Summary
מוצגת כאן שיטה ניתנת לשחזור, משתלמת וחזקה לבידוד והרחבה של תאי אפיתל סימפונות ראשוניים עבור ביו-בנקאות לטווח ארוך ויצירת תאי אפיתל ממוינים על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל.
Abstract
שכבת תאי האפיתל של דרכי הנשימה מהווה את המחסום הראשון בין רקמת הריאה לסביבה החיצונית ולכן היא חשופה כל הזמן לחומרים נשאפים, כולל גורמים זיהומיים ומזהמי אוויר. שכבת האפיתל של דרכי הנשימה ממלאת תפקיד מרכזי במגוון רחב של מחלות ריאה אקוטיות וכרוניות, וטיפולים שונים המכוונים לאפיתל זה ניתנים בשאיפה. הבנת תפקידו של אפיתל בפתוגנזה וכיצד ניתן למקד אותו לטיפול דורשת מודלים חזקים ומייצגים. מודלים של תרביות אפיתל חוץ גופיות נמצאים בשימוש הולך וגובר ומציעים את היתרון של ביצוע ניסויים בסביבה מבוקרת, חשיפת התאים לסוגים שונים של גירויים, רעלים או גורמים זיהומיים. לשימוש בתאים ראשוניים במקום בקווי תאים אימורטליים או סרטניים יש יתרון בכך שתאים אלה מתמיינים בתרבית לשכבת תאי אפיתל מקוטבת פסאודוסטראטית עם ייצוג טוב יותר של האפיתל בהשוואה לקווי תאים.
מוצג כאן פרוטוקול חזק, שעבר אופטימיזציה בעשורים האחרונים, לבידוד ותרבית של תאי אפיתל בדרכי הנשימה מרקמת הריאה. הליך זה מאפשר בידוד מוצלח, הרחבה, תרבית והתמיינות ליחה של תאי אפיתל ראשוניים של הסימפונות (PBECs) על ידי תרבית בממשק אוויר-נוזל (ALI) וכולל פרוטוקול לביו-בנקאות. כמו כן, מתואר אפיון תרביות אלה באמצעות גנים של סמן ספציפי לתא. תרביות ALI-PBEC אלה יכולות לשמש למגוון יישומים, כולל חשיפה לעשן סיגריות שלמות או מתווכים דלקתיים, ותרבית משותפת / זיהום עם וירוסים או חיידקים.
הפרוטוקול המובא בכתב יד זה, הממחיש את ההליך באופן שלב אחר שלב, צפוי לספק בסיס ו/או התייחסות למעוניינים להטמיע או להתאים מערכות תרבות כאלה במעבדתם.
Introduction
תפקידו של אפיתל דרכי הנשימה במגוון מחלות ריאה חריפות וכרוניות תואר בסקירות שונות 1,2,3,4,5,6,7. תרביות ממוינות היטב של תאי אפיתל בדרכי הנשימה הן כלי חשוב לפענוח תפקידו של אפיתל דרכי הנשימה. ממשק אוויר-נוזל (ALI) תרבית תאי אפיתל בדרכי הנשימה מיושמת באופן נרחב כדי לקדם את ההתמיינות של תאי אפיתל בסיסיים של דרכי הנשימה ובכך לחקור את אפיתל דרכי הנשימה באופן אמין במבחנה 8,9. בשנים האחרונות, השימוש במודלים כאלה גדל עוד יותר כתוצאה מיוזמות מחקר חדשות הקשורות למגפת הקורונה ומעבר עולמי למחקר ללא בעלי חיים. לכן, השימוש המוגבר בקו תאי מודל זה מדגיש את הצורך בשיתוף נהלים וחוויות כדי להשיג תוצאות חזקות. זה יאפשר גם השוואת תוצאות בין קבוצות מחקר. החוסן של ההליך הוא מאפיין המפתח ולכן צריך להיות נתון לבקרת איכות. מספר מעבדות השקיעו בפיתוח פרוטוקולים לגידול תאי אפיתל ראשוניים בדרכי הנשימה ב-ALI. ניתן להפחית את הזמן, המאמץ והתקציב הנדרש כאשר נהלים אלה משותפים בפירוט. פרטים אלה כוללים, למשל, את הבחירה של פלסטיק תרבית תאים ומדיה שסופקו על ידי יצרנים שונים, שכן זה נמצא להשפיע על המאפיינים של התרביות שהתקבלו10,11,12. זה מדגיש את החשיבות של שיתוף חוויות ופרטים של נהלי תרבות, שכן בהיעדר תובנות כאלה, התוצאות עשויות להיות מושפעות ו / או מאמצי אימות במעבדות שונות עלולים להיפגע.
אפיתל הריאה האנושי מורכב מסוגי תאים שונים, כולל סוגים עיקריים כגון תאי בסיס, תאים ריסונים, תאי גביע ותאי מועדון. על מנת לחקות באופן אמין את שכבת תאי האפיתל בדרכי הנשימה במבחנה, סוגי תאים אלה צריכים להיות מיוצגים במודלים של תרבית, והקיטוב והתפקוד שלהם נשמרים13,14,15,16. ההבנה כי מאפייני התורם (כולל מצב המחלה) והמקור האנטומי של התאים (כלומר, האף, קנה הנשימה, דרכי הנשימה הגדולות והקטנות) עשויים להשפיע על הרכב התאים ועל התגובות התפקודיות של תרבית התאים חשובה לא פחות. מומחיות ופרקטיקה רלוונטיות הן תנאי מוקדם לתרבית מוצלחת של תאי אפיתל ראשוניים בדרכי הנשימה ולהעריך את איכות התרבית הן באופן אינטואיטיבי (על ידי בדיקה חזותית במהלך התרבית) והן כמותית. מטרת תרומה זו היא לספק שיטה חסכונית וחסכונית בזמן לבידוד ולתרבית של תאי אפיתל ראשוניים של הסימפונות האנושיים (PBECs) שניתן ליישם גם בתרבית של תאי אפיתל קנה הנשימה ודרכי נשימה קטנות. בנוסף לתיאור שיטה לבידוד תאים כאלה מרקמת ריאה שנכרתה, מוצגת ונדונה שיטה להרחבה וביו-בנקאות, ולבסוף להקמה ואפיון של תרבית ALI מובחנת היטב בתוך עלות ופרק זמן סבירים.
Protocol
התאים בודדו מרקמת ריאה תקינה מקרוסקופית שהתקבלו מחולים שעברו ניתוח כריתה לסרטן ריאות במרכז הרפואי האוניברסיטאי ליידן, הולנד. חולים שמהם נגזרת רקמת ריאה זו נרשמו לביובנק באמצעות מערכת ללא התנגדות לשימוש אנונימי מקודד ברקמה כזו (www.coreon.org). עם זאת, מאז 01-09-2022, מטופלים נרשמו לביובנק באמצעות הסכמה מדעת פעילה בהתאם לתקנות המקומיות של הביובנק LUMC באישור ועדת האתיקה הרפואית המוסדית (B20.042/Ab/ab ו-B20.042/Kb/kb).
הערה: כל ההליכים מבוצעים בארון בטיחות ביולוגי, על פי כללי בטיחות ביולוגיים מקומיים, ובתנאי עבודה סטריליים תוך לבישת כפפות כירורגיות וחלוק מעבדה, אלא אם צוין אחרת. עבור כל המדיה, ריאגנטים ופתרונות אחרים המשמשים בפרוטוקול, עיין בטבלת החומרים ובטבלה משלימה 1. עיין באיור 1 לקבלת שלבי פרוטוקול מפורטים
1. בידוד תאי אפיתל הסימפונות מרקמת הריאה האנושית
הערה: כדי להשיג שיעור הצלחה אופטימלי לבידוד תאי אפיתל הסימפונות, טבעת הסימפונות שנכרתה צריכה להישמר שקועה ב -4 ° C למשך מקסימום של 24 שעות במי מלח חוצצים פוספט (PBS) עם תוספת פרימוצין.
- הכנות לפני תחילת ההליך
- הכינו תמיסת ציפוי ב-PBS, כמתואר בטבלה משלימה 1, וציפו מספר מתאים של לוחות 6 בארות בתמיסת ציפוי של 1.5 מ"ל לכל באר. דגירה במשך שעתיים באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
הערה: מספר הבארות שיש לצפות תלוי בגודל הרקמה שנכרתה. כהנחיה גסה, ארבעה לוחות 6 בארות מצופים כאשר טבעת הסימפונות שנכרתה היא בקוטר 10 מ"מ וברוחב 4 מ"מ. - הכינו מדיום שלם ללא קרטינוציטים בסרום (c-KSFM), כמתואר בטבלה משלימה 1; השתמש 2 מ"ל של המדיום לכל באר של צלחת 6 באר.
הערה: ניתן לאחסן C-KSFM זה ב-4°C למשך 7 ימים. c-KSFM הוא מדיום דל סידן המשמש להרחבת תאי אפיתל בדרכי הנשימה תוך עיכוב הצמיחה של פיברובלסטים מזהמים.
