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Immunology and Infection

बायोबैंकिंग के लिए कटे हुए फेफड़ों के ऊतकों से ब्रोन्कियल एपिथेलियल कोशिकाओं को अलग करना और अच्छी तरह से विभेदित वायु-तरल इंटरफ़ेस संस्कृतियों की स्थापना करना

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65102
Automatic Translation
1, 1, 1
1PulmoScience Laboratory, Department of Pulmonology, Leiden University Medical Center

Summary

यहां प्रस्तुत एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, सस्ती और मजबूत विधि है जो दीर्घकालिक बायोबैंकिंग के लिए प्राथमिक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के अलगाव और विस्तार और वायु-तरल इंटरफ़ेस पर संस्कृति द्वारा विभेदित उपकला कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए है।

Abstract

वायुमार्ग उपकला कोशिका परत फेफड़ों के ऊतकों और बाहरी वातावरण के बीच पहली बाधा बनाती है और इस प्रकार संक्रामक एजेंटों और वायु प्रदूषकों सहित साँस के पदार्थों के लगातार संपर्क में रहती है। वायुमार्ग उपकला परत तीव्र और पुरानी फेफड़ों की बीमारियों की एक बड़ी विविधता में एक केंद्रीय भूमिका निभाती है, और इस उपकला को लक्षित करने वाले विभिन्न उपचार साँस द्वारा प्रशासित किए जाते हैं। रोगजनन में एपिथेलियम की भूमिका को समझना और इसे चिकित्सा के लिए कैसे लक्षित किया जा सकता है, इसके लिए मजबूत और प्रतिनिधि मॉडल की आवश्यकता होती है। इन विट्रो एपिथेलियल कल्चर मॉडल का तेजी से उपयोग किया जा रहा है और एक नियंत्रित वातावरण में प्रयोग करने का लाभ प्रदान करता है, कोशिकाओं को विभिन्न प्रकार की उत्तेजनाओं, विषाक्त पदार्थों या संक्रामक एजेंटों को उजागर करता है। अमर या ट्यूमर सेल लाइनों के बजाय प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग का लाभ यह है कि ये कोशिकाएं सेल लाइनों की तुलना में उपकला के बेहतर प्रतिनिधित्व के साथ एक छद्मस्तरीकृत ध्रुवीकृत उपकला कोशिका परत के लिए संस्कृति में अंतर करती हैं।

यहां प्रस्तुत एक मजबूत प्रोटोकॉल है, जिसे फेफड़ों के ऊतकों से वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति के लिए पिछले दशकों में अनुकूलित किया गया है। यह प्रक्रिया वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) पर संवर्धन करके प्राथमिक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (पीबीईसी) के सफल अलगाव, विस्तार, संस्कृति और म्यूकोसिलरी भेदभाव की अनुमति देती है और इसमें बायोबैंकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल है। इसके अलावा, सेल-विशिष्ट मार्कर जीन का उपयोग करके इन संस्कृतियों के लक्षण वर्णन का वर्णन किया गया है। इन ALI-PBEC संस्कृतियों का उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें पूरे सिगरेट के धुएं या भड़काऊ मध्यस्थों के संपर्क में आना, और वायरस या बैक्टीरिया के साथ सह-संस्कृति / संक्रमण शामिल है।

इस पांडुलिपि में प्रदान किया गया प्रोटोकॉल, चरण-दर-चरण तरीके से प्रक्रिया को दर्शाता है, उन लोगों के लिए एक आधार और / या संदर्भ प्रदान करने की उम्मीद है जो अपनी प्रयोगशाला में ऐसी संस्कृति प्रणालियों को लागू करने या अनुकूलित करने में रुचि रखते हैं।

Introduction

विभिन्न प्रकार के तीव्र और पुरानी फेफड़ों के रोगों में वायुमार्ग उपकला की भूमिका कोविभिन्न समीक्षाओं 1,2,3,4,5,6,7 में वर्णित किया गया है। वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की अच्छी तरह से विभेदित संस्कृतियां वायुमार्ग उपकला की भूमिका को उजागर करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं। वायु-तरल इंटरफ़ेस (एएलआई) वायुमार्ग उपकला कोशिका संस्कृति को मोटे तौर पर वायुमार्ग बेसल उपकला कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए लागू किया जाता है और इस प्रकार विट्रो 8,9 में वायुमार्ग उपकला का विश्वसनीय रूप से अध्ययन किया जाता है। पिछले वर्षों में, कोविड-19 महामारी से संबंधित नई शोध पहलों और पशु-मुक्त अनुसंधान में विश्वव्यापी संक्रमण के परिणामस्वरूप ऐसे मॉडलों का उपयोग और भी बढ़ गया है। इसलिए, इस मॉडल सेल लाइन का बढ़ता उपयोग मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रक्रियाओं और अनुभवों को साझा करने की आवश्यकता पर जोर देता है। यह अनुसंधान समूहों के बीच परिणामों की तुलना की भी अनुमति देगा। प्रक्रिया की मजबूती प्रमुख विशेषता है और इसलिए गुणवत्ता नियंत्रण के अधीन होने की आवश्यकता है। कई प्रयोगशालाओं ने एएलआई में प्राथमिक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने में निवेश किया है। समय, प्रयास और आवश्यक बजट को कम किया जा सकता है जब इन प्रक्रियाओं को विस्तार से साझा किया जाता है। इन विवरणों में, उदाहरण के लिए, विभिन्न निर्माताओं द्वारा प्रदान किए गए सेल कल्चर प्लास्टिक और मीडिया की पसंद शामिल है, क्योंकि यह10,11,12 प्राप्त संस्कृतियों की विशेषताओं को प्रभावित करने के लिए पाया गया था। यह अनुभव और संस्कृति प्रक्रियाओं के विवरण साझा करने के महत्व पर जोर देता है, क्योंकि ऐसी अंतर्दृष्टि के अभाव में, परिणाम प्रभावित हो सकते हैं और / या विभिन्न प्रयोगशालाओं में सत्यापन प्रयासों में बाधा आ सकती है।

मानव फेफड़ों के उपकला में विभिन्न सेल प्रकार शामिल हैं, जिनमें बेसल कोशिकाएं, सिलिएटेड कोशिकाएं, गोब्लेट कोशिकाएं और क्लब कोशिकाएं जैसे प्रमुख प्रकार शामिल हैं। विट्रो में वायुमार्ग में उपकला कोशिका परत की मज़बूती से नकल करने के लिए, इन सेल प्रकारों को संस्कृति मॉडल में दर्शाया जाना चाहिए, और उनके ध्रुवीकरण और कार्यको 13,14,15,16 बनाए रखा गया। यह एहसास कि दाता विशेषताओं (रोग की स्थिति सहित) और कोशिकाओं की शारीरिक उत्पत्ति (यानी, नाक, श्वासनली, बड़े और छोटे वायुमार्ग) कोशिका संस्कृति की सेलुलर संरचना और कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं, समान रूप से महत्वपूर्ण है। प्रासंगिक विशेषज्ञता और अभ्यास प्राथमिक वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को सफलतापूर्वक कल्चर करने और संस्कृति की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए सहज रूप से (संस्कृति के दौरान दृश्य निरीक्षण द्वारा) और मात्रात्मक रूप से एक शर्त है। इस योगदान का उद्देश्य प्राथमिक मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (पीबीईसी) के अलगाव और संस्कृति के लिए एक लागत और समय प्रभावी विधि प्रदान करना है जिसे श्वासनली और छोटे वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की संस्कृति पर भी लागू किया जा सकता है। ऐसी कोशिकाओं को फेफड़े के ऊतकों से अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करने के अलावा, विस्तार और बायोबैंकिंग के लिए एक विधि, और अंत में उचित लागत और समय अवधि के भीतर एक अच्छी तरह से विभेदित एएलआई-संस्कृति की स्थापना और लक्षण वर्णन के लिए प्रस्तुत और चर्चा की जाती है।

Protocol

नीदरलैंड के लीडेन यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर में फेफड़ों के कैंसर के लिए रिसेक्शन सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से प्राप्त मैक्रोस्कोपिक रूप से सामान्य फेफड़ों के ऊतकों से कोशिकाओं को अलग किया गया था। जिन रोगियों से यह फेफड़े का ऊतक प्राप्त किया गया था, उन्हें ऐसे ऊतक (www.coreon.org) के कोडित गुमनाम उपयोग के लिए एक नो-ऑब्जेक्शन सिस्टम के माध्यम से बायोबैंक में नामांकित किया गया था। हालांकि, 01-09-2022 से, रोगियों को संस्थागत चिकित्सा नैतिक समिति (बी 20.042/एबी / एबी और बी 20.042 / केबी / केबी) द्वारा अनुमोदन के साथ एलयूएमसी बायोबैंक से स्थानीय नियमों के अनुसार सक्रिय सूचित सहमति का उपयोग करके बायोबैंक में नामांकित किया गया है।

नोट: सभी प्रक्रियाओं को स्थानीय जैविक सुरक्षा नियमों के अनुसार, जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है, और सर्जिकल दस्ताने और लैब कोट पहनते समय बाँझ कामकाजी परिस्थितियों में, जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी मीडिया, अभिकर्मकों और अन्य समाधानों के लिए, कृपया सामग्री की तालिका और पूरक तालिका 1 देखें। कृपया विस्तृत प्रोटोकॉल चरणों के लिए चित्र 1 देखें

1. मानव फेफड़ों के ऊतकों से ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं का अलगाव

नोट: ब्रोन्कियल उपकला कोशिका अलगाव के लिए एक इष्टतम सफलता दर प्राप्त करने के लिए, उत्पादित ब्रोन्कियल रिंग को प्राइमोसिन के साथ फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (पीबीएस) में अधिकतम 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जलमग्न रखा जाना चाहिए।

