Summary
Presentert her er en reproduserbar, rimelig og robust metode for isolering og utvidelse av primære bronkiale epitelceller for langsiktig biobanking og generering av differensierte epitelceller ved kultur ved luft-væske-grensesnittet.
Abstract
Luftveisepitelcellelaget danner den første barrieren mellom lungevev og ytre miljø og utsettes dermed konstant for innåndede stoffer, inkludert smittestoffer og luftforurensende stoffer. Luftveisepitellaget spiller en sentral rolle ved en lang rekke akutte og kroniske lungesykdommer, og ulike behandlinger rettet mot dette epitelet gis ved innånding. Å forstå epitelets rolle i patogenesen og hvordan det kan målrettes mot terapi krever robuste og representative modeller. In vitro epitelkulturmodeller blir i økende grad brukt og gir fordelen av å utføre eksperimenter i et kontrollert miljø, utsette cellene for forskjellige typer stimuli, toksiske stoffer eller smittsomme stoffer. Bruken av primære celler i stedet for immortaliserte eller tumorcellelinjer har fordelen at disse cellene skiller seg i kultur til et pseudostratifisert polarisert epitelcellelag med en bedre representasjon av epitelet sammenlignet med cellelinjer.
Presentert her er en robust protokoll, som har blitt optimalisert de siste tiårene, for isolasjon og kultur av luftveisepitelceller fra lungevev. Denne prosedyren tillater vellykket isolering, ekspansjon, kultur og mukociliær differensiering av primære bronkiale epitelceller (PBECs) ved dyrking ved luft-væskegrensesnittet (ALI) og inkluderer en protokoll for biobanking. Videre beskrives karakteriseringen av disse kulturene ved hjelp av cellespesifikke markørgener. Disse ALI-PBEC kulturer kan brukes til en rekke applikasjoner, inkludert eksponering for hele sigarettrøyk eller inflammatoriske mediatorer, og co-kultur / infeksjon med virus eller bakterier.
Protokollen i dette manuskriptet, som illustrerer prosedyren trinnvis, forventes å gi grunnlag og/eller referanse for de som er interessert i å implementere eller tilpasse slike kultursystemer i sitt laboratorium.
Introduction
Luftveisepitelets rolle i en rekke akutte og kroniske lungesykdommer er beskrevet i ulike vurderinger 1,2,3,4,5,6,7. Godt differensierte kulturer av luftveisepitelceller er et viktig verktøy for å løse rollen til luftveisepitelet. Luft-væske-grensesnitt (ALI) luftveis epitelcellekultur brukes bredt for å fremme differensiering av luftveis basale epitelceller og derved studere luftveisepitelet pålitelig in vitro 8,9. De siste årene har bruken av slike modeller økt ytterligere som følge av nye forskningsinitiativer knyttet til COVID-19-pandemien og en verdensomspennende overgang til dyrefri forskning. Derfor understreker den økte bruken av denne modellcellelinjen behovet for delingsprosedyrer og erfaringer for å oppnå robuste resultater. Dette vil også gjøre det mulig å sammenligne resultater mellom forskningsgrupper. Prosedyrens robusthet er nøkkelegenskapen og må derfor underkastes kvalitetskontroll. Flere laboratorier har investert i å utvikle protokoller for dyrking av primære luftveisepitelceller ved ALI. Tiden, innsatsen og det nødvendige budsjettet kan reduseres når disse prosedyrene deles i detalj. Disse detaljene inkluderer for eksempel valg av cellekulturplast og media levert av forskjellige produsenter, siden dette ble funnet å påvirke egenskapene til kulturene oppnådd10,11,12. Dette understreker viktigheten av å dele erfaringer og detaljer om kulturprosedyrer, siden i fravær av slik innsikt kan resultatene bli påvirket og / eller valideringsarbeidet på tvers av ulike laboratorier kan bli hindret.
Det menneskelige lungeepitelet består av forskjellige celletyper, inkludert hovedtyper som basale celler, cilierte celler, begerceller og klubbceller. For å kunne etterligne epitelcellelaget i luftveiene in vitro på en pålitelig måte, må disse celletypene være representert i kulturmodellene, og deres polarisering og funksjon opprettholdes13,14,15,16. Realiseringen av at donoregenskaper (inkludert sykdomstilstand) og cellens anatomiske opprinnelse (dvs. nese-, trakeal-, store og små luftveier) kan påvirke cellekulturens cellulære sammensetning og funksjonelle responser er like viktig. Relevant kompetanse og praksis er en forutsetning for vellykket dyrkning av primære luftveisepitelceller og vurdering av kulturens kvalitet både intuitivt (ved visuell inspeksjon under dyrkning) og kvantifiserbart. Målet med dette bidraget er å gi en kostnadseffektiv og tidseffektiv metode for isolering og kultur av primære humane bronkialepitelceller (PBECs) som også kan brukes på kulturen av trakeale og små luftveisepitelceller. I tillegg til å beskrive en metode for isolering av slike celler fra resektert lungevev, presenteres og diskuteres en metode for ekspansjon og biobanking, og til slutt for etablering og karakterisering av en godt differensiert ALI-kultur innenfor en rimelig kostnad og tidsperiode.
Protocol
Cellene ble isolert fra makroskopisk normalt lungevev fra pasienter som gjennomgikk reseksjonskirurgi for lungekreft ved Leiden University Medical Center, Nederland. Pasienter som fikk dette lungevevet avledet fra, ble registrert i biobanken via et ikke-innsigelsessystem for kodet anonym videre bruk av slikt vev (www.coreon.org). Siden 01-09-2022 har imidlertid pasienter blitt registrert i biobanken ved bruk av aktivt informert samtykke i henhold til lokale forskrifter fra LUMC biobank med godkjenning fra institusjonell medisinsk etisk komité (B20.042/Ab/ab og B20.042/Kb/kb).
MERK: Alle prosedyrer utføres i et biologisk sikkerhetsskap, i henhold til lokale biologiske sikkerhetsregler, og under sterile arbeidsforhold mens du bruker kirurgiske hansker og laboratoriefrakk, med mindre annet er angitt. For alle medier, reagenser og andre løsninger som brukes i protokollen, se materialfortegnelse og tilleggstabell 1. Se figur 1 for detaljerte protokolltrinn
1. Isolering av bronkiale epitelceller fra humant lungevev
MERK: For å oppnå en optimal suksessrate for isolering av bronkialepitelceller, bør den utskårne bronkialringen holdes nedsenket ved 4 °C i maksimalt 24 timer i fosfatbufret saltvann (PBS) tilsatt Primocin.
- Forberedelser før starten av prosedyren
- Klargjør en overflatebehandlingsløsning i PBS, som beskrevet i tilleggstabell 1, og belegg et passende antall 6-brønnsplater med 1,5 ml beleggløsning per brønn. Inkuber i 2 timer i en cellekulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
MERK: Antall brønner som skal belegges er avhengig av størrelsen på det utskårne vevet. Som en grov retningslinje er fire 6-brønnsplater belagt når den utskårne bronkialringen er 10 mm i diameter og 4 mm i bredden. - Klargjør komplett keratinocytt serumfritt medium (c-KSFM), som beskrevet i tilleggstabell 1; Bruk 2 ml av mediet per brønn på en 6-brønnsplate.
MERK: Denne c-KSFM kan oppbevares ved 4 °C i 7 dager. c-KSFM er et lavkalsiummedium som brukes til utvidelse av luftveisepitelceller mens det hemmer veksten av forurensende fibroblaster.