- הכינו תמיסת ציפוי ב-PBS, כמתואר בטבלה משלימה 1, וציפו מספר מתאים של לוחות 6 בארות בתמיסת ציפוי של 1.5 מ"ל לכל באר. דגירה במשך שעתיים באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.
- נקו את טבעת הסימפונות על ידי שטיפה עדינה של הטבעת ב-10 מ"ל PBS סטרילי בצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ. השתמשו בפינצטה כדי להחזיק בזהירות את הטבעת (נגעו רק בחוץ), ובמספריים קטנים כדי להסיר עודפי רקמת חיבור ושאריות דם. לעיבוד נוסף, חותכים את הטבעת לשניים.
הערה: יש לעקר את כל הכלים המשמשים בתהליך לפני השימוש. - יש לטבול את שני חצאי טבעת הסימפונות ב-10 מ"ל של תמיסה מחוממת מראש של פרוטאז XIV (1.8 מ"ג/מ"ל) בתמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS), כולל פרימוצין במיכל סטרילי סגור, ולדגור במשך שעתיים בדיוק ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרביות תאים.
הערה: HBSS משמש כמדלל עבור פרוטאז XIV כדי לנתק את התאים מהרקמה במהלך תקופת דגירה של שעתיים. HBSS הוא פתרון איזוטוני מאוזן המאפשר שמירה על כדאיות התא במהלך דגירות קצרות טווח. - לאחר הדגירה, מעבירים את חתיכות הרקמה לצלחת פטרי עם 10 מ"ל PBS חם ומגרדים את החלק הפנימי של הטבעת באמצעות פינצטה כפופה כדי לקבל תמיסת תאים.
הערה: הרקמה נראית רכה יותר ומורחבת במקצת. - השליכו את הטבעת, העבירו את תמיסת התא לצינור של 50 מ"ל והוסיפו PBS חם לקבלת נפח סופי של 50 מ"ל. צנטריפוגה למשך 7 דקות ב 230 x גרם ובטמפרטורת החדר (RT).
- שואפים את הסופרנאטנט ומשעיפים מחדש את הגלולה ב -10 מ"ל של PBS חם. יתר על כן, לפצות את נפח עד 50 מ"ל עם PBS חם. צנטריפוגה למשך 7 דקות ב 230 x גרם ב RT.
- שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא בכמות מתאימה של c-KSFM חם המכיל פרימוצין.
הערה: הפרימוצין משמש במשך 7 ימים לפחות כדי לחסל חיידקים, פטריות, או (חשוב) מיקופלסמה שעשויים להיות נוכחים ברקמה; לאחר 7 ימים, תוספת של פניצילין/סטרפטומיצין בלבד למדיום מספיקה. - שאפו את תמיסת הציפוי מלוחות 6 הבארות והוסיפו 2 מ"ל של תרחיף תאים לכל באר.
- אפשרו לתאים לגדול עד שמגיעים למפגש של 80% עד 90% ושנו את התווך שלוש פעמים בשבוע (למשל, כל יום שני, רביעי ושישי). מידת המפגש הרצויה מושגת בדרך כלל בין 7 ל -14 ימים; אם הזמן הדרוש כדי להגיע למפגש הרצוי עולה על 14 ימים, השליכו את התאים.
הערה: בימים הראשונים, רק מספר קטן של תאים מתחילים להתרבות; קבוצות של תאים מורגשות לאחר מספר ימים.
2. שימור בהקפאה של תאי אפיתל ראשוניים של הסימפונות האנושיים (PBECs)
הערה: כאשר עובדים עם טמפרטורות של -80 °C ו- -196 °C, כפפות הקפאה משמשות להגנה, ופינצטה משמשת להעברת בקבוקונים קפואים. כאשר עובדים עם חנקן נוזלי, כפפות קריו-כפפות ומגן פנים משמשים להגנה אישית.
- שואפים את המדיום ושוטפים את הבארות פעם אחת עם 2 מ"ל של PBS חם לכל באר.
- טריפסין התאים על ידי הוספת 0.5 מ"ל טריפסין רך לכל באר (ראה טבלה משלימה 1 להרכב תמיסת הטריפסין הרכה). לדגור על התאים במשך 5 עד מקסימום של 10 דקות ב 37 ° C. מערבלים את תמיסת הטריפסין בצלחת ומשחררים את התאים על ידי הקשה עדינה על הצלחת.
- מעבירים את התאים המנותקים לצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל המכיל מעכב טריפסין סויה במינון 1.1 מ"ג/מ"ל (SBTI; לעיכוב פעילות טריפסין) המומס ב-KSFM עם פניצילין/סטרפטומיצין. נפח SBTI חייב להיות כפול מהנפח הכולל של טריפסין רך (כלומר, 1 מ"ל לכל באר).
הערה: אל תוסיף SBTI ישירות לבארות, מכיוון שהתאים יתחברו מחדש תוך דקות. - צנטריפוגה את הצינור למשך 7 דקות ב 230 x גרם ב RT.
- יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את התאים הכדוריים ב-10 מ"ל של RT KSFM המכיל פניצילין/סטרפטומיצין אך ללא תוספים אחרים. ספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי. בצע ספירת תאים חיים/מתים על-ידי הוספת כחול טריפאן ביחס של 1:1, או השתמש בהליך חלופי של ספירת תאים חיים/מתים.
- Cryoלשמר את התאים בריכוז של 400,000 תאים לכל מדיום הקפאה מ"ל (עיין בטבלה משלימה 1 להרכב) ולהוסיף 1 מ"ל של תרחיף זה לכל קריוביאלי. מעבירים את הקריובלים למיכל Coolcell ומניחים אותו בטמפרטורה של -80°C. לאחר 24 שעות, העבירו את הבקבוקונים לחנקן נוזלי בטמפרטורה של -196°C לאחסון לטווח ארוך.
הערה: שתי אפשרויות אפשריות להעברת התאים למדיום הקפאה, ושתיהן פועלות היטב: 1) להניף את התאים שוב על ידי צנטריפוגה ולהשהות מחדש בתווך הקפאה קר בריכוז התאים הנדרש; או 2) להוסיף מדיום הקפאה קר ולהתאים את ריכוז cryopreservant (dimethyl sulfoxide [DMSO]) בהתבסס על נפח KSFM שבו התאים נמצאים.
3. הפשרת PBECs בהקפאה וגידולם לתרבית על תוספות
- צפו בקבוק תרבית תאים T75 למשך הלילה בתמיסת ציפוי של 10 מ"ל ב-PBS כשהמכסים סגורים היטב. לדגור את הבקבוק באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C ו 5% CO2.
- לפני הפשרת PBECs cryopserved, להסיר את תמיסת הציפוי מן הבקבוק ולמלא אותו עם 10 מ"ל של c-KSFM. תן לו להתחמם ל 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאים, עם מכסים פתוחים מעט כדי לאפשר לאינקובטור אוויר להיכנס.
- הפשירו את התאים במהירות באמבט מים או חרוזים בטמפרטורה של 37°C.
הערה: אמבטיית חרוזים עדיפה על פני אמבט מים בגלל הסיכון הנמוך יותר לזיהום וצריכת אנרגיה נמוכה יותר. - הוסף את התוכן המלא של cryovial לבקבוק T75 שחומם מראש עם בינוני (שלב 3.2) ולהפיץ את התאים באופן שווה.
הערה: אין לבצע צנטריפוגות לתאים בשלב זה, מכיוון שהם לא ישרדו את שלב הצנטריפוגה. - לאחר כ-4 שעות, ודא שהתאים מחוברים מספיק. החלף את המדיום עם 10 מ"ל של c-KSFM טרי וחם.
הערה: בדרך זו, DMSO ממדיום ההקפאה מוסר. שלב זה צריך להתרחש בין 4 שעות ל 24 שעות לאחר זריעת התאים בצלוחית. - לגדל את התאים עד 80% עד 90% מפגש הוא הגיע, לשנות את המדיום כל שני, רביעי, ושישי.
4. הקמת תרבית ממשק אוויר-נוזל עם תאי אפיתל ראשוניים של הסימפונות (ALI-PBEC)
הערה: ההליך הבא מיועד לתרבית של PBECs על תוספות בקוטר פנימי של 11.9 מ"מ.
- צפו מספר מתאים של תוספות תרבית תאים ב-0.4 מ"ל של תמיסת ציפוי לכל תוספת. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של תרביות תאים.
- הכינו מדיום BD מלא (מדיום cBD), כמתואר בטבלה משלימה 1.