  1. प्रक्रिया शुरू होने से पहले तैयारी
    1. पीबीएस में एक कोटिंग समाधान तैयार करें, जैसा कि पूरक तालिका 1 में वर्णित है, और प्रति कुएं 1.5 एमएल कोटिंग समाधान के साथ 6-वेल प्लेटों की उचित संख्या को कोट करें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: लेपित किए जाने वाले कुओं की संख्या उत्पादित ऊतक के आकार पर निर्भर करती है। एक मोटे दिशानिर्देश के रूप में, चार 6-वेल प्लेटों को लेपित किया जाता है जब एक्साइज्ड ब्रोन्कियल रिंग व्यास में 10 मिमी और चौड़ाई में 4 मिमी होती है।
    2. पूरक तालिका 1 में वर्णित के रूप में पूर्ण केराटिनोसाइट सीरम-मुक्त माध्यम (सी-केएसएफएम) तैयार करें; 6-वेल प्लेट के प्रति कुएं में 2 मिलीलीटर मध्यम का उपयोग करें।
      नोट: इस सी-केएसएफएम को 7 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। सी-केएसएफएम एक कम कैल्शियम वाला माध्यम है जिसका उपयोग वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं के विस्तार के लिए किया जाता है, जबकि दूषित फाइब्रोब्लास्ट के विकास को रोकता है।
  2. 10 सेमी पेट्री डिश में 10 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस में अंगूठी को धीरे से धोकर ब्रोन्कियल रिंग को साफ करें। अंगूठी को ध्यान से पकड़ने के लिए चिमटी का उपयोग करें (केवल बाहर स्पर्श करें), और किसी भी अतिरिक्त संयोजी ऊतक और रक्त अवशेषों को हटाने के लिए छोटी कैंची का उपयोग करें। आगे की प्रक्रिया के लिए, अंगूठी को दो में काट लें।
    नोट: प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों को उपयोग से पहले निष्फल किया जाना चाहिए।
  3. ब्रोन्कियल रिंग के दो हिस्सों को हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में प्रोटीज XIV (1.8 मिलीग्राम / एमएल) के एक पूर्वगर्म घोल के 10 मिलीलीटर में डुबोएं, जिसमें एक बंद बाँझ कंटेनर में प्रिमोसिन शामिल है, और सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ठीक 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: एचबीएसएस का उपयोग प्रोटीज XIV के लिए 2 घंटे की इनक्यूबेशन अवधि के दौरान ऊतक से कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक डिल्यूएंट के रूप में किया जाता है। एचबीएसएस एक संतुलित आइसोटोनिक समाधान है जो अल्पकालिक ऊष्मायन के दौरान सेल व्यवहार्यता के रखरखाव को सक्षम बनाता है।
  4. इनक्यूबेशन के बाद, ऊतक के टुकड़ों को 10 मिलीलीटर गर्म पीबीएस के साथ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और सेल समाधान प्राप्त करने के लिए बेंट चिमटी का उपयोग करके अंगूठी के अंदर खुरच ें।
    नोट: ऊतक नरम और कुछ हद तक विस्तारित दिखाई देता है।
  5. अंगूठी को त्याग दें, सेल समाधान को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 50 एमएल की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए गर्म पीबीएस जोड़ें। 230 x g पर और कमरे के तापमान (RT) पर 7 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  6. सतह पर तैरने वाला पदार्थ डालें और 10 मिलीलीटर गर्म पीबीएस में गोली को फिर से निलंबित करें। इसके अलावा, गर्म पीबीएस के साथ 50 एमएल तक की मात्रा बनाएं। आरटी पर 230 x g पर 7 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  7. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें और प्रिमोसिन युक्त गर्म सी-केएसएफएम की उचित मात्रा में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
    नोट: प्रिमोसिन का उपयोग किसी भी बैक्टीरिया, कवक, या (महत्वपूर्ण रूप से) माइकोप्लाज्मा को खत्म करने के लिए न्यूनतम 7 दिनों के लिए किया जाता है जो ऊतक में मौजूद हो सकता है; 7 दिनों के बाद, माध्यम में केवल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ना पर्याप्त है।
  8. 6-वेल प्लेटों से कोटिंग समाधान को एस्पिरेट करें और प्रति अच्छी तरह से 2 एमएल सेल सस्पेंशन जोड़ें।
  9. कोशिकाओं को तब तक बढ़ने दें जब तक कि 80% से 90% कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाए और प्रति सप्ताह तीन बार माध्यम बदलें (उदाहरण के लिए, हर सोमवार, बुधवार और शुक्रवार)। कॉन्फ्लुएंसी की वांछित डिग्री आमतौर पर 7 से 14 दिनों के बीच पहुंच जाती है; यदि वांछित प्रवाह तक पहुंचने के लिए आवश्यक समय 14 दिनों से अधिक है, तो कोशिकाओं को छोड़ दें।
    नोट: पहले कुछ दिनों में, केवल थोड़ी संख्या में कोशिकाएं प्रसार शुरू करती हैं; कोशिकाओं के समूह कुछ दिनों के बाद ध्यान देने योग्य होते हैं।

2. मानव प्राथमिक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (पीबीईसी) का क्रायोप्रिजर्वेशन।

नोट: -80 डिग्री सेल्सियस और -196 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ काम करते समय, क्रायो-दस्ताने का उपयोग सुरक्षा के लिए किया जाता है, और चिमटी का उपयोग जमे हुए शीशियों को स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है। तरल नाइट्रोजन के साथ काम करते समय, क्रायो-दस्ताने और एक फेस-शील्ड का उपयोग व्यक्तिगत सुरक्षा के लिए किया जाता है।

  1. माध्यम को एस्पिरेट करें और प्रति कुएं 2 मिलीलीटर गर्म पीबीएस के साथ एक बार कुओं को धो लें।
  2. प्रति अच्छी तरह से नरम ट्रिप्सिन के 0.5 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज्ड करें (नरम ट्रिप्सिन समाधान की संरचना के लिए पूरक तालिका 1 देखें)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 से अधिकतम 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। प्लेट में ट्रिप्सिन घोल को घुमाएं और प्लेट को धीरे से टैप करके कोशिकाओं को छोड़ दें।
  3. अलग की गई कोशिकाओं को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1.1 मिलीग्राम / एमएल सोयाबीन ट्रिप्सिन अवरोधक (एसबीटीआई; ट्रिप्सिन गतिविधि को रोकने के लिए) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ केएसएफएम में भंग होता है। एसबीटीआई की मात्रा नरम ट्रिप्सिन की कुल मात्रा से दोगुनी होनी चाहिए (यानी, 1 एमएल प्रति कुआं)।
    नोट: एसबीटीआई को सीधे कुओं में न जोड़ें, क्योंकि कोशिकाएं मिनटों के भीतर फिर से जुड़ जाएंगी।
  4. आरटी पर 230 x g पर 7 मिनट के लिए ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. सतह पर तैरने वाला पदार्थ छोड़ दें और पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त आरटी केएसएफएम के 10 मिलीलीटर में पेलेट कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें लेकिन कोई अन्य योजक नहीं। हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। 1: 1 अनुपात में ट्राइपैन ब्लू जोड़कर एक जीवित / मृत सेल गिनती करें, या एक वैकल्पिक जीवित / मृत सेल गिनती प्रक्रिया का उपयोग करें।
  6. क्रायोप्रिजर्व कोशिकाओं को 400,000 कोशिकाओं प्रति एमएल फ्रीजिंग माध्यम की एकाग्रता पर संरक्षित करता है (संरचना के लिए पूरक तालिका 1 देखें) और प्रति क्रायोवियल इस निलंबन के 1 एमएल जोड़ें। क्रायोवियल को एक कूलसेल कंटेनर में स्थानांतरित करें और इसे -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। 24 घंटे के बाद, शीशियों को दीर्घकालिक भंडारण के लिए -196 डिग्री सेल्सियस तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
    नोट: कोशिकाओं को ठंड माध्यम में स्थानांतरित करने के लिए दो विकल्प संभव हैं, जिनमें से दोनों अच्छी तरह से काम करते हैं: 1) सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को फिर से पेलेट करें और आवश्यक सेल एकाग्रता पर कोल्ड फ्रीजिंग माध्यम में पुन: निलंबित करें; या 2) कोल्ड फ्रीजिंग माध्यम जोड़ें और केएसएफएम की मात्रा के आधार पर क्रायोप्रेसर्वेंट (डाइमिथाइल सल्फोक्साइड [डीएमएसओ]) की एकाग्रता को समायोजित करें जिसमें कोशिकाएं मौजूद हैं।

3. क्रायोसंरक्षित पीबीईसी को पिघलाना और उन्हें इंसर्ट पर संस्कृति के लिए उगाना।

  1. ढक्कन को कसकर बंद करके पीबीएस में 10 एमएल कोटिंग समाधान के साथ रात भर टी 75 सेल कल्चर फ्लास्क कोट करें। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  2. क्रायोसंरक्षित पीबीईसी को पिघलाने से पहले, फ्लास्क से कोटिंग समाधान को हटा दें और इसे 10 एमएल सी-केएसएफएम से भरें। इसे सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म होने दें, इनक्यूबेटर को हवा में जाने देने के लिए थोड़ा खुले ढक्कन के साथ।
  3. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पानी- या मोती-स्नान में जल्दी से पिघलाएं।
    नोट: संदूषण के कम जोखिम और कम ऊर्जा खपत के कारण पानी-स्नान पर एक मोती-स्नान पसंद किया जाता है।
  4. मध्यम (चरण 3.2) के साथ पूर्व-गर्म टी 75 फ्लास्क में क्रायोवियल की पूरी सामग्री जोड़ें और कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करें।
    नोट: इस स्तर पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज न करें, क्योंकि वे सेंट्रीफ्यूजेशन चरण से बच नहीं पाएंगे।
  5. लगभग 4 घंटे के बाद, सुनिश्चित करें कि कोशिकाएं पर्याप्त रूप से जुड़ी हुई हैं। माध्यम को 10 एमएल ताजा, गर्म सी-केएसएफएम के साथ बदलें।
    नोट: इस तरह, फ्रीजिंग माध्यम से डीएमएसओ को हटा दिया जाता है। फ्लास्क में कोशिकाओं को बोने के बाद यह चरण 4 घंटे और 24 घंटे के बीच होना चाहिए।
  6. कोशिकाओं को तब तक बढ़ाएं जब तक कि 80% से 90% कंफ्लुएंसी तक न पहुंच जाए, हर सोमवार, बुधवार और शुक्रवार को माध्यम बदलें।

4. प्राथमिक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (एएलआई-पीबीईसी) के साथ एक वायु-तरल इंटरफ़ेस संस्कृति की स्थापना

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया 11.9 मिमी आंतरिक व्यास प्रविष्टियों पर पीबीईसी की संस्कृति के लिए है।

