Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Was der Teer-Test wirklich einzigartig macht, ist, dass er es ermöglicht, antigenspezifische T-Zellen direkt zu visualisieren. Der te, der Teer, ist der wichtigste einzigartige Aspekt unseres Tests. Das wird mit einem Verstärkungsschritt kombiniert, den wir durchführen.

Wir isolieren die T-Zellen und züchten sie dann in einer Umgebung, die die Probe für die T-Zellen bereichert, die uns interessieren. Dann können wir genau diese Zellen markieren und sie mit einem Durchflusszytometer visualisieren. Und bei früheren Assays, Dingen wie CSFE oder Proliferationstests, die es seit Jahrzehnten gibt, erhält man einfach eine Art Gesamtmasse der gesamten T-Zell-Population.

Aber du hast Millionen von T-Zellen im Körper, und sie sehen eine ganz Vielzahl von Mustern. Wenn Sie Glück haben, sind vielleicht eine von zwei bis 300.000 Zellen der Zelle in der Probe die, die Sie betrachten. Und deshalb führt dieser Test diese Anreicherungsschritte durch.

Und dann kann man mit einer Testzahl, und weil man direkt färbt, tatsächlich abseits des Hintergrunds eine Population visualisieren, die weniger als 1 % der Gesamtzahl der Zellen ausmacht. Man sieht also sehr, sehr kleine Unterschiede und erhält eine ziemlich genaue Anzahl der T-Zellen in dieser Blutprobe, die sich in dieser Person befinden und Ihr Muster erkennen. Aber es hört nicht damit auf, denn die Teters erlauben es dir auch, diese T-Zellen nicht nur zu beschriften, sondern sie auch für weitere Analysen zu isolieren.

Und die Teter, die Sie verwenden, werden tatsächlich hier bei BRI hergestellt, stimmt das? Ja. Wir sind eines der wenigen Labore im Land, die erfolgreich Klasse-2-Teters gemacht haben. Unser Ziel ist es, diese Reagenzien zu Kosten an alle Labore zu verteilen, die daran interessiert sind, diese Technologie zu importieren.

Was würden Sie sagen, sind die schwierigsten oder herausforderndsten Aspekte dieses Tests, wenn es darum geht, ihn in anderen Laboren zu replizieren? Nun, wenn ich darüber nachdenke, gibt es eigentlich zwei: das Wachstum der T-Zellen. Es ist wirklich eine Art Kunst.

Du hast fast täglich die Entscheidung, ob die Zellen zusätzliche Nährstoffe oder mehr Platz zum Wachsen brauchen. Und dann ist der zweite Teil, den ich für einen unerfahrenen Bediener wahrscheinlich am schwierigsten halte, tatsächlich die Datenanalyse. Es geht darum herauszufinden, welcher Teil des Signals wirklich eine positive Reaktion ist und welcher Teil einfach in Physik und Anziehung einhergeht.

Und die Tatsache, dass alles ein gewisses Maß an Haftigkeit hat, erfordert wiederum viel Erfahrung, besonders in Kontexten, in denen die Gesamtreaktion etwas schwach sein wird. Wie haben die Informationen, die Sie mit diesem Assay generieren werden, das Potenzial für Patienten zu diesem Zeitpunkt zu nutzen? Eines der ersten Merkmale, das bei jedem Autoimmunpatienten auftritt, ist eine Art Konstellation von Antikörpern, die spezifisch für diese Krankheit sind.

Wir wissen aus den grundlegenden Prinzipien der Immunologie, dass überall dort, wo es eine Antikörperantwort gibt, immer zuerst eine T-Zell-Reaktion auftritt. Wenn wir also bei gefährdeten Personen den Anstieg der T-Zellaktivität sehen könnten, der der Antikörperbildung vorausgeht, würde uns das helfen, ein wirklich neues Risikoniveau zu definieren oder dass Individuen auf Autoantikörper zusteuern, was hoffentlich ein Fenster für interventive Therapien öffnen würde. Dieses Verfahren wird antigenspezifische CD-4-positive T-Zellen reinigen und erweitern und mithilfe von Teters-Reagenzien und Geräten der Klasse zwei laminaren Fluss-Biosicherheitsschränke visualisieren.

Dies wird der Hauptarbeitsraum für das Verfahren sein. 50-Milliliter-konische Primärrohre für PBMC-Isolation mit XPBS. Dies sollte ein calcium- und magnesiumfreies Fol-Pack plus Folie sein, die vor leichtem Trommel gewickelt ist, um CoStar 10 mil Pipetten-Aerosolbehälter mit 50-mil-Einsätzen zu schützen, um eine Blutkontamination der Zentrifuge zu verhindern.

