællinger blev udført ved hjælp af en automatiseret celletæller (A) ved høst af passage 0 (P0) celler fra 6-brøndpladerne (trin 2 i protokollen), n = 123 donorer, celletællingen blev præsenteret som antallet af celler høstet pr. Brønd; Hver prik repræsenterer en donor, og medianen er angivet med en vandret bjælke. (B) Som en del af kvalitetskontrol blev den tid, P0-cellerne krævede for at nå 80% til 90% sammenløb i 6-brøndpladerne, overvåget og vist som dage efter start af den nedsænkede kultur i c-KSFM (n = 127 forskellige donorer). Hver enkelt donor er angivet med en prik, alle prikker, der tilhører 1 dag, smelter sammen til en linje; Jo bredere linjen er, jo flere donorer står den for; Det mediane antal dage, cellerne er i kultur, er angivet med en tyndere vandret bjælke. (C) Repræsentativt brightfieldbillede af P0-celler, der er dyrket nedsænket i c-KSFM på det tidspunkt, hvor cellerne blev høstet til langtidskryopræservering. (D) Repræsentativt brightfieldbillede af P1-celler, der er vokset nedsænket i c-KSFM på det tidspunkt, hvor cellerne blev høstet og overført til inserter, og (E) P1-celler, der er dyrket nedsænket i cBD-medium. F) Antallet af levende celler, der genereres pr. donor, blev overvåget ved hjælp af en automatiseret celletæller ved udtagning af P1-celler fra T75-kolben (afsnit 4 i protokollen), n = 63 forskellige donorer. celletallet præsenteres som antallet af celler pr. T75-kolbe, hver donor er angivet med en prik, og mediancelletallet er angivet med en vandret bjælke. Klik her for at se en større version af denne figur.
Luft-væske-interface (ALI) kultur
7 dage efter start af ALI-kulturen måles cellelagets elektriske modstand og skal være mere end 300 Ω (figur 3A); Hvis dette ikke opnås, betragtes kulturen som mislykket på grund af en mulig mangel på tæt forbindelsesdannelse. Det anbefales at udelukke muligheden for at få lave TEER-værdier forårsaget af beskadigelse af epitellaget i individuelle indsatser som følge af f.eks. beskadigelse af cellelaget under vask og aspiration. Dette kan kontrolleres ved visuel mikroskopisk inspektion af kulturindsatserne. Det er vores erfaring, at interdonorvariationen i elektrisk modstand kan være signifikant (figur 3B), hvilket også er rapporteret i litteraturen14, og som observeret også er markant påvirket af oprindelsen af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM), der anvendes (figur 3C).
Figur 3: Transepitelial elektrisk modstand som kvalitetskontrol af ALI-PBEC-kulturer. PBEC'er blev isoleret og udvidet, og veldifferentierede ALI-PBEC-kulturer blev etableret. På flere tidspunkter under dyrkning blev elektrisk modstand målt, og efterfølgende blev TEER beregnet (Ω·cm2). (A) Den elektriske modstand blev målt i løbet af 14 dage efter ALI. n = 4 forskellige donorer. Dataene er afbildet som middelværdien ± standardafvigelse (SD). (B) Som en del af ALI-PBEC cellekulturkvalitetskontrol blev elektrisk modstand målt på dag 7 (n = 50) og dag 14 post-ALI (n = 25); hver prik repræsenterer en donor, og medianen TEER (Ω·cm2) er angivet med en vandret bjælke. Data blev testet for signifikans ved hjælp af en ikke-parametrisk Mann-Whitney-test, og der blev ikke fundet nogen signifikant forskel. (C) Medier fra tre forskellige DMEM-leverandører blev testet for at vurdere indflydelsen på TEER-dannelsen. n = 4 forskellige donorer; middelværdier er afbildet ± SD. Klik her for at se en større version af denne figur.
Samtidig med at der etableres en veldifferentieret ALI-PBEC-kultur, øges koncentrationen af RA fra starten af lufteksponeringen22. På denne måde skifter cellerne fra proliferation til mucociliær differentiering, hvilket er synligt så tidligt som 9 dage (donorafhængig) efter lufteksponering ved hjælp af brightfield-mikroskopi. Bevægelse af de første cilier er synlig på dette tidspunkt og noget tidligere, når den er baseret på genekspression af markører for differentierede luminalceller23 (figur 4).
