Summary
여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.
Abstract
기도 상피 세포층은 폐 조직과 외부 환경 사이의 첫 번째 장벽을 형성하여 감염원 및 대기 오염 물질을 포함한 흡입 물질에 지속적으로 노출됩니다. 기도 상피층은 매우 다양한 급성 및 만성 폐 질환에서 중심적인 역할을 하며, 이 상피를 표적으로 하는 다양한 치료법이 흡입에 의해 투여됩니다. 병인에서 상피의 역할과 상피가 치료를 위해 표적이 될 수 있는 방법을 이해하려면 강력하고 대표적인 모델이 필요합니다. 체외 상피 배양 모델이 점점 더 많이 사용되고 있으며 통제된 환경에서 실험을 수행하여 세포를 다양한 종류의 자극, 독성 물질 또는 감염원에 노출시키는 이점을 제공합니다. 불멸화 또는 종양 세포주 대신에 일차 세포를 사용하는 것은 이들 세포가 세포주에 비해 상피의 더 나은 표현을 갖는 가성층화된 분극 상피 세포층으로 배양에서 분화된다는 이점을 갖는다.
여기에 제시된 것은 폐 조직에서 기도 상피 세포의 분리 및 배양을 위해 지난 수십 년 동안 최적화된 강력한 프로토콜입니다. 이 절차는 공기-액체 계면(ALI)에서 배양하여 원발성 기관지 상피 세포(PBEC)의 성공적인 분리, 확장, 배양 및 점막섬모 분화를 가능하게 하며 바이오뱅킹을 위한 프로토콜을 포함합니다. 또한, 세포 특이적 마커 유전자를 사용한 이러한 배양물의 특성화가 설명됩니다. 이러한 ALI-PBEC 배양은 전체 담배 연기 또는 염증 매개체에 대한 노출, 바이러스 또는 박테리아와의 공동 배양/감염을 포함한 다양한 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
절차를 단계별로 설명하는 이 원고에 제공된 프로토콜은 실험실에서 이러한 배양 시스템을 구현하거나 적용하는 데 관심이 있는 사람들에게 기초 및/또는 참고 자료를 제공할 것으로 기대됩니다.
Introduction
다양한 급성 및 만성 폐 질환에서 기도 상피의 역할은 다양한 문헌고찰 1,2,3,4,5,6,7에 기재되어 있다. 기도 상피 세포의 잘 분화된 배양은 기도 상피의 역할을 밝히는 중요한 도구입니다. 공기-액체 계면(ALI) 기도 상피 세포 배양은 기도 기저 상피 세포의 분화를 촉진하고 이를 통해 시험관 내에서 기도 상피를 안정적으로 연구하기 위해 광범위하게 적용됩니다 8,9. 지난 몇 년 동안 COVID-19 대유행과 관련된 새로운 연구 이니셔티브와 전 세계적으로 동물 없는 연구로의 전환의 결과로 이러한 모델의 사용이 더욱 증가했습니다. 따라서 이 모델 세포주의 사용 증가는 강력한 결과를 얻기 위해 절차와 경험을 공유해야 할 필요성을 강조합니다. 이것은 또한 연구 그룹 간의 결과 비교를 가능하게 할 것입니다. 절차의 견고성은 핵심 특성이므로 품질 관리를 받아야 합니다. 여러 실험실에서 ALI에서 일차기도 상피 세포를 배양하기 위한 프로토콜 개발에 투자했습니다. 이러한 절차를 자세히 공유하면 시간, 노력 및 필요한 예산을 줄일 수 있습니다. 이러한 세부사항은, 예를 들어, 다양한 제조업자에 의해 제공된 세포 배양 플라스틱 및 배지의 선택을 포함하는데, 이는 이것이 얻어진 배양물의 특성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌기 때문이다10,11,12. 이는 배양 절차의 경험과 세부 사항을 공유하는 것의 중요성을 강조하는데, 그러한 통찰력이 없으면 결과에 영향을 미치거나 다양한 실험실에서 검증 노력이 방해를 받을 수 있기 때문입니다.
인간 폐 상피는 기저 세포, 섬모 세포, 배 세포 및 클럽 세포와 같은 주요 유형을 포함하여 다양한 세포 유형을 포함합니다. 시험관 내 기도에서 상피 세포층을 신뢰성 있게 모방하기 위해서는 이러한 세포 유형이 배양 모델에서 표현되어야 하며 이들의 분극과 기능이 유지되어야 합니다13,14,15,16. 기증자 특성(질병 상태 포함)과 세포의 해부학적 기원(즉, 비강, 기관, 대기도 및 소기도)이 세포 배양의 세포 구성 및 기능적 반응에 영향을 미칠 수 있다는 인식은 똑같이 중요합니다. 관련 전문 지식과 실습은 일차성 기도 상피 세포를 성공적으로 배양하고 직관적으로(배양 중 육안 검사에 의해) 배양 품질을 정량적으로 평가하기 위한 전제 조건입니다. 이 기여의 목적은 기관 및 소기도 상피 세포의 배양에도 적용할 수 있는 일차 인간 기관지 상피 세포(PBEC)의 분리 및 배양을 위한 비용 및 시간 효율적인 방법을 제공하는 것입니다. 절제된 폐 조직에서 이러한 세포를 분리하는 방법을 설명하는 것 외에도 확장 및 바이오뱅킹 방법, 그리고 마지막으로 합리적인 비용과 기간 내에 잘 분화된 ALI 배양의 확립 및 특성화를 위한 방법을 제시하고 논의합니다.
Protocol
네덜란드 라이덴 대학 의료 센터에서 폐암 절제 수술을 받은 환자로부터 얻은 육안으로 정상적인 폐 조직에서 세포를 분리했습니다. 이 폐 조직이 유래된 환자는 이러한 조직의 코드화된 익명의 추가 사용을 위해 이의 없음 시스템을 통해 바이오뱅크에 등록되었습니다(www.coreon.org). 그러나 2022년 9월 1일부터 환자는 기관 의료 윤리 위원회(B20.042/Ab/ab 및 B20.042/Kb/kb)의 승인을 받아 LUMC 바이오뱅크의 현지 규정에 따라 적극적인 정보에 입각한 동의를 사용하여 바이오뱅크에 등록되었습니다.
알림: 모든 절차는 달리 명시되지 않는 한 현지 생물학적 안전 규칙에 따라 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되며 수술용 장갑과 실험복을 착용한 상태에서 멸균 작업 조건에서 수행됩니다. 프로토콜에 사용된 모든 배지, 시약 및 기타 용액에 대해서는 재료 표 및 보충 표 1을 참조하십시오. 자세한 프로토콜 단계는 그림 1 을 참조하십시오
1. 인간 폐 조직에서 기관지 상피 세포의 분리
참고: 기관지 상피 세포 분리에 대한 최적의 성공률을 얻으려면 절제된 기관지 링을 Primocin이 첨가된 인산염 완충 식염수(PBS)에 최대 4시간 동안 24°C에서 담가두어야 합니다.
- 절차 시작 전 준비
- 보충 표 1에 기재된 바와 같이, PBS에서 코팅 용액을 제조하고, 웰 당 1.5 mL의 코팅 용액으로 적절한 수의 6-웰 플레이트를 코팅한다. 세포 배양 인큐베이터에서 37°C 및 5%CO2에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 코팅할 웰의 수는 절제된 조직의 크기에 따라 다릅니다. 대략적인 지침으로, 절제된 기관지 링이 직경 10mm, 너비 4mm일 때 4개의 6웰 플레이트가 코팅됩니다. - 보충 표 1에 기재된 바와 같이 완전한 각질세포 무혈청 배지(c-KSFM)를 준비하고; 6-웰 플레이트의 웰 당 배지 2 mL를 사용한다.