הערה: מדיום cBD הוא מדיום מרוכב (ראה טבלה משלימה 1) שנוסח כדי לתמוך בצמיחה של תאי אפיתל הסימפונות לפרקי זמן ארוכים יותר, תוך מתן אפשרות התמיינות שלהם בעקבות עלייה בריכוז ובתרבית של חומצה רטינואית (RA) (או אנלוגית של RA כפי שמשמש בפרוטוקול הנוכחי) ב- ALI, כמתואר בשלב 4.10. - טריפסיניזציה של PBECs בבקבוק T75, באמצעות 2 מ"ל של טריפסין רך לכל בקבוק. דגרו על התאים במשך 5 עד 10 דקות כדי לאפשר לתאים להתנתק (בהתבסס על בדיקה חזותית). לאחר 5 דקות של דגירה, להקל על ניתוק של התאים על ידי ערבול טריפסין בבקבוק והקשה עדינה על הבקבוק (לחזור במידת הצורך).
- הוסף 4 מ"ל של SBTI לבקבוק ולהעביר ישירות את השעיית התא לצינור צנטריפוגה 25 מ"ל.
הערה: התאים מתחברים מחדש תוך דקות. לכן, כאשר עובדים עם יותר מבקבוק אחד, יש להעביר ישירות את מתלה התא המתקבל בשלב 4.4 לצינור צנטריפוגה לפני הוספת SBTI לצלוחית שנייה. בהליך, מקסימום של חמש צלוחיות מעובדים בו זמנית. - צנטריפוגה את הצינורות במשך 7 דקות ב 230 x גרם ב RT.
- להשהות מחדש את התאים ב 6 מ"ל של מדיום cBD ולספור את התאים באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי. בצע ספירת תאים חיים/מתים על-ידי, לדוגמה, הוספת כחול טריפאן ביחס של 1:1, או באמצעות הליך ספירת תאים חיים/מתים אחר.
- הסר את תמיסת הציפוי מתוספות תרבית התא.
- לדלל את תרחיף התא, שנוצר בשלב 4.6, עם מדיום cBD בתוספת 1 nM EC 23 לריכוז של 80,000 תאים למ"ל, ולהוסיף 0.5 מ"ל על החלק העליון של הממברנה בעלון. הוסף 1.5 מ"ל של cBD בינוני בתוספת 1 nM EC 23 לבאר שמתחת לעלון.
- שנה את המדיום עם מדיום cBD בתוספת 1 ננומטר EC 23 שלוש פעמים בשבוע עד שהתרביות מוכנות לחשיפה לאוויר (כלומר, יומיים לאחר 100% מפגש הוא הגיע). בכל פעם, 0.5 מ"ל של המדיום מתווסף בתוך הכנס (על התאים) ו 1.5 מ"ל מתווסף לתא התחתון (הבאר).
הערה: באופן כללי, שכבת התא מגיעה למפגש של 100% כ-5 ימים לאחר זריעת ה-PBECs על התוספות. בהתבסס על בדיקה חזותית של מפגש התאים, מתקבלת ההחלטה להעביר את התאים לשלב ALI יומיים לאחר מכן. - כאשר התאים מוכנים להעברה ל- ALI (כלומר, יומיים לאחר שהגיעו למפגש של 100%), הסר את התווך מהתוספות ומהבאר, אל תוסיף מדיום חדש בתוך העלון, והוסף תווך חדש (1 מ"ל של מדיום cBD בתוספת 50 ננומטר EC 23) רק לבאר. לשנות את המדיום בבארות שלוש פעמים בשבוע.
- כדי להסיר עודפי ריר ופסולת תאית, יש להוסיף בעדינות 200 μL של PBS חם בצד האפי של שכבת התא בתוך האינסרט (רצוי דרך הצד של האינסרט ולא על ידי פיפטינג ישיר על התאים) ולדגור במשך 10 דקות באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C. לאחר מכן, שאפו ל-PBS לסלק עודפי ריר ופסולת תאית.
הערה: מנקודה זו ואילך (תחילת תרבית ALI), לפני שינוי התווך של התא התחתון, שטפו את הצד האפי של התאים עם PBS בכל פעם. - תרבית את התאים ב- ALI למשך שבועיים לפחות כדי לוודא שכל סוגי התאים העיקריים מיוצגים.
5. ביסוס תרבות ALI-PBEC מאוכלוסיית תורמים מעורבת
- השתמש בתאים של עד חמישה תורמים בודדים כדי להתחיל תרביות PBEC מאוכלוסייה מעורבת.
- ערבבו מספר שווה של תאים לכל תורם באמצעות התאים שנוצרו בשלב 4.7 כדי להגיע לסך של 150,000 תאים בכל תוספת, (כלומר, 30,000 תאים לכל תורם בעת שימוש בחמישה תורמים). זה יבטיח שההתרבות בעלון תישמר למינימום ומספר שווה של תאים מהתורמים הבודדים נמצאים בתרבית.
- המשך את תרבות ALI-PBEC כמתואר בשלבים 4.9-4.12.
6. בקרת איכות של תרבות ALI-PBEC
- ניטור התנגדות חשמלית טרנס אפיתל (TEER) במהלך תרבית תאים
הערה: מדידת ההתנגדות החשמלית, המבוססת על שימוש במד וולטומטר, יכולה להתבצע בכל זמן נתון במהלך תרבית ALI-PBEC ומבוצעת בכל פעם על פי אותו פרוטוקול ובאותם תנאים, שכן מדידת ההתנגדות החשמלית מושפעת ממשתנים שונים, כולל מיקום האלקטרודה, טמפרטורה, מדיום וטיפול. ניתן לחשב TEER באמצעות ההתנגדות החשמלית הנמדדת על ידי יישום הנוסחה הבאה המבוססת על חוק אוהם:
, כאשר Rm היא ההתנגדות החשמלית הנמדדת, Rb היא ההתנגדות החשמלית הבסיסית של אינסרט ללא ציפוי ותאים, ו- SA הוא שטח הפנים של הממברנה של הכנס17.- הוסיפו בעדינות 200 μL של PBS חם לצד האפי של שכבת התא כדי להסיר את הריר והפסולת על התאים. יש לדגור על האינסטרוקציה למשך 10 דקות באינקובטור של תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C ולהסיר שוב את ה-PBS.
- הוסיפו בעדינות 700 μL של PBS חם לצד האפי של שכבת התא ודגרו על האינסרט למשך 10 דקות ב-RT כדי לאפשר ייצוב הטמפרטורה למדידות.
- כייל את מד הוולטוהמטר באמצעות נגד הבדיקה של 1,000 Ω, הגדר את מד המתח למדידת אוהם, והשתמש במברג כדי לכוונן את בורג הכיול "R ADJ" עד להגדרה של 1,000 Ω.
- שטפו את האלקטרודה על ידי הזזתה למעלה ולמטה מספר פעמים במים סטריליים (RT) ולאחר מכן ב-PBS סטרילי (RT).
- מדוד את ההתנגדות החשמלית של שכבת התא בתוספות. לשם כך, הניחו את האלקטרודה במצב אנכי בבאר כאשר זרועה הארוכה של האלקטרודה נוגעת בתחתית הצלחת. בדרך זו, הזרוע הקצרה נמצאת מעל שכבת התא בתוך העלון. קרא את הערך המוצג על מד הוולטוהמטר.
הערה: הערך המוצג לא יתייצב במלואו; קרא את הערך ברגע שהערך לסירוגין. - בין מדידה, נקו את האלקטרודה על ידי הזזתה למעלה ולמטה מספר פעמים ב-PBS סטרילי (RT).
- נקה את האלקטרודה בסיום המדידות על ידי הזזתה למעלה ולמטה מספר פעמים במים סטריליים (RT), PBS סטרילי (RT) ואתנול 70% (RT). יש לאחסן את האלקטרודה יבשה.
- בצע מדידה בסיסית של תוספות (ללא ציפוי) ותאים על ידי הוספת 700 מיקרוליטר PBS חם בתוך האינסרט ו-1 מ"ל PBS חם לבאר ומדידת ההתנגדות החשמלית לצד שאר התוספות.
- הערכת ההרכב התאי של תרבית ALI-PBEC
- במהלך שלב ALI, בדוק את ההבחנה על ידי הערכה חזותית של ריסונים מכות. ניתן לצפות בהם באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי כבר 9 ימים לאחר החשיפה לאוויר בצד האפי של התאים.
הערה: ריסונים מכים נראים בצורה הטובה ביותר מיד לאחר שטיפת המשטח האפיקאלי. תאי גביע מייצרים ריר, ולכן נוכחות של ריר, כפי שנצפתה במהלך שטיפת המשטח האפיקאלי, היא סימן לכך שנוצרים תאי גביע. עם זאת, רמת תאי הגביע וכמות הריר המיוצרת תלויה מאוד בתורם. נוכחות של ריר ניתן לראות בעת שאיפה PBS לאחר שטיפת פני השטח apical של שכבת התא בעלון; במקרה זה, PBS שואף הוא צמיג יותר, חוטי ריר ניתן לראות בזמן שאיפה. - הערכת הרכב התא באמצעות אימונוסטינינגים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS), או ניתוח ביטוי גנים על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (RT-qPCR) מספקת מידע חשוב על מצב ההתמיינות של התרבית, אך תיאורה חורג מהיקף תרומה זו.