Som beskrevet i protokollen kan slimproduktion også observeres ved skylning af den apikale overflade under medieændringen. RA er meget lysfølsom, hvilket fører til meget variabel aktivitet ved samme lagerkoncentration. Af denne grund erstattes RA af den syntetiske RA-analog EC 23 og anvendes i samme koncentration med lignende resultater som bestemt eksperimentelt. Af denne grund og for at undgå at ændre proceduren blev den valgte EC 23-koncentration holdt lig med RA-koncentrationen (dvs. 50 nM), der tidligere blev anvendt24,25 (figur 5). Figur 5A viser de TEER-værdier, der er opnået ved anvendelse af forskellige koncentrationer af EC 23, og viser en maksimal TEER ved 50 nM inden for dette testede koncentrationsområde. Resultaterne vist i figur 5B bekræfter, at genekspression af markører for cilierede og bægerceller er ens, når der anvendes 50 nM EC 23 eller RA. EC 23 er også påkrævet under dyrkning på det neddykkede stadium (dog i en meget lavere koncentration), da udeladelse af det på dette neddykkede stadium og kun tilføjelse af det på ALI-stadiet resulterer i en kultur, der aldrig når fuld sammenløb. Den tid, det tager at generere en veldifferentieret ALI-PBEC-kultur med synlig ciliær bankeaktivitet og slimproduktion, er omkring 14 dage, og de fleste af forsøgene påbegyndes derfor mellem 14-21 dages ALI-kulturer (figur 4). Alle de store forskellige celletyper (basal-, cilierede, bæger- og klubceller) observeres efter 14 dages ALI-kultur, selvom ekspressionsniveauer er meget donorafhængige. Dette demonstreres ved at vurdere genekspression af TP63, FOXJ1, MUC5AC og SCGB1A1 ved RT-qPCR eller proteinekspression ved hjælp af antistoffer rettet mod p63, α-tubulin, Muc5AC og CC-16 ved immunfluorescens (IF) farvning for at detektere markører for basal-, cilierede, bæger- og klubceller, henholdsvis25,26. Mens 14-21 dage kan betragtes som en tommelfingerregel for de fleste eksperimenter, kan der for udvalgte eksperimenter overvejes en længere varighed af differentiering, som det fremgår af xenobiotisk metabolisme, SARS-CoV-2-infektion og vurdering af mucociliær clearance27,28,29.
Figur 4: Luft-væske-interface (ALI) kultur. PBEC'er blev isoleret og udvidet, og veldifferentierede ALI-PBEC-kulturer blev etableret. ALI-PBEC-kulturer blev overvåget i løbet af 14 dage efter ALI. Cellekulturer blev lyseret til isolering af RNA på dag 0, 7 og 14 post-ALI. Data fra to forskellige donorer vises, hver prik repræsenterer en individuel donor overvåget over tid, og medianen er angivet med en vandret bjælke. Genekspression af basal-, cilierede, bæger- og klubcellemarkører (henholdsvis TP63, FOXJ1, MUC5B og SCGB1A1) blev målt ved qPCR og normaliseret for RPL13A - og ATP5B-genekspression (se reference 23 for detaljer). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sammenligning af retinsyre (RA) og dens syntetiske analog EC 23. PBEC'er blev isoleret og udvidet, og veldifferentierede ALI-PBEC-kulturer blev etableret. Ved påbegyndelse af lufteksponering af PBEC-kulturerne blev RA (50 nM) erstattet af forskellige koncentrationer af EC 23. (A ) Elektrisk modstand blev målt på dag 14 post-ALI og derefter blev TEER beregnet (Ω·cm 2), n =2 donorer, søjlerne viser middelværdien ± SD. ( B) På dag 14 efter ALI blev cellekulturer lyseret til RNA-isolering og efterfølgende genekspressionsanalyse af cellemarkører for henholdsvis cilierede celler og bægerceller (FOXJ1, MUC5AC) ved hjælp af qPCR, og normaliseret for RPL13A (n = 3 donorer). En foldstigning vises mod ALI-PBEC dyrket med 50 nM RA og afbildet som middelværdien ± SD. (Se reference 23 for detaljer) Klik her for at se en større version af denne figur.