알림: 이 c-KSFM은 4°C에서 7일 동안 보관할 수 있습니다. c-KSFM은 오염된 섬유아세포의 성장을 억제하면서 기도 상피세포의 확장에 사용되는 저칼슘 배지입니다.
- 보충 표 1에 기재된 바와 같이, PBS에서 코팅 용액을 제조하고, 웰 당 1.5 mL의 코팅 용액으로 적절한 수의 6-웰 플레이트를 코팅한다. 세포 배양 인큐베이터에서 37°C 및 5%CO2에서 2시간 동안 인큐베이션한다.
- 10cm 페트리 접시에 멸균 PBS 10mL로 링을 부드럽게 헹구어 기관지 링을 청소합니다. 핀셋을 사용하여 링을 조심스럽게 잡고(바깥쪽만 만지기) 작은 가위를 사용하여 과도한 결합 조직과 혈액 잔여물을 제거합니다. 추가 처리를 위해 링을 두 개로 자릅니다.
알림: 공정에 사용되는 모든 도구는 사용하기 전에 멸균해야 합니다. - Primocin을 포함한 Hank's balanced salt solution(HBSS)에 미리 예열된 프로테아제 XIV 용액(1.8mg/mL) 10mL에 기관지 고리의 두 반쪽을 밀폐된 멸균 용기에 담그고 세포 배양 배양기에서 37°C에서 정확히 2시간 동안 배양합니다.
참고: HBSS는 2시간 배양 기간 동안 조직에서 세포를 분리하기 위해 프로테아제 XIV의 희석제로 사용됩니다. HBSS는 단기 배양 동안 세포 생존율을 유지할 수 있는 균형 잡힌 등장 용액입니다. - 배양 후 조직 조각을 따뜻한 PBS 10mL가 담긴 페트리 접시에 옮기고 구부러진 핀셋을 사용하여 고리 내부를 긁어 세포 용액을 얻습니다.
참고: 조직이 더 부드럽고 약간 팽창된 것처럼 보입니다. - 링을 버리고, 세포 용액을 50 mL 튜브로 옮기고, 따뜻한 PBS를 첨가하여 50 mL의 최종 부피를 얻는다. 230 x g 및 실온(RT)에서 7분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 펠릿을 따뜻한 PBS 10mL에 재현탁합니다. 또한 따뜻한 PBS로 최대 50mL의 부피를 구성합니다. RT에서 230 x g 에서 7분 동안 원심분리기.
- 상청액을 흡인하고 Primocin을 함유한 따뜻한 c-KSFM의 적절한 양에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
참고: Primocin은 조직에 존재했을 수 있는 박테리아, 곰팡이 또는 (중요하게는) 마이코플라스마를 제거하기 위해 최소 7일 동안 사용됩니다. 7일 후에는 페니실린/스트렙토마이신만 배지에 첨가하면 충분합니다. - 6-웰 플레이트에서 코팅 용액을 흡인하고 웰당 2mL의 세포 현탁액을 추가합니다.
- 80% 내지 90% 밀도에 도달할 때까지 세포가 성장하도록 하고 배지를 일주일에 세 번(예: 매주 월요일, 수요일 및 금요일) 변경합니다. 원하는 밀도는 일반적으로 7일에서 14일 사이에 도달합니다. 원하는 밀도에 도달하는 데 필요한 시간이 14 일을 초과하면 셀을 폐기하십시오.
참고: 처음 며칠 동안은 소수의 세포만 증식하기 시작합니다. 세포 그룹은 며칠 후에 눈에 띄게 나타납니다.
2. 인간 일차 기관지 상피 세포(PBEC)의 냉동 보존
알림: -80 °C 및 -196 °C의 온도에서 작업할 때 보호를 위해 냉동 장갑을 사용하고 핀셋을 사용하여 냉동 바이알을 옮깁니다. 액체 질소로 작업 할 때는 냉동 장갑과 안면 보호대가 개인 보호용으로 사용됩니다.
- 배지를 흡인하고 웰 당 2mL의 따뜻한 PBS로 웰을 한 번 세척합니다.
- 웰 당 0.5 mL의 연질 트립신을 첨가하여 세포를 트립신화한다 (연질 트립신 용액의 조성에 대해서는 보충 표 1 참조). 세포를 37°C에서 5 내지 최대 10분 동안 인큐베이션한다. 플레이트에 트립신 용액을 소용돌이 치고 플레이트를 부드럽게 두드려 세포를 분리합니다.
- 분리된 세포를 페니실린/스트렙토마이신과 함께 KSFM에 용해된 1.1mg/mL 대두 트립신 억제제(SBTI, 트립신 활성 억제)가 들어 있는 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. SBTI의 부피는 연질 트립신의 총 부피의 두 배(즉, 웰당 1mL)여야 합니다.
알림: 셀이 몇 분 안에 다시 부착되므로 SBTI를 웰에 직접 추가하지 마십시오. - RT에서 230 x g 에서 7분 동안 튜브를 원심분리합니다.
- 상층액을 버리고 펠렛화된 세포를 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 RT KSFM 10mL에 재현탁하지만 다른 첨가제는 포함하지 않습니다. 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세십시오. 트리판 블루를 1:1 비율로 추가하여 살아있는/죽은 세포 계수를 수행하거나 다른 살아있는/죽은 세포 계수 절차를 사용하십시오.
- mL 동결 배지 당 400,000 세포의 농도로 세포를 냉동 보존하고 (조성에 대해서는 보충 표 1 참조) cryovial 당 1 mL의이 현탁액을 첨가합니다. cryovials를 coolcell 용기로 옮기고 -80 °C에 두십시오. 24시간 후, 바이알을 -196°C 액체 질소로 옮겨 장기 보관한다.
참고: 세포를 동결 배지로 옮기기 위한 두 가지 옵션이 가능하며, 둘 다 잘 작동합니다: 1) 원심분리에 의해 세포를 다시 펠릿화하고 필요한 세포 농도에서 저온 동결 배지에 재현탁합니다. 또는 2) 저온 동결 배지를 추가하고 세포가 존재하는 KSFM의 부피를 기준으로 극저온 하위(디메틸 설폭사이드[DMSO])의 농도를 조정합니다.
3. 냉동보존된 PBEC를 해동하고 삽입물에서 배양을 위해 재배합니다.
- 뚜껑을 단단히 닫은 상태에서 PBS에 10mL의 코팅 용액으로 T75 세포 배양 플라스크를 밤새 코팅합니다. 플라스크를 37°C 및 5%CO2의 세포 배양 배양기에서 배양한다.
- 냉동보존된 PBEC를 해동하기 전에 플라스크에서 코팅 용액을 제거하고 c-KSFM 10mL로 채웁니다. 세포 배양 인큐베이터에서 37°C로 데우고 뚜껑을 약간 열어 인큐베이터 공기가 들어오도록 합니다.
- 세포를 37°C의 물 또는 비드 수조에서 빠르게 해동합니다.