GS sechs R-Zentrifugen-Transferpipetten, Pasteur-Pipetten hämolytische Puffer mit 8,3 Gramm pro Liter. Ammoniumchlorid 1,0 Gramm pro Liter. Natriumbicarbonat 0,04 Gramm pro Liter DI Natrium EDTA Trian Blau 0,2 % Lösung in PBS Hämo CYTOMETER 15 Milliliter, konischer Röhrchen-Puffer mit PBS, ergänzt durch zwei millimolare EDTA plus fünf Gramm pro Liter.

BSA Max CD 4 Isolationskit, zwei von Milin Biotech gekauft, EP Magnetblock, gekauft von Stem Cell Technologies. Andere magnetische Zellanreicherungsplattformen könnten mit gleicher Wirksamkeit eingesetzt werden. Fünf Milliliter Polypropylen-Röhre RPMI 1640, ergänzt durch 25 millimolare Hippies, die zur Herstellung von T-Zell-Medium-Pooled humanem Serum verwendet werden, das zur Ergänzung des T-Zell-Mediums verwendet wird, T-Zell-Medium 500 Milliliter, 0,22 Mikron Flaschendeckelfilter, sterile 48-Brunnen-Platte, die für die In-vitro-Expansionskultur verwendet wird, Schritt 37 Grad CO2-Inkubator, 20 Milligramm pro Milliliter Lösung synthetischen Peptides mit dem interessierenden Epitope.

Fünf Milliliter Polystyrol-Faxröhren-Peptid-geladene Klasse-2-Teer, die zur Visualisierung von antigenspezifischen T-Zellen, Anti-CD-3, Anti-CD-4- und Anti-CD-25-Antikörpern zur Beschichtung antigenspezifischer T-Zellen verwendet werden. Faxen Sie vor Beginn des Eingriffs einen Flusszytometer oder ein Gleichwert. Stellen Sie alle Materialien und Ausrüstungen in Ihrem Arbeitsbereich zusammen.

Die folgende Demonstration behandelt die folgenden Schritte. PBMC-Isolation, CD-4-positive T-Zell-Trennung in vitro-Expansionskultur, T-Zellen visualisieren durch Teem oder Färbung. Schritt eins: PBMC-Isolation.

Nehmen Sie eine Blutprobe. Das Blut sollte in Spritzen oder Blutröhrchen gesammelt und mit Heparin im Verhältnis eins bis 50 antikoaguliert werden, um Gerinnung zu verhindern; mit einer Erträge von etwa 1 Million PBMC pro Milliliter Blut zu rechnen. Etwa 40 % davon werden CD-vier positive T-Zellen sein.

Aliquot das Blut in 50-Milliliter-konische Röhren. 25 Milliliter Blut pro Röhre. Mischen Sie das Blut vorsichtig vor dem ALI-Gerinnen, um das Plasma zu verteilen.

Fügen Sie PBS hinzu, wodurch das Gesamtvolumen auf 40 Milliliter steigt, und unterliegen, indem 11 Milliliter Fial getrocknet werden, in die Blutsonde eingeführt und die Pipettenhilfe vorsichtig aus der Pipette entfernt wird. Das Fiol wird langsam in den Boden des Rohrs abfließen. Sobald sich der Pegel ausgeglichen hat, entferne langsam die Pipette aus dem Blutschlauch, entsorge die Kappe und führe sie in das Aerosol der Kanister.

Schließe die Behälter fest und zentrifugiere bei 900 Mal G für 20 Minuten ohne Unterbrechung. Es ist entscheidend, dass am Ende dieses Spins kein Bruch angewendet wird, da die Bruchkraft die Zellschicht nach dem Drehen stört. Das PBMC sollte eine deutliche weiße Schicht zwischen dem gelben Plasma oben und dem transparenten Fial darunter bilden.

Lassen Sie die Schicht der weißen Blutkörperchen vorsichtig mit einer Transferpipette abgleiten und in ein neues Rohr übertragen. Etwas Plasma und Fial können mit dem PBMC entnommen werden, aber vermeiden Sie es, eine Schicht der roten Blutkörperchen aufzuziehen. Typischerweise können in diesem Schritt zwei Blutröhrchen zu einem Zellrohr kombiniert werden.