- במהלך שלב ALI, בדוק את ההבחנה על ידי הערכה חזותית של ריסונים מכות. ניתן לצפות בהם באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי כבר 9 ימים לאחר החשיפה לאוויר בצד האפי של התאים.
איור 1: סקירה סכמטית של הליך הבידוד, ההתרחבות והתרבית של תאי אפיתל ראשוניים של הסימפונות . (A) רקמת ריאה מתקבלת במהלך ניתוח כריתת סרטן והפתולוג כורת רקמת טבעת סימפונות שהיא תקינה מבחינה מקרוסקופית וללא גידולים. (B) טבעת הסימפונות מנוקה ונחשפת לטיפול אנזימטי כדי לנתק ולנתק את שכבת התא. (C) תרחיף התא המוחזר נשטף והתאים מופצים בבארות של צלחת בת 6 בארות לצורך הרחבה. (D) עם הרחבה מספקת של התאים המבודדים ב-c-KSFM עם פרימוצין, שכבות התאים מנותקות על ידי טריפסיניזציה והתאים מרחפים מחדש בתווך הקפאה לצורך שימור בהקפאה. בעת הצורך, תאים שמורים בהקפאה מופשרים ומורחבים שוב באמצעות c-KSFM עם פניצילין/סטרפטומיצין בצלוחיות תרבית תאים. לאחר הרחבתם, הם נזרעים בתווך cBD על תוספות תרבית תאים; (יא) תרבית ALI-PBEC מתרחשת בשני שלבים עיקריים: השלב השקוע בתווך cBD בתוספת 1 ננומטר EC 23 עד שהתאים מגיעים למפגש מלא, ואחריו הסרת התווך האפי והתרבית ב- ALI כדי לאפשר התמיינות; בשלב ALI זה, התאים מתורבתים בתווך cBD בתוספת 50 ננומטר EC 23. (יב) ייצוג גרפי של תאי בסיס המכסים את העלון במהלך תרבית שקועה. (א"ק) ייצוג גרפי של שכבת תאי אפיתל ממוינת המתקבלת בעקבות תרבית ב- ALI בנוכחות ריכוזים מוגברים של EC 23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Representative Results
התרחבות באמצעות תרבות שקועה
באמצעות השיטה המוצגת כאן, ניתן להשיג בממוצע שמונה קריובלים עם 400,000 תאים/קריוביאליים מצלחת אחת בת 6 בארות לאחסון לטווח ארוך בחנקן נוזלי (איור 2A). כדי להשיג זאת, PBECs מבודדים מתורבתים בצלחות של 6 בארות למשך 7 ימים לפחות ומקסימום של 14 יום (איור 2B) בנוכחות פרימוצין, כדי למנוע זיהום מיקרוביאלי (במיוחד מיקופלסמה). איור 2A,B מספק תובנה לגבי מספרי התאים שהתקבלו וזמן התרבית הנדרש בין בידודים שונים מתורמים שונים. לפני קצירת התאים על ידי טריפסיניזציה לאחסון בחנקן נוזלי, המפגש חייב להיות מעל 80%. אם זה לא מושג בתוך 14 ימים, התאים לא צריך להיות cryopreserved. חשוב לציין, בעת קציר לאחסון ומעבר, המפגש של שכבת התא לא יעלה על ~95% (איור 2C). לאחר אחסון בחנקן נוזלי, ניתן להפשיר את התאים ולגדל אותם בתרבית לצורך התרחבות עד לקבלת מספר תאים מספיק עבור תרביות ALI. התווך המשמש להרחבת התאים בשלב זה הוא c-KSFM, בדומה לתרבית הראשונית לאחר הקציר מטבעת הסימפונות18. עם זאת, אין צורך בפרימוצין בשלב זה, מכיוון שהסיכון לזיהום מיקרוביאלי נוסף שמקורו ברקמת הריאה אינו קיים, ולכן ניתן להחליף פרימוצין בפניצילין/סטרפטומיצין. מדיום זה מעדיף תאי אפיתל על פני פיברובלסטים ולכן מונע צמיחת יתר אפשרית של התרבית על ידי פיברובלסטים מתרבים מהר יותר 19,20,21. באמצעות תווך c-KSFM, התאים מפוזרים בבקבוק ואינם מתחברים זה לזה, דבר השונה במידה ניכרת מהמורפולוגיה של תאים בתרבית השקועים בשלב זה בתווך cBD (איור 2D,E). לאחר 5 או 6 ימים של תרבית התאים המופשרים בצלוחית T75, שכבת התא צריכה להיות 80%-95% במפגש, מה שמתורגם לכ-3 x 106 תאים בסך הכל (איור 2F). מכאן, ניתן להפיק כ -75 תוספות (גודל צלחת 12 בארות) לתרבות ALI.
שיטת הבידוד והתרבית המתוארת בתרומה זו יכולה להיות מותאמת גם לשימוש עם ביופסיות סימפונות או מברשות סימפונות כחומר מוצא.
איור 2: התרחבות תאי הבסיס לפני ואחרי שימור בהקפאה. התאים בודדו על פי הפרוטוקול המתואר וגודלו בתרבית באמצעות c-KSFM. מספר התאים שנוצרו לכל תורם נוטר, ספירת התאים החיים בוצעה באמצעות מונה תאים אוטומטי (A) בעת קצירת תאי המעבר 0 (P0) מלוחות 6 הקידוחים (שלב 2 של הפרוטוקול), n = 123 תורמים, ספירת התאים הוצגה כמספר התאים שנקצרו לכל באר; כל נקודה מייצגת תורם אחד והחציון מסומן בסרגל אופקי. (B) כחלק מבקרת איכות, הזמן הדרוש לתאי P0 כדי להגיע למפגש של 80% עד 90% בלוחות 6 הקידוחים נוטר והוצג כימים לאחר תחילת התרבית השקועה ב-c-KSFM (n = 127 תורמים שונים). כל תורם בודד מסומן על ידי נקודה, כל הנקודות השייכות ליום אחד מתמזגות לקו; ככל שהקו רחב יותר, כך הוא מייצג יותר תורמים; מספר הימים החציוני שבו נמצאים התאים בתרבית מסומן על ידי פס אופקי דק יותר. (C) תמונת שדה בהיר מייצגת של תאי P0 שגדלו שקועים ב-c-KSFM ברגע שבו התאים נקצרו לצורך שימור בהקפאה לטווח ארוך. (D) תמונת שדה בהיר מייצגת של תאי P1 שגדלו שקועים ב-c-KSFM ברגע שהתאים נקצרו והועברו לתוספות, ו-(E) תאי P1 שגדלו שקועים בתווך cBD. (F) מספר התאים החיים שנוצרו לכל תורם נוטר באמצעות מונה תאים אוטומטי בעת קצירת תאי P1 מבקבוק T75 (סעיף 4 לפרוטוקול), n = 63 תורמים שונים; ספירת התאים מוצגת כמספר התאים לכל צלוחיות T75, כל תורם מסומן בנקודה, וספירת התאים החציונית מסומנת על ידי פס אופקי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תרבות ממשק אוויר-נוזל (ALI)
7 ימים לאחר תחילת תרבית ALI, ההתנגדות החשמלית של שכבת התא נמדדת וצריכה להיות יותר מ-300 Ω (איור 3A); אם זה לא מושג, התרבות נחשבת ככישלון בגלל חוסר אפשרי של היווצרות צומת הדוק. מומלץ לשלול את האפשרות לקבל ערכי TEER נמוכים הנגרמים כתוצאה מפגיעה בשכבת האפיתל בתוספות בודדות הנובעת, למשל, מפגיעה בשכבת התא במהלך שטיפה ושיפה. ניתן לבדוק זאת על ידי בדיקה מיקרוסקופית חזותית של תוספות התרבית. מניסיוננו, השונות בין התורמים בהתנגדות החשמלית יכולה להיות משמעותית (איור 3B), אשר מדווח גם בספרות14, וכפי שנצפה הוא מושפע במידה ניכרת גם ממקורו של תווך העיט המעובד של דולבקו (DMEM) המשמש (איור 3C).
איור 3: התנגדות חשמלית טרנס-אפיתל כבקרת איכות של תרביות ALI-PBEC. PBECs בודדו והורחבו, ותרבויות ALI-PBEC מובחנות היטב הוקמו. במספר נקודות זמן במהלך התרבית נמדדה התנגדות חשמלית, ולאחר מכן חושב ה-TEER (Ω· ס"מ2). (A) התנגדות חשמלית נמדדה במהלך 14 יום לאחר ALI. n = 4 תורמים שונים. הנתונים מתוארים כערך הממוצע ± סטיית תקן (SD). (B) כחלק מבקרת האיכות של תרביות תאים ALI-PBEC, נמדדה התנגדות חשמלית ביום 7 (n = 50) וביום 14 לאחר ALI (n = 25); כל נקודה מייצגת תורם אחד וה-TEER החציוני (Ω·cm2) מסומן על ידי סרגל אופקי. הנתונים נבדקו למובהקות באמצעות מבחן מאן-ויטני לא פרמטרי, ולא נמצא הבדל משמעותי. (C) מדיה משלושה ספקי DMEM שונים נבדקה כדי להעריך את ההשפעה על היווצרות TEER. n = 4 תורמים שונים; ערכים ממוצעים מתוארים ± SD. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תוך ביסוס תרבות ALI-PBEC מובחנת היטב, מתחילת החשיפה לאוויר, ריכוז RA עולה22. בדרך זו, תאים עוברים מהתרבות להתמיינות ליחה, אשר נראית כבר 9 ימים (תלוי בתורם) לאחר חשיפה לאוויר באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. תנועה של ריסונים ראשונים נראית בנקודה זו, ומעט מוקדם יותר כאשר היא מבוססת על ביטוי גנים של סמנים של תאים לומינליים ממוינים23 (איור 4).