알림: 비드 배스는 오염 위험이 낮고 에너지 소비가 적기 때문에 수조보다 선호됩니다. - 극저온 혼합물의 전체 함량을 배지로 예열된 T75 플라스크에 첨가하고(단계 3.2) 세포를 고르게 분배한다.
알림: 이 단계에서 세포를 원심분리하지 마십시오.tage는 원심분리 단계에서 살아남지 못하기 때문입니다. - 약 4시간 후 셀이 충분히 부착되었는지 확인합니다. 배지를 신선하고 따뜻한 c-KSFM 10mL로 교체합니다.
알림: 이렇게 하면 동결 매체에서 DMSO가 제거됩니다. 이 단계는 플라스크에 세포를 파종한 후 4시간에서 24시간 사이에 이루어져야 합니다. - 80%에서 90% 밀도에 도달할 때까지 세포를 성장시키고 매주 월요일, 수요일 및 금요일에 배지를 변경합니다.
4. 원발성 기관지 상피 세포(ALI-PBEC)를 이용한 공기-액체 계면 배양 확립
참고: 다음 절차는 11.9mm 내경 인서트에서 PBEC를 배양하기 위한 것입니다.
- 삽입물당 0.4mL의 코팅 용액으로 적절한 수의 세포 배양 삽입물을 코팅합니다. 세포 배양 배양기에서 37°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
- 보충표 1에 기재된 바와 같이 완전한 BD 배지(cBD 배지)를 준비한다.
참고: cBD 배지는 4.10단계에 요약된 바와 같이 ALI에서 레티노산(RA)(또는 본 프로토콜에 사용되는 RA의 유사체) 농도 및 배양의 증가에 따른 분화를 허용하면서 더 오랜 기간 동안 기관지 상피 세포의 성장을 지원하도록 제형화된 복합 배지( 보충 표 1 참조)입니다. - 플라스크당 2mL의 소프트 트립신을 사용하여 T75 플라스크에서 PBEC를 트립신화합니다. 세포가 분리될 수 있도록 5분에서 10분 동안 세포를 배양합니다(육안 검사 기준). 5분 배양 후 플라스크에서 트립신을 소용돌이치게 하고 플라스크를 부드럽게 두드려 세포 분리를 용이하게 합니다(필요한 경우 반복).
- 4mL의 SBTI를 플라스크에 넣고 세포 현탁액을 25mL 원심분리기 튜브로 직접 옮깁니다.
참고: 셀은 몇 분 안에 다시 연결됩니다. 따라서 하나 이상의 플라스크로 작업할 때 SBTI를 두 번째 플라스크에 추가하기 전에 4.4단계에서 얻은 세포 현탁액을 원심분리기 튜브로 직접 옮겨야 합니다. 이 절차에서 최대 5 개의 플라스크가 동시에 처리됩니다. - RT에서 230 x g 에서 7분 동안 튜브를 원심분리합니다.
- 6mL의 cBD 배지에 세포를 재현탁하고 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 합니다. 예를 들어 트리판 블루를 1:1 비율로 추가하거나 다른 살아있는/죽은 세포 계수 절차를 사용하여 살아있는/죽은 세포 계수를 수행합니다.
- 세포 배양 삽입물에서 코팅 용액을 제거합니다.
- 단계 4.6에서 생성된 세포 현탁액을 1nM EC 23이 보충된 cBD 배지로 mL당 80,000 세포의 농도로 희석하고, 삽입물의 멤브레인 상단에 0.5 mL를 첨가한다. 1 nM EC 23으로 보충된 1.5 mL의 cBD 배지를 삽입물 아래의 웰에 첨가한다.
- 배양물이 공기 노출을 위해 준비될 때까지 일주일에 세 번 1nM EC 23이 보충된 cBD 배지로 배지를 교체하십시오(즉, 100% 밀도에 도달한 후 2일). 매번 0.5mL의 배지가 삽입물 내부 (셀)에 추가되고 1.5mL가 하단 구획 (웰)에 추가됩니다.
참고: 일반적으로 세포층은 삽입물에 PBEC를 파종한 후 약 5일 후에 100% 밀도에 도달합니다. 세포의 밀도에 대한 육안 검사를 기반으로 2 일 후에 세포를 ALI 단계로 옮기기로 결정합니다. - 세포가 ALI로 이식할 준비가 되면(즉, 100% 밀도에 도달한 후 2일 후), 삽입물과 웰에서 배지를 제거하고, 삽입물 내부에 새 배지를 추가하지 않고, 새 배지(50nM EC 23이 보충된 cBD 배지 1mL)를 웰에만 추가합니다. 일주일에 세 번 우물의 배지를 교체하십시오.
- 과도한 점액과 세포 파편을 제거하려면 인서트 내부의 세포층의 정점 쪽에 따뜻한 PBS 200μL를 부드럽게 추가하고(가급적이면 인서트 측면을 통해 세포에 직접 피펫팅하지 않음) 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS를 흡인하여 과도한 점액과 세포 파편을 제거합니다.
참고: 이 시점(ALI 배양 시작)부터 하부 구획의 배지를 교체하기 전에 매번 PBS로 세포의 정점 쪽을 세척합니다. - ALI에서 최소 2주 동안 세포를 배양하여 모든 주요 세포 유형이 나타나는지 확인합니다.
5. 혼합 기증자 집단에서 ALI-PBEC 문화 확립
- 최대 5명의 개별 기증자의 세포를 사용하여 혼합 집단에서 PBEC 배양을 시작할 수 있습니다.
- 4.7단계에서 생성된 세포를 사용하여 기증자당 동일한 수의 세포를 혼합하여 삽입물당 총 150,000개의 세포(즉, 5명의 기증자를 사용하는 경우 기증자당 30,000개의 세포)에 도달합니다. 이것은 삽입물에서의 증식이 최소한으로 유지되고 개별 기증자로부터의 동일한 수의 세포가 배양물에 존재한다는 것을 보장할 것이다.
- 4.9-4.12 단계에서 설명한대로 ALI-PBEC 배양을 계속하십시오.
6. ALI-PBEC 문화의 품질 관리
- 세포 배양 중 경 상피 전기 저항(TEER) 모니터링
참고: 전압저항계를 사용하는 것을 기반으로 하는 전기 저항 측정은 ALI-PBEC 배양 중 주어진 시간에 수행할 수 있으며 전기 저항 측정은 전극 위치, 온도, 매체 및 취급을 포함한 다양한 변수의 영향을 받기 때문에 동일한 조건에서 동일한 프로토콜에 따라 매번 수행됩니다. TEER은 옴의 법칙에 기초하여 다음의 공식을 적용하여 측정된 전기 저항을 사용하여 계산될 수 있다:
여기서 Rm은 측정된 전기 저항이고, Rb는 코팅되지 않은 인서트 및 셀의 기준선 전기 저항이고, SA는 인서트(17)의 멤브레인의 표면적이다.- 200μL의 따뜻한 PBS를 세포층의 정점 쪽에 부드럽게 추가하여 세포의 점액과 파편을 제거합니다. 37°C의 세포배양 배양기에서 10분 동안 인큐베이션하고 PBS를 다시 제거한다.
- 700 μL의 따뜻한 PBS를 세포층의 정점 쪽에 부드럽게 첨가하고 측정을 위한 온도의 안정화를 허용하기 위해 RT에서 10분 동안 삽입물을 배양합니다.
