Summary
ここでは、長期バイオバンキングのための初代気管支上皮細胞の単離と増殖、および気液界面での培養による分化上皮細胞の生成のための、再現性があり、手頃な価格で堅牢な方法を紹介します。
Abstract
気道上皮細胞層は、肺組織と外部環境との間の最初の障壁を形成し、それによって感染性病原体や大気汚染物質などの吸入物質に絶えずさらされます。気道上皮層は、多種多様な急性・慢性肺疾患において中心的な役割を果たしており、この上皮を標的とした様々な治療が吸入によって行われています。病因における上皮の役割と、それを治療の標的にする方法を理解するには、堅牢で代表的なモデルが必要です。 in vitro 上皮培養モデルはますます使用されており、制御された環境で実験を行い、細胞をさまざまな種類の刺激、毒物、または感染因子にさらすという利点があります。不死化または腫瘍細胞株の代わりに初代細胞を使用することは、これらの細胞が培養中に細胞株と比較して上皮のより良い表現を有する偽層別分極上皮細胞層に分化するという利点を有する。
ここでは、肺組織からの気道上皮細胞の単離と培養のために、過去数十年にわたって最適化されてきた堅牢なプロトコルを紹介します。この手順は、気液界面(ALI)で培養することにより、初代気管支上皮細胞(PBEC)の単離、増殖、培養、および粘液繊毛分化の成功を可能にし、バイオバンキングのプロトコルを含みます。さらに、細胞特異的マーカー遺伝子を用いたこれらの培養物の特性評価が記載されている。これらのALI-PBEC培養物は、タバコの煙全体または炎症メディエーターへの曝露、ウイルスまたは細菌との共培養/感染など、さまざまな用途に使用できます。
この原稿で提供されるプロトコルは、手順を段階的に説明しており、実験室でそのような培養システムを実施または適応させることに関心のある人に基礎および/または参照を提供することが期待されています。
Introduction
様々な急性および慢性肺疾患における気道上皮の役割は、様々なレビューに記載されている1、2、3、4、5、6、7。気道上皮細胞の高分化培養は、気道上皮の役割を解明するための重要なツールです。気液界面(ALI)気道上皮細胞培養は、気道基底上皮細胞の分化を促進し、それによって気道上皮を確実にin vitroで研究するために広く適用されています8,9。過去数年間で、COVID-19パンデミックに関連する新しい研究イニシアチブと動物を含まない研究への世界的な移行の結果として、そのようなモデルの使用はさらに増加しました。したがって、このモデル細胞株の使用の増加は、堅牢な結果を得るための手順と経験を共有する必要性を強調しています。これにより、研究グループ間の結果の比較も可能になります。手順の堅牢性は重要な特性であるため、品質管理を受ける必要があります。いくつかの研究所は、ALIで一次気道上皮細胞を培養するためのプロトコルの開発に投資しています。これらの手順を詳細に共有することで、時間、労力、必要な予算を削減できます。これらの詳細には、例えば、様々な製造業者によって提供される細胞培養プラスチックおよび培地の選択が含まれ、これが得られる培養物の特性に影響を与えることが見出されたからである10、11、12。これは、そのような洞察がない場合、結果が影響を受けたり、さまざまなラボにわたる検証作業が妨げられたりする可能性があるため、培養手順の経験と詳細を共有することの重要性を強調しています。
ヒト肺上皮は、基底細胞、繊毛細胞、杯細胞、クラブ細胞などの主要なタイプを含むさまざまな細胞タイプで構成されています。in vitroで気道の上皮細胞層を確実に模倣するためには、これらの細胞型を培養モデルで表し、それらの分極と機能を維持する必要があります13、14、15、16。ドナーの特性(疾患状態を含む)および細胞の解剖学的起源(すなわち、鼻、気管、大および小の気道)が細胞培養の細胞組成および機能応答に影響を与える可能性があることの認識も同様に重要である。関連する専門知識と実践は、初代気道上皮細胞を正常に培養し、直感的に(培養中の目視検査によって)そして定量的に培養の品質を評価するための前提条件です。この貢献の目的は、気管および小気道上皮細胞の培養にも適用できる、初代ヒト気管支上皮細胞(PBEC)の単離および培養のための費用効果と時間効率の高い方法を提供することです。切除された肺組織からそのような細胞を単離する方法を説明することに加えて、拡大およびバイオバンクのための方法、そして最後に妥当なコストと期間内での高分化型ALI培養の確立および特性評価のための方法が提示され、議論される。
Protocol
オランダのライデン大学医療センターで肺癌の切除手術を受けた患者から得られた肉眼的に正常な肺組織から細胞を単離した。この肺組織が由来する患者は、そのような組織のコード化された匿名のさらなる使用のための異議なしシステム を介して バイオバンクに登録されました(www.coreon.org)。ただし、2022年1月9日以降、患者は、施設の医療倫理委員会(B20.042 / Ab / abおよびB20.042 / Kb / kb)の承認を得て、LUMCバイオバンクからの地域の規制に従って、積極的なインフォームドコンセントを使用してバイオバンクに登録されています。
注意: すべての手順は、特に明記されていない限り、地域の生物学的安全規則に従って、生物学的安全キャビネット内で、手術用手袋と白衣を着用した状態で無菌の作業条件下で実行されます。プロトコルで使用されるすべての培地、試薬、およびその他の溶液については、 材料 表および 補足表1を参照してください。プロトコルの詳細な手順については、 図 1 を参照してください
1.ヒト肺組織からの気管支上皮細胞の単離
注:気管支上皮細胞分離の最適な成功率を得るには、切除した気管支リングをプリモシンを添加したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に最大24時間4°Cで沈めておく必要があります。
- 手順開始前の準備
- 補足表1に記載のようにPBS中でコーティング溶液を調製し、ウェルあたり1.5 mLのコーティング溶液で適切な数の6ウェルプレートをコーティングします。細胞培養インキュベーター内で37°C、5%CO2で2時間インキュベートします。
注:コーティングされるウェルの数は、切除された組織のサイズに依存します。大まかな目安として、摘出気管支リングの直径が10mm、幅が4mmの場合、4枚の6ウェルプレートをコーティングします。 - 補足表1に記載されているように、完全なケラチノサイト無血清培地(c-KSFM)を準備します。6ウェルプレートのウェルあたり2 mLの培地を使用します。
注:このc-KSFMは、4°Cで7日間保存できます。c-KSFMは、汚染された線維芽細胞の増殖を抑制しながら気道上皮細胞を増殖させるために使用される低カルシウム培地です。
- 補足表1に記載のようにPBS中でコーティング溶液を調製し、ウェルあたり1.5 mLのコーティング溶液で適切な数の6ウェルプレートをコーティングします。細胞培養インキュベーター内で37°C、5%CO2で2時間インキュベートします。
- 10 cmのペトリ皿で10 mLの滅菌PBSでリングを穏やかにすすぎ、気管支リングを洗浄します。ピンセットを使用してリングを注意深く保持し(外側にのみ触れます)、小さなはさみを使用して余分な結合組織と血液の残りを取り除きます。さらに処理するには、リングを2つにカットします。
注意: プロセスで使用されるすべてのツールは、使用前に滅菌する必要があります。 - 気管支リングの2つの半分を、密閉滅菌容器内のプリモシンを含むハンクス平衡塩溶液(HBSS)中のプロテアーゼXIV(1.8 mg / mL)の予熱溶液10 mLに浸し、細胞培養インキュベーターで37°Cで正確に2時間インキュベートします。
注:HBSSは、2時間のインキュベーション期間中に細胞を組織から剥離するためのプロテアーゼXIVの希釈液として使用されます。HBSSは、短期間のインキュベーション中に細胞生存率を維持することを可能にするバランスの取れた等張溶液です。 - インキュベーション後、組織片を10 mLの温かいPBSと共にシャーレに移し、ピンセットを曲げてリングの内側をこすり、細胞溶液を得た。