  1. प्रति सम्मिलित 0.4 एमएल कोटिंग समाधान के साथ उचित संख्या में सेल कल्चर इंसर्ट को कोट करें। सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. पूरक तालिका 1 में वर्णित पूर्ण बीडी माध्यम (सीबीडी माध्यम) तैयार करें।
    नोट: सीबीडी माध्यम एक समग्र माध्यम है ( पूरक तालिका 1 देखें) जो लंबे समय तक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के विकास का समर्थन करने के लिए तैयार किया गया है, जबकि एएलआई में रेटिनोइक एसिड (आरए) (या वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले आरए के एनालॉग) एकाग्रता और संस्कृति में वृद्धि के बाद उनके भेदभाव की अनुमति देता है, जैसा कि चरण 4.10 में उल्लिखित है।
  3. प्रति फ्लास्क 2 एमएल नरम ट्रिप्सिन का उपयोग करके, टी 75 फ्लास्क में पीबीईसी को ट्रिप्सिनाइज्ड करें। कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देने के लिए कोशिकाओं को 5 से 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (दृश्य निरीक्षण के आधार पर)। 5 मिनट के इनक्यूबेशन के बाद, फ्लास्क में ट्रिप्सिन को घुमाकर और फ्लास्क को धीरे से टैप करके कोशिकाओं की टुकड़ी की सुविधा प्रदान करें (यदि आवश्यक हो तो दोहराएं)।
  4. फ्लास्क में एसबीटीआई के 4 एमएल जोड़ें और सेल सस्पेंशन को सीधे 25 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: कोशिकाएं मिनटों के भीतर पुन: संलग्न होती हैं। इसलिए, एक से अधिक फ्लास्क के साथ काम करते समय, चरण 4.4 में प्राप्त सेल निलंबन को दूसरे फ्लास्क में एसबीटीआई जोड़ने से पहले सीधे सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। प्रक्रिया में, अधिकतम पांच फ्लास्क एक साथ संसाधित किए जाते हैं।
  5. आरटी पर 230 x g पर 7 मिनट के लिए ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
  6. सीबीडी माध्यम के 6 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और हेमोसाइटोमीटर या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। उदाहरण के लिए, 1: 1 अनुपात में ट्राइपैन ब्लू जोड़कर, या किसी अन्य जीवित / मृत सेल गिनती प्रक्रिया का उपयोग करके एक जीवित / मृत सेल गिनती करें।
  7. सेल कल्चर इंसर्ट से कोटिंग समाधान निकालें।
  8. चरण 4.6 में उत्पन्न सेल निलंबन को पतला करें, सीबीडी माध्यम के साथ 1 एनएम ईसी 23 के साथ 80,000 कोशिकाओं प्रति एमएल की एकाग्रता के लिए पूरक करें, और डालने में झिल्ली के शीर्ष पर 0.5 एमएल जोड़ें। सम्मिलित के नीचे कुएं में 1 एनएम ईसी 23 के साथ पूरक सीबीडी माध्यम का 1.5 एमएल जोड़ें।
  9. सप्ताह में तीन बार 1 एनएम ईसी 23 के साथ पूरक सीबीडी माध्यम के साथ माध्यम बदलें जब तक कि संस्कृतियां हवा के संपर्क के लिए तैयार न हों (यानी, 100% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने के 2 दिन बाद)। हर बार, माध्यम का 0.5 मिलीलीटर डालने के अंदर (कोशिकाओं पर) जोड़ा जाता है और 1.5 एमएल नीचे के डिब्बे (कुएं) में जोड़ा जाता है।
    नोट: सामान्य तौर पर, सेल परत आवेषण पर पीबीईसी को सीडिंग करने के लगभग 5 दिन बाद 100% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती है। कोशिकाओं के संयोजन के दृश्य निरीक्षण के आधार पर, कोशिकाओं को 2 दिन बाद एएलआई चरण में स्थानांतरित करने का निर्णय लिया जाता है।
  10. जब कोशिकाएं एएलआई में स्थानांतरण के लिए तैयार हों (यानी, 100% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने के 2 दिन बाद), तो माध्यम को आवेषण और कुएं से हटा दें, डालने के अंदर नया माध्यम न जोड़ें, और केवल कुएं में नया माध्यम (सीबीडी माध्यम का 1 एमएल 50 एनएम ईसी 23 के साथ पूरक) जोड़ें। सप्ताह में तीन बार कुओं में माध्यम बदलें।
  11. अतिरिक्त बलगम और सेलुलर मलबे को हटाने के लिए, धीरे से डालने के अंदर सेल परत के एपिकल साइड पर 200 μL गर्म पीबीएस जोड़ें (अधिमानतः डालने के पक्ष के माध्यम से और सीधे कोशिकाओं पर पाइप िंग द्वारा नहीं) और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, अतिरिक्त बलगम और सेलुलर मलबे को हटाने के लिए पीबीएस को एस्पिरेट करें।
    नोट: इस बिंदु से आगे (एएलआई संस्कृति की शुरुआत), निचले डिब्बे के माध्यम को बदलने से पहले, हर बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं के एपिकल पक्ष को धोएं।
  12. यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी प्रमुख सेल प्रकारों का प्रतिनिधित्व किया जाता है, कम से कम 2 सप्ताह के लिए एएलआई में कोशिकाओं को कल्चर करें।

5. मिश्रित दाता आबादी से एक ALI-PBEC संस्कृति की स्थापना

  1. मिश्रित आबादी से पीबीईसी संस्कृतियों को शुरू करने के लिए पांच अलग-अलग दाताओं की कोशिकाओं का उपयोग करें।
  2. चरण 4.7 में उत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग करके प्रति दाता समान संख्या में कोशिकाओं को मिलाएं ताकि प्रति सम्मिलित कुल 150,000 कोशिकाओं तक पहुंचा जा सके (यानी, पांच दाताओं का उपयोग करते समय प्रति दाता 30,000 कोशिकाएं)। यह सुनिश्चित करेगा कि सम्मिलित में प्रसार न्यूनतम रखा जाता है और व्यक्तिगत दाताओं से समान संख्या में कोशिकाएं संस्कृति में मौजूद होती हैं।
  3. चरण 4.9-4.12 में वर्णित ALI-PBEC संस्कृति को जारी रखें।

6. ALI-PBEC संस्कृति का गुणवत्ता नियंत्रण

  1. सेल कल्चर के दौरान ट्रांस एपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईआर) की निगरानी
    नोट: वोल्टोहममीटर का उपयोग करने के आधार पर विद्युत प्रतिरोध माप, ALI-PBEC संस्कृति के दौरान किसी भी समय किया जा सकता है और हर बार समान शर्तों के तहत एक ही प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है, क्योंकि विद्युत प्रतिरोध माप इलेक्ट्रोड स्थिति, तापमान, माध्यम और हैंडलिंग सहित विभिन्न चर से प्रभावित होता है। टीईआर की गणना ओम के नियम के आधार पर निम्नलिखित सूत्र को लागू करके मापा विद्युत प्रतिरोध का उपयोग करके की जा सकती है: Equation 1, जिसमें आरएम मापा विद्युत प्रतिरोध है, आरबी कोटिंग और कोशिकाओं के बिना एक सम्मिलित का आधारभूत विद्युत प्रतिरोध है, और एसए सम्मिलित17 की झिल्ली का सतह क्षेत्र है।
    1. कोशिकाओं पर बलगम और मलबे को हटाने के लिए सेल परत के एपिकल पक्ष में धीरे से गर्म पीबीएस के 200 μL जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए इंसर्ट को इनक्यूबेट करें और पीबीएस को फिर से हटा दें।
    2. धीरे से सेल परत के एपिकल पक्ष में गर्म पीबीएस के 700 μL जोड़ें और माप के लिए तापमान के स्थिरीकरण की अनुमति देने के लिए आरटी पर 10 मिनट के लिए सम्मिलित करें।
    3. 1,000 Ω परीक्षण प्रतिरोधक का उपयोग करके वोल्टोहममीटर को कैलिब्रेट करें, ओम को मापने के लिए वोल्टोमीटर सेट करें, और 1,000 Ω तक सेट होने तक "आर एडीजे" अंशांकन पेंच को समायोजित करने के लिए स्क्रू-ड्राइवर का उपयोग करें।
    4. इलेक्ट्रोड को बाँझ पानी (आरटी) में कुछ बार ऊपर और नीचे ले जाकर और फिर बाँझ पीबीएस (आरटी) में कुल्ला करें।
    5. आवेषण में सेल परत के विद्युत प्रतिरोध को मापें। इसके लिए, इलेक्ट्रोड को प्लेट के निचले हिस्से को छूने वाले इलेक्ट्रोड की लंबी बांह के साथ कुएं में एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में रखें। इस तरह, छोटी बांह डालने के अंदर सेल परत के ऊपर है। वोल्टोमीटर पर प्रदर्शित मान पढ़ें।
      नोट: प्रदर्शित मान पूरी तरह से स्थिर नहीं होगा; मान को उस क्षण पढ़ें जब मान आंतरायिक है।
    6. माप के बीच, इलेक्ट्रोड को बाँझ पीबीएस (आरटी) में कुछ बार ऊपर और नीचे ले जाकर साफ करें।
    7. माप समाप्त होने पर इलेक्ट्रोड को बाँझ पानी (आरटी), बाँझ पीबीएस (आरटी), और 70% इथेनॉल (आरटी) में कुछ बार ऊपर और नीचे ले जाकर साफ करें। इलेक्ट्रोड को सूखा स्टोर करें।
    8. एक सम्मिलित (कोटिंग के बिना) और कोशिकाओं का आधारभूत माप करें, जिसमें डालने के अंदर 700 μL गर्म PBS और कुएं में गर्म PBS का 1 मिलीलीटर जोड़ा जाए और अन्य आवेषण के साथ विद्युत प्रतिरोध को मापा जाए।
  2. ALI-PBEC संस्कृति की सेलुलर संरचना का मूल्यांकन
    1. एएलआई चरण के दौरान, बीटिंग सिलिया का नेत्रहीन आकलन करके भेदभाव की जांच करें। इन्हें कोशिकाओं के एपिकल पक्ष पर हवा के संपर्क में आने के 9 दिन बाद मानक ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखा जा सकता है।
      नोट: एपिकल सतह को धोने के बाद बीटिंग सिलिया सीधे दिखाई देती है। गोब्लेट कोशिकाएं बलगम का उत्पादन करती हैं, और इसलिए बलगम की उपस्थिति, जैसा कि एपिकल सतह की धुलाई के दौरान देखा जाता है, एक संकेत है कि गोब्लेट कोशिकाएं बनती हैं। हालांकि, गोब्लेट कोशिकाओं का स्तर और उत्पादित बलगम की मात्रा अत्यधिक दाता-निर्भर है। सम्मिलित में कोशिका परत की एपिकल सतह को धोने के बाद पीबीएस को उत्तेजित करते समय बलगम की उपस्थिति देखी जा सकती है; इस मामले में, एस्पिरेटेड पीबीएस अधिक चिपचिपा होता है, और श्लेष्म धागे को एस्पिरेटिंग के दौरान देखा जा सकता है।
    2. इम्यूनोस्टेनिंग और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी या फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस), या वास्तविक समय-मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण का उपयोग करके सेलुलर संरचना का मूल्यांकन संस्कृति की भेदभाव स्थिति पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है, लेकिन इसका विवरण इस योगदान के दायरे से परे है।