- 1,000 Ω 테스트 저항을 사용하여 전압계를 보정하고, 전압저항계를 옴을 측정하도록 설정하고, 드라이버를 사용하여 1,000 Ω로 설정될 때까지 "R ADJ" 교정 나사를 조정합니다.
- 전극을 멸균수(RT)에서 위아래로 몇 번 움직인 다음 멸균 PBS(RT)에서 헹굽니다.
- 인서트에서 세포층의 전기 저항을 측정합니다. 이를 위해 전극의 긴 암이 플레이트 바닥에 닿도록 전극을 웰의 수직 위치에 놓습니다. 이렇게 하면 짧은 팔이 인서트 내부의 세포층 위에 놓입니다. 전압계에 표시된 값을 읽습니다.
알림: 표시된 값은 완전히 안정화되지 않습니다. 값이 간헐적인 순간 값을 읽습니다. - 측정 사이에 멸균 PBS(RT)에서 전극을 위아래로 몇 번 움직여 전극을 청소합니다.
- 측정이 끝나면 멸균수(RT), 멸균 PBS(RT) 및 70% 에탄올(RT)에서 전극을 위아래로 몇 번 움직여 전극을 청소합니다. 전극을 건조한 상태로 보관하십시오.
- 삽입물 내부에 따뜻한 PBS 700μL, 따뜻한 PBS 1mL를 웰에 추가하고 다른 삽입물과 함께 전기 저항을 측정하여 삽입물(코팅 없음) 및 셀의 기준선 측정을 수행합니다.
- ALI-PBEC 배양액의 세포 조성 평가
- ALI 단계에서 박동 섬모를 육안으로 평가하여 차별화를 확인합니다. 이는 표준 명시야 현미경을 통해 세포의 정점 쪽에서 공기 노출 후 빠르면 9일 후에 관찰할 수 있습니다.
알림: 박동 섬모는 정점 표면을 세척한 직후에 가장 잘 보입니다. 배 세포는 점액을 생성하므로 정점 표면을 세척하는 동안 관찰되는 점액의 존재는 배 세포가 형성된다는 신호입니다. 그러나 배 세포의 수준과 생성되는 점액의 양은 기증자에 따라 크게 다릅니다. 점액의 존재는 삽입물에서 세포층의 정점 표면을 세척한 후 PBS를 흡인할 때 볼 수 있습니다. 이 경우, 흡인된 PBS는 더 점성이 있습니다., 흡인하는 동안 점액실이 관찰될 수 있습니다. - 면역염색 및 형광 현미경 또는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 실시간 정량 중합효소 연쇄 반응(RT-qPCR)에 의한 유전자 발현 분석을 이용한 세포 조성의 평가는 배양물의 분화 상태에 대한 중요한 정보를 제공하지만, 그 설명은 이러한 기여의 범위를 벗어납니다.
- ALI 단계에서 박동 섬모를 육안으로 평가하여 차별화를 확인합니다. 이는 표준 명시야 현미경을 통해 세포의 정점 쪽에서 공기 노출 후 빠르면 9일 후에 관찰할 수 있습니다.
그림 1: 원발성 기관지 상피 세포의 분리, 확장 및 배양 절차에 대한 개략도 . (A) 암 절제 수술 중에 폐 조직을 채취하고 병리학자는 육안으로 정상이고 종양이 없는 기관지 고리 조직을 절제합니다. (B) 기관지 고리를 세척하고 효소 처리에 노출시켜 세포층을 분리 및 해리시킵니다. (C) 회수된 세포 현탁액을 세척하고, 세포를 팽창을 위해 6-웰 플레이트의 웰에 분배한다. (D) 프리모신과 함께 c-KSFM에서 분리된 세포가 충분히 확장되면 트립신 처리에 의해 세포층이 해리되고 냉동 보존을 위해 동결 배지에 재현탁됩니다. 필요한 경우 냉동보존된 세포를 해동하고 세포 배양 플라스크에서 페니실린/스트렙토마이신과 함께 c-KSFM을 사용하여 다시 확장합니다. 확장 후, 세포 배양 삽입물 상의 cBD 배지에 시딩됩니다. (ea) ALI-PBEC 배양은 두 가지 주요 단계로 진행됩니다: 세포가 완전히 합류할 때까지 1nM EC 23이 보충된 cBD 배지에 잠긴 단계, 분화를 허용하기 위해 정점 배지 제거 및 ALI에서 배양; 이 ALI 단계에서, 세포는 50 nM EC23으로 보충된 cBD 배지에서 배양된다. (에브) 수중 배양 중 삽입물을 덮는 기저 세포의 그래픽 표현. (에크) EC 23의 증가된 농도의 존재 하에 ALI에서 배양한 후 얻어진 분화된 상피 세포층의 그래픽 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
수중 문화를 이용한 확장
여기에 제시된 방법을 사용하면 액체 질소에 장기간 보관하기 위해 하나의 6웰 플레이트에서 400,000개의 세포/극저온 세포를 가진 평균 8개의 극저온 난을 얻을 수 있습니다(그림 2A). 이를 달성하기 위해 분리된 PBEC는 미생물(특히 마이코플라스마) 오염을 배제하기 위해 Primocin이 있는 상태에서 최소 7일에서 최대 14일 동안 6웰 플레이트에서 배양됩니다(그림 2B). 그림 2A, B는 다양한 기증자로부터 분리된 다양한 세포 수 및 필요한 배양 시간에 대한 통찰력을 제공합니다. 액체 질소에 저장하기 위해 트립신 처리로 세포를 수확하기 전에 밀도가 80% 이상이어야 합니다. 이것이 14일 이내에 달성되지 않으면 세포를 냉동 보존해서는 안 됩니다. 중요한 것은 저장 및 계대배양을 위해 수확할 때 세포층의 밀도가 ~95%를 초과해서는 안 된다는 것입니다(그림 2C). 액체 질소에 보관한 후 ALI 배양을 위한 충분한 세포 수를 얻을 때까지 세포를 해동하고 팽창을 위해 배양할 수 있습니다. 이 단계에서 세포의 확장에 사용되는 배지는 c-KSFM이며, 기관지 고리로부터 수확 후 초기 배양 동안과 유사하다(18). 그러나 폐 조직에서 발생하는 추가 미생물 오염의 위험이 없기 때문에 이 단계에서는 Primocin이 필요하지 않으므로 Primocin을 페니실린/스트렙토마이신으로 변경할 수 있습니다. 이 배지는 섬유아세포보다 상피 세포를 선호하므로 더 빠른 증식 섬유아세포에 의한 배양물의 과증식 가능성을 방지한다 19,20,21. c-KSFM 배지를 사용하면 세포가 플라스크에 퍼지고 서로 연결되지 않는데, 이는 이 단계에서 cBD 배지에 담근 배양 세포의 형태와 현저히 다릅니다(그림 2D, E). T75 플라스크에서 해동된 세포를 5일 또는 6일 동안 배양한 후 세포층은 80%-95% 융합되어야 하며, 이는 총 약 3 x 106개 세포로 변환됩니다(그림 2F). 이를 통해 ALI 배양을 위해 약 75개의 인서트(12웰 플레이트 크기)를 생성할 수 있습니다.
이러한 기여에 기술된 분리 및 배양 방법은 또한 기관지 생검 또는 기관지 브러쉬를 출발 물질로 사용하기 위해 적응시킬 수 있다.