- Klargjør en overflatebehandlingsløsning i PBS, som beskrevet i tilleggstabell 1, og belegg et passende antall 6-brønnsplater med 1,5 ml beleggløsning per brønn. Inkuber i 2 timer i en cellekulturinkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Rengjør bronkialringen ved å skylle ringen forsiktig i 10 ml steril PBS i en 10 cm petriskål. Bruk pinsett til å holde ringen forsiktig (bare berør utsiden), og liten saks for å fjerne overflødig bindevev og blodrester. For videre behandling, kutt ringen i to.
MERK: Alle verktøy som brukes i prosessen skal steriliseres før bruk. - Senk de to halvdelene av bronkialringen i 10 ml av en forvarmet oppløsning av protease XIV (1,8 mg / ml) i Hanks balanserte saltløsning (HBSS), inkludert Primocin i en lukket steril beholder, og inkuber i nøyaktig 2 timer ved 37 ° C i en cellekulturinkubator.
MERK: HBSS brukes som et fortynningsmiddel for protease XIV for å løsne cellene fra vevet i løpet av en 2 timers inkubasjonsperiode. HBSS er en balansert isotonisk løsning som muliggjør opprettholdelse av celle levedyktighet under kortsiktige inkubasjoner. - Etter inkubasjonen, overfør biter av vev til en petriskål med 10 ml varm PBS og skrap innsiden av ringen ved hjelp av bøyd pinsett for å oppnå en celleløsning.
MERK: Vevet virker mykere og noe utvidet. - Kast ringen, overfør celleoppløsningen til et 50 ml rør, og tilsett varm PBS for å oppnå et endelig volum på 50 ml. Sentrifuge i 7 min ved 230 x g og ved romtemperatur (RT).
- Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 10 ml varm PBS. Videre utgjør volumet opp til 50 ml med varm PBS. Sentrifuge i 7 min ved 230 x g ved RT.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i en passende mengde varm c-KSFM inneholdende Primocin.
MERK: Primocin brukes i minst 7 dager for å eliminere bakterier, sopp eller (viktigere) mykoplasma som kan ha vært tilstede i vevet; Etter 7 dager er tilsetning av bare penicillin / streptomycin til mediet tilstrekkelig. - Aspirer beleggløsningen fra 6-brønnsplatene og tilsett 2 ml cellesuspensjon per brønn.
- La cellene vokse til 80% til 90% sammenløp er nådd, og bytt medium tre ganger per uke (f.eks. hver mandag, onsdag og fredag). Den ønskede grad av sammenløp oppnås vanligvis mellom 7 og 14 dager; Hvis tiden som kreves for å nå ønsket sammenløp overstiger 14 dager, kast cellene.
MERK: I de første dagene begynner bare et lite antall celler å spre seg; Grupper av celler er merkbare etter noen dager.
2. Kryopreservering av humane primære bronkiale epitelceller (PBECs)
MERK: Ved arbeid med temperaturer på -80 °C og -196 °C brukes kryohansker som beskyttelse, og pinsett brukes til å overføre frosne hetteglass. Ved arbeid med flytende nitrogen brukes kryohansker og ansiktsskjerm for personlig beskyttelse.
- Aspirer mediet og vask brønnene én gang med 2 ml varm PBS per brønn.
- Trypsiniser cellene ved å tilsette 0,5 ml mykt trypsin per brønn (se tilleggstabell 1 for sammensetning av den myke trypsinløsningen). Inkuber cellene i 5 til maksimalt 10 minutter ved 37 °C. Roter trypsinløsningen i platen og slipp cellene ved å banke forsiktig på platen.
- Overfør de frittliggende cellene til et 50 ml sentrifugerør inneholdende 1,1 mg/ml soyabønnetrypsinhemmer (SBTI; for å hemme trypsinaktivitet) oppløst i KSFM med penicillin/streptomycin. Volumet av SBTI må være dobbelt så stort som det totale volumet av mykt trypsin (dvs. 1 ml per brønn).
MERK: Ikke legg SBTI direkte til brønnene, da cellene vil feste seg igjen i løpet av minutter. - Sentrifuger røret i 7 min ved 230 x g ved RT.
- Kast supernatanten og resuspender de pelleterte cellene i 10 ml RT KSFM som inneholder penicillin/streptomycin, men ingen andre tilsetningsstoffer. Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller. Utfør en levende / død celletelling ved å legge til trypanblå i forholdet 1: 1, eller bruk en alternativ levende / død celle telling prosedyre.
- Kryokonservere cellene i en konsentrasjon på 400 000 celler per ml frysemedium (se tilleggstabell 1 for sammensetning) og tilsett 1 ml av denne suspensjonen per kryovial. Overfør kryovialene til en kjølecellebeholder og sett den ved -80 °C. Etter 24 timer overføres hetteglassene til -196 °C flytende nitrogen for langtidsoppbevaring.
MERK: To alternativer er mulige for å overføre cellene til frysemedium, som begge fungerer bra: 1) Pellet cellene igjen ved sentrifugering og resuspendere i kaldt frysemedium ved ønsket cellekonsentrasjon; eller 2) tilsett kaldt frysemedium og juster konsentrasjonen av kryopretjeneren (dimetylsulfoksid [DMSO]) basert på volumet av KSFM der cellene er til stede.
3. Tine kryopreserverte PBECer og dyrke dem for kultur på innsatser
- Belegg en T75 cellekulturkolbe over natten med 10 ml beleggløsning i PBS med lokkene tett lukket. Inkuber kolben i en cellekulturinkubator ved 37 °C og 5% CO2.
- Før du tiner kryopreserverte PBECs, fjern beleggoppløsningen fra kolben og fyll den med 10 ml c-KSFM. La det varme til 37 ° C i en cellekulturinkubator, med litt åpne lokk for å la inkubatorluft inn.
- Tine cellene raskt i et vann- eller perlebad på 37 °C.
MERK: Et perlebad foretrekkes fremfor et vannbad på grunn av lavere risiko for forurensning og lavere energiforbruk. - Tilsett det komplette innholdet av cryovialet til den forvarmede T75-kolben med medium (trinn 3.2) og fordel cellene jevnt.
MERK: Ikke sentrifuge cellene på dette stadiet, siden de ikke vil overleve sentrifugeringstrinnet. - Etter ca. 4 timer, sørg for at cellene er tilstrekkelig festet. Bytt ut mediet med 10 ml frisk, varm c-KSFM.
MERK: På denne måten fjernes DMSO fra frysemediet. Dette trinnet bør finne sted mellom 4 timer og 24 timer etter sådd av cellene i kolben. - Voks cellene til 80% til 90% sammenløp er nådd, endre mediet hver mandag, onsdag og fredag.
4. Etablering av en luft-væske grensesnittkultur med primære bronkiale epitelceller (ALI-PBEC)
MERK: Følgende prosedyre gjelder for dyrkning av PBEC på 11,9 mm innsatser med indre diameter.
- Belegg et passende antall cellekulturinnlegg med 0,4 ml beleggoppløsning per innsats. Inkuber over natten ved 37 °C i en cellekulturinkubator.
- Klargjør komplett BD-medium (cBD-medium), som beskrevet i tilleggstabell 1.
MERK: cBD-medium er et sammensatt medium (se tilleggstabell 1) formulert for å støtte veksten av bronkiale epitelceller i lengre perioder, samtidig som de tillater differensiering etter en økning i retinsyre (RA) (eller en analog av RA som brukt i denne protokollen) konsentrasjon og kultur ved ALI, som beskrevet i trinn 4.10. - Trypsiniser PBECene i T75-kolben, ved å bruke 2 ml mykt trypsin per kolbe. Inkuber cellene i 5 til 10 minutter for å la cellene løsne (basert på visuell inspeksjon). Etter 5 min inkubasjon, lette løsningen av cellene ved å virvle trypsinet i kolben og forsiktig tappe kolben (gjenta om nødvendig).