Figure 1
चित्रा 1: प्राथमिक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के अलगाव, विस्तार और संस्कृति प्रक्रिया का योजनाबद्ध अवलोकन। (ए) फेफड़ों के ऊतकों को कैंसर रिसेक्शन सर्जरी के दौरान प्राप्त किया जाता है और रोगविज्ञानी ब्रोन्कियल रिंग ऊतक का उत्पादन करता है जो मैक्रोस्कोपिक रूप से सामान्य और ट्यूमर मुक्त होता है। (बी) ब्रोन्कियल रिंग को साफ किया जाता है और सेल परत को अलग करने और अलग करने के लिए एंजाइमेटिक उपचार के संपर्क में लाया जाता है। (सी) पुनर्प्राप्त सेल निलंबन को धोया जाता है और कोशिकाओं को विस्तार के लिए 6-वेल प्लेट के कुओं में वितरित किया जाता है। (डी) प्रिमोसिन के साथ सी-केएसएफएम में पृथक कोशिकाओं के पर्याप्त विस्तार पर, सेल परतों को ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा अलग कर दिया जाता है और क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए कोशिकाओं को फ्रीजिंग माध्यम में फिर से निलंबित कर दिया जाता है। जब आवश्यक हो, क्रायोसंरक्षित कोशिकाओं को पिघलाया जाता है और सेल कल्चर फ्लास्क में पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ सी-केएसएफएम का उपयोग करके फिर से विस्तारित किया जाता है। विस्तार के बाद, उन्हें सेल कल्चर इंसर्ट पर सीबीडी माध्यम में बीज दिया जाता है; (ई) ALI-PBEC संस्कृति दो मुख्य चरणों में होती है: सीबीडी माध्यम में जलमग्न चरण 1 एनएम ईसी 23 के साथ पूरक होता है जब तक कि कोशिकाएं पूर्ण संगम तक नहीं पहुंच जाती हैं, इसके बाद विभेदन की अनुमति देने के लिए एएलआई में एपिकल माध्यम और संस्कृति को हटा दिया जाता है; इस एएलआई चरण में, कोशिकाओं को सीबीडी माध्यम में 50 एनएम ईसी 23 के साथ पूरक किया जाता है। (ईबी) बेसल कोशिकाओं का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व जो जलमग्न संस्कृति के दौरान सम्मिलित को कवर करता है। (ईसी) ईसी 23 की बढ़ी हुई सांद्रता की उपस्थिति में एएलआई में कल्चर के बाद प्राप्त विभेदित उपकला कोशिका परत का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

जलमग्न संस्कृति का उपयोग करके विस्तार
यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग करके, तरल नाइट्रोजन में दीर्घकालिक भंडारण के लिए एक 6-वेल प्लेट से 400,000 कोशिकाओं / क्रायोवियल के साथ औसतन आठ क्रायोवियल प्राप्त किए जा सकते हैं (चित्रा 2 ए)। इसे प्राप्त करने के लिए, माइक्रोबियल (विशेष रूप से माइकोप्लाज्मा) संदूषण को बाहर करने के लिए प्रिमोसिन की उपस्थिति में कम से कम 7 दिनों और अधिकतम 14 दिनों (चित्रा 2 बी) के लिए पृथक पीबीईसी को 6-वेल प्लेटों में संवर्धित किया जाता है। चित्रा 2 ए, बी विभिन्न दाताओं से विभिन्न अलगाव ों के बीच प्राप्त सेल संख्याओं और आवश्यक संस्कृति समय में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। तरल नाइट्रोजन में भंडारण के लिए ट्रिप्सिनाइजेशन द्वारा कोशिकाओं की कटाई से पहले, कंफ्लुएंसी 80% से अधिक होनी चाहिए। यदि यह 14 दिनों के भीतर प्राप्त नहीं होता है, तो कोशिकाओं को क्रायोसंरक्षित नहीं किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण रूप से, भंडारण और पासिंग के लिए कटाई करते समय, सेल परत का प्रवाह ~ 95% से अधिक नहीं होना चाहिए (चित्रा 2 सी)। तरल नाइट्रोजन में भंडारण के बाद, कोशिकाओं को पिघलाया जा सकता है और विस्तार के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है जब तक कि एएलआई संस्कृतियों के लिए पर्याप्त सेल संख्या प्राप्त न हो जाए। इस स्तर पर कोशिकाओं के विस्तार के लिए उपयोग किया जाने वाला माध्यम सी-केएसएफएम है, जैसा कि ब्रोन्कियल रिंग18 से फसल के बाद प्रारंभिक संस्कृति के दौरान होता है। हालांकि इस स्तर पर प्रिमोसिन की कोई आवश्यकता नहीं है, क्योंकि फेफड़ों के ऊतकों से उत्पन्न होने वाले अतिरिक्त माइक्रोबियल संदूषण का जोखिम अनुपस्थित है, और इसलिए प्रिमोसिन को पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के लिए बदला जा सकता है। यह माध्यम फाइब्रोब्लास्ट ्स पर उपकला कोशिकाओं का पक्ष लेता है और इसलिए फाइब्रोब्लास्ट 19,20,21 को तेजी से बढ़ाकर संस्कृति के संभावित अतिवृद्धि को रोकता है। सी-केएसएफएम माध्यम का उपयोग करके, कोशिकाएं फ्लास्क में फैल जाती हैं और एक दूसरे से कनेक्ट नहीं होती हैं, जो सीबीडी माध्यम (चित्रा 2 डी, ई) में इस स्तर पर जलमग्न सुसंस्कृत कोशिकाओं की आकृति विज्ञान से स्पष्ट रूप से अलग है। टी 75 फ्लास्क में पिघली हुई कोशिकाओं को संवर्धित करने के 5 या 6 दिनों के बाद, सेल परत 80% -95% कॉन्फ्लुएंट होनी चाहिए, जो कुल मिलाकर लगभग 3 x 106 कोशिकाओं का अनुवाद करती है (चित्रा 2 एफ)। इससे, एएलआई संस्कृति के लिए लगभग 75 आवेषण (12-वेल प्लेट आकार) उत्पन्न किए जा सकते हैं।

इस योगदान में वर्णित अलगाव और संस्कृति के लिए विधि को शुरुआती सामग्री के रूप में ब्रोन्कियल बायोप्सी या ब्रोन्कियल ब्रश के साथ उपयोग के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले और बाद में बेसल सेल विस्तार। कोशिकाओं को वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार अलग किया गया था और सी-केएसएफएम का उपयोग करके सुसंस्कृत किया गया था। प्रति दाता उत्पन्न कोशिकाओं की संख्या की निगरानी की गई थी, 6-वेल प्लेटों (प्रोटोकॉल के चरण 2) से मार्ग 0 (पी 0) कोशिकाओं की कटाई करते समय एक स्वचालित सेल काउंटर (ए) का उपयोग करके लाइव सेल गणना की गई थी, एन = 123 दाताओं, सेल गिनती को प्रति कुएं काटी गई कोशिकाओं की संख्या के रूप में प्रस्तुत किया गया था; प्रत्येक बिंदु एक दाता का प्रतिनिधित्व करता है और माध्य को क्षैतिज पट्टी द्वारा इंगित किया जाता है। (बी) गुणवत्ता नियंत्रण के भाग के रूप में, 6-वेल प्लेटों में 80% से 90% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने के लिए आवश्यक पी 0 कोशिकाओं के समय की निगरानी की गई और सी-केएसएफएम (एन = 127 विभिन्न दाताओं) में जलमग्न संस्कृति शुरू करने के बाद के दिनों के रूप में दिखाया गया। प्रत्येक व्यक्तिगत दाता को एक बिंदु द्वारा इंगित किया जाता है, 1 दिन से संबंधित सभी बिंदु एक रेखा में विलय हो जाते हैं; लाइन जितनी व्यापक होगी, उतने ही अधिक दाताओं के लिए खड़ा होगा; कोशिकाओं की संस्कृति में दिनों की औसत संख्या एक पतली क्षैतिज पट्टी द्वारा इंगित की जाती है। (सी) पी0 कोशिकाओं की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवि सी-केएसएफएम में डूबी हुई थी, जिस समय कोशिकाओं को दीर्घकालिक क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए काटा गया था। (डी) सी-केएसएफएम में डूबे हुए पी 1 कोशिकाओं की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवि उस समय कोशिकाओं को काटा गया और डालने के लिए स्थानांतरित किया गया और (ई) पी 1 कोशिकाएं सीबीडी माध्यम में जलमग्न हो गईं। (एफ) टी 75 फ्लास्क (प्रोटोकॉल के खंड 4), एन = 63 विभिन्न दाताओं से पी 1 कोशिकाओं की कटाई करते समय एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके प्रति दाता उत्पन्न जीवित कोशिकाओं की संख्या की निगरानी की गई थी; सेल गिनती को प्रति टी 75 फ्लास्क में कोशिकाओं की संख्या के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, प्रत्येक दाता को एक डॉट द्वारा इंगित किया जाता है, और औसत सेल गिनती को क्षैतिज बार द्वारा इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एयर-लिक्विड इंटरफेस (ALI) संस्कृति
एएलआई संस्कृति शुरू करने के 7 दिनों बाद, सेल परत के विद्युत प्रतिरोध को मापा जाता है और 300 Ω से अधिक होना चाहिए (चित्रा 3 ए); यदि यह हासिल नहीं किया जाता है, तो तंग जंक्शन गठन की संभावित कमी के कारण संस्कृति को विफल माना जाता है। उदाहरण के लिए, धोने और आकांक्षा के दौरान सेल परत को नुकसान के परिणामस्वरूप व्यक्तिगत इंसर्ट में उपकला परत को नुकसान के कारण कम टीईआर मान प्राप्त करने की संभावना को बाहर करने की सिफारिश की जाती है। यह संस्कृति सम्मिलित के दृश्य सूक्ष्म निरीक्षण द्वारा जांचा जा सकता है। हमारे अनुभव में, विद्युत प्रतिरोध में अंतर-दाता परिवर्तनशीलता महत्वपूर्ण हो सकती है (चित्रा 3 बी), जिसे साहित्य14 में भी बताया गया है, और जैसा कि देखा गया है कि डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) की उत्पत्ति से भी स्पष्ट रूप से प्रभावित है (चित्रा 3 सी)।