그림 2: 냉동보존 전후의 기저 세포 확장. 세포를 기재된 프로토콜에 따라 단리하고, c-KSFM을 사용하여 배양하였다. 공여자 당 생성된 세포의 수를 모니터링하였고, 살아있는 세포 계수는 6-웰 플레이트로부터 계대 0 (P0) 세포를 수확할 때 자동화된 세포 계수기 (A)를 사용하여 수행하였고 (프로토콜의 단계 2), n=123 공여자, 세포 계수는 웰 당 수확된 세포의 수로서 제시하였고; 각 점은 한 명의 기증자를 나타내고 중앙값은 가로 막대로 표시됩니다. (B) 품질 관리의 일환으로, P0 세포가 6-웰 플레이트에서 80% 내지 90% 컨플루언스에 도달하는 데 필요한 시간을 모니터링하고, c-KSFM (n=127명의 상이한 공여자)에서 침중 배양을 시작한 후 일수로 표시하였다. 각 개별 기증자는 점으로 표시되며 1일에 속하는 모든 점은 선으로 합쳐집니다. 선이 넓을수록 더 많은 기증자를 의미합니다. 세포가 배양되는 평균 일수는 더 얇은 가로 막대로 표시됩니다. (C) 장기 냉동보존을 위해 세포를 수확한 순간 c-KSFM에 잠겨 성장한 P0 세포의 대표적인 명시야 이미지. (D) cBD 배지에 잠겨 성장한 세포를 수확하여 이식한 후 c-KSFM에 잠겨 성장한 P1 세포의 대표적인 명시야 이미지 및 (E) P1 세포를 삽입하여 옮겼다. (f) T75 플라스크로부터 P1 세포를 수확할 때 자동 세포 계수기를 사용하여 공여체당 생성된 살아있는 세포의 수를 모니터링하였고(프로토콜의 섹션 4), n = 63명의 상이한 공여자; 세포 수는 T75 플라스크당 세포 수로 표시되고, 각 기증자는 점으로 표시되며, 중앙값 세포 수는 가로 막대로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
공기-액체 인터페이스(ALI) 배양
ALI 배양 시작 후 7 일에 세포층의 전기 저항이 측정되고 300 Ω 이상이어야합니다 (그림 3A). 이것이 달성되지 않으면, 문화는 단단한 접합 형성의 부족 가능성 때문에 실패한 것으로 간주됩니다. 예를 들어, 세척 및 흡인 중 세포층 손상으로 인한 개별 삽입물의 상피층 손상으로 인해 낮은 TEER 값을 얻을 가능성을 배제하는 것이 좋습니다. 이것은 배양 삽입물의 육안 현미경 검사로 확인할 수 있습니다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, 전기 저항의 공여체 간 가변성은 중요할 수 있으며(그림 3B), 이는 문헌14에도 보고되어 있으며, 관찰된 바와 같이 사용된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)의 기원에 의해서도 현저한 영향을 받습니다(그림 3C).
그림 3: ALI-PBEC 배양의 품질 관리로서의 경상피 전기 저항. PBEC는 분리 및 확장되었으며 잘 분화된 ALI-PBEC 배양이 확립되었습니다. 배양 중 여러 시점에서 전기 저항을 측정한 후 TEER을 계산했습니다(Ω·cm2). (A) 전기 저항은 ALI 후 14일 동안 측정되었습니다. n = 4명의 다른 기증자. 데이터는 표준 편차(SD)± 평균값으로 표시됩니다. (B) ALI-PBEC 세포 배양 품질 관리의 일환으로, ALI 후 7일(n=50) 및 14일(n=25)에 전기 저항을 측정했습니다. 각 점은 하나의 기증자를 나타내고 중앙값 TEER(Ω·cm2)은 가로 막대로 표시됩니다. 데이터는 비모수 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 유의성을 테스트했으며 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다. (C) TEER 형성에 미치는 영향을 평가하기 위해 3개의 다른 DMEM 공급업체의 매체를 테스트했습니다. n = 4명의 다른 기증자; 평균값은 SD± 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
잘 분화된 ALI-PBEC 배양을 확립하면서 공기 노출 시작부터 RA의 농도가 증가합니다22. 이러한 방식으로 세포는 증식에서 점액섬모 분화로 전환되며, 이는 명시야 현미경을 사용하여 공기 노출 후 빠르면 9일(기증자 의존적)에 볼 수 있습니다. 첫 번째 섬모의 이동은 이 시점에서 볼 수 있으며, 분화된 내강 세포의 마커의 유전자 발현에 기초할 때 다소 더 일찍 볼 수 있다(도 23 )(도 4).
프로토콜에 기재된 바와 같이, 점액 생성은 또한 배지 변화 동안 정점 표면을 헹굴 때 관찰될 수 있다. RA는 빛에 매우 민감하며, 이는 동일한 스톡 농도에서 매우 가변적인 활성을 유도합니다. 이러한 이유로, RA는 합성 RA 유사체 EC 23으로 대체되고 동일한 농도로 사용되며, 실험적으로 결정된 것과 유사한 결과를 갖는다. 이러한 이유로 그리고 절차의 변경을 피하기 위해, 선택된 EC 23 농도는 이전에 사용된 RA 농도24,25(즉, 50 nM)와 동일하게 유지되었다(도 5). 도 5A는 상이한 농도의 EC 23을 사용할 때 달성된 TEER 값을 도시하며, 시험된 이 농도 범위 내에서 50 nM에서의 최대 TEER을 나타낸다. 도 5B에 나타낸 결과는 50 nM EC23 또는 RA를 사용하였을 때 섬모 및 잔 세포에 대한 마커의 유전자 발현이 유사함을 확인하였다. EC 23은 수중 단계에서 배양하는 동안에도 필요한데(농도는 훨씬 낮지만), 이 수중 단계에서 생략하고 ALI 단계에서만 추가하면 배양이 완전한 합류도에 도달하지 못하기 때문입니다. 섬모 박동 활성과 점액 생성이 가시적인 잘 분화된 ALI-PBEC 배양을 생성하는 데 필요한 시간은 약 14일이므로 대부분의 실험은 14-21일 ALI 배양 사이에 시작됩니다(그림 4). 모든 주요 세포 유형(기저세포, 섬모세포, 잔세포, 곤봉세포)은 ALI 배양 14일 후에 관찰되지만 발현 수준은 기증자에 따라 크게 다릅니다. 이는 RT-qPCR에 의한 TP63, FOXJ1, MUC5AC 및 SCGB1A1의 유전자 발현을 평가하거나 면역 형광(IF) 염색에 의해 p63, α-튜불린, Muc5AC 및 CC-16에 대한 항체를 사용하여 기저, 섬모, 잔 및 클럽 세포에 대한 마커를 각각 검출함으로써 입증됩니다25,26. 그러나 대부분의 실험에서는 14-21일이 경험 법칙으로 간주될 수 있는 반면, 일부 실험의 경우 생체 이물 대사, SARS-CoV-2 감염 및 점액섬모 청소율평가 27,28,29.