כפי שמתואר בפרוטוקול, ניתן לראות ייצור ריר גם בעת שטיפת המשטח האפי במהלך השינוי הבינוני. RA רגיש מאוד לאור, מה שמוביל לפעילות משתנה מאוד באותו ריכוז מניות. מסיבה זו, RA מוחלף על ידי אנלוגי RA סינתטי EC 23 ומשמש באותו ריכוז, עם תוצאות דומות כפי שנקבע בניסוי. מסיבה זו וכדי להימנע משינוי הנוהל, ריכוז EC 23 שנבחר נשמר שווה לריכוז RA (כלומר, 50 ננומטר) ששימש בעבר24,25 (איור 5). איור 5A מתאר את ערכי ה-TEER שהושגו בעת שימוש בריכוזים שונים של EC 23, ומראה TEER מקסימלי ב-50 ננומטר בטווח הריכוזים הזה שנבדק. התוצאות המוצגות באיור 5B מאשרות כי ביטוי גנים של סמנים עבור תאים ריסניים ותאי גביע דומה בעת שימוש ב-50 ננומטר EC 23 או RA. EC 23 נדרש גם במהלך התרבית בשלב השקוע (אם כי בריכוז נמוך בהרבה), שכן השמטתו בשלב שקוע זה והוספתו רק בשלב ALI יוצרת תרבות שלעולם אינה מגיעה למפגש מלא. הזמן הדרוש ליצירת תרבית ALI-PBEC מובחנת היטב עם פעילות פעימות ריסניות נראות לעין וייצור ריר הוא בסביבות 14 יום, ולכן רוב הניסויים מתחילים בין תרביות ALI של 14-21 יום (איור 4). כל סוגי התאים העיקריים (תאי בסיס, ריסון, גביע וקלאב) נצפים במשך 14 יום של תרבית ALI, אם כי רמות הביטוי תלויות מאוד בתורם. זה מודגם על ידי הערכת ביטוי גנים של TP63, FOXJ1, MUC5AC, ו SCGB1A1 על ידי RT-qPCR, או ביטוי חלבון באמצעות נוגדנים המכוונים נגד p63, α-tubulin, Muc5AC, ו CC-16 על ידי צביעה פלואורסצנטית חיסונית (IF), כדי לזהות סמנים עבור תאי בסיס, ciliated, גביע ומועדון, בהתאמה25,26 . עם זאת, בעוד 14-21 ימים עשויים להיחשב ככלל אצבע עבור רוב הניסויים, עבור ניסויים נבחרים, משך זמן ארוך יותר של התמיינות עשוי להיחשב, כפי שנמצא עבור מטבוליזם קסנוביוטיקה, זיהום SARS-CoV-2, ואת הערכת פינוי ליחה27,28,29.
איור 4: תרבית ממשק אוויר-נוזל (ALI). PBECs בודדו והורחבו, ותרבויות ALI-PBEC מובחנות היטב הוקמו. תרביות ALI-PBEC נוטרו במשך 14 יום לאחר ALI. תרביות תאים נערכו לצורך בידוד RNA בימים 0, 7 ו-14 לאחר ALI. מוצגים נתונים משני תורמים שונים, כל נקודה מייצגת תורם בודד אחד המנוטר לאורך זמן, והחציון מסומן על ידי סרגל אופקי. ביטוי גנים של סמני תאי בסיס, ריסון, גביע ומועדון (TP63, FOXJ1, MUC5B ו-SCGB1A1, בהתאמה) נמדד על ידי qPCR ונורמל עבור ביטוי גנים RPL13A ו-ATP5B (ראו הפניה 23 לפרטים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: השוואה בין חומצה רטינואית (RA) לבין האנלוגיה הסינתטית שלה EC 23. PBECs בודדו והורחבו, ותרבויות ALI-PBEC מובחנות היטב הוקמו. עם תחילת החשיפה לאוויר של תרביות PTEC, RA (50 ננומטר) הוחלף בריכוזים שונים של EC 23. (A) התנגדות חשמלית נמדדה ביום ה-14 שלאחר ה-ALI ולאחר מכן חושב ה-TEER (Ω·cm 2), n =2 תורמים, העמודות מתארות את הערך הממוצע ±-SD. (B) ביום ה-14 שלאחר ה-ALI, תרביות תאים עברו ליזה לצורך בידוד RNA וניתוח ביטוי גנים עוקב של סמני תאים עבור תאי ריסון וגביע בהתאמה (FOXJ1, MUC5AC) באמצעות qPCR, ומנורמל עבור RPL13A (n = 3 תורמים). גידול בקיפול מוצג כנגד ALI-PBEC בתרבית עם 50 ננומטר RA ומתואר כערך הממוצע ± SD. (ראה הערה 23 לפרטים) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בשנים האחרונות נבחנו ביצועיהם של מוצרים אלטרנטיביים במערכת התרבות, כגון המדיה והפלסטיק התרבותי. היו סיבות שונות להערכות כאלה, ביניהן שינויים בהרכב הבינוני של היצרנים, הכנסת מדיה חדשה וכן מחסור במוצרים במהלך מגפת הקורונה (2020-2022). התצפית נעשתה שמוצרים דומים מספקים שונים גורמים לתרביות תאי אפיתל ממוינים בהתבסס על הערכת סמנים של סוגי תאי אפיתל, אף על פי שההרכב התאי הסופי עשוי להשתנות באופן משמעותי (איור 6A), בעוד שההבדלים ב-TEER היו פחות בולטים (איור 6B). לעומת זאת, מדיום מספקים שונים הביא להבדלים ניכרים בהרכב הסלולר; בעת שימוש בתוספות של מותגים שונים, הבדלים אלה היו מוגבלים (איור 6C). בפרט, בעת שימוש במדיום תרבית תאי אפיתל של דרכי הנשימה PneumaCult מבית STEMCELL Technologies, נצפתה מורפולוגיה שונה והיווצרות מהירה יותר של פעילות ריסנית נראית לעין. מלבד תצפיות אלה, נצפה גם הבדל בערכי TEER והבדל בהרכב התאי של ALI-PBEC בהשוואה למדיום cBD (איור 6D).
איור 6: השוואה בין ספקים שונים של תווך תאי אפיתל ותוספות תרבית תאים. PBEC היו מבודדים, מורחבים ומובחנים היטב תרבויות ALI-PBEC הוקמו. (A) ALI-PBECs גודלו בתרבית במשך 14 יום, ולאחר מכן שכבות התא עברו ליזה לצורך בידוד RNA. ביטוי גנים של סמני תאי בסיס, ריסונים, גביעים ותאי מועדון (TP63, FOXJ1, MUC5AC, ו-SCGB1A1, בהתאמה) נמדד על ידי qPCR ונורמל עבור RPL13A ו-ATP5B. n = 2 תורמים; העמודות מתארות את הערך הממוצע ± SD. (B) במהלך 9 ימים לאחר ALI נמדדה התנגדות חשמלית ולאחר מכן חושב ה-TEER (Ω·cm2). n = 3 תורמים שונים; ערכים ממוצעים מתוארים ± SD. (C) ALI-PBECs תורבתו במשך 14 יום באמצעות תוספות תרבית תאים שנרכשו משלושה ספקים שונים, ולאחר מכן שכבות התא עברו ליזה לצורך בידוד RNA. ביטוי גנים של סמנים של תאי ציליאט, גביע ומועדון (FOXJ1, MUC5AC, ו-SCGB1A1, בהתאמה) נמדד על ידי qPCR ונורמל עבור RPL13A. n = 18 תורמים שונים, העמודות מתארות את הערך הממוצע ± SD. הנתונים נבדקו למובהקות באמצעות מבחן קרוסקל-וואליס חד כיווני ANOVA לא פרמטרי ולא נמצא הבדל משמעותי. (D) ALI-PBECs גודלו בתרבית בתווך cBD או בתווך PneumaCult (טכנולוגיות STEMMCELL) במשך 14 יום לאחר ALI, ואז שכבות התא עברו ליזה לצורך בידוד RNA. ביטוי גנים של סמני תאי בסיס, ריסון, גביע ומועדון (TP63, FOXJ1, MUC5B ו-SCGB1A1, בהתאמה) נמדד על ידי qPCR ונורמל עבור RPL13A (הפסים מתארים את הערך הממוצע ± SD), והתנגדות חשמלית נמדדה בימים 5 ו-12 לאחר ALI ושימשה לחישוב TEER (Ω·cm2). n = 2; הערך הממוצע מתואר ± SD (ראה הערה 23 לפרטים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה משלימה 1: הרכב הפתרונות והמדיה המשמשים בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
הפרוטוקול המוצג כאן מתאר בידוד של תאי אפיתל סימפונות אנושיים מרקמת ריאה שנכרתה, שיטה להתרחבות אופטימלית של תאים ללא אובדן פוטנציאל התמיינות, הליך שימור בהקפאה, והליך ליצירת תרביות ALI-PBEC ממוינות היטב. יתר על כן, ניתן תיאור של בקרת איכות, כמו גם הוראות לניטור והערכה של ALI-PBECs מובחנים.