Figure 3
चित्रा 3: एएलआई-पीबीईसी संस्कृतियों के गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में ट्रांस-उपकला विद्युत प्रतिरोध। पीबीईसी को अलग और विस्तारित किया गया था, और अच्छी तरह से विभेदित ALI-PBEC संस्कृतियों की स्थापना की गई थी। संस्कृति के दौरान कई समय बिंदुओं पर, विद्युत प्रतिरोध मापा गया था, और बाद में टीईआर की गणना की गई थी (Ω.सेमी 2)। (ए) एएलआई के बाद 14 दिनों के दौरान विद्युत प्रतिरोध मापा गया था। n = 4 अलग-अलग दाता। डेटा को मानक विचलन (एसडी) ± औसत मान के रूप में दर्शाया गया है। (बी) एएलआई-पीबीईसी सेल कल्चर गुणवत्ता नियंत्रण के हिस्से के रूप में, विद्युत प्रतिरोध को दिन 7 (एन = 50) और दिन 14 पोस्ट-एएलआई (एन = 25) पर मापा गया था; प्रत्येक बिंदु एक दाता का प्रतिनिधित्व करता है और औसत टीईआर (Ω.सेमी2) को क्षैतिज पट्टी द्वारा इंगित किया जाता है। डेटा को एक गैर-पैरामीट्रिक मैन-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग करके महत्व के लिए परीक्षण किया गया था, और कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया था। (ग) टीईआर गठन पर प्रभाव का आकलन करने के लिए तीन अलग-अलग डीएमईएम आपूतकर्ताओं के मीडिया का परीक्षण किया गया। एन = 4 अलग-अलग दाता; माध्य मान SD ± दर्शाए गए हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एक अच्छी तरह से विभेदित ALI-PBEC संस्कृति की स्थापना करते समय, वायु जोखिम की शुरुआत से, आरए की एकाग्रता22 बढ़ जाती है। इस तरह, कोशिकाएं प्रसार से म्यूकोसिलरी भेदभाव में बदल जाती हैं, जो ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके हवा के संपर्क में आने के 9 दिनों (दाता-निर्भर) के रूप में दिखाई देती है। पहली सिलिया की गति इस बिंदु पर दिखाई देती है, और कुछ हद तक पहले जब विभेदित ल्यूमिनल कोशिकाओं के मार्करों की जीन अभिव्यक्ति पर आधारित होती है23 (चित्रा 4)।

जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है, मध्यम परिवर्तन के दौरान एपिकल सतह को धोते समय बलगम उत्पादन भी देखा जा सकता है। आरए प्रकाश के प्रति बहुत संवेदनशील है, जो एक ही स्टॉक एकाग्रता पर अत्यधिक परिवर्तनशील गतिविधि की ओर जाता है। इस कारण से, आरए को सिंथेटिक आरए एनालॉग ईसी 23 द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है और उसी एकाग्रता में उपयोग किया जाता है, प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित समान परिणामों के साथ। इस कारण से और प्रक्रिया को बदलने से बचने के लिए, चयनित ईसी 23 एकाग्रता को आरए एकाग्रता (यानी, 50 एनएम) के बराबर रखा गया था जो पहले24,25 (चित्रा 5) का उपयोग किया गया था। चित्रा 5 ए ईसी 23 की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करते समय प्राप्त टीईआर मूल्यों को दर्शाता है, परीक्षण की गई सांद्रता की इस सीमा के भीतर 50 एनएम पर अधिकतम टीईआर दिखाता है। चित्रा 5 बी में दिखाए गए परिणाम पुष्टि करते हैं कि 50 एनएम ईसी 23 या आरए का उपयोग करते समय सिलिएटेड और गोब्लेट कोशिकाओं के लिए मार्करों की जीन अभिव्यक्ति समान होती है। जलमग्न अवस्था में संस्कृति के दौरान ईसी 23 की भी आवश्यकता होती है (हालांकि बहुत कम सांद्रता पर), क्योंकि इस जलमग्न चरण में इसे छोड़ने और केवल एएलआई चरण में इसे जोड़ने से एक ऐसी संस्कृति होती है जो कभी भी पूर्ण सामंजस्य तक नहीं पहुंचती है। दृश्यमान सिलिअरी बीटिंग गतिविधि और बलगम उत्पादन के साथ एक अच्छी तरह से विभेदित ALI-PBEC संस्कृति उत्पन्न करने के लिए आवश्यक समय लगभग 14 दिन है, और इसलिए अधिकांश प्रयोग 14-21 दिन की ALI संस्कृतियों के बीच शुरू किए जाते हैं (चित्रा 4)। सभी प्रमुख विभिन्न सेल प्रकार (बेसल, सिलिएटेड, गोब्लेट और क्लब कोशिकाएं) एएलआई संस्कृति के 14 दिनों पर देखे जाते हैं, हालांकि अभिव्यक्ति के स्तर अत्यधिक दाता-निर्भर हैं। यह क्रमशः25,26 बेसल, सिलिएटेड, गोब्लेट और क्लब कोशिकाओं के मार्करों का पता लगाने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिदीप्ति (आईएफ) धुंधला करके पी 63, α-ट्यूबुलिन, म्यूक 5 एसी और सीसी -16 के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी का उपयोग करके आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा टीपी 63, फॉक्सजे 1, एमयूसी 5 एसी और SCGB1A1 की जीन अभिव्यक्ति का आकलन करके प्रदर्शित किया जाता है।. हालांकि, अधिकांश प्रयोगों के लिए 14-21 दिनों को अंगूठे का नियम माना जा सकता है, चुनिंदा प्रयोगों के लिए, भेदभाव की लंबी अवधि पर विचार किया जा सकता है, जैसा कि ज़ेनोबायोटिक चयापचय, सार्स-सीओवी-2 संक्रमण और म्यूकोसिलरी क्लीयरेंस 27,28,29 के मूल्यांकन के लिए पाया जाता है।

Figure 4
चित्रा 4: एयर-लिक्विड इंटरफेस (एएलआई) संस्कृति। पीबीईसी को अलग और विस्तारित किया गया था, और अच्छी तरह से विभेदित ALI-PBEC संस्कृतियों की स्थापना की गई थी। एएलआई के बाद 14 दिनों के दौरान एएलआई-पीबीईसी संस्कृतियों की निगरानी की गई। एएलआई के बाद 0, 7 और 14 दिनों में आरएनए के अलगाव के लिए सेल संस्कृतियों का विश्लेषण किया गया था। दो अलग-अलग दाताओं के डेटा दिखाए गए हैं, प्रत्येक बिंदु समय के साथ निगरानी किए गए एक व्यक्तिगत दाता का प्रतिनिधित्व करता है, और औसत को क्षैतिज पट्टी द्वारा इंगित किया जाता है। बेसल, सिलिएटेड, गोब्लेट और क्लब सेल मार्करों (क्रमशः टीपी 63, फॉक्सजे 1, एमयूसी 5 बी और SCGB1A1) की जीन अभिव्यक्ति को क्यूपीसीआर द्वारा मापा गया था और आरपीएल 13 ए और एटीपी 5 बी जीन अभिव्यक्ति के लिए सामान्यीकृत किया गया था (विवरण के लिए संदर्भ 23 देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: रेटिनोइक एसिड (आरए) और इसके सिंथेटिक एनालॉग ईसी 23 की तुलना। पीबीईसी को अलग और विस्तारित किया गया था, और अच्छी तरह से विभेदित ALI-PBEC संस्कृतियों की स्थापना की गई थी। पीबीईसी संस्कृतियों के वायु संपर्क की शुरुआत पर, आरए (50 एनएम) को ईसी 23 की विभिन्न सांद्रता द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था। (A ) विद्युत प्रतिरोध को ALI के बाद 14 वें दिन मापा गया था और बाद में TEER की गणना (Ω.सेमी 2), n =2 दाताओं के रूप में की गई थी, सलाखों में SD ± औसत मूल्य दर्शाया गया था। ( B) ALI के बाद 14 वें दिन, सेल कल्चर को QPCR का उपयोग करके क्रमशः सिलिएटेड और गोब्लेट कोशिकाओं (FOXJ1, MUC5AC) के लिए क्रमशः सिलिएटेड और गोब्लेट कोशिकाओं (FOXJ1, MUC5AC) के लिए आरएनए अलगाव और बाद में सेल मार्करों के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए व्यवस्थित किया गया था। और RPL13A (n = 3 दाताओं) के लिए सामान्यीकृत। 50 एनएम आरए के साथ संवर्धित ALI-PBEC के खिलाफ एक गुना वृद्धि दिखाई गई है और एसडी ± औसत मान के रूप में दर्शाया गया है। (विवरण के लिए संदर्भ 23 देखें) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पिछले वर्षों में, संस्कृति प्रणाली में वैकल्पिक उत्पादों के प्रदर्शन की जांच की गई है, जैसे कि मीडिया और संस्कृति प्लास्टिक। इस तरह के मूल्यांकन के विभिन्न कारण थे, जिनमें निर्माताओं द्वारा मध्यम संरचना में बदलाव, नए मीडिया की पेशकश, साथ ही कोविड-19 महामारी (2020-2022) के दौरान उत्पादों की कमी शामिल थी। अवलोकन किया गया था कि विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं के समान उत्पादों के परिणामस्वरूप उपकला कोशिका प्रकारों के मार्करों के मूल्यांकन के आधार पर विभेदित उपकला कोशिका संस्कृतियां होती हैं, हालांकि अंतिम सेलुलर संरचना काफी भिन्न हो सकती है (चित्रा 6 ए), जबकि टीईआर में अंतर कम स्पष्ट थे (चित्रा 6 बी)। दूसरी ओर, विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं के माध्यम के परिणामस्वरूप सेलुलर संरचना में पर्याप्त अंतर हुआ; विभिन्न ब्रांडों से आवेषण का उपयोग करते समय, ऐसे अंतर सीमित थे (चित्रा 6 सी)। विशेष रूप से, स्टेमसेल टेक्नोलॉजीज से वायुमार्ग उपकला कोशिका संस्कृति माध्यम न्यूमाकल्ट का उपयोग करते समय, एक अलग आकृति विज्ञान और दृश्य शील सिलिअरी गतिविधि का अधिक तेजी से गठन देखा गया था। इन टिप्पणियों के अलावा, टीईआर मूल्यों में अंतर और सीबीडी माध्यम की तुलना में एएलआई-पीबीईसी की सेलुलर संरचना में अंतर भी नोट किया गया था (चित्रा 6 डी)।