그림 4: 공기-액체 계면(ALI) 배양. PBEC는 분리 및 확장되었으며 잘 분화된 ALI-PBEC 배양이 확립되었습니다. ALI-PBEC 배양은 ALI 후 14일 동안 모니터링되었습니다. 세포 배양은 ALI 후 0일, 7일 및 14일에 RNA 분리를 위해 용해되었습니다. 두 명의 서로 다른 기증자의 데이터가 표시되며, 각 점은 시간이 지남에 따라 모니터링되는 한 명의 개별 기증자를 나타내며 중앙값은 가로 막대로 표시됩니다. 기저, 섬모, 잔 및 클럽 세포 마커 (각각 TP63, FOXJ1, MUC5B 및 SCGB1A1)의 유전자 발현을 qPCR에 의해 측정하고, RPL13A 및 ATP5B 유전자 발현에 대해 표준화하였다 (상세한 내용은 참고문헌 23 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 레티노산(RA)과 그 합성 유사체 EC 23의 비교. PBEC는 분리 및 확장되었으며 잘 분화된 ALI-PBEC 배양이 확립되었습니다. PBEC 배양물의 공기 노출 개시시, RA (50 nM)를 다양한 농도의 EC23으로 대체하였다. (A) ALI 후 14일째에 전기 저항을 측정하고 이어서 TEER을 계산했습니다(Ω·cm2), n=2 공여자, 막대는 평균값을 SD± 나타냅니다. (B) ALI 후 14일째에 qPCR을 사용하여 각각 섬모 세포 및 배 세포(FOXJ1, MUC5AC)에 대한 세포 마커의 RNA 분리 및 후속 유전자 발현 분석을 위해 세포 배양을 용해했습니다. RPL13A(n = 3명의 기증자)에 대해 정규화되었습니다. 50 nM RA로 배양된 ALI-PBEC에 대해 배수 증가가 나타나고 SD± 평균값으로 표시됩니다. (자세한 내용은 참고 문헌 23 참조) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
지난 몇 년 동안 배지 및 배양 플라스틱과 같은 배양 시스템에서 대체 제품의 성능이 조사되었습니다. 이러한 평가에는 제조업체의 매체 구성 변경, 도입된 새로운 미디어, COVID-19 대유행(2020-2022) 동안의 제품 부족 등 다양한 이유가 있었습니다. 최종 세포 조성은 상당히 다를 수 있지만(그림 6A) TEER의 차이는 덜 두드러지지만(그림 6B) 상피 세포 유형의 마커 평가를 기반으로 서로 다른 공급업체의 유사한 제품이 분화된 상피 세포 배양을 초래하는 것으로 관찰되었습니다. 반면에, 상이한 공급 업체의 배지는 세포 조성에 상당한 차이를 가져 왔습니다. 다른 브랜드의 인서트를 사용할 때 이러한 차이는 제한적이었습니다 (그림 6C). 특히, STEMCELL Technologies의 기도 상피 세포 배양 배지 PneumaCult를 사용할 때, 다른 형태와 가시적인 섬모 활성의 보다 빠른 형성이 관찰되었습니다. 이러한 관찰 외에도 cBD 배지와 비교하여 ALI-PBEC의 TEER 값 차이 및 세포 조성의 차이도 주목되었습니다(그림 6D).
그림 6: 상피 세포 배지와 세포 배양 삽입물의 다양한 공급업체 비교. PBEC는 분리, 확장되었으며 잘 분화된 ALI-PBEC 배양이 확립되었습니다. (A) ALI-PBECs를 14일 동안 배양한 후 RNA 분리를 위해 세포층을 용해시켰다. 기저, 섬모, 잔 및 클럽 세포 마커 (각각 TP63, FOXJ1, MUC5AC 및 SCGB1A1)의 유전자 발현을 qPCR에 의해 측정하고, RPL13A 및 ATP5B에 대해 표준화하였다. n = 2 명의 기증자; 막대는 평균값 ± SD를 나타냅니다. (B) ALI 후 9일 동안 전기 저항을 측정한 후 TEER을 계산했습니다(Ω·cm2). n = 3명의 다른 기증자; 평균값은 SD± 표시됩니다. (C) ALI-PBEC를 3개의 다른 공급업체로부터 구입한 세포 배양 삽입물을 사용하여 14일 동안 배양한 다음, RNA 분리를 위해 세포층을 용해했습니다. 섬모, 잔 및 클럽 세포 마커(각각 FOXJ1, MUC5AC 및 SCGB1A1)의 유전자 발현을 qPCR에 의해 측정하고 RPL13A에 대해 표준화했습니다. n = 18개의 상이한 기증자, 막대는 SD± 평균값을 나타낸다. 데이터는 일원 분산 분석 비모수 Kruskal-Wallis 검정을 사용하여 유의성에 대해 테스트되었으며 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다. (D) ALI-PBEC를 ALI 후 14일 동안 cBD 배지 또는 PneumaCult 배지(STEMMCELL 기술)에서 배양한 다음 RNA 분리를 위해 세포층을 용해했습니다. 기저세포, 섬모세포, 잔세포, 클럽세포 마커(각각 TP63, FOXJ1, MUC5B, SCGB1A1)의 유전자 발현을 qPCR로 측정하고 RPL13A 에 대해 정규화하고(막대는 SD± 평균값을 나타냄), ALI 후 5일과 12일에 전기 저항을 측정하고 TEER(Ω·cm2)을 계산하는 데 사용했습니다. n = 2; 평균값은 SD± 표시됩니다(자세한 내용은 참조 23 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1: 프로토콜에 사용된 솔루션 및 매체의 구성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 제시된 프로토콜은 절제된 폐 조직에서 인간 기관지 상피 세포의 분리, 분화 잠재력의 손실 없이 세포의 최적 확장을 위한 방법, 냉동 보존 절차 및 잘 분화된 ALI-PBEC 배양을 생성하는 절차를 설명합니다. 또한 품질 관리에 대한 설명과 차별화된 ALI-PBEC의 모니터링 및 평가 지침이 제공됩니다.
설명된 프로토콜은 폐암 진단과 관련된 수술을 받는 환자의 폐엽에서 절제된 거시적으로 정상적이고 종양이 없는 기관지 링으로 시작합니다. 따라서 이러한 고리는 엄격하게 건강한 조직으로 간주될 수 없으므로 세포 배양 특성에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 기관지 상피 세포를 얻기 위한 대안적인 공급원은 기관지 생검, 기관지 칫솔질, 또는 이식 기증자 또는 수용자 폐로부터의 조직을 사용하는 것을 포함한다. 출처에 관계없이 폐 조직을 사용할 때 미생물 오염 위험을 고려해야하므로 세포 배양의 미생물 오염 위험을 줄이기 위해 다른 배양 배지에서 항생제를 사용합니다. 특히, 마이코플라스마는 세포 배양에 미치는 다양한 영향, 세포 배양에 일반적으로 사용되는 항생제에 대한 내성, 마이코플라스마 오염은 마이코플라스마 검출 분석에 의해서만 확인할 수 있기 때문에 세포 배양에서 높고 흔한 위험입니다. 따라서 폐 조직에서 세포를 분리 한 후 세포 배양의 초기 단계에서 광범위한 항균 제제 인 Primocin을 사용하고 배양 과정에서 무작위로 선택된 샘플을 마이코 플라스마의 존재 여부를 테스트합니다.