- Tilsett 4 ml SBTI til kolben og overfør cellesuspensjonen direkte til et 25 ml sentrifugerør.
MERK: Cellene festes på nytt i løpet av få minutter. Derfor, når du arbeider med mer enn én kolbe, må cellesuspensjonen oppnådd i trinn 4.4 overføres direkte til et sentrifugerør før SBTI tilsettes til en annen kolbe. I prosedyren behandles maksimalt fem kolber samtidig. - Sentrifuger rørene i 7 min ved 230 x g ved RT.
- Resuspender cellene i 6 ml cBD-medium og tell cellene ved hjelp av et hemocytometer eller automatisert celleteller. Utfør en levende/død celletelling ved for eksempel å legge til trypanblå i forholdet 1:1, eller ved å bruke en annen telleprosedyre for levende/døde celler.
- Fjern belegningsløsningen fra cellekulturinnsatsene.
- Fortynn cellesuspensjonen, generert i trinn 4.6, med cBD-medium supplert med 1 nM EC 23 til en konsentrasjon på 80 000 celler per ml, og tilsett 0,5 ml på toppen av membranen i innsatsen. Tilsett 1,5 ml cBD-medium supplert med 1 nM EC 23 til brønnen under innsatsen.
- Bytt medium med cBD-medium supplert med 1 nM EC 23 tre ganger i uken til kulturene er klare for lufteksponering (dvs. 2 dager etter at 100% sammenløp er nådd). Hver gang tilsettes 0,5 ml av mediet inne i innsatsen (på cellene) og 1,5 ml legges til bunnrommet (brønnen).
NOTAT: Generelt når cellelaget 100% sammenløp ca. 5 dager etter såing av PBECene på innsatsene. Basert på den visuelle inspeksjonen av sammenløpet av cellene, blir det besluttet å overføre cellene til ALI-trinnet 2 dager senere. - Når cellene er klare for overføring til ALI (dvs. 2 dager etter å ha nådd 100% konfluens), fjern mediet fra innsatsene og brønnen, ikke legg til nytt medium inne i innsatsen, og tilsett nytt medium (1 ml cBD-medium supplert med 50 nM EC 23) bare til brønnen. Bytt medium i brønnene tre ganger i uken.
- For å fjerne overflødig slim og cellulært rusk, tilsett forsiktig 200 μL varm PBS på den apikale siden av cellelaget inne i innsatsen (helst via siden av innsatsen og ikke ved direkte pipettering på cellene) og inkuber i 10 minutter i en cellekulturinkubator ved 37 ° C. Deretter aspirerer PBS for å fjerne overflødig slim og cellulært rusk.
MERK: Fra dette tidspunktet (starten av ALI-kulturen), før du bytter medium i det nedre rommet, vask den apikale siden av cellene med PBS hver gang. - Dyrk cellene på ALI i minst 2 uker for å sikre at alle de store celletypene er representert.
5. Etablering av en ALI-PBEC-kultur fra en blandet donorpopulasjon
- Bruk celler fra opptil fem individuelle givere for å starte PBEC-kulturer fra en blandet populasjon.
- Bland like mange celler per donor ved hjelp av cellene som ble generert i trinn 4.7 for å nå totalt 150 000 celler per innsetting (dvs. 30 000 celler per donor når du bruker fem givere). Dette vil sørge for at spredning i innsatsen holdes på et minimum og like mange celler fra de enkelte donorene er til stede i kulturen.
- Fortsett ALI-PBEC-kulturen som beskrevet i trinn 4.9-4.12.
6. Kvalitetskontroll av ALI-PBEC-kulturen
- Overvåking av transepitelial elektrisk motstand (TEER) under cellekultur
MERK: Den elektriske motstandsmålingen, basert på bruk av et voltohmmeter, kan utføres til enhver tid under ALI-PBEC-kultur og utføres hver gang i henhold til samme protokoll under de samme forholdene, siden den elektriske motstandsmålingen påvirkes av forskjellige variabler, inkludert elektrodeposisjon, temperatur, medium og håndtering. TEER kan beregnes ved hjelp av den målte elektriske motstanden ved å bruke følgende formel basert på Ohms lov:
, hvor Rm er den målte elektriske motstanden, Rb er den grunnleggende elektriske motstanden til en innsats uten belegg og celler, og SA er overflaten av membranen til innsatsen17.- Tilsett forsiktig 200 μL varm PBS til den apikale siden av cellelaget for å fjerne slim og rusk på cellene. Inkuber innsatsen i 10 minutter i en cellekulturinkubator ved 37 °C og fjern PBS igjen.
- Tilsett forsiktig 700 μL varm PBS til den apikale siden av cellelaget og inkuber innsatsen i 10 minutter ved RT for å tillate stabilisering av temperaturen for målinger.
- Kalibrer voltohmmeteret ved hjelp av 1,000 Ω testmotstand, sett voltohmmeteret til å måle Ohms, og bruk en skrutrekker for å justere "R ADJ" kalibreringsskruen til den er satt til 1,000 Ω.
- Skyll elektroden ved å bevege den opp og ned noen ganger i sterilt vann (RT) og deretter i steril PBS (RT).
- Mål den elektriske motstanden til cellelaget i innsatsene. Til dette formål plasserer elektroden i vertikal stilling i brønnen med elektrodens lange arm som berører bunnen av platen. På denne måten er den korte armen over cellelaget inne i innsatsen. Les verdien som vises på voltohmmeteret.
MERK: Den viste verdien vil ikke stabilisere seg fullstendig. Les verdien i det øyeblikket verdien er uregelmessig. - Mellom målingene, rengjør elektroden ved å flytte den opp og ned noen ganger i steril PBS (RT).
- Rengjør elektroden når målingene er ferdige ved å flytte den opp og ned noen ganger i sterilt vann (RT), steril PBS (RT) og 70% etanol (RT). Oppbevar elektroden tørt.
- Utfør en baselinemåling av en innsats (uten belegg) og celler ved å tilsette 700 μL varm PBS inne i innsatsen og 1 ml varm PBS til brønnen og måle den elektriske motstanden sammen med de andre innsatsene.
- Evaluering av den cellulære sammensetningen av ALI-PBEC-kulturen
- Under ALI-scenen, kontroller differensieringen ved visuelt å vurdere å slå cilia. Disse kan observeres via standard lysfeltmikroskopi så tidlig som 9 dager etter lufteksponering på den apikale siden av cellene.
MERK: Slående flimmerhår er best synlige rett etter vask av den apikale overflaten. Goblet celler produserer slim, og derfor er tilstedeværelsen av slim, som observert under vask av den apikale overflaten, et tegn på at bobleceller dannes. Imidlertid er nivået av begerceller og mengden slim produsert svært donoravhengig. Tilstedeværelsen av slim kan ses ved aspirasjon av PBS etter vasking av den apikale overflaten av cellelaget i innsatsen; i dette tilfellet er den aspirerte PBS mer viskøs, og slimtråder kan observeres under aspirasjon. - Evaluering av den cellulære sammensetningen ved hjelp av immunfarginger og fluorescerende mikroskopi eller fluorescensaktivert cellesortering (FACS), eller genuttrykksanalyse ved sanntidskvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) gir viktig informasjon om kulturens differensieringstilstand, men beskrivelsen er utenfor omfanget av dette bidraget.
- Under ALI-scenen, kontroller differensieringen ved visuelt å vurdere å slå cilia. Disse kan observeres via standard lysfeltmikroskopi så tidlig som 9 dager etter lufteksponering på den apikale siden av cellene.