Figure 6
चित्रा 6: उपकला कोशिका माध्यम और सेल कल्चर सम्मिलित के विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं की तुलना करना। पीबीईसी को अलग-थलग, विस्तारित और अच्छी तरह से विभेदित ALI-PBEC संस्कृतियों की स्थापना की गई थी। (ए) एएलआई-पीबीईसी को 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था, और फिर आरएनए अलगाव के लिए सेल परतों को व्यवस्थित किया गया था। बेसल, सिलिएटेड, गोब्लेट और क्लब सेल मार्करों (क्रमशः टीपी 63, फॉक्सजे 1, एमयूसी 5 एसी और SCGB1A1) की जीन अभिव्यक्ति को क्यूपीसीआर द्वारा मापा गया और आरपीएल 13 ए और एटीपी 5 बी के लिए सामान्यीकृत किया गया। एन = 2 दाता; (B) ALI ±के बाद 9 दिनों के दौरान, विद्युत प्रतिरोध मापा गया और बाद में TEER की गणना की गई (Ω.cm2)। एन = 3 अलग-अलग दाता; (सी) एएलआई-पीबीईसी को तीन अलग-अलग आपूर्तिकर्ताओं ±से खरीदे गए सेल कल्चर इंसर्ट का उपयोग करके 14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था, और फिर सेल परतों को आरएनए अलगाव के लिए व्यवस्थित किया गया था। सिलिएटेड, गोब्लेट और क्लब सेल मार्करों (क्रमशः FOXJ1, MUC5AC और SCGB1A1) की जीन अभिव्यक्ति को QPCR द्वारा मापा गया और RPL13A के लिए सामान्यीकृत किया गया। एन = 18 अलग-अलग दाताओं, सलाखों ने एसडी ± औसत मूल्य को दर्शाया है। डेटा को एक-तरफ़ा एनोवा गैर-पैरामीट्रिक क्रुस्कल-वालिस परीक्षण का उपयोग करके महत्व के लिए परीक्षण किया गया था और कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया था। (घ) एएलआई-पीबीईसी को एएलआई के बाद 14 दिनों के लिए या तो सीबीडी माध्यम या न्यूमाकल्ट माध्यम (एसटीईएमसेल प्रौद्योगिकियों) में संवर्धित किया गया था, और फिर कोशिका परतों को आरएनए अलगाव के लिए व्यवस्थित किया गया था। बेसल, सिलिएटेड, गोब्लेट और क्लब सेल मार्करों (क्रमशः टीपी 63, फॉक्सजे 1, एमयूसी 5 बी, और SCGB1A1) की जीन अभिव्यक्ति को क्यूपीसीआर द्वारा मापा गया था और आरपीएल 13 ए के लिए सामान्यीकृत किया गया था (सलाखों एसडी ± औसत मूल्य को दर्शाते हैं), और विद्युत प्रतिरोध को 5 और 12 दिनों के बाद एएलआई में मापा गया था और टीईआर (Ω सेमी2) की गणना करने के लिए उपयोग किया गया था। n = 2; माध्य मान एसडी ± दर्शाया गया है (विवरण के लिए संदर्भ 23 देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधान और मीडिया की संरचना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के फेफड़े के ऊतकों से अलगाव का वर्णन करता है, भेदभाव क्षमता के नुकसान के बिना कोशिकाओं के इष्टतम विस्तार के लिए एक विधि, एक क्रायोप्रिजर्वेशन प्रक्रिया, और अच्छी तरह से विभेदित एएलआई-पीबीईसी संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए एक प्रक्रिया। इसके अलावा, गुणवत्ता नियंत्रण का विवरण प्रदान किया जाता है, साथ ही विभेदित ALI-PBECs की निगरानी और मूल्यांकन के लिए निर्देश भी दिए जाते हैं।

वर्णित प्रोटोकॉल एक मैक्रोस्कोपिक रूप से सामान्य, ट्यूमर-मुक्त ब्रोन्कियल रिंग से शुरू होता है जिसे उनके फेफड़ों के कैंसर के निदान से संबंधित सर्जरी से गुजरने वाले रोगियों से फेफड़ों के लोब से निकाला जाता है। इसलिए यह ध्यान देने की आवश्यकता है कि इन छल्ले को सख्ती से स्वस्थ ऊतक के रूप में नहीं माना जा सकता है, जो इसलिए सेल संस्कृति विशेषताओं को प्रभावित कर सकता है। ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए वैकल्पिक स्रोतों में ब्रोन्कियल बायोप्सी, ब्रोन्कियल ब्रशिंग, या प्रत्यारोपण दाता या प्राप्तकर्ता फेफड़ों से ऊतक का उपयोग करना शामिल है। स्रोत के बावजूद, फेफड़ों के ऊतकों का उपयोग करते समय, माइक्रोबियल संदूषण के जोखिम पर विचार किया जाना चाहिए, और इसलिए सेल संस्कृति के माइक्रोबियल संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए विभिन्न संस्कृति मीडिया में एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग किया जाता है। विशेष रूप से, माइकोप्लाज्मा सेल कल्चर में एक उच्च और सामान्य जोखिम है, क्योंकि सेल कल्चर पर इसके व्यापक प्रकार के प्रभाव, सेल कल्चर में आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिरोध, और तथ्य यह है कि माइकोप्लाज्मा संदूषण की पुष्टि केवल माइकोप्लाज्मा डिटेक्शन परख द्वारा की जा सकती है। इसलिए, फेफड़ों के ऊतकों से कोशिकाओं के अलगाव के बाद सेल कल्चर के प्रारंभिक चरण में, व्यापक स्पेक्ट्रम रोगाणुरोधी सूत्रीकरण प्रिमोसिन का उपयोग किया जाता है, और संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, यादृच्छिक रूप से चयनित नमूनों को माइकोप्लाज्मा की उपस्थिति के लिए परीक्षण किया जाता है।

ब्रोन्कियल रिंग से शुरू होने वाली अलगाव प्रक्रिया भेदभाव क्षमता से समझौता किए बिना एएलआई में संस्कृतियों को शुरू करने के लिए आवश्यक इन प्राथमिक कोशिकाओं के विस्तार की डिग्री की अनुमति देने के लिए पर्याप्त प्रारंभिक सामग्री प्रदान करती है। हालांकि, सीमित संख्या में कोशिकाओं के साथ पृथक उपकला कोशिकाओं का विस्तार शुरू करने से पर्याप्त कोशिकाओं के साथ पर्याप्त संख्या में आवेषण प्राप्त करने में समस्याएं हो सकती हैं जिन्हें एएलआई संस्कृति के लिए बीज दिया जा सकता है। विस्तारित संस्कृति और प्राथमिक कोशिकाओं के बार-बार पासिंग के परिणामस्वरूप प्रतिकृति शिथिलता हो सकती है। इस सीमा को दूर करने के लिए विभिन्न समाधान प्रस्तावित किए गए हैं। होरानी एट अल ने दिखाया कि रो काइनेज इनहिबिटर (रॉक) वाई -27632 ने बेसल कोशिकाओं के प्रसार में वृद्धि की 30, मौ एट अल ने विभेदित उपकला कोशिका परत 31 की विशेषताओं को बनाए रखते हुए बेसल स्टेम कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए दोहरे स्मैड निषेध का उपयोग किया, और सैक्स एट अल ने एक वायुमार्ग ऑर्गेनॉइड प्रणाली विकसित की है जिसका उपयोग वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं का विस्तार करने और कई मार्गों के दौरान उनकी भेदभाव क्षमता को बनाए रखने के लिए किया जा सकता है।. बाद की विधि का उपयोग बहुत कम कोशिका संख्या वाले स्रोतों से कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए भी किया गया था, जैसे कि प्रीटरम शिशुओं (<28 सप्ताह की गर्भावस्था आयु) से श्वासनली एस्पाइरेट्स (टीए) और ब्रोन्कोएल्वोलर लैवेज (बीएएल) तरल पदार्थ, जैसाकि यहां वर्णित है। यह पाया गया कि बीएएल और टीए से अलग की गई कोशिकाओं ने एक विभेदन क्षमता दिखाई जो ब्रोन्कियल ऊतक से उत्पन्न कोशिकाओं के समान थी, हालांकि अंतर तब देखा गया जब भेदभाव नॉच सिग्नलिंग अवरोध या टीएच 2 साइटोकिन आईएल -1333 का उपयोग करके अधिक सिलिएटेड या अधिक गोब्लेट सेल युक्त संस्कृतियों की ओर झुका हुआ था। इसलिए यह अनुशंसा की जाती है कि यदि ALI-PBECs को समान दृष्टिकोण ों का उपयोग करके कम उपकला कोशिका संख्या ओं के साथ एक प्रारंभिक सामग्री से संवर्धित किया जाता है, तो हमेशा बुनियादी गुणवत्ता मानदंडों के लिए संस्कृतियों की जांच करें, जैसा कि प्रोटोकॉल के खंड 6 में चर्चा की गई है। महत्वपूर्ण रूप से, फीडर कोशिकाओं का उपयोग बड़ी सेल संख्या प्राप्त करने में भी मदद कर सकता है, जो प्रत्यारोपण योग्य मचान इंजीनियरिंग के लिए एक सेटिंग में आवश्यक है जहां समय और सेल संख्या आवश्यक है। यह एक अध्ययन द्वारा चित्रित किया गया है जिसमें ऑटोलॉगस उपकला कोशिकाओं को श्वासनली रोग वाले रोगी से प्राप्त बायोप्सी से संवर्धित किया गया था और कोशिकाओं को एक मुराइन भ्रूण फीडर परत (माइटोटिक रूप से निष्क्रिय 3 टी 3-जे 2 फाइब्रोब्लास्ट) और रोड / रॉक मार्ग (वाई -27632) के उपर्युक्त अवरोधक की उपस्थिति में तेजी से विस्तारित किया गया था। परिणामी सेल कल्चर को श्वासनली मचानों के पुनर्जनन के लिए उपयोगी पाया गया, और इस प्रकार इसे प्रत्यारोपण मॉडल के लिए एक उपयुक्त प्रोटोकॉल के रूप में देखा जा सकता है।