注意: 組織は柔らかく、やや拡張しているように見えます。 - リングを廃棄し、細胞溶液を50 mLチューブに移し、温かいPBSを加えて最終容量50 mLを得ます。230 x g 、室温(RT)で7分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、ペレットを10 mLの温かいPBSに再懸濁します。さらに、温かいPBSで50mLまでの容量を補います。RTで230 x g で7分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、細胞ペレットをプリモシンを含む適量の温かいc-KSFMに再懸濁する。
注:プリモシンは、組織に存在していた可能性のある細菌、真菌、または(重要な)マイコプラズマを排除するために最低7日間使用されます。7日後、ペニシリン/ストレプトマイシンのみを培地に添加するだけで十分です。 - 6ウェルプレートからコーティング溶液を吸引し、ウェルあたり2 mLの細胞懸濁液を加えます。
- 80%から90%のコンフルエントに達するまで細胞を増殖させ、培地を週に3回(例えば、毎週月曜日、水曜日、金曜日)交換する。望ましい程度のコンフルエンシーは通常7〜14日の間に到達します。所望のコンフルエントに達するのに必要な時間が14日を超える場合は、細胞を廃棄する。
注:最初の数日間は、少数の細胞だけが増殖し始めます。細胞のグループは数日後に目立ちます。
2. ヒト初代気管支上皮細胞(PBEC)の凍結保存
注意: -80°Cおよび-196°Cの温度で作業する場合、保護にはクライオグローブが使用され、凍結バイアルの移動にはピンセットが使用されます。液体窒素を扱う場合、凍結手袋とフェイスシールドが個人用保護に使用されます。
- 培地を吸引し、ウェルあたり2 mLの温かいPBSでウェルを1回洗浄します。
- ウェルあたり0.5 mLのソフトトリプシンを添加して細胞をトリプシン化します(ソフトトリプシン溶液の組成については 補足表1 を参照)。細胞を37°Cで5〜最大10分間インキュベートします。 プレート内でトリプシン溶液を旋回させ、プレートを軽くたたいて細胞を放出します。
- 剥離した細胞を、ペニシリン/ストレプトマイシンを含むKSFMに溶解した1.1 mg/mL大豆トリプシン阻害剤(SBTI;トリプシン活性を阻害するため)を含む50 mLの遠沈管に移します。SBTIの容量は、ソフトトリプシンの総容量の2倍でなければなりません(つまり、1ウェルあたり1 mL)。
注:細胞は数分以内に再付着するため、SBTIをウェルに直接添加しないでください。 - チューブをRTで230 x g で7分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、ペレット化した細胞をペニシリン/ストレプトマイシンを含むが他の添加物を含まない10 mLのRT KSFMに再懸濁します。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。トリパンブルーを1:1の比率で添加して生細胞/死細胞カウントを実行するか、別の生細胞/死細胞カウント手順を使用します。
- 凍結培地あたり400,000細胞の濃度で細胞を凍結保存し(組成については 補足表 1を参照)、クライオバイアルあたりこの懸濁液を1 mL加えます。クライオバイアルをクールセル容器に移し、-80°Cに置きます。 24時間後、バイアルを-196°Cの液体窒素に移し、長期保存します。
注:細胞を凍結培地に移すには2つの選択肢があり、どちらもうまく機能します:1)遠心分離によって細胞を再度ペレット化し、必要な細胞濃度で低温凍結培地に再懸濁します。または2)低温凍結培地を添加し、細胞が存在するKSFMの量に基づいて凍結保存剤(ジメチルスルホキシド[DMSO])の濃度を調整します。
3. 凍結保存したPBECを解凍し、インサート上で培養するために増殖させる
- T75細胞培養フラスコに、蓋をしっかりと閉めた状態でPBS中の10 mLのコーティング溶液で一晩コーティングします。フラスコを37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーター内でインキュベートする。
- 凍結保存されたPBECを解凍する前に、フラスコからコーティング溶液を取り出し、10 mLのc-KSFMで満たします。細胞培養インキュベーターで37°Cに温め、蓋を少し開いてインキュベーターに空気を入れます。
- 細胞を37°Cの水浴またはビーズ浴で素早く解凍します。
注:ビーズバスは、汚染のリスクが低く、エネルギー消費が少ないため、ウォーターバスよりも好まれます。 - 培地を入れた予熱したT75フラスコにクライオバイアルの全内容物を加え(ステップ3.2)、細胞を均等に分配します。
注:細胞は遠心分離ステップに耐えられないため、この段階では細胞を遠心分離しないでください。 - 約4時間後、細胞が十分に付着していることを確認します。培地を10 mLの新鮮で温かいc-KSFMと交換します。
注:このようにして、凍結培地からDMSOが除去されます。このステップは、フラスコに細胞を播種してから4時間から24時間の間に行われるべきです。 - 80%から90%のコンフルエントに達するまで細胞を増殖させ、毎週月曜日、水曜日、金曜日に培地を交換します。
4. 初代気管支上皮細胞(ALI-PBEC)との気液界面培養の確立
注:次の手順は、内径11.9 mmのインサートでPBECを培養するためのものです。
- 適切な数の細胞培養インサートを、インサートあたり0.4 mLのコーティング溶液でコーティングします。細胞培養インキュベーター内で37°Cで一晩インキュベートします。
- 補足 表1に記載のとおり、完全なBD培地(cBD培地)を調製する。
注:cBD培地は、ステップ4.10で概説されているように、レチノイン酸(RA)(または本プロトコルで使用されるRAの類似体)濃度およびALIでの培養の増加後の分化を可能にしながら、気管支上皮細胞の増殖を長期間サポートするように処方された複合培地( 補足表1を参照)です。 - フラスコあたり2 mLのソフトトリプシンを使用して、T75フラスコ内のPBECをトリプシン化します。細胞を5〜10分間インキュベートして、細胞を剥離させます(目視検査に基づく)。5分間のインキュベーション後、フラスコ内のトリプシンを旋回させ、フラスコを軽くたたくことにより、細胞の剥離を促進します(必要に応じて繰り返します)。
- 4 mLのSBTIをフラスコに加え、細胞懸濁液を25 mLの遠沈管に直接移します。
メモ: セルは数分以内に再結合します。したがって、複数のフラスコで作業する場合、ステップ4.4で得られた細胞懸濁液は、SBTIを第2のフラスコに添加する前に、遠沈管に直接移す必要があります。この手順では、最大5つのフラスコが同時に処理されます。 - RTで230 x g でチューブを7分間遠心分離します。
- 細胞を6 mLのcBD培地に再懸濁し、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。たとえば、トリパンブルーを1:1の比率で添加するか、別の生細胞/死細胞カウント手順を使用して、生細胞/死細胞カウントを実行します。
- 細胞培養インサートからコーティング溶液を取り除きます。
- ステップ4.6で生成した細胞懸濁液を、1 nM EC 23を添加したcBD培地で1 mLあたり80,000細胞の濃度に希釈し、インサートのメンブレンの上部に0.5 mLを加えます。1 nM EC 23を添加した1.5 mLのcBD培地をインサートの下のウェルに追加します。
- 培養物が空気曝露の準備ができるまで(すなわち、100%コンフルエンシーに達した2日後)、1 nM EC 23を添加したcBD培地を週に3回交換します。毎回、0.5 mLの培地がインサートの内側(細胞上)に添加され、1.5 mLが下部コンパートメント(ウェル)に追加されます。
注:一般に、細胞層は、インサートにPBECを播種してから約5日後に100%コンフルエントに達します。細胞のコンフルエンシーの目視検査に基づいて、2日後に細胞をALIステージに移すことを決定する。 - 細胞をALIに移す準備ができたら(すなわち、100%コンフルエントに達した2日後)、インサートとウェルから培地を取り出し、インサート内に新しい培地を追加せず、新しい培地(50 nM EC 23を添加した1 mLのcBD培地)をウェルにのみ追加します。ウェル内の培地を週に3回交換してください。
- 余分な粘液や細胞破片を除去するには、インサート内の細胞層の頂端側に200 μLの温かいPBSを穏やかに添加し(できれば、細胞を直接ピペッティングするのではなく、インサートの側面 を介して )、37°Cの細胞培養インキュベーターで10分間インキュベートします。 次に、PBSを吸引して、余分な粘液や細胞の破片を取り除きます。