Figur 1 Skjematisk oversikt over isolasjons-, ekspansjons- og dyrkningsprosedyren til primære bronkiale epitelceller. (A) Lungevev oppnås under kreftreseksjonskirurgi og patologen skjærer ut bronkial ringvev som er makroskopisk normalt og tumorfritt. (B) Bronkialringen rengjøres og utsettes for enzymatisk behandling for å løsne og dissosiere cellelaget. (C) Den uthentede cellesuspensjonen vaskes og cellene fordeles i brønner på en 6-brønnsplate for ekspansjon. (D) Ved tilstrekkelig utvidelse av de isolerte cellene i c-KSFM med Primocin, dissosieres cellelagene ved trypsinisering og celler resuspenderes i frysemedium for kryopreservering. Ved behov tines kryopreserverte celler og utvides igjen ved hjelp av c-KSFM med penicillin/streptomycin i cellekulturkolber. Etter utvidelse blir de sådd i cBD-medium på cellekulturinnsatser; (VG Nett) ALI-PBEC-kulturen foregår i to hovedfaser: det nedsenkede stadiet i cBD-medium supplert med 1 nM EC 23 til cellene når full sammenløp, etterfulgt av fjerning av apikalt medium og kultur ved ALI for å tillate differensiering; i denne ALI-fasen dyrkes cellene i cBD-medium supplert med 50 nM EC 23. (VG Nett) Grafisk fremstilling av basalceller som dekker innsatsen under nedsenket kultur. (VG Nett) Grafisk fremstilling av det differensierte epitelcellelaget oppnådd etter kultur ved ALI i nærvær av økte konsentrasjoner av EC 23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Representative Results
Ekspansjon ved hjelp av nedsenket kultur
Ved å bruke metoden som presenteres her, kan gjennomsnittlig åtte kryovialer med 400 000 celler / kryovial fås fra en 6-brønnsplate for langtidslagring i flytende nitrogen (figur 2A). For å oppnå dette dyrkes isolerte PBECer i 6-brønnsplater i minimum 7 dager og maksimum 14 dager (figur 2B) i nærvær av Primocin for å utelukke mikrobiell (spesielt mykoplasma) forurensning. Figur 2A,B gir innsikt i antall innhentede celler og nødvendig dyrkningstid blant ulike isolasjoner fra ulike donorer. Før høsting av cellene ved trypsinisering for lagring i flytende nitrogen, må samløpet være over 80%. Hvis dette ikke oppnås innen 14 dager, bør cellene ikke kryopreserveres. Det er viktig at når du høster for lagring og passering, bør sammenløpet av cellelaget ikke overstige ~ 95% (figur 2C). Etter lagring i flytende nitrogen kan cellene tines og dyrkes for ekspansjon inntil tilstrekkelig cellenummer er oppnådd for ALI-kulturer. Mediet som brukes til utvidelse av cellene på dette stadiet er c-KSFM, tilsvarende som under den opprinnelige kulturen etter høsting fra bronkialringen18. Det er imidlertid ikke behov for Primocin på dette stadiet, fordi risikoen for ytterligere mikrobiell kontaminasjon fra lungevevet er fraværende, og derfor kan Primocin endres til penicillin/streptomycin. Dette mediet favoriserer epitelceller over fibroblaster og forhindrer derfor mulig gjengroing av kulturen ved raskere spredning av fibroblaster 19,20,21. Ved bruk av c-KSFM-medium er cellene spredt ut i kolben og kobles ikke til hverandre, noe som er markant forskjellig fra morfologien til dyrkede celler nedsenket på dette stadiet i cBD-medium (figur 2D, E). Etter 5 eller 6 dager med dyrking av de tinte cellene i en T75-kolbe, bør cellelaget være 80% -95% sammenflytende, noe som oversetter til omtrent 3 x 106 celler totalt (figur 2F). Fra dette kan ca. 75 innsatser (12-brønns platestørrelse) genereres for ALI-kultur.
Metoden for isolering og dyrkning beskrevet i dette bidraget kan også tilpasses for bruk med bronkialbiopsier eller bronkialpensler som utgangsmateriale.
Figur 2 Basalcelleekspansjon før og etter kryopreservering. Celler ble isolert i henhold til den beskrevne protokollen og dyrket ved bruk av c-KSFM. Antall celler generert per donor ble overvåket, de levende celletellingene ble utført ved hjelp av en automatisert celleteller (A) ved høsting av passasjen 0 (P0) celler fra 6-brønnplatene (trinn 2 i protokollen), n = 123 givere, celletallet ble presentert som antall celler høstet per brønn; Hvert punkt representerer en donor og medianen er indikert med en horisontal linje. (B) Som en del av kvalitetskontrollen ble tiden P0-cellene krevde for å nå 80% til 90% sammenløp i 6-brønnsplatene overvåket og vist som dager etter start av nedsenket kultur i c-KSFM (n = 127 forskjellige givere). Hver enkelt giver er indikert med en prikk, alle prikker som tilhører 1 dag smelter sammen til en linje; Jo bredere linjen er, jo flere givere står den for; Median antall dager cellene er i kultur er indikert med en tynnere horisontal stang. (C) Representativt lysfeltbilde av P0-celler dyrket nedsenket i c-KSFM i det øyeblikket cellene ble høstet for langsiktig kryopreservering. (D) Representativt lysfeltbilde av P1-celler dyrket nedsenket i c-KSFM i det øyeblikket cellene ble høstet og overført til innsatser og (E) P1-celler dyrket nedsenket i cBD-medium. (F) Antall levende celler generert per donor ble overvåket ved hjelp av en automatisert celleteller ved høsting av P1-celler fra T75-kolben (seksjon 4 i protokollen), n = 63 forskjellige givere; celletallet presenteres som antall celler per T75-kolbe, hver donor er indikert med en prikk, og mediancelletallet er indikert med en horisontal stolpe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Kultur for luft-væskegrensesnitt (ALI)
Ved 7 dager etter start av ALI-kulturen måles den elektriske motstanden til cellelaget og skal være over 300 Ω (figur 3A); Hvis dette ikke oppnås, anses kulturen som mislykket på grunn av en mulig mangel på tett kryssdannelse. Det anbefales å utelukke muligheten for å få lave TEER-verdier forårsaket av skade på epitellaget i individuelle innlegg som følge av for eksempel skade på cellelaget under vask og aspirasjon. Dette kan kontrolleres ved visuell mikroskopisk inspeksjon av dyrkningsinnsatsene. Vår erfaring er at interdonorvariabiliteten i elektrisk motstand kan være signifikant (figur 3B), noe som også er rapportert i litteraturen14, og som observert også er markert påvirket av opprinnelsen til Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) som ble brukt (figur 3C).
Figur 3: Transepitelial elektrisk motstand som kvalitetskontroll av ALI-PBEC kulturer. PBEC ble isolert og utvidet, og godt differensierte ALI-PBEC-kulturer ble etablert. Ved flere tidspunkt under dyrkning ble elektrisk motstand målt, og deretter ble TEER beregnet (Ω·cm2). (A) Elektrisk motstand ble målt i løpet av 14 dager etter ALI. n = 4 ulike givere. Dataene er vist som middelverdi ± standardavvik (SD). (B) Som en del av ALI-PBEC cellekulturkvalitetskontroll ble elektrisk motstand målt ved dag 7 (n = 50) og dag 14 etter ALI (n = 25); hvert punkt representerer en donor og median TEER (Ω ·cm 2) er indikert med en horisontal strek. Data ble signifikanstestet med en ikke-parametrisk Mann-Whitney-test, og det ble ikke funnet noen signifikant forskjell. (C) Media fra tre forskjellige DMEM-leverandører ble testet for å vurdere innflytelsen på TEER-dannelse. n = 4 forskjellige givere; middelverdier er avbildet ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Mens det etableres en godt differensiert ALI-PBEC-kultur, øker konsentrasjonen av RA fra starten av lufteksponering22. På denne måten bytter celler fra proliferasjon til mukociliær differensiering, som er synlig så tidlig som 9 dager (donoravhengig) etter lufteksponering ved hjelp av brightfield-mikroskopi. Bevegelsen av de første flimmerhårene er synlig på dette punktet, og noe tidligere når man baserer seg på genuttrykk av markører for differensierte luminalceller23 (figur 4).