इस योगदान में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, लेकिन अन्य संस्कृति प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, अनिवार्य रूप से एक चयन पूर्वाग्रह पेश किया जाता है। यह महसूस करना महत्वपूर्ण है कि प्रोटोकॉल विवरण में अंतर, जैसे कि संस्कृतियों को शुरू करने के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की उत्पत्ति, मध्यम संरचना, और अन्य प्रोटोकॉल विवरण, संस्कृतियों की सेलुलर संरचना में परिवर्तन का कारण बन सकते हैं और इस प्रकार एएलआई संस्कृति33,35 की प्रतिक्रिया में परिवर्तन हो सकते हैं। इसके अलावा, वायुमार्ग कोशिकाओं10,11 को अलग करने के लिए विभिन्न मीडिया की तुलना करते समय सेल गुणों में अंतर भी देखा गया है। न्यूमाकल्ट और सीबीडी माध्यम की तुलना करते समय, गोब्लेट सेल और क्लब सेल एमआरएनए मार्करों, टीईआर मूल्यों और सेल परत मोटाई में अंतर देखा गया। इन टिप्पणियों के आधार पर, सांख्यिकीय आधार की कमी के बावजूद, उपयोग किए गए दाताओं की कम संख्या के कारण, मध्यम संरचना ग्राहकों के लिए अज्ञात है, और न्यूमाकल्ट माध्यम की उच्च लागत, सीबीडी माध्यम का उपयोग करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में निर्णय लिया गया था।

जैसा कि चर्चा की गई है, कोशिकाओं को शुरू में ऑर्गनॉइड कल्चर का उपयोग करके विस्तारित किया जा सकता है और बाद में 2 डी एएलआई इंसर्ट सिस्टम में स्थानांतरित किया जा सकता है। यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि वायुमार्ग उपकला ऑर्गेनोइड ्स वायुजनित पदार्थों के संपर्क में आने के लिए उपयुक्त नहीं हैं, जबकि एएलआई 2 डी प्रणाली का उपयोग सुसंस्कृत वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं पर सिगरेट के धुएं23,36 जैसे वायुजनित पदार्थों के प्रभाव के मूल्यांकन की अनुमति देता है। एएलआई वायुमार्ग उपकला कोशिका संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक अलग दृष्टिकोण मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (एचआईपीएससी) 37 के भेदभाव द्वारा वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को उत्पन्न करना है। ऐसे प्रोटोकॉल में, समीपस्थ वायुमार्ग पूर्वजों के भेदभाव के बाद भेदभाव प्रोटोकॉल के अंतिम चरण में, कोशिकाओं को यहां वर्णित प्रक्रियाओं के समान प्रक्रियाओं का उपयोग करके एएलआई में कल्चर द्वारा विभेदित किया जा सकता है।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, ALI में संस्कृति के लिए cBD माध्यम का उपयोग किया जाता है। सीबीडी माध्यम एक सीरम-मुक्त माध्यम है जिसे विभिन्न पूरक ों के मिश्रण को जोड़कर तैयार किया जाता है, जो फुलचर एट अल .38 के साथ-साथ अन्य अध्ययनों से प्रेरित है। पूरक समाधान में 52 μg / mL गोजातीय पिट्यूटरी अर्क (BPE), 0.5 μg / mL हाइड्रोकार्टिसोन, 0.5 ng / mL मानव ईजीएफ, 0.5 μg / mL एपिनेफ्रीन, 10 μg / mL ट्रांसफरिन, 5 μg / mL इंसुलिन, 6.5 ng / mL ट्राइआयोडोथायरोनिन, और 0.1 ng / mL RA39 शामिल हैं। चूंकि बीपीई एक ऊतक अर्क है और बैच वार भिन्नता के अधीन है, इसलिए माध्यम को पूरी तरह से परिभाषित माध्यम नहीं माना जा सकता है, न ही यह पशु-मुक्त है। सेल कल्चर माध्यम जो पूरी तरह से परिभाषित है, बैच से बैच मतभेदों को कम करने के लिए पसंद किया जाता है। पशु-मुक्त अनुसंधान में संक्रमण को देखते हुए, यह महत्वपूर्ण है कि परिभाषित मीडिया के उत्पादन के लिए प्रयास किए जाएं जिनमें पशु उत्पाद शामिल नहीं हैं और जो वैज्ञानिक समुदाय के लिए सस्ती हैं।

अनुसंधान प्रश्न के आधार पर एएलआई मॉडल के आधार पर विभिन्न प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यौगिकों के प्रभाव की जांच करने के लिए जो भेदभाव प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं, इसे जलमग्न संस्कृति के विभिन्न चरणों के दौरान, भेदभाव के दौरान, या अच्छी तरह से विभेदित चरण में संस्कृति में यौगिकों को जोड़कर संबोधित किया जा सकता है। ALI-PBEC संस्कृति की सेलुलर संरचना विशिष्ट यौगिकों को जोड़कर प्रभावित की जा सकती है; उदाहरण के लिए, आईएल -13 की उपस्थिति में एएलआई-पीबीईसी को अलग करने से अधिक गोब्लेट कोशिकाओं और कम सिलिएटेड कोशिकाओं के साथ एक संस्कृति उत्पन्न होती है, जबकि भेदभाव के दौरान γ-स्रावी अवरोधक डीएपीटी (नॉच सिग्नलिंग को अवरुद्ध करने के लिए उपयोग किया जाता है) के साथ उपचार के परिणामस्वरूप गोब्लेट कोशिकाओं 23,40,41,42 की कीमत पर अधिक सिलिएटेड कोशिकाओं के साथ एक संस्कृति होती है।

इसके अलावा, कोशिकाओं को उत्तेजित करने या कुछ प्रक्रियाओं को अवरुद्ध करने के लिए एजेंटों को या तो बेसल डिब्बे पर या (बहुत कम मात्रा में) संस्कृति के एपिकल डिब्बे पर लागू किया जा सकता है। कोशिकाओं को एपिकल पक्ष से हवाई पदार्थों के संपर्क में भी लाया जा सकता है। इस तरह के एक्सपोजर डिजाइनों का उपयोग पीबीईसी 23,43,44 पर डीजल निकास या पूरे सिगरेट के धुएं के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया गया है। बेसल साइड पर स्रावित प्रोटीन की निगरानी के लिए माध्यम को हर बार बदला जा सकता है; बेसल माध्यम को ताज़ा करते समय पीबीएस के साथ धोए जाने वाले कोशिकाओं के एपिकल पक्ष के लिए भी यही लागू होता है। तथाकथित एपिकल वॉश काटा जाता है और वैकल्पिक डिथियोएरिथ्रिटोल (डीटीई) को बलगम को अलग करने के लिए जोड़ा जाता है जो गोब्लेट कोशिकाओं द्वारा अधिक कुशलता से उत्पादित होता है। सेल लाइसेट को कुल प्रोटीन, आरएनए और क्रोमोसोमल और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के अलगाव के लिए प्राप्त किया जा सकता है। प्लास्टिक डालने से पॉलीथीन टेरेफ्थेलेट (पीईटी) झिल्ली को काटकर और इस झिल्ली को कई इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलाकरने के लिए छोटे टुकड़ों में काटकर, विशिष्ट मार्करों के लिए एंटीबॉडी का उपयोग करके कोशिकाओं का आगे अध्ययन किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रवाह साइटोमेट्री या एफएसीएस का उपयोग आवेषण में कोशिकाओं के ट्रिप्सिनाइजेशन के बाद भी किया जा सकता है। एएलआई चरण के दौरान, सेलुलर अवरोध के विकास की निगरानी विद्युत प्रतिरोध को मापकर और बाद में टीईआर की गणना करके की जा सकती है, जहां विद्युत प्रतिरोध झिल्ली डालने के सतह क्षेत्र के व्युत्क्रमानुपाती होता है। गणना निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके ओम के नियम पर आधारित है: Equation 1, जिसमें आरएम मापा विद्युत प्रतिरोध है, आरबी कोटिंग और कोशिकाओं के बिना एक सम्मिलित का आधारभूत विद्युत प्रतिरोध है, और एसए सम्मिलित की झिल्ली का सतह क्षेत्र है। चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड का उपयोग करके विद्युत प्रतिरोध को मापना सीधा है लेकिन कुएं में पेश करते समय प्रक्रियाओं को संभालने पर अत्यधिक निर्भर है। इसके अलावा, इलेक्ट्रोड के आकार को अपेक्षाकृत बड़े सतह क्षेत्र17 के बाधा समारोह के माप को प्रभावित करने का सुझाव दिया गया है।

सटीक ऊतक प्रतिनिधित्व बढ़ाने के उद्देश्य से एएलआई सेल कल्चर सिस्टम में और सुधार में अतिरिक्त सेल प्रकार के कोकल्चर शामिल हैं, जैसे ल्यूकोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट या एंडोथेलियल कोशिकाएं46,47,48। यह देखा गया है कि ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) या एम-सीएसएफ-विभेदित मैक्रोफेज के साथ एएलआई-पीबीईसी की सह-संस्कृति जन्मजात उपकला प्रतिक्रियाओं और मरम्मतको स्पष्ट रूप से प्रभावित करती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ऐसे कोकल्चर मॉडल में, मध्यम संगतता एक मुद्दा हो सकती है। चूंकि वायुमार्ग उपकला कोशिका संस्कृति के लिए उपयोग किया जाने वाला माध्यम विशेष रूप से पीबीईसी के लिए विकसित किया गया है और अन्य सेल प्रकारों के लिए बेहतर रूप से अनुकूल नहीं हो सकता है, इसलिए अनुकूलन आवश्यक है। वायुमार्ग जीव विज्ञान के क्षेत्र में देखी गई एक अन्य प्रकार की प्रगति जिसके लिए पृथक पीबीईसी का उपयोग किया जा सकता है, ऑर्गन्स-ऑन-चिप्स (ओओसी) तकनीक49,50 का उपयोग है। इस तकनीक का उपयोग करके, श्वास और रक्त प्रवाह की यांत्रिक शक्तियों, जैसे खिंचाव, हवा और मध्यम प्रवाह के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है।