I løbet af de seneste år er resultaterne af alternative produkter i kultursystemet blevet undersøgt, såsom medier og kulturplast. Der var forskellige årsager til sådanne evalueringer, herunder ændringer i producenternes mediesammensætning, nye medier introduceret samt mangel på produkter under COVID-19-pandemien (2020-2022). Det blev observeret, at ensartede produkter fra forskellige leverandører resulterer i differentierede epitelcellekulturer baseret på vurdering af markører for epitelcelletyper, selv om den endelige cellesammensætning kan variere betydeligt (figur 6A), mens forskellene i TEER var mindre udtalte (figur 6B). På den anden side resulterede medium fra forskellige leverandører i betydelige forskelle i cellulær sammensætning; ved brug af indsatser fra forskellige mærker var sådanne forskelle begrænsede (figur 6C). Især ved anvendelse af luftvejsepitelcellekulturmediet PneumaCult fra STEMCELL Technologies blev der observeret en anden morfologi og hurtigere dannelse af synlig ciliær aktivitet. Ud over disse observationer blev der også konstateret en forskel i TEER-værdier og en forskel i cellesammensætningen af ALI-PBEC sammenlignet med cBD-substratet (figur 6D).
Figur 6: Sammenligning af forskellige leverandører af epitelcellemedier og cellekulturindsatser. PBEC blev isoleret, udvidet og veldifferentierede ALI-PBEC kulturer blev etableret. (A) ALI-PBEC'er blev dyrket i 14 dage, og derefter blev cellelagene lyseret til RNA-isolering. Genekspression af basale, cilierede, bæger- og klubcellemarkører (henholdsvis TP63, FOXJ1, MUC5AC og SCGB1A1) blev målt ved qPCR og normaliseret for RPL13A og ATP5B. n = 2 donorer; søjlerne viser middelværdien ± SD. (B) I løbet af 9 dage efter ALI blev den elektriske modstand målt, og derefter blev TEER beregnet (Ω·cm2). n = 3 forskellige donorer; Middelværdier er afbildet ± SD. (C) ALI-PBEC'er blev dyrket i 14 dage ved hjælp af cellekulturindsatser købt fra tre forskellige leverandører, og derefter blev cellelagene lyseret til RNA-isolering. Genekspression af cilierede, bæger- og klubcellemarkører (henholdsvis FOXJ1, MUC5AC og SCGB1A1) blev målt ved qPCR og normaliseret for RPL13A. n = 18 forskellige donorer, søjlerne viser middelværdien ± SD. Data blev testet for signifikans ved hjælp af en envejs ANOVA ikke-parametrisk Kruskal-Wallis-test, og der blev ikke fundet nogen signifikant forskel. (D) ALI-PBEC'er blev dyrket enten i cBD-medium eller PneumaCult-medium (STEMMCELL-teknologier) i 14 dage efter ALI, og derefter blev cellelagene lyseret til RNA-isolering. Genekspression af basal-, cilierede, bæger- og klubcellemarkører (henholdsvis TP63, FOXJ1, MUC5B og SCGB1A1) blev målt ved qPCR og normaliseret for RPL13A (søjlerne viser middelværdien ± SD), og elektrisk modstand blev målt på dag 5 og 12 post-ALI og brugt til at beregne TEER (Ω·cm2). n = 2; middelværdien er afbildet ± SD (se reference 23 for detaljer). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Sammensætning af de opløsninger og medier, der anvendes i protokollen. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Protokollen præsenteret her beskriver isoleringen af humane bronchiale epitelceller fra resekteret lungevæv, en metode til optimal udvidelse af celler uden tab af differentieringspotentiale, en kryopræserveringsprocedure og en procedure til generering af veldifferentierede ALI-PBEC-kulturer. Desuden gives en beskrivelse af kvalitetskontrol samt instruktioner til overvågning og evaluering af de differentierede ALI-PBEC'er.
Den beskrevne protokol starter med en makroskopisk normal, tumorfri bronchial ring, der resekteres fra en lungelap fra patienter, der gennemgår operation relateret til deres lungekræftdiagnose. Det skal derfor bemærkes, at disse ringe strengt taget ikke kan betragtes som sundt væv, hvilket derfor kan påvirke cellekulturens egenskaber. Alternative kilder til opnåelse af bronchiale epitelceller omfatter anvendelse af bronchiale biopsier, bronchiale børstninger eller væv fra en transplantationsdonor eller modtagerlunger. Uanset kilden bør der ved brug af lungevæv overvejes en risiko for mikrobiel kontaminering, og derfor anvendes antibiotika i de forskellige dyrkningsmedier for at reducere risikoen for mikrobiel kontaminering af cellekulturen. Især mycoplasma er en høj og almindelig risiko i cellekultur på grund af dens mange forskellige virkninger på cellekultur, resistens over for antibiotika, der almindeligvis anvendes i cellekultur, og det faktum, at mycoplasma-kontaminering kun kan bekræftes ved mycoplasma-detektionsassays. Derfor anvendes den bredspektrede antimikrobielle formulering Primocin i den indledende fase af cellekultur efter isolering af celler fra lungevæv, og under dyrkningsprocessen testes tilfældigt udvalgte prøver for tilstedeværelsen af mycoplasma.