Um die Pelletgröße zu vergrößern, fügen Sie PBS hinzu, wodurch das Gesamtvolumen auf 15 Milliliter steigt, und zentrifugieren Sie bei 500 Mal G für 15 Minuten bei niedriger Unterbrechung, und Aerosol der Kanister aspirieren Sie die Flüssigkeit mit einer Pastepipettette, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Behandeln Sie mit einem hämolytischen Puffer, indem Sie fünf bis sechs Milliliter zu jedem Rohr hinzufügen und vorsichtig mischen, um Klumpen zu entfernen. Inkubieren Sie nicht länger als fünf Minuten.

Fügen Sie PBS hinzu, wodurch das Gesamtvolumen auf 50 Milliliter steigt, und zentrifugieren Sie bei 230 G-fachen für 10 Minuten. Bei niedrigen Bremsen werden Aerosolbehälter für diese langsameren Drehungen nicht mehr benötigt. Waschen Sie zweimal die Aspirationsflüssigkeit mit einem mit PBS gefüllten Rohr auf der Weidepipette und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 230 x G vor dem letzten Waschschritt, entfernen Sie einen Aliquot der resuspendierten Zellen, verdünnen Sie mit Trian-Blau und zählen Sie mit einem Hämozytometer.

Diese Zellanzahl bestimmt die Reagenzienvolumen, die bei der T-Zell-Trennung verwendet werden. Schritt zwei: CD-4 positive T-Zell-Trennung, Flüssigkeit aspirieren und einen laufenden Puffer hinzufügen, um das Gesamtvolumen auf 40 Mikroliter pro 10 Millionen Zellen zu bringen. In der Regel benötigt dies 30 Mikroliter Puffer plus das restliche Pelletvolumen.

Übertragen Sie dieses Volumen auf ein 15-Milliliter-konisches Rohr. Fügen Sie einen Antikörpercocktail aus den CD-4-Isolationskits hinzu, 10 Mikroliter pro 10-Millionen-Zellen-Kapselröhre und legen Sie sie 10 Minuten auf Eis. Entferne den Schlauch aus dem Eis, entferne die Kappe und gib 30 Mikroliter Laufpuffer pro 10 Millionen Zellen hinzu.

Füge magnetische Perlen aus dem CD-4-Isolationskit hinzu. 20 Mikroliter pro 10 Millionen Zellen schließen Sie das Rohr ab und legen Sie es 15 Minuten auf Eis. Fügen Sie 10 Bände laufenden Puffer zum Waschen hinzu und zentrifugieren Sie bei 230-fach G für 10 Minuten.

Während des Drehens stellen Sie den Magneten und das Fünf-Milliliter-Polypropylenrohr in Ihrem Arbeitsbereich auf. Flüssigkeit aus dem Zellpellet aspirieren. Fügen Sie zwei Milliliter laufenden Puffer hinzu und entfernen Sie Klumpen mit einer Transferpipette.

Mit denselben Transferpipetten-Transfercellen in das Fünf-Milliliter-Rohr und 15 Minuten im Magneten inkubieren. Dekantieren Sie vorsichtig die CD-4-positive T-Zell-Fraktion in eine markierte 15-mil-Röhre, indem Sie den Magneten invertieren und alle bis auf den letzten Tropfen entleeren. Füge weitere zwei Milliliter Laufpuffer zum Fünf-Milliliter-Rohr hinzu und entferne es vom Magneten.

Spülen Sie vorsichtig die CD vier negative Zellen von den Seiten des Röhrchens ab und übertragen Sie sie auf eine markierte 15-mil-Röhre. Fügen Sie jedem Rohr zwei Milliliter T-Zell-Medium hinzu. Entfernen Sie Aliquots für die Zellzählung und zentrifugieren Sie bei 230 G-Mengen für 10 Minuten.

Verdünne Zellaliquoten mit Trian-Blau und zähle mit einem Hämozytometer. Diese Zellzählungen bestimmen die Anzahl der für die Expansionskultur verwendeten Bohrungen. Schritt Schritt drei.

In vitro-Expansionskultur wird Flüssigkeit aus den CD vier positiven und CD vier negativen Zellpellets basierend auf den Zellzählungen abgesaugt. Fügen Sie dem CD vier positive Zellen ein Medium hinzu, um das Volumen auf 3 Millionen Zellen pro Mil anzupassen. Fügen Sie dem CD vier negative Zellen ein Medium hinzu, um das Volumen auf 10 Millionen Zellen pro Mil anzupassen.