注:この時点(ALI培養の開始)以降、下部コンパートメントの培地を交換する前に、毎回細胞の頂端側をPBSで洗浄します。 - ALIで細胞を最低2週間培養して、すべての主要な細胞タイプが表現されていることを確認します。
5. 混合ドナー集団からのALI-PBEC培養の確立
- 最大5人の個人ドナーの細胞を使用して、混合集団からPBEC培養を開始します。
- ステップ4.7で生成した細胞を使用してドナーあたり同数の細胞を混合し、インサートあたり合計150,000細胞(つまり、5人のドナーを使用する場合はドナーあたり30,000細胞)に到達します。これにより、インサート内の増殖が最小限に抑えられ、個々のドナーからの同数の細胞が培養中に存在することが保証されます。
- 手順 4.9 から 4.12 の説明に従って、ALI-PBEC 培養を続行します。
6. ALI-PBEC文化の品質管理
- 細胞培養中の経上皮電気抵抗(TEER)のモニタリング
注:電圧計の使用に基づく電気抵抗測定は、ALI-PBEC培養中の任意の時点で実行でき、電気抵抗測定は電極位置、温度、媒体、取り扱いなどのさまざまな変数の影響を受けるため、同じプロトコルに従って同じ条件下で毎回実行されます。TEERは、オームの法則に基づいて次の式を適用することにより、測定された電気抵抗を使用して計算できます:
ここで、Rmは 測定された電気抵抗であり、Rb はコーティングおよびセルのないインサートのベースライン電気抵抗であり、SAはインサート17の膜の表面積です。- 200 μLの温かいPBSを細胞層の頂端側に静かに加え、細胞上の粘液や破片を取り除きます。インサートを37°Cの細胞培養インキュベーターで10分間インキュベートし、PBSを再度除去します。
- 700 μLの温かいPBSを細胞層の頂端側に穏やかに添加し、インサートをRTで10分間インキュベートして、測定の温度を安定させます。
- 1,000 Ωのテスト抵抗を使用してボルトオーム計を校正し、ボルトオームを測定するようにボルトオーム計を設定し、ドライバーを使用して1,000 Ωに設定されるまで「R ADJ」校正ネジを調整します。
- 電極を滅菌水(RT)で数回上下に動かしてから、滅菌PBS(RT)で動かしてすすぎます。
- インサート内のセル層の電気抵抗を測定します。このために、電極の長いアームがプレートの底に触れた状態で、電極をウェル内の垂直位置に置きます。このように、短いアームはインサート内のセル層の上にあります。ボルトオームメーターに表示されている値を読み取ります。
注意: 表示される値は完全には安定しません。値が断続的になった瞬間に値を読み取ります。 - 測定の合間に、滅菌PBS(RT)で電極を数回上下に動かして洗浄します。
- 測定が終了したら、滅菌水(RT)、滅菌PBS(RT)、および70%エタノール(RT)で電極を数回上下に動かして電極を洗浄します。電極を乾かして保管してください。
- インサート内に700 μLの温かいPBSを、ウェルに1 mLの温かいPBSを加え、他のインサートと一緒に電気抵抗を測定することで、インサート(コーティングなし)と細胞のベースライン測定を実行します。
- ALI-PBEC培養物の細胞組成の評価
- ALI段階では、拍動繊毛を視覚的に評価して鑑別を確認します。これらは、細胞の頂端側の空気曝露後9日という早い 時期に、標準的な 明視野顕微鏡で観察することができます。
注:鼓動繊毛は、頂端表面を洗浄した直後に最もよく見えます。ゴブレット細胞は粘液を産生するため、頂端表面の洗浄中に観察される粘液の存在は、杯細胞が形成される兆候です。ただし、杯細胞のレベルと産生される粘液の量は、ドナーに大きく依存します。粘液の存在は、インサート内の細胞層の頂端表面を洗浄した後にPBSを吸引するときに見ることができます。この場合、吸引されたPBSはより粘性があり、吸引中に粘液糸が観察される可能性があります。 - 免疫染色および蛍光顕微鏡または蛍光活性化セルソーティング(FACS)を用いた細胞組成物の評価、またはリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)による遺伝子発現解析は、培養の分化状態に関する重要な情報を提供するが、その説明はこの貢献の範囲を超えている。
- ALI段階では、拍動繊毛を視覚的に評価して鑑別を確認します。これらは、細胞の頂端側の空気曝露後9日という早い 時期に、標準的な 明視野顕微鏡で観察することができます。
図1:初代気管支上皮細胞の単離、増殖、および培養手順の概略図。 (A)がん切除手術中に肺組織が得られ、病理医は肉眼的に正常で腫瘍のない気管支輪組織を切除します。(B)気管支リングを洗浄し、酵素処理にさらして細胞層を剥離および解離させる。(c)回収した細胞懸濁液を洗浄し、細胞を増殖のために6ウェルプレートのウェルに分配する。(D)プリモシンを含むc-KSFMで単離した細胞を十分に増殖させた後、細胞層をトリプシン処理によって解離させ、細胞を凍結保存用の凍結培地に再懸濁します。必要に応じて、凍結保存された細胞を解凍し、細胞培養フラスコ内のペニシリン/ストレプトマイシンを含むc-KSFMを使用して再度増殖させます。増殖後、それらは細胞培養インサート上のcBD培地に播種されます。(イー)ALI-PBEC培養は、主に2つの段階で行われます:細胞が完全にコンフルエントに達するまで1 nM EC 23を添加したcBD培地に沈めた段階、続いて頂端培地を除去し、ALIで培養して分化を可能にします。このALI期において、細胞は、50nM EC23を添加したcBD培地中で培養される。(エブ)水中培養中にインサートを覆う基底細胞のグラフ表示。(エック)増加した濃度のEC23の存在下でALIでの培養後に得られた分化上皮細胞層のグラフ表示。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Representative Results
水中培養による拡大
ここに示す方法を使用すると、液体窒素中での長期保存のために、1つの6ウェルプレートから400,000細胞/クライオバイアルを含む平均8つのクライオバイアルを得ることができます(図2A)。これを達成するために、単離されたPBECは、微生物(特にマイコプラズマ)汚染を排除するために、プリモシンの存在下で最低7日間、最大14日間(図2B)6ウェルプレートで培養されます。図2A、Bは、さまざまなドナーからのさまざまな単離間で得られた細胞数と必要な培養時間に関する洞察を提供します。液体窒素中で保存するためにトリプシン処理によって細胞を回収する前に、コンフルエントは80%以上でなければならない。これが14日以内に達成されない場合、細胞は凍結保存されるべきではありません。重要なのは、保存および継代のために収穫する場合、細胞層のコンフルエントが~95%を超えてはならないということです(図2C)。液体窒素中で保存した後、細胞を解凍し、ALI培養に十分な細胞数が得られるまで増殖のために培養することができる。この段階で細胞の増殖に使用される培地はc-KSFMであり、気管支リング18からの収穫後の初期培養時と同様である。ただし、肺組織に起因する追加の微生物汚染のリスクがないため、この段階ではプリモシンは必要ありません。この培地は線維芽細胞よりも上皮細胞を優先するため、線維芽細胞をより早く増殖させることによって培養物の異常増殖の可能性を防ぎます19、20、21。c-KSFM培地を用いると、細胞はフラスコ内に広げられ、互いに連結しないため、この段階でcBD培地に浸漬した培養細胞の形態とは大きく異なります(図2D、E)。解凍した細胞をT75フラスコで5〜6日間培養した後、細胞層は80%〜95%コンフルエントになるはずであり、これは合計で約3 x 106細胞に相当します(図2F)。これにより、ALI培養用に約75個のインサート(12ウェルプレートサイズ)を作製することができます。
この貢献に記載されている単離および培養のための方法は、出発材料として気管支生検または気管支ブラシと共に使用するために適合させることもできる。