Som beskrevet i protokollen, kan slimproduksjon også observeres ved skylling av den apikale overflaten under mediumendringen. RA er svært følsom for lys, noe som fører til svært variabel aktivitet ved samme stamkonsentrasjon. Av denne grunn erstattes RA av den syntetiske RA-analogen EC 23 og brukes i samme konsentrasjon, med lignende resultater som bestemt eksperimentelt. Av denne grunn og for å unngå å endre prosedyren, ble den valgte EC 23-konsentrasjonen holdt lik RA-konsentrasjonen (dvs. 50 nM) som tidligere ble brukt24,25 (figur 5). Figur 5A viser TEER-verdiene oppnådd ved bruk av forskjellige konsentrasjoner av EC 23, som viser en maksimal TEER ved 50 nM innenfor dette området av konsentrasjoner som er testet. Resultatene vist i figur 5B bekrefter at genuttrykk av markører for cilierte celler og begerceller er like ved bruk av 50 nM EC 23 eller RA. EC 23 er også nødvendig under kultur på nedsenket stadium (selv om det er i en mye lavere konsentrasjon), siden utelatelse av det på dette nedsenkede stadiet og bare legger det til på ALI-stadiet, resulterer i en kultur som aldri når full sammenløp. Tiden det tar å generere en godt differensiert ALI-PBEC-kultur med synlig ciliærbankende aktivitet og slimproduksjon er rundt 14 dager, og de fleste forsøkene er derfor igangsatt mellom 14-21 dagers ALI-kulturer (figur 4). Alle de store forskjellige celletyper (basal-, ciliated-, goblet- og klubbceller) observeres på 14 dager med ALI-kultur, selv om ekspresjonsnivåene er svært donoravhengige. Dette demonstreres ved å vurdere genuttrykk av TP63, FOXJ1, MUC5AC og SCGB1A1 ved RT-qPCR, eller proteinuttrykk ved bruk av antistoffer rettet mot p63, α-tubulin, Muc5AC og CC-16 ved immunfluorescens (IF) farging, for å oppdage markører for henholdsvis basal-, ciliated-, goblet- og klubbceller25,26. Imidlertid, mens 14-21 dager kan betraktes som en tommelfingerregel for de fleste eksperimenter, kan det for utvalgte eksperimenter vurderes en lengre varighet av differensiering, som funnet for xenobiotisk metabolisme, SARS-CoV-2-infeksjon og vurdering av mukociliær clearance27,28,29.
Figur 4: Kultur av luft-væske-grensesnitt (ALI). PBEC ble isolert og utvidet, og godt differensierte ALI-PBEC-kulturer ble etablert. ALI-PBEC kulturer ble overvåket i løpet av 14 dager etter ALI. Cellekulturer ble lysert for isolering av RNA på dag 0, 7 og 14 etter ALI. Data fra to ulike donorer vises, hvert punkt representerer en individuell donor overvåket over tid, og medianen er indikert med en horisontal strek. Genuttrykk av basal-, cilierte-, beger- og klubbcellemarkører (henholdsvis TP63, FOXJ1, MUC5B og SCGB1A1) ble målt ved qPCR og normalisert for RPL13A- og ATP5B-genuttrykk (se referanse 23 for detaljer). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenligning av retinsyre (RA) og dens syntetiske analog EC 23. PBEC ble isolert og utvidet, og godt differensierte ALI-PBEC-kulturer ble etablert. Ved start av lufteksponering av PBEC-kulturene ble RA (50 nM) erstattet av forskjellige konsentrasjoner av EC 23. (A) Elektrisk motstand ble målt ved dag 14 etter ALI og deretter ble TEER beregnet (Ω ·cm 2), n =2 donorer, stolpene viser middelverdien ± SD. (B) Ved dag 14 etter Ali ble cellekulturer lysert for RNA-isolering og påfølgende genekspresjonsanalyse av cellemarkører for henholdsvis cilierte celler og begerceller (FOXJ1, MUC5AC) ved bruk av qPCR, og normalisert for RPL13A (n = 3 donorer). En fold økning er vist mot ALI-PBEC dyrket med 50 nM RA og avbildet som middelverdi ± SD. (Se referanse 23 for detaljer) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I løpet av de siste årene har ytelsen til alternative produkter i kultursystemet blitt undersøkt, for eksempel media og kulturplast. Det var ulike årsaker til slike evalueringer, inkludert endringer i mediumsammensetning av produsentene, nye medier introdusert, samt mangel på produkter under COVID-19-pandemien (2020-2022). Det ble observert at lignende produkter fra ulike leverandører gir differensierte epitelcellekulturer basert på vurdering av markører for epitelcelletyper, selv om den endelige cellesammensetningen kan variere betydelig (figur 6A), mens forskjellene i TEER var mindre uttalt (figur 6B). På den annen side resulterte medium fra forskjellige leverandører i betydelige forskjeller i cellulær sammensetning; Ved bruk av innlegg fra forskjellige merker var slike forskjeller begrenset (figur 6C). Spesielt ved bruk av luftveisepitelcellekulturmediet PneumaCult fra STEMCELL Technologies ble det observert en annen morfologi og raskere dannelse av synlig ciliær aktivitet. I tillegg til disse observasjonene ble det også observert en forskjell i TEER-verdier og en forskjell i cellulær sammensetning av ALI-PBEC sammenlignet med cBD-medium (figur 6D).
Figur 6: Sammenligning av ulike leverandører av epitelcellemedium og cellekulturinnsatser. PBEC ble isolert, utvidet og godt differensierte ALI-PBEC kulturer ble etablert. (A) ALI-PBECs ble dyrket i 14 dager, og deretter ble cellelagene lysert for RNA-isolasjon. Genuttrykk av basal-, ciliert-, beger- og klubbcellemarkører (henholdsvis TP63, FOXJ1, MUC5AC og SCGB1A1) ble målt ved qPCR og normalisert for RPL13A og ATP5B. n = 2 givere; stolpene viser middelverdien ± SD. (B) I løpet av 9 dager etter ali ble elektrisk motstand målt og deretter ble TEER beregnet (Ω ·cm2). n = 3 forskjellige givere; middelverdier er avbildet ± SD. (C) ALI-PBEC ble dyrket i 14 dager ved hjelp av cellekulturinnlegg kjøpt fra tre forskjellige leverandører, og deretter ble cellelagene lysert for RNA-isolering. Genuttrykk av cilierte, beger og klubbcellemarkører (henholdsvis FOXJ1, MUC5AC og SCGB1A1) ble målt ved qPCR og normalisert for RPL13A. n = 18 forskjellige givere, stolpene viser middelverdien ± SD. Data ble testet for signifikans ved hjelp av en enveis ANOVA ikke-parametrisk Kruskal-Wallis-test, og det ble ikke funnet noen signifikant forskjell. (D) ALI-PBEC ble dyrket enten i cBD-medium eller PneumaCult-medium (STEMMCELL-teknologier) i 14 dager etter ALI, og deretter ble cellelagene lysert for RNA-isolasjon. Genuttrykk for basal-, ciliert-, beger- og klubbcellemarkører (henholdsvis TP63, FOXJ1, MUC5B og SCGB1A1) ble målt ved qPCR og normalisert for RPL13A (stolpene viser middelverdien ± SD), og elektrisk motstand ble målt ved dag 5 og 12 etter ALI og brukt til å beregne TEER (Ω ·cm2). n = 2; middelverdien er avbildet ± SD (se referanse 23 for detaljer). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell 1: Sammensetning av løsningene og mediene som brukes i protokollen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Protokollen som presenteres her beskriver isolering av humane bronkialepitelceller fra resektert lungevev, en metode for optimal ekspansjon av celler uten tap av differensieringspotensial, en kryopreserveringsprosedyre og en prosedyre for å generere godt differensierte ALI-PBEC-kulturer. Videre gis en beskrivelse av kvalitetskontrollen, samt instruksjoner for overvåking og evaluering av de differensierte ALI-PBECene.