הפרוטוקול המתואר מתחיל בטבעת סימפונות תקינה מבחינה מקרוסקופית, נטולת גידולים, הנכרתת מאונת ריאה מחולים שעברו ניתוח הקשור לאבחון סרטן הריאות שלהם. לכן יש לציין כי טבעות אלה בהחלט לא יכולות להיחשב כרקמה בריאה, ולכן עשויות להשפיע על מאפייני תרבית התא. מקורות חלופיים להשגת תאי אפיתל של הסימפונות כוללים שימוש בביופסיות סימפונות, צחצוח סימפונות או רקמות מתורם מושתל או ריאות מושתל. ללא קשר למקור, בעת שימוש ברקמת ריאה יש לקחת בחשבון סיכון לזיהום מיקרוביאלי, ולכן אנטיביוטיקה משמשת באמצעי התרבית השונים כדי להפחית את הסיכון לזיהום מיקרוביאלי של תרבית התא. בפרט, מיקופלסמה היא סיכון גבוה ונפוץ בתרבית תאים, בגלל מגוון רחב של השפעות על תרבית תאים, עמידות לאנטיביוטיקה הנפוצה בתרבית תאים, והעובדה כי זיהום מיקופלסמה יכול להיות מאושר רק על ידי בדיקות זיהוי מיקופלסמה. לכן, בשלב הראשוני של תרבית תאים לאחר בידוד התאים מרקמת הריאה, נעשה שימוש בניסוח האנטי-מיקרוביאלי רחב הספקטרום פרימוצין, ובמהלך תהליך התרבית, דגימות שנבחרו באופן אקראי נבדקות לנוכחות מיקופלסמה.
הליך הבידוד המתחיל בטבעת סימפונות מספק חומר מוצא מספיק כדי לאפשר את מידת ההתרחבות של תאים ראשוניים אלה הדרושים להתחלת תרביות ב- ALI מבלי לפגוע ביכולת ההתמיינות. עם זאת, התחלת ההתרחבות של תאי אפיתל מבודדים עם מספר מוגבל של תאים עלולה להוות בעיה עם השגת מספר מספיק של תוספות עם מספיק תאים שניתן לזרוע עבור תרבית ALI. תרבית ממושכת ומעבר חוזר ונשנה של תאים ראשוניים עלולים לגרום להזדקנות משוכפלת. הוצעו פתרונות שונים כדי להתגבר על מגבלה זו. Horani et al. הראו כי מעכב Rho kinase (ROCK) Y-27632 הגביר את התפשטות תאי הבסיס30, Mou et al. השתמשו בעיכוב Smad כפול כדי להרחיב תאי גזע בסיסיים תוך שמירה על המאפיינים של שכבת תאי אפיתל ממוינים 31, ו Sachs et al. פיתחו מערכת אורגנואידים של דרכי הנשימה שניתן להשתמש בה כדי להרחיב תאי אפיתל של דרכי הנשימה ולשמור על פוטנציאל ההתמיינות שלהם במהלך מעברים מרובים32. השיטה האחרונה שימשה גם להרחבת תאים ממקורות בעלי מספר תאים נמוך מאוד, כגון שואבי קנה הנשימה (TAs) מפגים (גיל <28 שבועות להריון) ונוזל שטיפה ברונכואלבאולרי (BAL), לפני העברתם לתרבית ALI כמתואר כאן33. נמצא כי תאים שבודדו מ-BAL ו-TAs הראו יכולת התמיינות דומה לתאים שנוצרו מרקמת הסימפונות, אם כי הבדלים נצפו כאשר ההתמיינות הייתה מוטה לכיוון תרביות המכילות יותר תאי גביע או יותר באמצעות עיכוב איתות Notch או ציטוקין Th2 IL-1333. לכן מומלץ שאם ALI-PBECs מתורבתים מחומר מוצא עם מספרי תאי אפיתל נמוכים בגישות דומות, לבדוק תמיד את התרביות עבור קריטריוני האיכות הבסיסיים, כפי שנדון בסעיף 6 של הפרוטוקול. חשוב לציין, השימוש בתאי הזנה עשוי גם לסייע בהשגת מספר תאים גדול יותר, דבר חיוני בסביבה להנדסת פיגומים להשתלה שבה זמן ומספר תאים חיוניים. הדבר מומחש על ידי מחקר שבו תאי אפיתל אוטולוגיים גודלו בתרבית מביופסיות שמקורן בחולה עם מחלת קנה הנשימה, ותאים הורחבו במהירות בנוכחות שכבת הזנה עוברית מורין (פיברובלסטים 3T3-J2 מומתים מיטוטית ) והמעכב הנ"ל של מסלול Rho/ROCK (Y-27632)34. תרבית התאים שהתקבלה נמצאה שימושית לאכלוס מחדש של פיגומי קנה הנשימה, ולכן ניתן לראות בכך פרוטוקול מתאים למודל השתלה.
בעת שימוש בפרוטוקול המתואר בתרומה זו, אך גם בעת שימוש בפרוטוקולי תרבות אחרים, באופן בלתי נמנע מוצגת הטיית בחירה. חשוב להבין כי הבדלים בפרטי הפרוטוקול, כגון מוצא התאים המשמשים ליזום תרביות, הרכב בינוני ופרטי פרוטוקול אחרים, יכולים להוביל לשינויים בהרכב התא של התרביות ובכך לשינויים בתגובת תרבית ALI33,35. בנוסף, הבדלים בתכונות התא נצפו גם בעת השוואת מדיה שונה להבחנה בין תאי דרכי הנשימה10,11. כאשר השוו בין PneumaCult לבין מדיום cBD, נצפו הבדלים בסמני mRNA של תאי גביע ותאי מועדון, ערכי TEER ועובי שכבת התא. בהתבסס על תצפיות אלה, למרות היעדר ביסוס סטטיסטי, בשל מספר התורמים הנמוך בו נעשה שימוש, ההרכב הבינוני אינו ידוע ללקוחות, והעלויות הגבוהות יותר של מדיום PneumaCult, הוחלט במעבדה שלנו להשתמש בתווך cBD.
כפי שנדון, תאים ניתן להרחיב תחילה באמצעות תרבית אורגנואידים ולאחר מכן להעביר למערכת החדרת 2D ALI. זה חשוב, שכן אורגנואידים אפיתל דרכי הנשימה אינם מתאימים לחשיפה לחומרים הנישאים באוויר, ואילו השימוש במערכת ALI2D מאפשר להעריך את ההשפעה של חומרים הנישאים באוויר כגון עשן סיגריות 23,36 על תאי אפיתל של דרכי הנשימה בתרבית. גישה שונה לביסוס תרביות תאי אפיתל בדרכי הנשימה של ALI היא יצירת תאי אפיתל בדרכי הנשימה על ידי התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSCs)37. בפרוטוקולים כאלה, בשלב הסופי של פרוטוקול ההתמיינות לאחר התמיינות לאבות דרכי הנשימה הפרוקסימליות, תאים יכולים להיות ממוינים על ידי תרבית ל- ALI באמצעות הליכים דומים לאלה המתוארים כאן.
בפרוטוקול הנוכחי, מדיום cBD משמש לתרבות ב- ALI. cBD medium הוא מדיום ללא סרום כי הוא מוכן על ידי הוספת תערובת של תוספי מזון שונים, בהשראת Fulcher et al.38 , כמו גם מחקרים אחרים. תמיסת התוסף מכילה 52 מיקרוגרם/מ"ל תמצית יותרת המוח מפרות (BPE), 0.5 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון, 0.5 נ"ג/מ"ל EGF אנושי, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל אפינפרין, 10 מיקרוגרם/מ"ל טרנספרין, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 6.5 נ"ג/מ"ל טריודותירונין ו-0.1 נ"ג/מ"ל RA39. מכיוון ש-BPE היא תמצית רקמה ונתונה לשינויים חכמים באצווה, המדיום אינו יכול להיחשב כמדיום מוגדר במלואו, וגם אינו נטול בעלי חיים. מדיום תרבית תאים המוגדר במלואו עדיף כדי למזער את הבדלי אצווה לאצווה. לאור המעבר למחקר ללא בעלי חיים, חשוב שייעשו מאמצים לייצר מדיה מוגדרת שאינה מכילה מוצרים מן החי ובמחיר סביר לקהילה המדעית.