図2:凍結保存前後の基底細胞増殖。 記載されたプロトコールに従って細胞を単離し、c−KSFMを用いて培養した。ドナー当たりに生成された細胞数をモニターし、生細胞カウントを、6ウェルプレートから継代0(P0)細胞を採取する際の自動細胞カウンター(A)を用いて実施し(プロトコルのステップ2)、n=123ドナー、細胞数を、ウェル当たり採取した細胞数として提示した;各ドットは1人のドナーを表し、中央値は水平バーで示されます。(B)品質管理の一環として、P0細胞が6ウェルプレートで80%〜90%のコンフルエンシーに達するのに必要な時間をモニターし、c-KSFM(n=127人の異なるドナー)での水中培養を開始してから数日後として示した。個々のドナーはドットで示され、1日に属するすべてのドットは線にマージされます。線が広いほど、それはより多くのドナーを表します。細胞が培養されている日数の中央値は、より細い水平バーで示されます。(C)長期凍結保存のために細胞を回収した瞬間にc-KSFMに沈めて増殖したP0細胞の代表的な明視野画像。(D)細胞を回収し、cBD培地に沈めて増殖させた瞬間のc-KSFMに浸漬して増殖したP1細胞の代表的な明視野画像および(E)インサートに転写したP1細胞。(f)T75フラスコからP1細胞を採取する際に、ドナーごとに生成された生細胞の数を自動セルカウンターを用いてモニターした(プロトコルのセクション4)、n = 63の異なるドナー;細胞数はT75フラスコ当たりの細胞数として示され、各ドナーはドットで示され、細胞数の中央値は水平バーで示される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
気液界面(ALI)培養
ALI培養を開始してから7日後に、細胞層の電気抵抗を測定し、300 Ω以上である必要があります(図3A)。これが達成されない場合、タイトジャンクション形成の欠如の可能性があるため、培養は失敗したと見なされます。洗浄や吸引中の細胞層の損傷などに起因する個々のインサートの上皮層の損傷によって引き起こされる低いTEER値を得る可能性を排除することをお勧めします。これは、培養インサートの目視顕微鏡検査によって確認することができる。我々の経験では、電気抵抗のドナー間の変動は有意であり得(図3B)、これは文献14でも報告されており、観察されたように、使用されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)の起源によっても著しく影響を受ける(図3C)。
図3:ALI-PBEC培養の品質管理としての経上皮電気抵抗。 PBECを単離・増殖させ、分化したALI-PBEC培養を確立しました。培養中のいくつかの時点で、電気抵抗を測定し、続いてTEERを算出した(Ω・cm2)。(A)電気抵抗はALI後14日間にわたって測定した。n = 4人の異なるドナー。データは、平均値±標準偏差 (SD) として表されます。(B)ALI-PBEC細胞培養の品質管理の一環として、ALI後7日目(n = 50)および14日目(n = 25)に電気抵抗を測定しました。各ドットは1つのドナーを表し、中央値のTEER(Ω・cm2)は水平バーで示されます。ノンパラメトリックなマン・ホイットニー検定を用いてデータの有意性を検定したところ、有意差は認められなかった。(C)3つの異なるDMEMサプライヤーからのメディアは、TEER形成への影響を評価するためにテストされました。n = 4人の異なるドナー。平均値はSD±示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
高度に分化したALI-PBEC培養を確立する一方で、空気曝露の開始から、RAの濃度は22増加する。このようにして、細胞は増殖から粘液繊毛分化に切り替わり、明視野顕微鏡を使用して空気曝露後9日(ドナー依存)という早い時期に見ることができます。第1繊毛の動きはこの時点で可視であり、分化した管腔細胞のマーカーの遺伝子発現に基づくとやや早くなる23 (図4)。
プロトコルに記載されているように、粘液産生は、培地交換中に頂端表面をすすぐときにも観察できます。RAは光に非常に敏感であり、同じストック濃度で非常に変動する活性をもたらします。このため、RAは合成RA類似体EC23に置き換えられ、同じ濃度で使用され、実験的に決定されたものと同様の結果が得られます。この理由および手順の変更を避けるために、選択されたEC23濃度は、以前に使用したRA濃度と等しい(すなわち、50nM)24、25に保たれた(図5)。図5Aは、異なる濃度のEC23を使用した場合に達成されるTEER値を示し、試験したこの濃度範囲内の50nMにおける最大TEERを示す。図5Bに示す結果は、繊毛細胞および杯細胞についてのマーカーの遺伝子発現が、50nM EC23またはRAを用いた場合に類似していることを裏付ける。EC23は、この水没段階でそれを省略し、ALI段階でのみ添加すると、完全なコンフルエントに達することのない培養をもたらすため、水中段階での培養中にも必要である(ただし、はるかに低い濃度である)。目に見える繊毛拍動活性と粘液産生を備えた高分化型ALI-PBEC培養を生成するのに必要な時間は約14日であり、したがって、ほとんどの実験は14〜21日のALI培養の間に開始されます(図4)。ALI培養の14日間で、すべての主要な異なる細胞タイプ(基底細胞、繊毛細胞、杯細胞、およびクラブ細胞)が観察されますが、発現レベルはドナーに大きく依存します。これは、RT-qPCRによってTP63、FOXJ1、MUC5AC、およびSCGB1A1の遺伝子発現を評価することによって、または免疫蛍光(IF)染色によってp63、αチューブリン、Muc5AC、およびCC-16に対する抗体を使用してタンパク質発現を評価し、それぞれ基底細胞、繊毛細胞、杯細胞、およびクラブ細胞のマーカーを検出することによって実証されます25,26.ただし、ほとんどの実験では14〜21日が経験則と見なされる場合がありますが、一部の実験では、生体異物代謝、SARS-CoV-2感染、および粘液繊毛クリアランスの評価に見られるように、より長い分化期間を考慮することができます27,28,29。
図4:気液界面(ALI)培養。PBECを単離・増殖させ、分化したALI-PBEC培養を確立しました。ALI-PBEC培養は、ALI後14日間にわたってモニターされた。細胞培養物を、ALI後0、7、および14日目にRNAの単離のために溶解した。2つの異なるドナーからのデータが表示され、各ドットは経時的に監視された1人の個々のドナーを表し、中央値は水平バーで示されます。基底細胞マーカー、繊毛細胞、杯細胞、およびクラブ細胞マーカー(それぞれTP63、FOXJ1、MUC5B、およびSCGB1A1)の遺伝子発現をqPCRによって測定し、RPL13AおよびATP5B遺伝子発現について正規化した(詳細については参考文献23を参照)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:レチノイン酸(RA)とその合成類似体EC 23の比較。PBECを単離・増殖させ、分化したALI-PBEC培養を確立しました。PBEC培養物の空気曝露の開始時に、RA(50nM)を様々な濃度のEC23で置換した。(a)電気抵抗をALI後14日目に測定し、続いてTEERを算出し(Ω・cm2)、n=2ドナー、バーはSD±平均値を示す。 (B)ALI後14日目に、qPCRを用いて、それぞれ繊毛細胞および杯細胞(FOXJ1、MUC5AC)の細胞マーカーのRNA単離およびその後の遺伝子発現解析のために細胞培養物を溶解し、 RPL13A(n = 3ドナー)について正規化した。50 nM RAで培養したALI-PBECに対して倍増が示され、SD±平均値として表されます。 (詳細は参考文献23を参照) この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
過去数年間、培地や培養プラスチックなどの培養システムにおける代替製品の性能が調査されてきました。このような評価には、メーカーによる培地組成の変更、新しいメディアの導入、COVID-19パンデミック(2020-2022)中の製品の不足など、さまざまな理由がありました。異なるサプライヤーからの類似製品は、上皮細胞タイプのマーカーの評価に基づいて分化した上皮細胞培養をもたらすという観察がなされたが、最終的な細胞組成は実質的に異なる可能性があるが(図6A)、TEERの違いはそれほど顕著ではなかった(図6B)。一方、異なるサプライヤーからの培地は、細胞組成に大きな違いをもたらしました。異なるブランドのインサートを使用する場合、そのような違いは限られていました(図6C)。特に、STEMCELL Technologiesの気道上皮細胞培養培地PneumaCultを使用した場合、異なる形態および目に見える繊毛活性のより迅速な形成が観察された。これらの観察に加えて、cBD培地と比較したALI-PBECのTEER値の違いおよび細胞組成の違いも注目された(図6D)。