기관지 고리로 시작하는 분리 절차는 분화 능력을 손상시키지 않으면서 ALI에서 배양을 시작하는 데 필요한 이러한 일차 세포의 확장 정도를 허용하기에 충분한 출발 물질을 제공합니다. 그러나, 제한된 수의 세포로 분리된 상피 세포의 확장을 시작하면 ALI 배양을 위해 시딩될 수 있는 충분한 수의 세포와 함께 충분한 수의 삽입물을 얻는 데 문제가 발생할 수 있습니다. 일차 세포의 연장된 배양 및 반복적인 계대배양은 복제 노화를 초래할 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 다양한 해결책이 제안되었습니다. Horani 등은 Rho 키나제 억제제(ROCK) Y-27632가 기저 세포의 증식을 증가시킨다는 것을 보여주었고30, Mou 등은 분화된 상피 세포층(31)의 특성을 유지하면서 기저 줄기 세포를 확장하기 위해 이중 Smad 억제를 사용했으며, Sachs 등은 기도 상피 세포를 확장하고 여러 계대 동안 분화 가능성을 유지하는 데 사용할 수 있는 기도 오가노이드 시스템을 개발했습니다32. 후자의 방법은 또한 여기에 설명된 바와 같이 ALI 배양으로 옮기기 전에 조산아(임신 28주령)의 기관 흡인물<(TA) 및 기관지폐포 세척액(BAL)과 같이 세포 수가 매우 낮은 공급원에서 세포를 확장하는 데 사용되었습니다(33). 기관지 폐 화합물 및 TA로부터 분리된 세포는 기관지 조직에서 생성된 세포와 유사한 분화 능력을 보였지만, Notch 신호 전달 억제 또는 Th2 사이토카인 IL-13을 사용하여 분화가 더 섬모 또는 더 많은 잔 함유 배양으로 편향되었을 때 차이가 관찰되었다33. 따라서 유사한 접근법을 사용하여 상피 세포 수가 낮은 출발 물질에서 ALI-PBEC를 배양하는 경우 프로토콜의 섹션 6에서 논의된 대로 항상 기본 품질 기준에 대한 배양을 확인하는 것이 좋습니다. 중요하게도, 영양 세포의 사용은 또한 더 큰 세포 수를 얻는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 시간과 세포 수가 필수적인 이식 가능한 스캐폴드 엔지니어링 환경에서 필수적입니다. 이것은 기관 질환 환자로부터 유래한 생검에서 자가 상피 세포를 배양하고 쥐 배아 영양층(유사분열적으로 비활성화된 3T3-J2 섬유아세포)과 위에서 언급한 Rho/ROCK 경로의 억제제(Y-27632)34. 생성된 세포 배양은 기관 스캐폴드의 재증식에 유용한 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이것은 이식 모델에 적합한 프로토콜로 볼 수 있습니다.
이 기여에 설명된 프로토콜을 사용할 때뿐만 아니라 다른 배양 프로토콜을 사용할 때도 필연적으로 선택 편향이 도입됩니다. 배양을 개시하는 데 사용되는 세포의 기원, 배지 조성 및 기타 프로토콜 세부사항과 같은 프로토콜 세부사항의 차이는 배양의 세포 구성의 변화로 이어질 수 있으며, 이에 따라 ALI 배양의 반응이 변화할 수 있다는 것을 인식하는 것이 중요하다33,35. 또한, 기도 세포를 분화시키기 위한 상이한 배지를 비교할 때 세포 특성의 차이가 또한 관찰되었다10,11. PneumaCult와 cBD 배지를 비교했을 때, 배상 세포와 클럽 세포 mRNA 마커, TEER 값 및 세포층 두께에서 차이가 관찰되었습니다. 이러한 관찰을 바탕으로 통계적 토대가 부족함에도 불구하고 사용된 기증자 수가 적고 배지 구성이 고객에게 알려지지 않았으며 PneumaCult 배지의 비용이 높기 때문에 우리 실험실에서 cBD 배지를 사용하기로 결정했습니다.
앞서 살펴본 바와 같이, 세포는 오가노이드 배양을 사용하여 초기에 확장될 수 있으며, 이후 2D ALI 삽입 시스템으로 옮겨질 수 있습니다. 기도 상피 오가노이드는 공기 중 물질에 노출되기에 적합하지 않은 반면, ALI 2D 시스템을 사용하면 담배 연기23,36과 같은 공기 중 물질이 배양된 기도 상피 세포에 미치는 영향을 평가할 수 있기 때문에 이는 중요합니다. ALI 기도 상피 세포 배양을 확립하기 위한 다른 접근 방식은 인간 만능 줄기 세포(hiPSC)의 분화에 의해 기도 상피 세포를 생성하는 것입니다37. 이러한 프로토콜에서, 근위 기도 전구체로 분화한 후 분화 프로토콜의 최종 단계에서, 세포는 여기에 기술된 것과 유사한 절차를 사용하여 ALI로의 배양에 의해 분화될 수 있다.
현재 프로토콜에서 cBD 배지는 ALI에서 배양에 사용됩니다. cBD 배지는 Fulcher et al.38 및 기타 연구에서 영감을 받은 다양한 보충제를 혼합하여 제조한 무혈청 배지입니다. 보충 용액에는 52μg/mL 소 뇌하수체 추출물(BPE), 0.5μg/mL 하이드로코르티손, 0.5ng/mL 인간 EGF, 0.5μg/mL 에피네프린, 10μg/mL 트랜스페린, 5μg/mL 인슐린, 6.5ng/mL 트리요오드티로닌 및 0.1ng/mL RA39가 포함되어 있습니다. BPE는 조직 추출물이고 배치별 변형을 거치기 때문에 배지는 완전히 정의된 배지로 간주될 수 없으며 동물이 없는 것도 아닙니다. 완전히 규정되어 있는 세포 배양 배지는 배치 간 차이를 최소화하는 것이 바람직하다. 동물성 없는 연구로의 전환을 고려할 때, 동물성 제품을 포함하지 않고 과학계에 적합한 정의된 배지를 생산하기 위한 노력이 중요합니다.
연구 질문에 따라 ALI 모델을 기반으로 다양한 실험 설정을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 분화 과정에 영향을 미칠 수 있는 화합물의 영향을 조사하기 위해 수중 배양의 여러 단계, 분화 중 또는 잘 분화된 단계에서 배양에 화합물을 추가하여 이 문제를 해결할 수 있습니다. ALI-PBEC 배양의 세포 조성은 특정 화합물을 첨가함으로써 영향을 받을 수 있습니다. 예를 들어, IL-13의 존재 하에서 ALI-PBEC를 분화하면 더 많은 배상 세포와 더 적은 섬모 세포로 배양되는 반면, 분화 동안 γ-세크레타제 억제제 DAPT(Notch 신호 전달을 차단하는 데 사용됨)로 처리하면 배 세포를 희생시키면서 더 많은 섬모 세포로 배양됩니다(23,40,41,42).