ניתן להשתמש במערכי ניסוי שונים המבוססים על מודל ALI, בהתאם לשאלת המחקר. לדוגמה, כדי לחקור את ההשפעה של תרכובות שעשויות להשפיע על תהליך ההתמיינות, ניתן לטפל בכך על ידי הוספת התרכובות לתרבות במהלך השלבים השונים של התרבות השקועה, במהלך ההתמיינות, או בשלב המובחן היטב. ההרכב התאי של תרבית ALI-PBEC יכול להיות מושפע על ידי הוספת תרכובות ספציפיות; לדוגמה, התמיינות ALI-PBECs בנוכחות IL-13 יוצרת תרבית עם יותר תאי גביע ופחות תאים ריסונים, בעוד שטיפול במעכב γ-secretase DAPT (המשמש לחסימת איתות Notch) במהלך התמיינות מביא לתרבית עם יותר תאים ריסונים על חשבון תאי גביע 23,40,41,42.
יתר על כן, חומרים כדי לעורר תאים או לחסום תהליכים מסוימים יכולים להיות מיושמים על התא הבסיסי או (בנפח קטן מאוד) על התא האפי של התרבית. תאים יכולים גם להיחשף לחומרים הנישאים באוויר מהצד האפיקאלי. עיצובי חשיפה כאלה שימשו לחקר ההשפעה של פליטת דיזל או עשן סיגריות שלמות על PBECs23,43,44. ניתן לקצור את המדיום בכל פעם שהמדיום משתנה כדי לפקח על חלבונים המופרשים בצד הבסיסי; כנ"ל לגבי הצד האפי של התאים שנשטף עם PBS תוך רענון המדיום הבסיסי. מה שנקרא שטיפה אפית הוא קציר אופציונלי dithioerythritol (DTE) מתווסף כדי לנתק את הריר המיוצר על ידי תאי גביע בצורה יעילה יותר. ניתן להשיג ליזטים של תאים לבידוד של סך כל החלבון, הרנ"א והדנ"א הכרומוזומלי והמיטוכונדריאלי. ניתן להמשיך ולחקור את התאים באמצעות נוגדנים לסמנים ספציפיים, על ידי חיתוך קרום הפוליאתילן טרפתאלט (PET) מתוספת הפלסטיק וחיתוך נוסף של קרום זה לחתיכות קטנות יותר עבור כתמים אימונופלואורסצנטיים מרובים45. יתר על כן, ציטומטריית זרימה או FACS ניתן להשתמש גם לאחר טריפסיניזציה של התאים בתוספות. בשלב ה-ALI ניתן לעקוב אחר התפתחות המחסום התאי על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית ולאחר מכן חישוב ה-TEER, כאשר ההתנגדות החשמלית עומדת ביחס הפוך לשטח הפנים של החדרת הממברנה. החישוב מבוסס על חוק אוהם באמצעות הנוסחה הבאה: 
, כאשר Rm היא ההתנגדות החשמלית הנמדדת, Rb היא ההתנגדות החשמלית הבסיסית של אינסרט ללא ציפוי ותאים, ו- SA הוא שטח הפנים של הממברנה של העלון. מדידת ההתנגדות החשמלית באמצעות אלקטרודות EVOM2 ו-STX/מקל אכילה היא פשוטה אך תלויה מאוד בהליכי הטיפול בעת הכנסתה לבאר. כמו כן, הוצע כי צורת האלקטרודה משפיעה על מדידת פונקציית המחסום של שטח הפנים הגדול יחסית17.
שיפור נוסף במערכת תרביות תאי ALI, שמטרתו להגדיל את ייצוג הרקמה המדויק, כולל תרבית משותפת של סוגי תאים נוספים, כגון לויקוציטים, פיברובלסטים או תאי אנדותל46,47,48. נצפה כי תרבית משותפת של ALI-PBEC עם גרנולוציטים-מקרופאגים-גורם מגרה מושבה (GM-CSF) או מקרופאגים ממוינים M-CSF משפיעה במידה ניכרת על תגובות אפיתל מולדות ותיקון48. חשוב לציין כי במודלים כאלה coculture, תאימות בינונית יכולה להיות בעיה. מכיוון שהתווך המשמש לתרבית תאי אפיתל בדרכי הנשימה פותח במיוחד עבור PBECs ועשוי שלא להתאים באופן אופטימלי לסוגי תאים אחרים, יש צורך באופטימיזציה. סוג נוסף של התקדמות שנצפה בתחום הביולוגיה של דרכי הנשימה שעבורו ניתן להשתמש ב-PBEC מבודדים הוא השימוש בטכנולוגיית Organs-on-Chips (OoC)49,50. באמצעות טכנולוגיה זו ניתן ללמוד את השפעת הכוחות המכניים של הנשימה וזרימת הדם, כגון מתיחה, אוויר וזרימה בינונית 29.
שונות בין תורמים יכולה להיות משמעותית בעת שימוש ב- PBECs מתורמים שונים, ולכן חשוב לשקול שימוש בתאים ממספר תורמים כדי להסביר שונות זו במחקרי תרביות תאי אפיתל. מכיוון שתרבית ALI-PBEC גוזלת זמן וכרוכה בעלויות ניכרות, נבחנת האפשרות להקים תרביות ALI-PBEC על ידי ערבוב תאים מתורמים שונים בעלון תרבית תאים אחד. בדרך זו, ניסויי פיילוט ניתן לבצע בקלות באמצעות תאים ראשוניים, לפני ניתוח התגובות של תרביות שמקורן בתורמים בודדים שונים . בנוסף, ניתן לקבץ תורמים בעלי מאפיינים שונים (למשל, קטגוריית גיל שונה או מגדר שונה) למחקרי גישוש. בעת שימוש בתמהילי תורמים, חשוב לוודא כי קיימים מספר תאים שווה של תורמים שונים, כדי למנוע את האפשרות שתורם אחד שולט בתוצאות כתוצאה משיעור ריבוי גבוה יותר. לכן, תאים מתורמים בודדים מורחבים בנפרד ונזרעים בצפיפות גבוהה יותר באינסרט בהשוואה לתאי זריעה מתורם בודד, כדי למזער את ההתרבות באינסרט לפני המעבר ל- ALI. תגובות של תערובות תורמים ותורמים בודדים מקבילים הושוו על ידי לימוד קינטיקה של זיהום של SARS-CoV-2. באמצעות RT-qPCR וצביעה אימונופלואורסצנטית, נצפה כי תמהיל התורמים סיפק ייצוג טוב של התורמים הבודדים השונים, על ידי הצגת מספר דומה של חלקיקי וירוס המיוצרים ומספר דומה של תאים נגועים28.
כדי להפוך לחלופה מקובלת עבור מודלים של בעלי חיים, עריכה גנטית של תאי אפיתל סימפונות בתרבית צריכה להיות אפשרית51. נבדקת טכנולוגיית התאבכות RNA באמצעות RNA מפריע קטן (siRNAs) ב- ALI-PBECs, אולם מכיוון שהתאים צריכים להיות נגועים ב- siRNA במהלך השלב השקוע של התרבית, ההפלה אינה נשמרת מספיק במהלך תרבית ALI בגלל משך התרבית הארוך, אלא אם כן טרנספקציה של siRNA חוזרת לעתים קרובות במהלך התרבית52. עם זאת, siRNA יכול לשמש בהצלחה לשינוי ביטוי גנים בתאי בסיס שקועים. אחרים השתמשו בהצלחה בטכנולוגיית CRISPR/Cas9 כדי להשיג עריכת גנים בתרביות תאי אפיתל ראשוניים של דרכי הנשימה ALI עם העברת ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) 53. בעת שימוש בטכניקות כאלה, חיוני כי התאים לשמור על יכולת ההתמיינות המלאה שלהם. מכיוון שלא ניתן לעבור תרביות תאים ראשוניות בדרכי הנשימה ללא הגבלת זמן, הרחבת השבט של התאים הערוכים גנטית אינה קלה והתוספת של תאים מדיום לבחירת תאים נגועים היא מסורבלת. לכן, קשה להשיג את המפלה הרצויה בכל התאים בתרבית. חלופה ליצירת שיבוטים נוקאאוט היא השימוש באסטרטגיות נוק-אאוט ב-hiPSCs54 והשימוש בתאים אלה ליצירת תאי אפיתל בדרכי הנשימה. חלופה נוספת, אם כי תת-אופטימלית, היא הקמת קו PBEC אימורטלי כדי להרחיב באופן קלונלי תאים ערוכים גנטית55.