Isolationsproceduren, der starter med en bronkial ring, giver tilstrækkeligt udgangsmateriale til at muliggøre den grad af udvidelse af disse primære celler, der er nødvendig for at starte kulturer ved ALI uden at gå på kompromis med differentieringskapaciteten. Imidlertid kan start af udvidelsen af de isolerede epitelceller med et begrænset antal celler udgøre problemer med at opnå et tilstrækkeligt antal indsatser med nok celler, der kan podes til ALI-kultur. Udvidet dyrkning og gentagen passage af primære celler kan resultere i replikativ ældning. Der er foreslået forskellige løsninger for at overvinde denne begrænsning. Horani et al. viste, at Rho-kinasehæmmeren (ROCK) Y-27632 øgede spredningen af basalceller30, Mou et al. brugte dobbelt Smad-hæmning til at udvide basale stamceller, samtidig med at egenskaberne ved det differentierede epitelcellelag 31 opretholdes, og Sachs et al. har udviklet et luftvejsorganoidsystem, der kan bruges til at udvide luftvejsepitelceller og opretholde deres differentieringspotentiale i løbet af flere passager32. Sidstnævnte metode blev også brugt til at udvide celler fra kilder med meget lave celletal, såsom trakeale aspirater (TA'er) fra for tidligt fødte spædbørn (<28 ugers svangerskabsalder) og bronchoalveolær skylning (BAL) væske, før overførsel til ALI-kulturen som beskrevet her33. Det blev konstateret, at celler isoleret fra BAL og TA'er viste en differentieringskapacitet, der lignede celler genereret fra bronchialt væv, selvom forskelle blev observeret, når differentieringen var skæv mod mere cilierede eller mere bægercelleholdige kulturer ved hjælp af Notch-signalhæmning eller Th2-cytokinet IL-1333. Det anbefales derfor, at hvis ALI-PBEC'er dyrkes fra et udgangsmateriale med lavt epitelcelleantal ved hjælp af lignende tilgange, skal kulturerne altid kontrolleres for de grundlæggende kvalitetskriterier, som diskuteret i afsnit 6 i protokollen. Det er vigtigt, at brugen af fødeceller også kan hjælpe med at opnå større celleantal, hvilket er vigtigt i en indstilling til transplanterelig stilladsteknik, hvor tid og cellenummer er afgørende. Dette illustreres af en undersøgelse, hvor autologe epitelceller blev dyrket fra biopsier fra en patient med trakealsygdom, og celler hurtigt blev udvidet i nærværelse af et murin embryonalt fødelag (mitotisk inaktiverede 3T3-J2 fibroblaster) og ovennævnte hæmmer af Rho/ROCK-vejen (Y-27632)34. Den resulterende cellekultur viste sig at være nyttig til genbefolkning af trakealstilladser, og dette kunne derfor ses som en passende protokol til en transplantationsmodel.
Når man bruger den protokol, der er beskrevet i dette bidrag, men også når man bruger andre kulturprotokoller, introduceres uundgåeligt en selektionsbias. Det er vigtigt at indse, at forskelle i protokoldetaljer, såsom oprindelsen af celler, der bruges til at initiere kulturer, mediumsammensætning og andre protokoldetaljer, kan føre til ændringer i kulturernes cellulære sammensætning og derved ændringer i responsen fra ALI-kulturen33,35. Derudover er forskelle i celleegenskaber også blevet observeret, når man sammenligner forskellige medier til differentiering af luftvejscellerne10,11. Ved sammenligning af PneumaCult og cBD-medium blev der observeret forskelle i bægercelle- og klubcelle-mRNA-markører, TEER-værdier og cellelagtykkelse. Baseret på disse observationer, på trods af manglen på statistisk underbygning på grund af det lave antal anvendte donorer, er mediesammensætningen ukendt for kunderne og højere omkostninger ved PneumaCult-mediet, blev beslutningen truffet i vores laboratorium om at bruge cBD-mediet.