Den beskrevne protokollen starter med en makroskopisk normal, tumorfri bronkialring som resekteres fra en lungelapp fra pasienter som gjennomgår kirurgi relatert til lungekreftdiagnosen. Det må derfor bemerkes at disse ringene strengt tatt ikke kan betraktes som sunt vev, noe som derfor kan påvirke cellekulturegenskaper. Alternative kilder for å skaffe bronkial epitelceller inkluderer bruk av bronkial biopsier, bronkial børsting, eller vev fra en transplantasjon donor eller mottaker lunger. Uavhengig av kilden, ved bruk av lungevev, bør en risiko for mikrobiell kontaminering vurderes, og derfor brukes antibiotika i de forskjellige kulturmediene for å redusere risikoen for mikrobiell kontaminering av cellekulturen. Spesielt er mykoplasma en høy og vanlig risiko i cellekultur, på grunn av sin store variasjon av effekter på cellekultur, resistens mot antibiotika som vanligvis brukes i cellekultur, og det faktum at mykoplasmaforurensning kun kan bekreftes ved mykoplasmadeteksjonsanalyser. Derfor, i den første fasen av cellekultur etter isolering av celler fra lungevev, brukes den bredspektrede antimikrobielle formuleringen Primocin, og under kulturprosessen testes tilfeldig utvalgte prøver for tilstedeværelse av mykoplasma.
Isolasjonsprosedyren som starter med en bronkialring gir tilstrekkelig utgangsmateriale for å tillate graden av ekspansjon av disse primære cellene som trengs for å starte kulturer ved ALI uten at det går ut over differensieringskapasiteten. Å starte utvidelsen av de isolerte epitelcellene med et begrenset antall celler kan imidlertid by på problemer med å oppnå et tilstrekkelig antall innlegg med nok celler som kan sås for ALI-kultur. Utvidet kultur og gjentatt passering av primære celler kan resultere i replikativ senescens. Det er foreslått ulike løsninger for å overvinne denne begrensningen. Horani et al. viste at Rho-kinasehemmeren (ROCK) Y-27632 økte spredningen av basale celler30, Mou et al. brukte dobbel Smad-hemming for å utvide basale stamceller samtidig som egenskapene til det differensierte epitelcellelaget 31 opprettholdes, og Sachs et al. har utviklet et luftveisorganoidsystem som kan brukes til å utvide luftveisepitelceller og opprettholde deres differensieringspotensial i løpet av flere passasjer32. Sistnevnte metode ble også brukt til å utvide celler fra kilder med svært lave celletall, for eksempel trakealaspirater (TA) fra premature spedbarn (<28 ukers svangerskapsalder) og bronkoalveolær skylling (BAL) væske, før overføring til ALI-kulturen som beskrevet her33. Det ble funnet at celler isolert fra BAL og TA viste en differensieringskapasitet som var lik celler generert fra bronkialvev, selv om forskjeller ble observert når differensieringen var skjev mot mer cilierte eller mer begercelleholdige kulturer ved bruk av Notch-signalinhibering eller Th2-cytokinet IL-1333. Det anbefales derfor at hvis ALI-PBECer dyrkes fra et utgangsmateriale med lavt epitelcelletall med lignende tilnærminger, alltid kontrollerer kulturene for de grunnleggende kvalitetskriteriene, som diskutert i avsnitt 6 i protokollen. Det er viktig at bruken av materceller også kan bidra til å oppnå større celletall, noe som er viktig i en setting for transplanterbar stillasteknikk der tid og cellenummer er avgjørende. Dette illustreres av en studie hvor autologe epitelceller ble dyrket fra biopsier avledet fra en pasient med trakealsykdom, og celler ble raskt utvidet i nærvær av et murine embryonalt materlag (mitotisk inaktiverte 3T3-J2 fibroblaster) og den ovennevnte inhibitoren av Rho / ROCK-banen (Y-27632) 34. Den resulterende cellekulturen ble funnet å være nyttig for repopulasjon av trakealstillas, og dette kunne derfor betraktes som en egnet protokoll for en transplantasjonsmodell.
Ved bruk av protokollen beskrevet i dette bidraget, men også ved bruk av andre kulturprotokoller, introduseres uunngåelig en seleksjonsskjevhet. Det er viktig å innse at forskjeller i protokolldetaljer, for eksempel opprinnelsen til celler som brukes til å initiere kulturer, mediumsammensetning og andre protokolldetaljer, kan føre til endringer i cellulær sammensetning av kulturene og dermed endringer i responsen til ALI-kulturen33,35. I tillegg har forskjeller i celleegenskaper også blitt observert ved sammenligning av forskjellige medier for differensiering av luftveiscellene10,11. Ved sammenligning av PneumaCult og cBD-medium ble det observert forskjeller i begercelle- og klubbcelle-mRNA-markører, TEER-verdier og cellelagtykkelse. Basert på disse observasjonene, til tross for mangelen på statistisk understøttelse, på grunn av det lave antallet donorer som brukes, er mediesammensetningen ukjent for kundene, og høyere kostnader for PneumaCult-mediet, ble beslutningen tatt i vårt laboratorium om å bruke cBD-medium.
Som diskutert kan celler først utvides ved hjelp av organoidkultur og deretter overføres til 2D ALI-innsatssystemet. Dette er viktig, siden luftveisepitelorganoider ikke er egnet for eksponering for luftbårne stoffer, mens bruk av ALI 2D-systemet tillater evaluering av virkningen av luftbårne stoffer som sigarettrøyk23,36 på dyrkede luftveisepitelceller. En annen tilnærming for å etablere ALI-epitelcellekulturer i luftveiene er å generere luftveisepitelceller ved differensiering av humane pluripotente stamceller (hiPSCs)37. I slike protokoller, i sluttfasen av differensieringsprotokollen etter differensiering til proksimale luftveisprogenitorer, kan celler differensieres etter kultur til ALI ved hjelp av prosedyrer som ligner de som er beskrevet her.
I den nåværende protokollen brukes cBD-medium til kultur ved ALI. cBD-medium er et serumfritt medium som fremstilles ved å legge til en blanding av forskjellige kosttilskudd, inspirert av Fulcher et al.38 , samt andre studier. Tilleggsløsningen inneholder 52 μg/ml bovint hypofyseekstrakt (BPE), 0,5 μg/ml hydrokortison, 0,5 ng/ml human EGF, 0,5 μg/ml adrenalin, 10 μg/ml transferrin, 5 μg/ml insulin, 6,5 ng/ml trijodtyronin og 0,1 ng/ml RA39. Siden BPE er et vevekstrakt og blir utsatt for batchvis variasjon, kan mediet ikke betraktes som et fullt definert medium, og det er heller ikke dyrefritt. Cellekulturmedium som er fullstendig definert, foretrekkes for å minimere batch-til-batch-forskjeller. I lys av overgangen til dyrefri forskning er det viktig at det arbeides for å produsere definerte medier som ikke inneholder animalske produkter og som er rimelige for det vitenskapelige samfunnet.
