Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-spezifischen CD8 ⁺ T-Zellen in Rhesusaffen von Peptid-MHC-I Tetramerfärbung

Das übergeordnete Ziel dieses Assays ist die Aufzählung und Charakterisierung von Simian Immunodeficiency Virus-spezifischen CD8-positiven T-Zell-Populationen, die durch Impfung oder Primärinfektion erzeugt wurden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der T-Zell-Immunologie zu beantworten, z. B. wie hoch die Häufigkeit von antigenspezifischen CD8-T-Zellen ist, die entweder durch Impfung oder Infektion induziert werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie antigenspezifische CD8-T-Zellen in biologischen Proben quantifizieren kann, die direkt ex vivo gewonnen werden, ohne dass eine In-vitro-Restimulation erforderlich ist.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Bewertung von inzisionsspezifischen CD8-T-Zellen beim Rhesusaffen und auf die Untersuchung von CDB-T-Zell-Antworten in verschiedenen Krankheitsumgebungen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da das Wissen über die MHC-Genetik von Rhesusaffen unvollständig ist und die durchflusszytometrische Färbung eine präzise Antikörperapplikation erfordert. Beginnen Sie mit der erneuten Suspendierung des Rhesus-PBMC in R10-Medium.

Addieren Sie eine 1,6 mal 10 zu den siebten Zellen pro Milliliter Konzentration. Aliquotieren Sie 50 Mikroliter Zellen auf die entsprechende Anzahl von Durchflusszytometrie-Röhrchen und fügen Sie 50 Mikroliter Proteinkinase-Inhibitor zu jedem Röhrchen hinzu. Wirbeln Sie jedes Röhrchen vor und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Die richtige Menge des titrierten Peptids MHC-Tetramer muss in genügend Mastermix verdünnt werden, um alle Versuchsröhrchen zu färben. Daher ist es wichtig, einen Überschuss von 15 % des Mastermixes vorzubereiten, um Pippettfehler zu berücksichtigen. Während die Zellen inkubieren, pelletieren Sie die Proteinaggregate in der Tetramerlösung durch Zentrifugation, um die Hintergrundfärbung zu minimieren.

Als nächstes verdünnen Sie die Tetramere in ausreichend Färbepuffer, so dass 25 Mikroliter des Tetramer-Mastermixes in jedes Durchflusszytometrieröhrchen gegeben werden können. Anschließend werden die Probenröhrchen verwirbelt und die PBMC-Tetramerlösungen 45 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Am Ende der Inkubation geben Sie 50 Mikroliter Färbe-Mastermix in die entsprechenden Probenröhrchen.

Und mischen Sie die Röhren für das Vortexen. Nach 25 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur die Zellen mit Waschpuffer waschen, die Zellen durch Zentrifugation pelletieren und die Überstände vorsichtig dekantieren, ohne die Pellets zu stören. Wirbeln Sie die Zellen in den übrig gebliebenen Puffer in jedem Röhrchen und fixieren Sie die Proben mit 250 Mikrolitern 2%-Paraformaldehyd pro Röhrchen.

Sofort die Röhren im Dunkeln bei 4 Grad Celsius vortexen und inkubieren. Waschen Sie die Zellen nach 20 Minuten in frischem Waschpuffer. Die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert und der Überstand wird dekantiert, ohne das Pellet zu stören.

Die Zellen in 500 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer resuspendieren, vortexen und 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen und pelletieren Sie dann die Zellen. Anschließend werden die Überstände wie zuvor beschrieben dekantiert.

Fahren Sie mit der Zugabe von 50 Mikrolitern intrazellulärer Flecken-Mastermischung in die entsprechenden Röhrchen fort. Jede Probe vortexen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, waschen und pelletieren Sie die Zellen.

Die Proben sind nun bereit, in einem Durchflusszytometer entnommen zu werden. Mamu-B017.01-Tetramere ergeben typischerweise eine schwache Färbung, die durch Vorbehandlung der Zellen mit einem Proteinkinase-Inhibitor erheblich verbessert werden kann. Um eine Hintergrundfärbung zu vermeiden, sollten MHC-Klasse-1-Matching-Zellen, die die antigenspezifische CD8-positive T-Zellpopulation von Interesse enthalten oder nicht, mit dem relevanten Tetramer und mehreren Verdünnungen markiert werden, um die optimale Menge zu bestimmen, die die beste Trennung zwischen Tetramer-positiven und negativen CD8-positiven T-Zellen ergibt.

In diesen Diagrammen wird die Gating-Strategie gezeigt, die zur Analyse des Ausmaßes und des Gedächtnisphänotyps von impfstoffinduzierten Gag CM9-spezifischen CD8-positiven T-Zell-Antworten bei einem Mamu-A 01-positiven Rhesusaffen verwendet wird. Beachten Sie, dass die Tetramer-positive CD8-positive T-Zellpopulation gut getrennt ist und nur minimale Hintergrundfärbung aufweist. Und mit den Gedächtnis-Untergruppen, die durch ihre CD28-, CCR7- und Granzym-B-Expression innerhalb des Tetramer-Gates klar abgegrenzt sind.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jedem Antikörper oder Tetramer-Mastermix die richtigen Reagenzien hinzuzufügen und jedes Mal mit den Versuchsröhrchen zu arbeiten, wie gezeigt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um die Spezifität und den Phänotyp von antigenspezifischen CD8-T-Zellen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine MHC-Tetramerfärbung der Klasse 1 im Assay des Rhesusaffenmodells der menschlichen HIV-1-AIDS-Forschung einrichten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischen Proben von Rhesusaffen besondere Vorsichtsmaßnahmen erfordert, wie z. B. das Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung während der Probenverarbeitung.