Som diskuteret kan celler oprindeligt udvides ved hjælp af organoidkultur og derefter overføres til 2D ALI-indsatssystemet. Dette er vigtigt, da luftvejsepitelorganoider ikke er egnede til eksponering for luftbårne stoffer, mens brugen af ALI 2D-systemet muliggør evaluering af virkningen af luftbårne stoffer såsom cigaretrøg 23,36 på dyrkede luftvejsepitelceller. En anden tilgang til etablering af ALI-luftvejsepitelcellekulturer er at generere luftvejsepitelceller ved differentiering af humane pluripotente stamceller (hiPSC'er)37. I sådanne protokoller kan celler i den sidste fase af differentieringsprotokollen efter differentiering til proksimale luftvejsforfædre differentieres ved dyrkning til ALI ved hjælp af procedurer svarende til dem, der er beskrevet her.
I den nuværende protokol anvendes cBD-medium til kultur på ALI. cBD-medium er et serumfrit medium, der fremstilles ved at tilføje en blanding af forskellige kosttilskud, inspireret af Fulcher et al.38 samt andre undersøgelser. Tilskudsopløsningen indeholder 52 μg / ml bovin hypofyseekstrakt (BPE), 0,5 μg / ml hydrocortison, 0,5 ng / ml human EGF, 0,5 μg / ml adrenalin, 10 μg / ml transferrin, 5 μg / ml insulin, 6,5 ng / ml triiodothyronin og 0,1 ng / ml RA39. Da BPE er et vævsekstrakt og udsættes for batchvis variation, kan substratet ikke betragtes som et fuldt defineret medium, og det er heller ikke dyrefrit. Cellekulturmedium, der er fuldt defineret, foretrækkes for at minimere batch-til-batch-forskelle. I lyset af overgangen til dyrefri forskning er det vigtigt, at der gøres en indsats for at producere definerede medier, der ikke indeholder animalske produkter, og som er økonomisk overkommelige for forskersamfundet.
Forskellige eksperimentelle opsætninger kan bruges baseret på ALI-modellen, afhængigt af forskningsspørgsmålet. For eksempel for at undersøge virkningen af forbindelser, der kan påvirke differentieringsprocessen, kan dette løses ved at tilføje forbindelserne til kulturen under de forskellige stadier af nedsænket kultur, under differentiering eller på det veldifferentierede stadium. Den cellulære sammensætning af ALI-PBEC-kulturen kan påvirkes ved tilsætning af specifikke forbindelser; for eksempel genererer differentiering af ALI-PBEC'er i nærvær af IL-13 en kultur med flere bægerceller og færre cilierede celler, mens behandling med γ-sekretasehæmmeren DAPT (bruges til at blokere Notch-signalering) under differentiering resulterer i en kultur med mere cilierede celler på bekostning af bægerceller 23,40,41,42.
Desuden kan midler til at stimulere celler eller blokere visse processer enten påføres basalrummet eller (i et meget lille volumen) til kulturens apikale rum. Celler kan også udsættes for luftbårne stoffer fra den apikale side. Sådanne eksponeringsdesign er blevet brugt til at undersøge virkningen af dieseludstødning eller hel cigaretrøg på PBEC'er23,43,44. Mediet kan høstes hver gang mediet ændres for at overvåge udskillede proteiner på basalsiden; det samme gælder for den apikale side af cellerne, der vaskes med PBS, mens basalmediet opdateres. Den såkaldte apikale vask høstes, og valgfri dithioerythritol (DTE) tilsættes for at adskille slimet, der produceres af bægercellerne mere effektivt. Cellelysater kan opnås til isolering af total protein, RNA og kromosomalt og mitokondrielt DNA. Cellerne kan undersøges yderligere ved hjælp af antistoffer til specifikke markører ved at skære polyethylenterephthalatmembranen (PET) fra plastindsatsen og yderligere skære denne membran i mindre stykker til flere immunfluorescensfarvninger45. Desuden kan flowcytometri eller FACS også anvendes efter trypsinisering af cellerne i indsatserne. Under ALI-stadiet kan udviklingen af cellebarrieren overvåges ved at måle den elektriske modstand og efterfølgende beregne TEER, hvor den elektriske modstand er omvendt proportional med membranindsatsens overfladeareal. Beregningen er baseret på Ohms lov ved hjælp af følgende formel: 
, hvor Rm er den målte elektriske modstand, Rb er den grundlæggende elektriske modstand for en indsats uden belægning og celler, og SA er overfladearealet af skærets membran. Måling af den elektriske modstand ved hjælp af EVOM2- og STX/spisepindeelektroder er ligetil, men meget afhængig af håndteringsprocedurer, når den indføres i brønden. Det er også blevet foreslået, at elektrodens form påvirker målingen af barrierefunktionen af det relativt store overfladeareal17.