図6:上皮細胞培地と細胞培養インサートの異なるサプライヤーの比較。 PBECを単離、拡張し、分化したALI-PBEC培養を確立しました。(A)ALI-PBECを14日間培養した後、RNA単離のために細胞層を溶解した。基底細胞、繊毛細胞、杯細胞、およびクラブ細胞マーカー(それぞれTP63、 FOXJ1、 MUC5AC、および SCGB1A1)の遺伝子発現をqPCRによって測定し、 RPL13A および ATP5Bについて標準化しました。n = 2ドナー。バーはSD±平均値を示す。 (B)ALI後9日間にわたって電気抵抗を測定し、続いてTEERを算出した(Ω・cm2)。n = 3人の異なるドナー。平均値はSD±示されています。 (C)ALI-PBECを、3つの異なるサプライヤーから購入した細胞培養インサートを使用して14日間培養し、その後、RNA単離のために細胞層を溶解しました。繊毛細胞マーカー、杯細胞マーカー、およびクラブ細胞マーカー(それぞれFOXJ1、 MUC5AC、および SCGB1A1)の遺伝子発現をqPCRによって測定し、 RPL13Aについて標準化しました。n = 18の異なるドナー、バーはSD±平均値を示す。 データは、一元配置ANOVAノンパラメトリッククラスカル-ウォリス検定を使用して有意性について検定され、有意差は見つかりませんでした。(D)ALI-PBECをcBD培地またはニューマカルト培地(STEMMCELLテクノロジー)のいずれかでALI後14日間培養し、その後、RNA単離のために細胞層を溶解しました。基底細胞マーカー、繊毛細胞マーカー、杯細胞マーカー、クラブ細胞マーカー(それぞれTP63、 FOXJ1、 MUC5B、および SCGB1A1)の遺伝子発現をqPCRで測定し、 RPL13A について正規化し(バーはSD±平均値を示す)、ALI後5日目と12日目に電気抵抗を測定し、TEER(Ω・cm2)の計算に使用しました。n = 2;平均値はSD±示されています(詳細については、参考文献 23 を参照してください)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足表1:プロトコルで使用される溶液および媒体の組成。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
ここで提示するプロトコルは、切除された肺組織からのヒト気管支上皮細胞の単離、分化能を失うことなく細胞を最適に増殖させる方法、凍結保存手順、および高分化型ALI-PBEC培養物を生成するための手順について説明しています。さらに、品質管理の説明、および差別化されたALI-PBECの監視と評価の手順が提供されます。
説明されているプロトコルは、肺がんの診断に関連する手術を受けている患者の肺葉から切除された肉眼的に正常な腫瘍のない気管支リングから始まります。したがって、これらのリングは厳密には健康な組織と見なすことができず、したがって細胞培養特性に影響を与える可能性があることに注意する必要があります。気管支上皮細胞を得るための代替供給源には、気管支生検、気管支ブラッシング、または移植ドナーまたはレシピエント肺からの組織を使用することが含まれる。発生源に関係なく、肺組織を使用する場合、微生物汚染のリスクを考慮する必要があるため、細胞培養の微生物汚染のリスクを減らすために、さまざまな培養培地で抗生物質が使用されます。特に、マイコプラズマは、細胞培養に対する多種多様な影響、細胞培養で一般的に使用される抗生物質に対する耐性、およびマイコプラズマ汚染がマイコプラズマ検出アッセイによってのみ確認できるという事実のために、細胞培養における高い一般的なリスクです。したがって、肺組織から細胞を単離した後の細胞培養の初期段階では、広域スペクトル抗菌製剤プリモシンが使用され、培養プロセス中に、無作為に選択されたサンプルがマイコプラズマの存在について試験される。
気管支リングから始まる単離手順は、分化能力を損なうことなくALIで培養を開始するために必要なこれらの初代細胞の増殖の程度を可能にするのに十分な出発材料を提供します。しかし、限られた細胞数で単離された上皮細胞の増殖を開始することは、ALI培養のために播種することができる十分な細胞を有する十分な数のインサートを得ることに問題を引き起こす可能性がある。初代細胞の長期培養および反復継代は、複製老化をもたらす可能性がある。この制限を克服するために、さまざまなソリューションが提案されています。Horaniらは、Rhoキナーゼ阻害剤(ROCK)Y−27632が基底細胞の増殖を増加させることを示し30、Mouらは、分化した上皮細胞層31の特性を維持しながら基底幹細胞を拡張するために二重Smad阻害を使用し、Sachsらは、気道上皮細胞を拡張し、複数回継代の過程でそれらの分化能を維持するために使用することができる気道オルガノイド系を開発した32.後者の方法は、早産児(妊娠28週齢<)からの気管吸引液(TA)や気管支肺胞洗浄(BAL)液などの細胞数が非常に少ないソースから細胞を増殖させるためにも使用され、ここで説明するようにALI培養に移しました33。BALおよびTAから単離された細胞は、気管支組織から生成された細胞と同様の分化能力を示したが、Notchシグナル伝達阻害またはTh2サイトカインIL-13を用いてより繊毛またはより多くの杯細胞含有培養物に分化が偏った場合、差異が観察された33。したがって、ALI-PBECを同様のアプローチで上皮細胞数の低い出発物質から培養する場合は、プロトコルのセクション6で説明されているように、基本的な品質基準について培養物を常に確認することをお勧めします。重要なことに、フィーダー細胞の使用は、時間と細胞数が不可欠な移植可能な足場工学の設定で不可欠な、より大きな細胞数の取得にも役立つ可能性があります。このことは、気管疾患患者由来の生検から自家上皮細胞を培養し、マウス胚フィーダー層(有糸分裂的に不活化された3T3-J2線維芽細胞)および上記のRho/ROCK経路阻害剤(Y-27632)の存在下で細胞を急速に増殖させた研究によって示されています34。得られた細胞培養は、気管足場の再増殖に有用であることが見出され、したがって、これは移植モデルに適したプロトコルと見なすことができる。
この貢献で説明されているプロトコルを使用する場合だけでなく、他の培養プロトコルを使用する場合も、必然的に選択バイアスが導入されます。培養を開始するために使用される細胞の起源、培地組成、およびその他のプロトコルの詳細などのプロトコルの詳細の違いは、培養物の細胞組成の変化、ひいてはALI培養の応答の変化につながる可能性があることを認識することが重要です33、35。加えて、気道細胞10、11を分化させるための異なる培地を比較すると、細胞特性の違いも観察された。PneumaCult培地とcBD培地を比較すると、杯細胞とクラブ細胞のmRNAマーカー、TEER値、および細胞層の厚さに違いが見られました。これらの観察に基づいて、統計的裏付けがないにもかかわらず、使用されるドナーの数が少なく、培地組成が顧客に知られておらず、PneumaCult培地のコストが高いため、私たちの研究室ではcBD培地を使用することが決定されました。
説明したように、細胞はオルガノイド培養を使用して最初に増殖させ、その後2D ALIインサートシステムに移すことができます。気道上皮オルガノイドは空気浮遊物質への曝露には適していないのに対し、ALI 2Dシステムを使用すると、タバコの煙23,36などの浮遊物質が培養気道上皮細胞に与える影響を評価できるため、これは重要です。ALI気道上皮細胞培養を確立するための別のアプローチは、ヒト多能性幹細胞(hiPSC)の分化によって気道上皮細胞を生成することです37。このようなプロトコルでは、近位気道前駆細胞への分化後の分化プロトコールの最終段階で、ここで説明したものと同様の手順を用いてALIへの培養によって細胞を分化させることができる。
現在のプロトコールでは、ALIでの培養にはcBD培地が用いられている。cBD培地は、Fulcherら38 および他の研究に触発された、異なるサプリメントの混合物を加えることによって調製される無血清培地である。サプリメント溶液には、52 μg/mLのウシ下垂体抽出物(BPE)、0.5 μg/mLのヒドロコルチゾン、0.5 ng/mLのヒトEGF、0.5 μg/mLのエピネフリン、10 μg/mLのトランスフェリン、5 μg/mLのインスリン、6.5 ng/mLのトリヨードサイロニン、および0.1 ng/mLのRA39が含まれています。BPEは組織抽出物であり、バッチごとの変動を受けるため、培地を完全に定義された培地と見なすことはできず、動物を含まないものでもありません。完全に定義された細胞培養培地は、バッチ間の差異を最小限に抑えるために好ましい。動物を含まない研究への移行を考慮すると、動物性食品を含まず、科学界にとって手頃な価格の定義された培地を作成するための努力がなされることが重要です。