Ulike eksperimentelle oppsett kan brukes basert på ALI-modellen, avhengig av forskningsspørsmålet. For eksempel, for å undersøke virkningen av forbindelser som kan påvirke differensieringsprosessen, kan dette løses ved å tilsette forbindelsene til kulturen under de forskjellige stadier av nedsenket kultur, under differensiering eller på det godt differensierte stadiet. Den cellulære sammensetningen av ALI-PBEC-kulturen kan påvirkes ved å tilsette spesifikke forbindelser; for eksempel genererer differensiering av ALI-PBECs i nærvær av IL-13 en kultur med flere begerceller og færre cilierte celler, mens behandling med γ-sekretasehemmeren DAPT (brukes til å blokkere Notch-signalering) under differensiering resulterer i en kultur med flere cilierte celler på bekostning av begerceller 23,40,41,42.
Videre kan agenter for å stimulere celler eller blokkere visse prosesser enten påføres basalrommet eller (i et svært lite volum) til kulturens apikale rom. Celler kan også bli utsatt for luftbårne stoffer fra den apikale siden. Slike eksponeringsdesign har blitt brukt til å studere effekten av dieseleksos eller hel sigarettrøyk på PBEC23,43,44. Mediet kan høstes hver gang mediet endres for å overvåke utskilte proteiner på basalsiden; det samme gjelder for den apikale siden av cellene som vaskes med PBS mens basalmediet forfriskes. Den såkalte apikale vasken høstes og valgfri dithioerythritol (DTE) tilsettes for å dissosiere slimet som produseres av begercellene mer effektivt. Cellelysater kan oppnås for isolering av totalt protein, RNA og kromosomalt og mitokondrielt DNA. Cellene kan studeres videre ved hjelp av antistoffer for spesifikke markører, ved å kutte polyetylentereftalatmembranen (PET) fra plastinnsatsen og videre kutte denne membranen i mindre biter for flere immunfluorescensfarginger45. Videre kan flowcytometri eller FACS også brukes etter trypsinisering av cellene i innleggene. Under ALI-stadiet kan utviklingen av den cellulære barrieren overvåkes ved å måle den elektriske motstanden og deretter beregne TEER, hvor den elektriske motstanden er omvendt proporsjonal med overflaten av membraninnsatsen. Beregningen er basert på Ohms lov ved å bruke følgende formel: 
, hvor Rm er den målte elektriske motstanden, Rb er den grunnleggende elektriske motstanden til en innsats uten belegg og celler, og SA er overflaten av membranen til innsatsen. Måling av elektrisk motstand ved hjelp av EVOM2 og STX / spisepinne elektroder er enkelt, men svært avhengig av håndteringsprosedyrer ved innføring i brønnen. Formen på elektroden har også blitt foreslått å påvirke målingen av barrierefunksjonen til det relativt store overflatearealet17.
Ytterligere forbedring i ALI-cellekultursystemet, med sikte på å øke nøyaktig vevsrepresentasjon, inkluderer kokultur av ytterligere celletype, som leukocytter, fibroblaster eller endotelceller46,47,48. Det har blitt observert at den samkulturen av ALI-PBEC med granulocytt-makrofagkolonistimulerende faktor (GM-CSF) eller M-CSF-differensierte makrofager påvirker medfødte epitelresponser og reparasjon48. Det er viktig å merke seg at i slike kokulturmodeller kan mediumkompatibilitet være et problem. Siden mediet som brukes til epitelcellekulturen i luftveiene er utviklet spesielt for PBEC og kanskje ikke er optimalt egnet for andre celletyper, er optimalisering nødvendig. En annen type fremskritt sett innen luftveisbiologi som isolerte PBECer kan brukes til, er bruken av Organs-on-Chips (OoC) teknologi49,50. Ved hjelp av denne teknologien kan påvirkningen av de mekaniske kreftene til pust og blodstrøm, som strekk, luft og middels strømning, studeres 29.
Interdonorvariabilitet kan være signifikant ved bruk av PBEC fra ulike donorer, og det er derfor viktig å vurdere å bruke celler fra flere donorer for å ta hensyn til denne variasjonen i epitelcellekulturstudier. Siden kulturen av ALI-PBECs er tidkrevende og forbundet med betydelige kostnader, undersøkes muligheten til å etablere ALI-PBEC-kulturer ved å blande celler fra forskjellige donorer i en cellekulturinnsats. På denne måten kan piloteksperimenter lett utføres ved hjelp av primære celler, før analysere responsene til kulturer avledet fra ulike individuelle givere . I tillegg kan donorer med ulike karakteristika (f.eks. ulik alderskategori eller kjønn) grupperes for eksplorative studier. Ved bruk av donorblandinger er det viktig å sørge for at det er likt antall donorer til stede, for å forhindre muligheten for at en donor dominerer utfallet som følge av en høyere spredningsrate. Derfor utvides celler fra individuelle donorer separat og sås med en høyere tetthet i innsatsen sammenlignet med såceller fra en individuell donor, for å minimere spredning i innsatsen før overgang til ALI. Respons fra donorblandinger og korresponderende enkeltdonorer ble sammenlignet ved å studere infeksjonskinetikken til SARS-CoV-2. Ved hjelp av RT-qPCR og immunfluorescensfarging ble det observert at donorblandingen ga en god representasjon av de ulike enkeltdonorene, ved å vise tilsvarende antall produserte viruspartikler og tilsvarende antall infiserte celler28.
For å bli et akseptabelt alternativ for dyremodeller, bør genredigering av dyrkede bronkiale epitelceller være mulig51. RNA-interferensteknologi ved bruk av små forstyrrende RNA (siRNA) i ALI-PBECs undersøkes, men siden cellene må transfekteres med siRNA under den nedsenkede fasen av kulturen, opprettholdes ikke knockdown tilstrekkelig under ALI-kulturen på grunn av den lange kulturvarigheten, med mindre siRNA-transfeksjon ofte gjentas under kultur52. Likevel kan siRNA med hell brukes til å modifisere genuttrykk i nedsenkede basalceller. Andre har med hell brukt CRISPR / Cas9-teknologi for å oppnå genredigering i primære ALI-luftveisepitelcellekulturer med ribonukleoprotein (RNP) levering 53. Ved bruk av slike teknikker er det viktig at cellene opprettholder sin fulle differensieringskapasitet. Fordi primære luftveiscellekulturer ikke kan passeres på ubestemt tid, er klonal ekspansjon av genredigerte celler ikke lett, og tilsetning av medium for å velge transfekterte celler er tungvint. Derfor er det vanskelig å oppnå den ønskelige knockdown i alle dyrkede celler. Et alternativ til å generere knockout-kloner er bruken av knock-out-strategier i hiPSCs54 og bruken av disse cellene for å generere luftveisepitelceller. Et annet, om enn suboptimalt, alternativ er å etablere en udødeliggjort PBEC-linje for å klonalt utvide genredigerte celler55.
Protokollen som presenteres her er en måte å generere en godt differensiert pseudostratifisert ALI-PBEC, men andre protokoller har også blitt funnet å etablere en slik kultur, med mindre og større forskjeller i forhold til den presenterte protokollen. Etter vår mening er laboratorievalidering av kulturmetoder og streng kvalitetskontroll avgjørende for at ALI-PBEC-systemet og lignende kultursystemer av luftveisepitelceller, skal bli et gyldig alternativ for dyreforsøk.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen relevante interessekonflikter.