Yderligere forbedring i ALI-cellekultursystemet, der sigter mod at øge nøjagtig vævsrepræsentation, inkluderer samkultur af yderligere celletype, såsom leukocytter, fibroblaster eller endotelceller46,47,48. Det er blevet observeret, at denne co-kultur af ALI-PBEC med granulocyt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) eller M-CSF-differentierede makrofager markant påvirker medfødte epitelresponser og reparation48. Det er vigtigt at bemærke, at i sådanne samkulturmodeller kan mediumkompatibilitet være et problem. Da mediet, der anvendes til luftvejsepitelcellekulturen, er udviklet specielt til PBEC'er og muligvis ikke er optimalt egnet til andre celletyper, er optimering nødvendig. En anden form for fremskridt, der ses inden for luftvejsbiologi, som isolerede PBEC'er kan bruges til, er brugen af Organs-on-Chips (OoC) teknologi49,50. Ved hjælp af denne teknologi kan indflydelsen af de mekaniske kræfter ved vejrtrækning og blodgennemstrømning, såsom strækning, luft og medium strømning, studeres 29.
Interdonorvariabilitet kan være signifikant, når der anvendes PBEC'er fra forskellige donorer, og det er derfor vigtigt at overveje at bruge celler fra flere donorer til at tage højde for denne variabilitet i epitelcellekulturundersøgelser. Da kulturen af ALI-PBEC'er er tidskrævende og forbundet med betydelige omkostninger, undersøges muligheden for at etablere ALI-PBEC-kulturer ved at blande celler fra forskellige donorer i en cellekulturindsats. På denne måde kan pilotforsøg let udføres ved hjælp af primære celler, inden man analyserer responserne fra kulturer afledt af forskellige individuelle donorer . Derudover kan donorer med forskellige karakteristika (f.eks. forskellige aldersgrupper eller køn) grupperes til eksplorative undersøgelser. Når der anvendes donorblandinger, er det vigtigt at sikre, at der er lige mange forskellige donorer til stede for at forhindre, at én donor dominerer resultaterne som følge af en højere spredningsrate. Derfor udvides celler fra individuelle donorer separat og podes med en højere densitet i indsatsen sammenlignet med såceller fra en individuel donor for at minimere spredning i indsatsen før overgang til ALI. Respons fra donorblandinger og tilsvarende individuelle donorer blev sammenlignet ved at studere infektionskinetikken for SARS-CoV-2. Ved anvendelse af RT-qPCR og immunofluorescensfarvning blev det observeret, at donorblandingen gav en god repræsentation af de forskellige individuelle donorer ved at vise et lignende antal producerede viruspartikler og et tilsvarende antal inficerede celler28.
For at blive et acceptabelt alternativ til dyremodeller bør genredigering af dyrkede bronchiale epitelceller være mulig51. RNA-interferensteknologi ved hjælp af små interfererende RNA'er (siRNA'er) i ALI-PBEC'er undersøges, men da cellerne skal transfekteres med siRNA under den nedsænkede fase af kulturen, opretholdes knockdown ikke tilstrækkeligt under ALI-kultur på grund af den lange dyrkningsvarighed, medmindre siRNA-transfektion ofte gentages under kultur52. Ikke desto mindre kan siRNA'er med succes anvendes til at modificere genekspression i nedsænkede basalceller. Andre har med succes brugt CRISPR/Cas9-teknologi til at opnå genredigering i primære ALI-luftvejsepitelcellekulturer med ribonukleoprotein (RNP) levering 53. Ved anvendelse af sådanne teknikker er det vigtigt, at cellerne opretholder deres fulde differentieringskapacitet. Fordi primære luftvejscellekulturer ikke kan passeres på ubestemt tid, er klonal udvidelse af de genredigerede celler ikke let, og tilføjelsen af medium til udvælgelse af transfekterede celler er besværlig. Derfor er det svært at opnå den ønskelige knockdown i alle de dyrkede celler. Et alternativ til at generere knockout-kloner er brugen af knock-out-strategier i hiPSC'er54 og brugen af disse celler til at generere luftvejsepitelceller. Et andet, omend suboptimalt, alternativ er at etablere en udødeliggjort PPEC-linje for klonalt at udvide genredigerede celler55.