研究課題に応じて、ALIモデルに基づいてさまざまな実験セットアップを使用できます。例えば、分化プロセスに影響を与える可能性のある化合物の影響を調べるために、これは、水中培養のさまざまな段階、分化中、または高分化段階で化合物を培養物に添加することによって対処できます。ALI-PBEC培養物の細胞組成は、特定の化合物を添加することによって影響を受ける可能性があります。例えば、IL-13の存在下でALI-PBECを分化させると、より多くの杯細胞とより少ない繊毛細胞を含む培養が生成されますが、分化中にγセクレターゼ阻害剤DAPT(Notchシグナル伝達をブロックするために使用)で処理すると、杯細胞を犠牲にしてより多くの繊毛細胞で培養されます23,40,41,42。
さらに、細胞を刺激するか、または特定のプロセスを遮断する薬剤は、基底区画に適用することも、培養物の頂端区画に(非常に少量で)適用することもできる。細胞は、頂端側から空気中の物質にさらされることもあります。このような暴露設計は、PBECに対するディーゼル排気ガスまたはタバコの煙全体の影響を研究するために使用されています23,43,44。培地は、培地を交換するたびに回収して、基底側で分泌されたタンパク質をモニターすることができます。基礎培地をリフレッシュしながらPBSで洗浄した細胞の頂端側についても同様である。いわゆる頂端洗浄液を採取し、オプションのジチオエリスリトール(DTE)を添加して、杯細胞によって生成される粘液をより効率的に解離します。細胞ライセートは、総タンパク質、RNA、染色体およびミトコンドリアDNAの単離のために得ることができます。細胞は、プラスチックインサートからポリエチレンテレフタレート(PET)膜を切断し、さらにこの膜を複数の免疫蛍光染色のためにより小さな断片に切断することによって、特異的マーカーに対する抗体を用いてさらに研究することができる45。さらに、フローサイトメトリーまたはFACSは、インサート内の細胞のトリプシン処理後に使用することもできる。ALI段階では、電気抵抗を測定し、続いて電気抵抗がメンブレンインサートの表面積に反比例するTEERを計算することにより、細胞バリアの発達をモニターできます。計算は、次の式を使用してオームの法則に基づいています:
ここで、Rmは測定された電気抵抗、Rbはコーティングおよびセルのないインサートのベースライン電気抵抗、SAはインサートの膜の表面積です。EVOM2およびSTX/箸電極を使用した電気抵抗の測定は簡単ですが、ウェルに導入する際の取り扱い手順に大きく依存します。また、電極の形状は比較的大きな表面積17のバリア機能の測定に影響することが示唆された。
正確な組織表現を増加させることを目的としたALI細胞培養システムのさらなる改善には、白血球、線維芽細胞または内皮細胞などの追加の細胞型の共培養が含まれる46,47,48。ALI-PBECと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)またはM-CSF分化マクロファージとの共培養は、自然上皮応答および修復に著しく影響することが観察されている48。このような共文化モデルでは、中程度の互換性が問題になる可能性があることに注意することが重要です。気道上皮細胞培養に使用される培地はPBEC専用に開発されており、他の細胞種には最適ではない可能性があるため、最適化が必要です。単離されたPBECを使用できる気道生物学の分野で見られる別のタイプの進歩は、臓器チップ(OoC)技術の使用です49,50。この技術を使用して、ストレッチ、空気、媒体の流れなどの呼吸と血流の機械的な力の影響を調べることができます29。
さまざまなドナーからのPBECを使用する場合、ドナー間の変動性は重要である可能性があるため、上皮細胞培養研究でこの変動性を説明するために、複数のドナーからの細胞を使用することを検討することが重要です。ALI-PBECの培養には時間がかかり、かなりのコストがかかるため、1つの細胞培養インサートで異なるドナーの細胞を混合してALI-PBEC培養を確立するオプションを検討します。このようにして、様々な個々のドナーに由来する培養物の応答を分析する前に、初代細胞を用いてパイロット実験を容易に行うことができる。さらに、異なる特性(例えば、異なる年齢カテゴリーまたは性別)を有するドナーを、探索的研究のためにグループ化することができる。ドナーミックスを使用する場合、より高い増殖率の結果として1人のドナーが結果を支配する可能性を防ぐために、異なるドナーの等しい細胞数が存在することを確認することが重要です。したがって、個々のドナーからの細胞は別々に増殖され、個々のドナーからの細胞の播種と比較してインサート内でより高い密度で播種され、ALIに移行する前のインサートでの増殖を最小限に抑える。ドナーミックスと対応する個々のドナーの反応は、SARS-CoV-2の感染動態を研究することによって比較されました。RT-qPCRおよび免疫蛍光染色を用いて、ドナーミックスは、産生されたウイルス粒子の数が同程度で、感染細胞の数が類似していることを示すことにより、様々な個々のドナーの良好な表現を提供することが観察された28。
動物モデルにとって許容可能な代替手段となるためには、培養気管支上皮細胞の遺伝子編集が実行可能であるべきである51。ALI-PBECに低分子干渉RNA(siRNA)を用いることによるRNA干渉技術を検討しているが、培養液中に細胞にsiRNAをトランスフェクトする必要があるため、培養中にsiRNAトランスフェクションを頻繁に繰り返さない限り、ALI培養中は培養期間が長いため、ノックダウンが十分に維持されない52.それにもかかわらず、siRNAは、水中基底細胞における遺伝子発現を改変するために首尾よく使用することができる。また、CRISPR/Cas9技術を用いて、リボ核タンパク質(RNP)送達を用いた初代ALI気道上皮細胞培養において遺伝子編集に成功した者もいる 53。このような技術を使用する場合、細胞が完全な分化能力を維持することが不可欠です。初代気道細胞培養は無期限に継代できないため、遺伝子編集細胞のクローン増殖は容易ではなく、トランスフェクト細胞を選択するための培地の追加は煩雑です。そのため、全ての培養細胞において望ましいノックダウンを達成することは困難である。ノックアウトクローンを生成するための代替案は、hiPSCにおけるノックアウト戦略の使用54 および気道上皮細胞を生成するためのこれらの細胞の使用である。最適ではないが別の代替案は、遺伝子編集細胞55をクローン的に増殖させるために不死化PBEC系統を確立することである。
ここで提示されたプロトコルは、高度に分化した疑似層別化ALI-PBECを生成する1つの方法ですが、提示されたプロトコルと比較して、より小さな違いと大きな違いで、そのような文化を確立する他のプロトコルも見出されています。私たちの意見では、ALI-PBECシステムおよび気道上皮細胞の同様の培養システムが動物実験の有効な代替手段になるには、培養方法の実験室全体の検証と厳格な品質管理が不可欠です。
Disclosures
著者は、関連する利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この寄稿で説明されているモデルを使用した研究は、オランダ肺財団、オランダ健康研究開発機構(ZonMw、COVID-19 MKMD助成金)、オランダ動物実験代替協会(Stichting Proefdiervrij、助成金#114025007)、ベーリンガーインゲルハイムやガラパゴスなどの企業からの研究助成金など、さまざまな資金提供機関によってサポートされています。 図 1 は BioRender.com を使用して作成しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 ohm test resistor | World Precision Instruments | N/A | Used to calibrate the EVOM2 Epithelial Voltohmmeter |
| 4-[2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)ethynyl)-benzoic acid (EC 23) | Tocris | 4011 | Used in cBD medium |