Acknowledgments
Studiene som bruker modellen beskrevet i dette bidraget har blitt støttet av en rekke finansieringsorganisasjoner, inkludert Lung Foundation Nederland, Nederlands organisasjon for helseforskning og utvikling (ZonMw, COVID-19 MKMD-stipend), Dutch Society for the Replacement of Animal Testing (Stichting Proefdiervrij, stipend #114025007), samt forskningstilskudd fra selskaper som Boehringer Ingelheim og Galapagos. Figur 1 ble laget med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
| 4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
| Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
| Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
| BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
| Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
| Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
| Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
| Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
| CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
| Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
| CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
| Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
| Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
| Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
| D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
| dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
| EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
| IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
| Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
| Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
| M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
| M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
| MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
| Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
| Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
| Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
| Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
| Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
| Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
| Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
| Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
| Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
| Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
| Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
| Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
| Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
| Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
| Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
| Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
| Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
| Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
| RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
| TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
| Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
| Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
| Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
| Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |
References
- Aghapour, M., et al. Role of air pollutants in airway epithelial barrier dysfunction in asthma and COPD. European Respiratory Review. 31 (163), 210112 (2022).
- de Waal, A. M., Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
- Duchesne, M., Okoye, I., Lacy, P. Epithelial cell alarmin cytokines: Frontline mediators of the asthma inflammatory response. Frontiers in Immunology. 13, 975914 (2022).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Ruysseveldt, E., Martens, K., Steelant, B. Airway basal cells, protectors of epithelial walls in health and respiratory diseases. Frontiers in Allergy. 2, 787128 (2021).
- Alysandratos, K. D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
- Hammad, H., Lambrecht, B. N. Barrier epithelial cells and the control of type 2 immunity. Immunity. 43 (1), 29-40 (2015).
- Hynds, R. E., Bonfanti, P., Janes, S. M. Regenerating human epithelia with cultured stem cells: feeder cells, organoids and beyond. EMBO Molecular Medicine. 10 (2), 139-150 (2018).
- Hiemstra, P. S., Tetley, T. D., Janes, S. M. Airway and alveolar epithelial cells in culture. The European Respiratory Journal. 54 (5), 1900742 (2019).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
- Morgan, R., et al. A medium composition containing normal resting glucose that supports differentiation of primary human airway cells. Scientific Reports. 12 (1), 1540 (2022).
- Ghosh, B., et al. Strong correlation between air-liquid interface cultures and in vivo transcriptomics of nasal brush biopsy. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1056-L1062 (2020).
- Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 300 (1), L25-L31 (2011).
- Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air-liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 465-473 (2011).
- Legebeke, J., et al. Temporal whole-transcriptomic analysis of characterized in vitro and ex vivo primary nasal epithelia. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 907511 (2022).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- van Wetering, S., et al. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. Journal of Investigative Medicine. 48 (5), 359-366 (2000).
- Balk, S. D. Calcium as a regulator of the proliferation of normal, but not of transformed, chicken fibroblasts in a plasma-containing medium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 68 (2), 271-275 (1971).
- Gail, M. H., Boone, C. W., Thompson, C. S. A calcium requirement for fibroblast motility and prolifertion. Experimental Cell Research. 79 (2), 386-390 (1973).
- Dulbecco, R., Elkington, J. Induction of growth in resting fibroblastic cell cultures by Ca. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72 (4), 1584-1588 (1975).
- van Wetering, S., et al. Epithelial differentiation is a determinant in the production of eotaxin-2 and -3 by bronchial epithelial cells in response to IL-4 and IL-13. Molecular Immunology. 44 (5), 803-811 (2007).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. The European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 239-245 (2010).
- Schrumpf, J. A., Ninaber, D. K., vander Does, A. M., Hiemstra, P. S. TGF-β1 impairs vitamin D-induced and constitutive airway epithelial host defense mechanisms. Journal of Innate Immunity. 12 (1), 74-89 (2020).
- Schrumpf, J. A., et al. Proinflammatory cytokines impair vitamin D-induced host defense in cultured airway epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (6), 749-761 (2017).
- Boei, J. J. W. A., et al. Xenobiotic metabolism in differentiated human bronchial epithelial cells. Archives of Toxicology. 91 (5), 2093-2105 (2017).
- Wang, Y., et al. Impact of human airway epithelial cellular composition on SARS-CoV-2 infection biology. bioRxiv. , (2021).
- Nawroth, J. C., et al. Breathing on Chip: Dynamic flow and stretch tune cellular composition and accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. bioRxiv. , (2022).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Eenjes, E., et al. Disease modeling following organoid-based expansion of airway epithelial cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (4), L775-L786 (2021).
- Butler, C. R., et al. Rapid expansion of human epithelial stem cells suitable for airway tissue engineering. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (2), 156-168 (2016).
- Amatngalim, G. D., et al. Antibacterial defense of human airway epithelial cells from chronic obstructive pulmonary disease patients induced by acute exposure to nontypeable Haemophilus influenzae: modulation by cigarette smoke. Journal of Innate Immunity. 9 (4), 359-374 (2017).
- Plebani, R., et al. 3D lung tissue models for studies on SARS-CoV-2 pathophysiology and therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 10071 (2022).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature Biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 107, 183-206 (2005).
- Cao, J., Wong, C. K., Yin, Y., Lam, C. W. K. Activation of human bronchial epithelial cells by inflammatory cytokines IL-27 and TNF-alpha: implications for immunopathophysiology of airway inflammation. The Journal of Cellular Physiology. 223 (3), 788-797 (2010).
- Tsao, P. N., et al. Notch signaling controls the balance of ciliated and secretory cell fates in developing airways. Development. 136 (13), 2297-2307 (2009).
- Laoukili, J., et al. IL-13 alters mucociliary differentiation and ciliary beating of human respiratory epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 108 (12), 1817-1824 (2001).
- Mertens, T. C. J., et al. Cigarette smoke differentially affects IL-13-induced gene expression in human airway epithelial cells. Physiological Reports. 5 (13), e13347 (2017).
- Zarcone, M. C., et al. Effect of diesel exhaust generated by a city bus engine on stress responses and innate immunity in primary bronchial epithelial cell cultures. Toxicology in Vitro. 48, 221-231 (2018).
- vander Does, A. M., et al. Early transcriptional responses of bronchial epithelial cells to whole cigarette smoke mirror those of in-vivo exposed human bronchial mucosa. Respiratory Research. 23 (1), 227 (2022).
- Wang, Y., Ninaber, D. K., van Schadewijk, A., Hiemstra, P. S. Tiotropium and fluticasone inhibit rhinovirus-induced mucin production via multiple mechanisms in differentiated airway epithelial cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 278 (2020).
- Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not M0- or M2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), 0276013 (2022).
- Gindele, J. A., et al. Opposing effects of in vitro differentiated macrophages sub-type on epithelial wound healing. PLoS One. 12 (9), e0184386 (2017).
- van Riet, S., et al. Modulation of airway epithelial innate immunity and wound repair by M(GM-CSF) and M(M-CSF) macrophages. Journal of Innate Immunity. 12 (5), 410-421 (2020).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Stucki, A. O., et al. A lung-on-a-chip array with an integrated bio-inspired respiration mechanism. Lab on a Chip. 15 (5), 1302-1310 (2015).
- Peters-Hall, J. R., et al. Long-term culture and cloning of primary human bronchial basal cells that maintain multipotent differentiation capacity and CFTR channel function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (2), L313-L327 (2018).
- Bartman, C. M., Stelzig, K. E., Linden, D. R., Prakash, Y. S., Chiarella, S. E. Passive siRNA transfection method for gene knockdown in air-liquid interface airway epithelial cell cultures. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), L280-L286 (2021).
- Koh, K. D., et al. Efficient RNP-directed human gene targeting reveals SPDEF is required for IL-13-induced mucostasis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (3), 373-381 (2020).
- Bhargava, N., et al. Development of an efficient single-cell cloning and expansion strategy for genome edited induced pluripotent stem cells. Molecular Biology Reports. 49 (8), 7887-7898 (2022).
- Angelopoulou, A., Papaspyropoulos, A., Papantonis, A., Gorgoulis, V. G. CRISPR-Cas9-mediated induction of large chromosomal inversions in human bronchial epithelial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101257 (2022).