Den protokol, der præsenteres her, er en måde at generere en veldifferentieret pseudostratificeret ALI-PBEC på, men andre protokoller har også vist sig at etablere en sådan kultur med mindre og større forskelle i forhold til den præsenterede protokol. Efter vores mening er validering af dyrkningsmetoder og streng kvalitetskontrol på tværs af laboratorier afgørende for, at ALI-PBEC-systemet og lignende kultursystemer af luftvejsepitelceller kan blive et gyldigt alternativ til dyreforsøg.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen relevante interessekonflikter.
Acknowledgments
Undersøgelserne ved hjælp af modellen beskrevet i dette bidrag er blevet støttet af en række finansieringsorganisationer, herunder Lung Foundation Netherlands, den hollandske organisation for sundhedsforskning og udvikling (ZonMw, COVID-19 MKMD-tilskud), det hollandske samfund for udskiftning af dyreforsøg (Stichting Proefdiervrij, bevilling # 114025007) samt forskningsbevillinger fra virksomheder som Boehringer Ingelheim og Galapagos. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
| 4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
| Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
| Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
| BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
| Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
| Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
| Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
| Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
| CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
| Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
| CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
| Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
| Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
| Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
| D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
| dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
| EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
| IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
| Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
| Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
| M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
| M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
| MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
| Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
| Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
| Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
| Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
| Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
| Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
| Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
| Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
| Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
| Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
| Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
| Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
| Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
| Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
| Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
| Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
| Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
| Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
| RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
| TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
| Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
| Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
| Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
| Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |
References
- Aghapour, M., et al. Role of air pollutants in airway epithelial barrier dysfunction in asthma and COPD. European Respiratory Review. 31 (163), 210112 (2022).
- de Waal, A. M., Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
- Duchesne, M., Okoye, I., Lacy, P. Epithelial cell alarmin cytokines: Frontline mediators of the asthma inflammatory response. Frontiers in Immunology. 13, 975914 (2022).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Ruysseveldt, E., Martens, K., Steelant, B. Airway basal cells, protectors of epithelial walls in health and respiratory diseases. Frontiers in Allergy. 2, 787128 (2021).
- Alysandratos, K. D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
- Hammad, H., Lambrecht, B. N. Barrier epithelial cells and the control of type 2 immunity. Immunity. 43 (1), 29-40 (2015).
- Hynds, R. E., Bonfanti, P., Janes, S. M. Regenerating human epithelia with cultured stem cells: feeder cells, organoids and beyond. EMBO Molecular Medicine. 10 (2), 139-150 (2018).
- Hiemstra, P. S., Tetley, T. D., Janes, S. M. Airway and alveolar epithelial cells in culture. The European Respiratory Journal. 54 (5), 1900742 (2019).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
- Morgan, R., et al. A medium composition containing normal resting glucose that supports differentiation of primary human airway cells. Scientific Reports. 12 (1), 1540 (2022).
- Ghosh, B., et al. Strong correlation between air-liquid interface cultures and in vivo transcriptomics of nasal brush biopsy. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1056-L1062 (2020).
- Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 300 (1), L25-L31 (2011).
- Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air-liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 465-473 (2011).
- Legebeke, J., et al. Temporal whole-transcriptomic analysis of characterized in vitro and ex vivo primary nasal epithelia. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 907511 (2022).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- van Wetering, S., et al. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. Journal of Investigative Medicine. 48 (5), 359-366 (2000).
- Balk, S. D. Calcium as a regulator of the proliferation of normal, but not of transformed, chicken fibroblasts in a plasma-containing medium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 68 (2), 271-275 (1971).
- Gail, M. H., Boone, C. W., Thompson, C. S. A calcium requirement for fibroblast motility and prolifertion. Experimental Cell Research. 79 (2), 386-390 (1973).
- Dulbecco, R., Elkington, J. Induction of growth in resting fibroblastic cell cultures by Ca. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72 (4), 1584-1588 (1975).
- van Wetering, S., et al. Epithelial differentiation is a determinant in the production of eotaxin-2 and -3 by bronchial epithelial cells in response to IL-4 and IL-13. Molecular Immunology. 44 (5), 803-811 (2007).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. The European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 239-245 (2010).
- Schrumpf, J. A., Ninaber, D. K., vander Does, A. M., Hiemstra, P. S. TGF-β1 impairs vitamin D-induced and constitutive airway epithelial host defense mechanisms. Journal of Innate Immunity. 12 (1), 74-89 (2020).