| 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3506 | Used in the first step to grow the cells isolated form the bronchial ring |
| Airway Epithelial Cell Growth Medium Kit | PromoCell | C-21160 | Used to compare to cBD medium |
| Bead Bath 20 Liter | Lab Armor | 74220-720 | Used to pre-warm cell culture solutions |
| BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium BulletKit | LONZA | CC-3170 | Used to compare to cBD medium |
| Bovine albumin fraction V (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | Used in coating solution |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Bronchial epithelial cell growth supplement (BEpiCGS) | ScienCell Research Laboratories | 3262 | Used in cBD medium |
| Bronchial epithelial cell medium-basal (BEpiCM-b) | ScienCell Research Laboratories | SCC3211-b | Used in cBD medium |
| Cell culture inserts; 12 mm Transwell with 0.4 µm pore polyester membrane insert | Corning | 3460 | Cell culture inserts used in the protocol |
| Cell culture inserts; 12-well inserts, 0.4 µm PET clear | CellQART made by SABEU | 9310412 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| Cell culture inserts; 12-well ThinCert Tissue culture Inserts | Greiner Bio-One | 82050-032 | Cell culture inserts used to compare with Corning cell culture inserts |
| CELLSTAR flask, TC, PS, 250 ml, 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658170 | Used to expand the number cells |
| CFX Maestro 1.0 | Bio-Rad | N/A | Software program for analyzing qPCR data generated with the CFX384 System |
| CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855484 | qPCR detection system |
| Chopstick electrode set | World Precision Instruments | STX2 | Used to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| CO2-Incubator | PHCbi | MCO-170AICUV-PE | Cell culture incubator used for mycplasma free cell cultures |
| CO2-Incubator | Hereaus | Heracell 150 | Cell culture incubator used for possibly mycplasma infected cell cultures |
| Coolcell Container | Corning | 432006 | Used to cryopreserve cells at -80 °C before transfer to liquid N2 |
| Countess 3 Automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX2000 | Used to count cells and determine the cell concentration |
| Cryovials | Nalgene | 479-3224 | Used to cryopreserve cells in |
| D-Glucose | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 101174Y | Used in soft trypsin |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Avantor VWR | 0231 | Used in cell freeze medium |
| dNTP (10 mM) | Promega | U1515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 4500 mg/l D-Glucose | STEMCELL Technologies | 36250 | Used in cBD medium |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 4.5 g/l glucose with l-glutamine | LONZA | LOBE12-604F | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966029 | Used in cBD medium to compare with DMEM from other manufacturers |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermo Fisher Scientific | 37000-015 | Used in c-KSFM |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Avantor VWR BDH CHEMICALS | 443885J | Used in soft trypsin |
| EVOM2 Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | 91799 | Used with the chopstick electrode set to measure electrical resistance in ALI-PBEC |
| Fibronectin solution, Human | PromoCell | C-43060 | Used in coating solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | Used in cBD medium |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) | ScienCell Research Laboratories | SCC0313 | Used to dissolve protease XIV |
| IQ SYBR Green Super mix | Bio-Rad | 170887 | qPCR reagent |
| Isoproterenol hydrochloride, (-)- | Sigma-Aldrich | I-6504 | Used in c-KSFM |