הפרוטוקול המוצג כאן הוא אחת הדרכים ליצור ALI-PBEC מובחן היטב, אך גם פרוטוקולים אחרים נמצאו כמבססים תרבות כזו, עם הבדלים קטנים וגדולים יותר בהשוואה לפרוטוקול המוצג. לדעתנו, תיקוף מעבדתי של שיטות תרבית ובקרת איכות מחמירה חיוניים למערכת ALI-PBEC ולמערכות תרבית דומות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה, כדי להפוך לחלופה תקפה לניסויים בבעלי חיים.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים רלוונטיים.
Acknowledgments
המחקרים המשתמשים במודל המתואר בתרומה זו נתמכו על ידי מגוון ארגוני מימון, כולל קרן הריאות הולנד, הארגון ההולנדי למחקר ופיתוח בריאות (ZonMw, מענק MKMD COVID-19), האגודה ההולנדית להחלפת ניסויים בבעלי חיים (Stichting Proefdiervrij, grant #114025007), כמו גם מענקי מחקר מחברות כמו Boehringer Ingelheim ו- Galapagos. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
| 4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
| Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
| Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
| BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
| Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
| Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
| Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
| Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
| CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
| Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
| CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
| Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
| Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
| Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
| D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
| dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
| EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
| IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
| Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
| Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
| M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
| M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
| MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
| Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
| Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
| Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
| Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
| Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
| Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
| Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
| Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
| Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
| Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
| Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
| Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
| Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
| Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
| Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
| Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
| Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
| Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
| RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
| TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
| Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
| Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
| Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
| Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |
References
- Aghapour, M., et al. Role of air pollutants in airway epithelial barrier dysfunction in asthma and COPD. European Respiratory Review. 31 (163), 210112 (2022).
- de Waal, A. M., Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
- Duchesne, M., Okoye, I., Lacy, P. Epithelial cell alarmin cytokines: Frontline mediators of the asthma inflammatory response. Frontiers in Immunology. 13, 975914 (2022).
- Hewitt, R. J., Lloyd, C. M. Regulation of immune responses by the airway epithelial cell landscape. Nature Reviews Immunology. 21 (6), 347-362 (2021).
- Ruysseveldt, E., Martens, K., Steelant, B. Airway basal cells, protectors of epithelial walls in health and respiratory diseases. Frontiers in Allergy. 2, 787128 (2021).
- Alysandratos, K. D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
- Hammad, H., Lambrecht, B. N. Barrier epithelial cells and the control of type 2 immunity. Immunity. 43 (1), 29-40 (2015).
- Hynds, R. E., Bonfanti, P., Janes, S. M. Regenerating human epithelia with cultured stem cells: feeder cells, organoids and beyond. EMBO Molecular Medicine. 10 (2), 139-150 (2018).
- Hiemstra, P. S., Tetley, T. D., Janes, S. M. Airway and alveolar epithelial cells in culture. The European Respiratory Journal. 54 (5), 1900742 (2019).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
- Morgan, R., et al. A medium composition containing normal resting glucose that supports differentiation of primary human airway cells. Scientific Reports. 12 (1), 1540 (2022).
- Ghosh, B., et al. Strong correlation between air-liquid interface cultures and in vivo transcriptomics of nasal brush biopsy. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (5), L1056-L1062 (2020).
- Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 300 (1), L25-L31 (2011).
- Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air-liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 465-473 (2011).
- Legebeke, J., et al. Temporal whole-transcriptomic analysis of characterized in vitro and ex vivo primary nasal epithelia. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 907511 (2022).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- van Wetering, S., et al. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. Journal of Investigative Medicine. 48 (5), 359-366 (2000).
- Balk, S. D. Calcium as a regulator of the proliferation of normal, but not of transformed, chicken fibroblasts in a plasma-containing medium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 68 (2), 271-275 (1971).
- Gail, M. H., Boone, C. W., Thompson, C. S. A calcium requirement for fibroblast motility and prolifertion. Experimental Cell Research. 79 (2), 386-390 (1973).
- Dulbecco, R., Elkington, J. Induction of growth in resting fibroblastic cell cultures by Ca. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72 (4), 1584-1588 (1975).
- van Wetering, S., et al. Epithelial differentiation is a determinant in the production of eotaxin-2 and -3 by bronchial epithelial cells in response to IL-4 and IL-13. Molecular Immunology. 44 (5), 803-811 (2007).
- Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. The European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009 (2018).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 193 (2), 239-245 (2010).
- Schrumpf, J. A., Ninaber, D. K., vander Does, A. M., Hiemstra, P. S. TGF-β1 impairs vitamin D-induced and constitutive airway epithelial host defense mechanisms. Journal of Innate Immunity. 12 (1), 74-89 (2020).
- Schrumpf, J. A., et al. Proinflammatory cytokines impair vitamin D-induced host defense in cultured airway epithelial cells. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (6), 749-761 (2017).
- Boei, J. J. W. A., et al. Xenobiotic metabolism in differentiated human bronchial epithelial cells. Archives of Toxicology. 91 (5), 2093-2105 (2017).
- Wang, Y., et al. Impact of human airway epithelial cellular composition on SARS-CoV-2 infection biology. bioRxiv. , (2021).
- Nawroth, J. C., et al. Breathing on Chip: Dynamic flow and stretch tune cellular composition and accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. bioRxiv. , (2022).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial Basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Eenjes, E., et al. Disease modeling following organoid-based expansion of airway epithelial cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (4), L775-L786 (2021).
- Butler, C. R., et al. Rapid expansion of human epithelial stem cells suitable for airway tissue engineering. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (2), 156-168 (2016).
- Amatngalim, G. D., et al. Antibacterial defense of human airway epithelial cells from chronic obstructive pulmonary disease patients induced by acute exposure to nontypeable Haemophilus influenzae: modulation by cigarette smoke. Journal of Innate Immunity. 9 (4), 359-374 (2017).
- Plebani, R., et al. 3D lung tissue models for studies on SARS-CoV-2 pathophysiology and therapeutics. International Journal of Molecular Sciences. 23 (17), 10071 (2022).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nature Biotechnology. 30 (9), 876-882 (2012).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Biology. 107, 183-206 (2005).
- Cao, J., Wong, C. K., Yin, Y., Lam, C. W. K. Activation of human bronchial epithelial cells by inflammatory cytokines IL-27 and TNF-alpha: implications for immunopathophysiology of airway inflammation. The Journal of Cellular Physiology. 223 (3), 788-797 (2010).
- Tsao, P. N., et al. Notch signaling controls the balance of ciliated and secretory cell fates in developing airways. Development. 136 (13), 2297-2307 (2009).
- Laoukili, J., et al. IL-13 alters mucociliary differentiation and ciliary beating of human respiratory epithelial cells. The Journal of Clinical Investigation. 108 (12), 1817-1824 (2001).
- Mertens, T. C. J., et al. Cigarette smoke differentially affects IL-13-induced gene expression in human airway epithelial cells. Physiological Reports. 5 (13), e13347 (2017).
- Zarcone, M. C., et al. Effect of diesel exhaust generated by a city bus engine on stress responses and innate immunity in primary bronchial epithelial cell cultures. Toxicology in Vitro. 48, 221-231 (2018).
- vander Does, A. M., et al. Early transcriptional responses of bronchial epithelial cells to whole cigarette smoke mirror those of in-vivo exposed human bronchial mucosa. Respiratory Research. 23 (1), 227 (2022).
- Wang, Y., Ninaber, D. K., van Schadewijk, A., Hiemstra, P. S. Tiotropium and fluticasone inhibit rhinovirus-induced mucin production via multiple mechanisms in differentiated airway epithelial cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 278 (2020).
- Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not M0- or M2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), 0276013 (2022).
- Gindele, J. A., et al. Opposing effects of in vitro differentiated macrophages sub-type on epithelial wound healing. PLoS One. 12 (9), e0184386 (2017).
- van Riet, S., et al. Modulation of airway epithelial innate immunity and wound repair by M(GM-CSF) and M(M-CSF) macrophages. Journal of Innate Immunity. 12 (5), 410-421 (2020).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Stucki, A. O., et al. A lung-on-a-chip array with an integrated bio-inspired respiration mechanism. Lab on a Chip. 15 (5), 1302-1310 (2015).
- Peters-Hall, J. R., et al. Long-term culture and cloning of primary human bronchial basal cells that maintain multipotent differentiation capacity and CFTR channel function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 315 (2), L313-L327 (2018).
- Bartman, C. M., Stelzig, K. E., Linden, D. R., Prakash, Y. S., Chiarella, S. E. Passive siRNA transfection method for gene knockdown in air-liquid interface airway epithelial cell cultures. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), L280-L286 (2021).
- Koh, K. D., et al. Efficient RNP-directed human gene targeting reveals SPDEF is required for IL-13-induced mucostasis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (3), 373-381 (2020).
- Bhargava, N., et al. Development of an efficient single-cell cloning and expansion strategy for genome edited induced pluripotent stem cells. Molecular Biology Reports. 49 (8), 7887-7898 (2022).
- Angelopoulou, A., Papaspyropoulos, A., Papantonis, A., Gorgoulis, V. G. CRISPR-Cas9-mediated induction of large chromosomal inversions in human bronchial epithelial cells. STAR Protocols. 3 (2), 101257 (2022).