Die Expansionskultur benötigt 3 Millionen CD 4 negative Zellen pro Bohrloch und zwei bis 3 Millionen CD vier positive Zellen pro Brunnen. Typischerweise sind CD-4-positive Zellen die limitierende Population. Aliquot CD vier negative Zellen in die entsprechende Anzahl von Bohrlöchern auf einer 48-Bohrloch-Platte.

Indem du jeweils 300 Mikroliter hinzufügst, stellst du den Teller für eine Stunde in einen 37-Grad-Inkubator. Entfernen Sie die Platte, den Inkubator, waschen Sie die Brunnen, indem Sie 500 Mikroliter frisches Medium hinzufügen und vorsichtig 12 bis 20 Mal mit einer Transferpipette auf und ab pipettieren und die gesamte Flüssigkeit entfernen. Diese Wäsche hinterlässt eine Schicht adhärenter antigenpräsentierender Zellen.

Wenn das Waschen abgeschlossen ist, füge gerade genug Submedium hinzu, um den Boden jedes Stücks zu befeuchten, also etwa 100 Mikroliter. Andernfalls trocknen die A-haftenden Zellen aus. Fügen Sie bei Bedarf zwei bis 3 Millionen CD-vier positive Zellen zu jeder Welle hinzu.

Fügen Sie zusätzliches Medium hinzu, um das Gesamtvolumen in jedem Brunnen auf einen Milliliter zu erhöhen. Gib jedem das gewünschte Peptid hinzu. Brunnen. Die typische Konzentration für die Stimulation beträgt 10 Mikrogramm pro Milliliter.

Endplatzierung in einem 37-Grad-Inkubator für sieben Tage. Nach sieben Tagen. Fügen Sie an jedem folgenden Tag 50 Mikroliter Hämo-IL zwei zu jedem Brunnen hinzu.

Überwachen Sie das Zellwachstum mit einem Mikroskop, die noch nicht konfluent sind, indem Sie die Hälfte des Mediums entfernen, frisches Medium und 50 Mikroliter IL hinzufügen, zwei geteilte Confluent-Brunnen durch Resus-Aufhängen der Zellen, die die Hälfte der Zellen in einen leeren Brunnen bewegen. Frisches Medium und 50 Mikroliter IL kehren zwei Zellen in den Inkubator zurück. Die expandierenden Zellen sind nach 13 bis 15 Tagen Kultur bereit für eine Teer-Färbung.

Schritt vier: Visualisierung von T-Zellen durch Teer-Färbung, Kauf oder Zusammenbau von Teters, die zum Peptid passen. MHC-Kombinationen, die zur Stimulation der CD-vier positiven T-Zellen verwendet werden. Entferne den Teller aus dem Inkubator.

Ziehe sorgfältig die Hälfte des Mediums von jedem ab. Einen Brunnen von jeweils 75 Mikrolitern oder etwa 50.000 Zellen in ein Fünf-Milliliter-Polystyrol-Faxrohr übertragen, einen Mikroliter pro 50 Mikroliter Gesamtvolumen hinzufügen und für eine Stunde in einen 37-Grad-Inkubator platzieren. Es ist außerdem ratsam, einen zweiten Aliquot jedes Brunnens mit einem nicht übereinstimmenden Teer als Negativkontroll-Label-Zellen mit Anti-CD-3-, Anti-CD-4- und Anti-CD-25-Antikörpern zu färben.

Zusätzliche oder alternative Antikörpermarker können verwendet werden. Verwenden Sie jedoch keine mit PE markierten Antikörper, da dieser Kanal zu diesem Zeitpunkt für die Teems reserviert sein muss. Beschrifte außerdem einzelne Farb- oder Isotyp-Kontrollen mit zusätzlichen Zellen.

Inkubieren Sie antikörperbeschriftete Zellen für 15 bis 30 Minuten bei vier Grad. Waschen Sie jeden Schlauch mit 0,5 bis einem Milliliter laufenden Puffer und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 230 mal G. Vorsichtig die Flüssigkeit aus den Faxröhren dekantieren, das Durchflusszytometer mit Referenzperlen, Einfarb-Kontrollröhren, Isotyp-Steuerungen usw. kalibrieren.

Analysieren Sie jedes Rohr mit dem Durchflusszytometer. Die tetra-positiven Zellen sollten eine eigenständige Population unter den erweiterten CD-vier positiven T-Zellen sein. Tetra-positive Zellen sind üblicherweise CD 25-positiv und oft CD 4 high.I.