| Keratinocyte-SFM (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005-034 | Used in c-KSFM |
| Maxwell RSC Instrument | Promega | AS4500 | Automated RNA isolation system |
| Maxwell RSC simplyRNA Tissue Kit | Promega | AS1340 | Used to isolate total RNA with the Maxwell RSC Instrument |
| M-MLV Reverse transcriptase | Promega | M5301 | Used in the synthesis of cDNA |
| M-MLV Reverse transcriptase 5X reaction buffer | Promega | M531A | Used in the synthesis of cDNA |
| MycoStrip | InvivoGen | rep-mys-10 | Used to detect the presence of mycoplasma in cell culture samples |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | Thermo Fisher Scientific | 15630056 | Used in cBD medium |
| Oligo(dT)15 | Qiagen | 79237 | Used in the synthesis of cDNA |
| Penicillin/Streptomycin solution (Pen/Strep) | ScienCell Research Laboratories | SCC0513 | Used as antibiotic in c-KSFM and cBD medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | LUMC pharmacy | N/A | Used in different steps of the protocol |
| Pneumacult-ALI Medium | STEMCELL Technologies | 05002 | Used to grow cells in the differentiation stage to compare to cBD medium |
| Pneumacult-Ex Plus Medium | STEMCELL Technologies | 05040 | Used to grow cells in the submerged stage to compare to cBD medium |
| Primer, ATP5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCACCCAGGCTGGTTCAGA |
| Primer, ATP5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGTGGCCAGGGTAGGCTGAT |
| Primer, FOXJ1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGAGGGGACGTAAATCCCTA |
| Primer, FOXJ1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TTGGTCCCAGTAGTTCCAGC |
| Primer, MUC5AC, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCTTCGACGGACAGAGCTAC |
| Primer, MUC5AC, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCTCGGTGACAACACGAAAG |
| Primer, MUC5B, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: GGGCTTTGACAAGAGAGT |
| Primer, MUC5B, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AGGATGGTCGTGTTGATGCG |
| Primer, RPL13A, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: AAGGTGGTGGTCGTACGCTGTG |
| Primer, RPL13A, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CGGGAAGGGTTGGTGTTCATCC |
| Primer, SCGB1A1, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACATGAGGGAGGCAGGGGCTC |
| Primer, SCGB1A1, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: ACTCAAAGCATGGCAGCGGCA |
| Primer, TP63, forward | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: CCACCTGGACGTATTCCACTG |
| Primer, TP63, reverse | Integrated DNA Technologies | N/A | Nucleotide sequence: TCGAATCAAATGACTAGGAGGGG |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | Used as antimicrobial agent against bacteria, mycoplasma, and fungi in c-KSFM medium |
| Protease XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | Used for the enzymatic treatment of the bronchial ring |
| RNAsin Recombinant Ribonuclease inhibitor | Promega | N2515 | Used in the synthesis of cDNA |
| Soybean trypsin inhibitor (SBTI) | Sigma-Aldrich | T9128 | Used to inhibit the action of soft trypsin |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Used in the synthesis of cDNA |
| TissueSAFE plus | MILESTONE MEDICAL | N/A | Vacuum transfer system for biological specimens |
| Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to count live- and dead cells |
| Trypsin 1:250 | Thermo Fisher Scientific | 27250-018 | Used in soft trypsin |
| Type I collagen solution (PureCol) | Advanced BioMatrix | 5005-B | Used in coating solution |
| Universal container, PP, with PE screw cap | Avantor VWR | 216-2053 | Used in the protocol for the Protease XIV treatment of the bronchial ring |
References
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