또한, 세포를 자극하거나 특정 과정을 차단하는 제제는 기저 구획에 또는 (매우 작은 부피로) 배양의 정점 구획에 적용될 수 있습니다. 세포는 또한 정점 쪽에서 공기 중 물질에 노출될 수 있습니다. 이러한 노출 설계는 PBEC 23,43,44에 대한 디젤 배기 가스 또는 전체 담배 연기의 영향을 연구하는 데 사용되었습니다. 배지는 기저부에서 분비된 단백질을 모니터링하기 위해 배지가 변경될 때마다 수확할 수 있습니다. 기저 배지를 상쾌하게 하는 동안 PBS로 세척되는 세포의 정점 측면에도 동일하게 적용됩니다. 소위 정점 세척을 수확하고 선택적 디티오에리트리톨(DTE)을 첨가하여 배 세포에서 생성되는 점액을 보다 효율적으로 해리합니다. 세포 용해물은 총 단백질, RNA, 염색체 및 미토콘드리아 DNA의 분리를 위해 얻을 수 있습니다. 플라스틱 삽입물로부터 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 막을 절단하고 다중 면역형광 염색을 위해 이 막을 더 작은 조각으로 추가로 절단함으로써 특정 마커에 대한 항체를 사용하여 세포를 추가로 연구할 수 있다45. 또한, 유세포 분석 또는 FACS는 삽입물에서 세포의 트립신 처리 후에 사용될 수도 있습니다. ALI 단계에서 전기 저항을 측정하고 이후에 TEER을 계산하여 세포 장벽의 발달을 모니터링할 수 있으며, 여기서 전기 저항은 멤브레인 삽입물의 표면적에 반비례합니다. 계산은 다음 공식을 사용하는 옴의 법칙을 기반으로 합니다: 
여기서 Rm은 측정된 전기 저항이고, Rb는 코팅 및 셀이 없는 삽입물의 기준선 전기 저항이고, SA는 삽입물의 멤브레인의 표면적입니다. EVOM2 및 STX/젓가락 전극을 사용하여 전기 저항을 측정하는 것은 간단하지만 웰에 도입할 때 취급 절차에 크게 의존합니다. 또한, 전극의 형상은 상대적으로 넓은 표면적(17)의 배리어 기능의 측정에 영향을 미치는 것으로 제안되었다.
정확한 조직 표현을 증가시키는 것을 목표로 하는 ALI 세포 배양 시스템의 추가 개선에는 백혈구, 섬유아세포 또는 내피 세포와 같은 추가 세포 유형의 공동 배양이 포함됩니다46,47,48. ALI-PBEC와 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 또는 M-CSF 분화 대식세포의 공동 배양이 선천성 상피 반응 및 복구에 현저한 영향을 미치는 것으로 관찰되었습니다48. 이러한 공동 배양 모델에서는 배지 호환성이 문제가 될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 기도 상피 세포 배양에 사용되는 배지는 PBEC용으로 특별히 개발되었으며 다른 세포 유형에는 최적으로 적합하지 않을 수 있으므로 최적화가 필요합니다. 분리된 PBEC가 사용될 수 있는 기도 생물학 분야에서 볼 수 있는 또 다른 유형의 발전은 OoC(Organs-on-Chips) 기술49,50의 사용이다. 이 기술을 사용하여 스트레칭, 공기 및 중간 흐름과 같은 호흡 및 혈류의 기계적 힘의 영향을 연구 할 수 있습니다 29.
다양한 기증자의 PBEC를 사용할 때 기증자 간 가변성은 중요할 수 있으므로 상피 세포 배양 연구에서 이러한 가변성을 설명하기 위해 여러 기증자의 세포를 사용하는 것을 고려하는 것이 중요합니다. ALI-PBEC의 배양은 시간이 많이 걸리고 상당한 비용이 들기 때문에 하나의 세포 배양 삽입물에서 서로 다른 기증자의 세포를 혼합하여 ALI-PBEC 배양을 확립하는 옵션을 검토합니다. 이러한 방식으로 파일럿 실험은 다양한 개별 기증자로부터 파생된 배양물의 반응을 분석하기 전에 일차 세포를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 또한 탐색적 연구를 위해 다양한 특성(예: 연령 범주 또는 성별)을 가진 기증자를 그룹화할 수 있습니다. 기증자 혼합물을 사용할 때 더 높은 증식률로 인해 한 기증자가 결과를 지배할 가능성을 방지하기 위해 서로 다른 기증자의 동일한 세포 수가 존재하는지 확인하는 것이 중요합니다. 따라서 개별 공여자의 세포는 개별적으로 확장되고 개별 기증자의 파종 세포에 비해 삽입물에서 더 높은 밀도로 시딩되어 ALI로 전환되기 전에 삽입물에서 증식을 최소화합니다. SARS-CoV-2의 감염 동역학을 연구하여 기증자 믹스와 해당 개별 기증자의 반응을 비교했습니다. RT-qPCR 및 면역형광 염색을 사용하여, 생성된 유사한 수의 바이러스 입자와 유사한 수의 감염된 세포를 보여줌으로써 공여체 혼합물이 다양한 개별 기증자를 잘 나타내는 것으로 관찰되었다28.
동물 모델에 대한 수용 가능한 대안이 되려면 배양된 기관지 상피 세포의 유전자 편집이 가능해야 합니다51. 그러나 ALI-PBEC에서 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용하는 RNA 간섭 기술이 검토되지만, 배양의 잠수 단계에서 세포가 siRNA로 형질감염되어야 하기 때문에 배양 중에 siRNA 형질감염이 자주 반복되지 않는 한 배양 기간이 길기 때문에 ALI 배양 중에 녹다운이 충분히 유지되지 않습니다52. 그럼에도 불구하고, siRNA는 물에 잠긴 기저 세포에서 유전자 발현을 변형시키는 데 성공적으로 사용될 수 있습니다. 다른 연구자들은 CRISPR/Cas9 기술을 성공적으로 사용하여 리보핵단백질(ribonucleoprotein, RNP) 전달을 통한 1차 ALI 기도 상피 세포 배양에서 유전자 편집을 달성했다 53. 이러한 기술을 사용할 때 세포가 완전한 분화 능력을 유지하는 것이 필수적입니다. 1차 기도 세포 배양은 무한정 계대배양할 수 없기 때문에 유전자 편집 세포의 클론 확장이 쉽지 않고 형질주입된 세포를 선택하기 위한 배지 추가가 번거롭다. 따라서, 모든 배양된 세포에서 바람직한 녹다운을 달성하는 것은 어렵다. 녹아웃 클론을 생성하는 대안은hiPSCs(54 )에서 녹아웃 전략을 사용하고 이들 세포를 사용하여 기도 상피 세포를 생성하는 것이다. 차선책이기는 하지만 또 다른 대안은 유전자 편집 세포를 클론적으로 확장하기 위해 불멸화된 PBEC 라인을 구축하는것입니다(55).
여기에 제시된 프로토콜은 잘 차별화된 pseudostratified ALI-PBEC를 생성하는 한 가지 방법이지만, 제시된 프로토콜에 비해 점점 더 큰 차이로 이러한 문화를 확립하는 다른 프로토콜도 발견되었습니다. 실험실 전반에 걸쳐 배양 방법에 대한 검증과 엄격한 품질 관리가 ALI-PBEC 시스템 및 기도 상피 세포의 유사한 배양 시스템이 동물 실험의 유효한 대안이 되기 위해서는 필수적입니다.
Disclosures
저자는 관련 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 기여에 설명된 모델을 사용한 연구는 Lung Foundation Netherlands, 네덜란드 보건 연구 개발 기구(ZonMw, COVID-19 MKMD 보조금), 네덜란드 동물 실험 대체 협회(Stichting Proefdiervrij, 보조금 #114025007), Boehringer Ingelheim 및 Galapagos와 같은 회사의 연구 보조금을 포함한 다양한 자금 지원 기관의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 BioRender.com 사용하여 작성되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
| 4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
| Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
| Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
| BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
| Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
| Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
| Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
| Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
| CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
| Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
| CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
| Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
| Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
| Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
| D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
| dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
| EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
| IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
| Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
| Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
| M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
| M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
| MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
| Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
| Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
| Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
| Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
| Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
| Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
| Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
| Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
| Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
| Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
| Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
| Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
| Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
| Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
| Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
| Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
| Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
| Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
| RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
| TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
| Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
| Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
| Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
| Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |
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