विभिन्न दाताओं से पीबीईसी का उपयोग करते समय अंतर-दाता परिवर्तनशीलता महत्वपूर्ण हो सकती है, और इसलिए उपकला कोशिका संस्कृति अध्ययनों में इस परिवर्तनशीलता के लिए कई दाताओं से कोशिकाओं का उपयोग करने पर विचार करना महत्वपूर्ण है। चूंकि ALI-PBECs की संस्कृति समय लेने वाली है और काफी लागत ों से जुड़ी है, इसलिए एक सेल कल्चर इंसर्ट में विभिन्न दाताओं से कोशिकाओं को मिलाकर ALI-PBEC संस्कृतियों को स्थापित करने के विकल्प की जांच की जाती है। इस तरह, विभिन्न व्यक्तिगत दाताओं से प्राप्त संस्कृतियों की प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने से पहले, प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग करके पायलट प्रयोग आसानी से किए जा सकते हैं। इसके अलावा, विभिन्न विशेषताओं (जैसे, विभिन्न आयु वर्ग या लिंग) वाले दाताओं को एक्सप्लोरेटिव अध्ययन के लिए समूहीकृत किया जा सकता है। दाता मिश्रण का उपयोग करते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि विभिन्न दाताओं की समान सेल संख्या मौजूद है, इस संभावना को रोकने के लिए कि एक दाता उच्च प्रसार दर के परिणामस्वरूप परिणामों पर हावी है। इसलिए, अलग-अलग दाताओं की कोशिकाओं को अलग से विस्तारित किया जाता है और एक व्यक्तिगत दाता से सीडिंग कोशिकाओं की तुलना में सम्मिलित में उच्च घनत्व पर बीज दिया जाता है, ताकि एएलआई में संक्रमण से पहले सम्मिलित में प्रसार को कम किया जा सके। सार्स-सीओवी-2 के संक्रमण कैनेटीक्स का अध्ययन करके दाता मिश्रण और संबंधित व्यक्तिगत दाताओं की प्रतिक्रियाओं की तुलना की गई। आरटी-क्यूपीसीआर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग का उपयोग करते हुए, यह देखा गया कि दाता मिश्रण ने उत्पादित वायरस कणों की समान संख्या औरसंक्रमित कोशिकाओं की समान संख्या दिखाकर विभिन्न व्यक्तिगत दाताओं का एक अच्छा प्रतिनिधित्व प्रदान किया।

पशु मॉडल के लिए एक स्वीकार्य विकल्प बनने के लिए, सुसंस्कृत ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं का जीन संपादन संभव होनाचाहिए। एएलआई-पीबीईसी में छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (एसआईआरएनए) का उपयोग करके आरएनए हस्तक्षेप प्रौद्योगिकी की जांच की जाती है, हालांकि चूंकि कोशिकाओं को संस्कृति के जलमग्न चरण के दौरान सीआरएनए के साथ स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है, इसलिए लंबी संस्कृति अवधि के कारण एएलआई संस्कृति के दौरान वध को पर्याप्त रूप से बनाए नहीं रखा जाता है, जब तक कि संस्कृतिके दौरान सीआरएनए अभिकर्मक को अक्सर दोहराया न जाए।. फिर भी, जलमग्न बेसल कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए एसआईआरएनए का सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। अन्य लोगों ने राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) वितरण के साथ प्राथमिक एएलआई वायुमार्ग उपकला कोशिका संस्कृतियों में जीन संपादन प्राप्त करने के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 तकनीक का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। ऐसी तकनीकों का उपयोग करते समय, यह आवश्यक है कि कोशिकाएं अपनी पूर्ण भेदभाव क्षमता बनाए रखें। क्योंकि प्राथमिक वायुमार्ग कोशिका संस्कृतियों को अनिश्चित काल तक पारित नहीं किया जा सकता है, जीन संपादित कोशिकाओं का क्लोनल विस्तार आसान नहीं है और संक्रमित कोशिकाओं का चयन करने के लिए माध्यम को जोड़ना बोझिल है। इसलिए, सभी सुसंस्कृत कोशिकाओं में वांछनीय वध प्राप्त करना मुश्किल है। नॉकआउट क्लोन उत्पन्न करने का एक विकल्प HIPSC54 में नॉक-आउट रणनीतियों का उपयोग और वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग है। एक और, यद्यपि उप-मानक, विकल्प जीन-संपादित कोशिकाओं55 का क्लोनल रूप से विस्तार करने के लिए एक अमर पीबीईसी लाइन स्थापित कर रहा है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक अच्छी तरह से विभेदित स्यूडोस्ट्रेटिफाइड एएलआई-पीबीईसी उत्पन्न करने का एक तरीका है, लेकिन प्रस्तुत प्रोटोकॉल की तुलना में छोटे और बड़े अंतर के साथ ऐसी संस्कृति को स्थापित करने के लिए अन्य प्रोटोकॉल भी पाए गए हैं। हमारी राय में, संस्कृति विधियों के प्रयोगशाला सत्यापन और कड़े गुणवत्ता नियंत्रण एएलआई-पीबीईसी प्रणाली और वायुमार्ग उपकला कोशिकाओं की समान संस्कृति प्रणालियों के लिए आवश्यक हैं, ताकि पशु प्रयोगों के लिए एक वैध विकल्प बन सके।

Disclosures

लेखक ों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का कोई प्रासंगिक टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस योगदान में वर्णित मॉडल का उपयोग करने वाले अध्ययनों को विभिन्न वित्त पोषण संगठनों द्वारा समर्थित किया गया है, जिसमें लंग फाउंडेशन नीदरलैंड, नीदरलैंड ऑर्गनाइजेशन फॉर हेल्थ रिसर्च एंड डेवलपमेंट (ज़ोनएमडब्ल्यू, सीओवीआईडी -19 एमकेएमडी अनुदान), डच सोसाइटी फॉर द रिप्लेसमेंट ऑफ एनिमल टेस्टिंग (स्टिचिंग प्रोएफडियरवरिज, अनुदान # 114025007), साथ ही बोहरिंगर इंगेलहेम और गैलापागोस जैसी कंपनियों से अनुसंधान अनुदान शामिल हैं। चित्र 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 ohm test resistor World Precision Instruments N/A Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter
4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) Tocris 4011 Used in cBD medium
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3506 Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring 
Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit PromoCell C-21160 Used to compare to cBD medium
Bead Bath 20 Liter Lab Armor 74220-720 Used to pre-warm cell culture solutions
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit LONZA CC-3170 Used to compare to cBD medium
Bovine albumin fraction V (BSA) Thermo Fisher Scientific 15260037 Used in coating solution
Bovine pituitary extract (BPE) Thermo Fisher Scientific 37000-015 Used in c-KSFM
Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) ScienCell Research Laboratories 3262 Used in cBD medium
Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) ScienCell Research Laboratories SCC3211-b Used in cBD medium
Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert Corning 3460 Cell culture inserts used in the protocol
Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear CellQART made by SABEU 9310412 Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts
Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts Greiner Bio-One 82050-032 Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts
CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 Greiner Bio-One 658170 Used to expand the number cells
CFX Maestro 1.0 Bio-Rad N/A Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System
CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855484 qPCR detection system
Chopstick electrode set World Precision Instruments STX2 Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC
CO2-Incubator PHCbi MCO-170AICUV-PE Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures
CO2-Incubator Hereaus Heracell 150 Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures
Coolcell Container Corning 432006 Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2
Countess 3 Automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX2000 Used to count cells and determine the cell concentration
Cryovials Nalgene 479-3224 Used to cryopreserve cells in
D-Glucose Avantor VWR BDH CHEMICALS 101174Y Used in soft trypsin
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Avantor VWR 0231 Used in cell freeze medium
dNTP (10 mM) Promega U1515 Used in the synthesis of cDNA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose STEMCELL Technologies 36250 Used in cBD medium
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine LONZA LOBE12-604F Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate Thermo Fisher Scientific 41966029 Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers 
Epidermal growth factor (EGF) Thermo Fisher Scientific 37000-015 Used in c-KSFM
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Avantor VWR BDH CHEMICALS 443885J Used in soft trypsin
EVOM2 Epithelial Voltohmmeter World Precision Instruments 91799 Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC
Fibronectin solution, Human  PromoCell C-43060 Used in coating solution
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050038 Used in cBD medium
Hanks balanced salt solution (HBSS) ScienCell Research Laboratories SCC0313 Used to dissolve protease XIV 
IQ SYBR Green Super mix Bio-Rad 170887 qPCR reagent
Isoproterenol hydrochloride, (-)- Sigma-Aldrich I-6504 Used in c-KSFM
Keratinocyte-SFM (KSFM) Thermo Fisher Scientific 17005-034 Used in c-KSFM
Maxwell RSC Instrument Promega AS4500 Automated RNA isolation system
Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit Promega AS1340 Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument
M-MLV Reverse transcriptase Promega M5301 Used in the synthesis of cDNA
M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer Promega M531A Used in the synthesis of cDNA
MycoStrip InvivoGen rep-mys-10 Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) Thermo Fisher Scientific 15630056 Used in cBD medium
Oligo(dT)15 Qiagen 79237 Used in the synthesis of cDNA
Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) ScienCell Research Laboratories SCC0513 Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium
Phosphate buffered saline (PBS) LUMC pharmacy N/A Used in different steps of the protocol
Pneumacult-ALI Medium STEMCELL Technologies 05002 Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium
Pneumacult-Ex Plus Medium STEMCELL Technologies 05040 Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium
Primer, ATP5B, forward Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA
Primer, ATP5B, reverse Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT
Primer, FOXJ1, forward Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA
Primer, FOXJ1, reverse Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC
Primer, MUC5AC, forward Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC
Primer, MUC5AC, reverse Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG
Primer, MUC5B, forward Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT
Primer, MUC5B, reverse Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG
Primer, RPL13A, forward Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG
Primer, RPL13A, reverse Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC
Primer, SCGB1A1, forward Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC
Primer, SCGB1A1, reverse Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA
Primer, TP63, forward Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG
Primer, TP63, reverse Integrated DNA Technologies N/A Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG
Primocin InvivoGen ant-pm-2 Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium
Protease XIV Sigma-Aldrich P5147 Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring
RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor Promega N2515 Used in the synthesis of cDNA
Soybean trypsin inhibitor (SBTI) Sigma-Aldrich T9128 Used to inhibit the action of soft trypsin
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096 Used in the synthesis of cDNA
TissueSAFE plus MILESTONE MEDICAL N/A Vacuum transfer system for biological specimens
Trypan blue solution Thermo Fisher Scientific 15250061 Used to count live- and dead cells 
Trypsin 1:250 Thermo Fisher Scientific 27250-018 Used in soft trypsin
Type I collagen solution (PureCol) Advanced BioMatrix 5005-B Used in coating solution
Universal container, PP, with PE screw cap Avantor VWR 216-2053 Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 195
बायोबैंकिंग के लिए कटे हुए फेफड़ों के ऊतकों से ब्रोन्कियल एपिथेलियल कोशिकाओं को अलग करना और अच्छी तरह से विभेदित वायु-तरल इंटरफ़ेस संस्कृतियों की स्थापना करना
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Ninaber, D. K., van der Does, A. M., … More

Ninaber, D. K., van der Does, A. M., Hiemstra, P. S. Isolating Bronchial Epithelial Cells from Resected Lung Tissue for Biobanking and Establishing Well-Differentiated Air-Liquid Interface Cultures. J. Vis. Exp. (195), e65102, doi:10.3791/65102 (2023).

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