- Schrumpf, J. A., et al. Proinflammatory cytokines impair vitamin D-induced host defense in cultured airway epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (6), 749-761 (2017).
- Boei, J. J. W. A., et al. Xenobiotic metabolism in differentiated human bronchial epithelial cells. Archives of Toxicology. 91 (5), 2093-2105 (2017).
- Wang, Y., et al. Impact of human airway epithelial cellular composition on SARS-CoV-2 infection biology. bioRxiv. , (2021).
- Nawroth, J. C., et al. Breathing on Chip: Dynamic flow and stretch tune cellular composition and accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. bioRxiv. , (2022).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Eenjes, E., et al. Disease modeling following organoid-based expansion of airway epithelial cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (4), L775-L786 (2021).
- Butler, C. R., et al. Rapid expansion of human epithelial stem cells suitable for airway tissue engineering. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (2), 156-168 (2016).
- Amatngalim, G. D., et al. Antibacterial defense of human airway epithelial cells from chronic obstructive pulmonary disease patients induced by acute exposure to nontypeable Haemophilus influenzae: modulation by cigarette smoke. Journal of Innate Immunity. 9 (4), 359-374 (2017).
- Plebani, R., et al. 3D lung tissue models for studies on SARS-CoV-2 pathophysiology and therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 10071 (2022).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature Biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 107, 183-206 (2005).
- Cao, J., Wong, C. K., Yin, Y., Lam, C. W. K. Activation of human bronchial epithelial cells by inflammatory cytokines IL-27 and TNF-alpha: implications for immunopathophysiology of airway inflammation. The Journal of Cellular Physiology. 223 (3), 788-797 (2010).
- Tsao, P. N., et al. Notch signaling controls the balance of ciliated and secretory cell fates in developing airways. Development. 136 (13), 2297-2307 (2009).
- Laoukili, J., et al. IL-13 alters mucociliary differentiation and ciliary beating of human respiratory epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 108 (12), 1817-1824 (2001).
- Mertens, T. C. J., et al. Cigarette smoke differentially affects IL-13-induced gene expression in human airway epithelial cells. Physiological Reports. 5 (13), e13347 (2017).
- Zarcone, M. C., et al. Effect of diesel exhaust generated by a city bus engine on stress responses and innate immunity in primary bronchial epithelial cell cultures. Toxicology in Vitro. 48, 221-231 (2018).
- vander Does, A. M., et al. Early transcriptional responses of bronchial epithelial cells to whole cigarette smoke mirror those of in-vivo exposed human bronchial mucosa. Respiratory Research. 23 (1), 227 (2022).
- Wang, Y., Ninaber, D. K., van Schadewijk, A., Hiemstra, P. S. Tiotropium and fluticasone inhibit rhinovirus-induced mucin production via multiple mechanisms in differentiated airway epithelial cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 278 (2020).
- Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not M0- or M2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), 0276013 (2022).
- Gindele, J. A., et al. Opposing effects of in vitro differentiated macrophages sub-type on epithelial wound healing. PLoS One. 12 (9), e0184386 (2017).
- van Riet, S., et al. Modulation of airway epithelial innate immunity and wound repair by M(GM-CSF) and M(M-CSF) macrophages. Journal of Innate Immunity. 12 (5), 410-421 (2020).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Stucki, A. O., et al. A lung-on-a-chip array with an integrated bio-inspired respiration mechanism. Lab on a Chip. 15 (5), 1302-1310 (2015).
- Peters-Hall, J. R., et al. Long-term culture and cloning of primary human bronchial basal cells that maintain multipotent differentiation capacity and CFTR channel function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (2), L313-L327 (2018).
- Bartman, C. M., Stelzig, K. E., Linden, D. R., Prakash, Y. S., Chiarella, S. E. Passive siRNA transfection method for gene knockdown in air-liquid interface airway epithelial cell cultures. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), L280-L286 (2021).
- Koh, K. D., et al. Efficient RNP-directed human gene targeting reveals SPDEF is required for IL-13-induced mucostasis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (3), 373-381 (2020).
- Bhargava, N., et al. Development of an efficient single-cell cloning and expansion strategy for genome edited induced pluripotent stem cells. Molecular Biology Reports. 49 (8), 7887-7898 (2022).
- Angelopoulou, A., Papaspyropoulos, A., Papantonis, A., Gorgoulis, V. G. CRISPR-Cas9-mediated induction of large chromosomal inversions in human bronchial epithelial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101257 (2022).
