Osmotische Vermeidung in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function von zwei Genen, Orthologe der Menschenrechte NRXN1 Und NLGN1, Die als Kandidaten für Autismus

Hallo, mein Name ist Manuel Ruiz Rubio hier an der Abteilung für Genetik der Universität von Cordova in Spanien. Wir verwenden die Eleganz als experimentelles Werkzeug Bei der Erforschung von Autismus, Nutzung der Welt charakterisiert Nervensystem von drei Eleganz. Wir untersuchen die Mutante des Fadenwurms, die in Genen wirksam ist, die an der neuronalen Synapse beteiligt sind und mit Autismus in Verbindung gebracht wurde.

Rein Regane sind Membranadhäsionsmoleküle, die in der Synaptik vorkommen. Der Kopf von C elegance enthält das Amfi, ein Sinnesorgan des Fadenwurms mit vermittelten Reaktionen auf verschiedene Reize, einschließlich osmotischer Stärke. Amfi besteht aus 12 sensorischen Bipo-Neuronen mit verwandter Höhe und einer INAP-Terminal-Wirkung.

Zwei dieser Neuronen, Name A SH, rechts und links, sind besonders wichtig für die osmotische sensorische Funktion. Erkennung von wasserlöslichem Ungleichgewicht mit hoher osmotischer Stärke. Hallo, ein Nan River Wein mit Himmelsmethode zur Messung der osmotischen Vermeidung in Synapsendefekt-Mutanten der ance.

Um die Implikationen der Vermeidung von neurologischer und neurohoher osmotischer Stärke zu bewerten, berichteten wir über die unterschiedliche Reaktion von C gegen Mutanten, die in neuroneuralen Genen defekt sind, mit einer Methode, die auf einer viermolaren Fruktoselösung basiert. Läuten Sie den Tag des Sagens, bereiten Sie eine vier molare Stammlösung aus Fruktose mit 1% Kongorot vor und lösen Sie sich bei Raumtemperatur vollständig auf. Der ringförmige Ring mit einem Durchmesser von einem Zentimeter auf der NGM-Platte befindet sich in der Mitte des festen Mediums.

Mit 15 Mikrolitern der roten viermolaren Fruktoselösung. Lassen Sie die Fruktose etwa fünf Minuten auf dem Hektar einwirken, das Experiment sollte blind durchgeführt werden. Die Platte, auf der jeder Stamm S acht sein soll, sollte von einem zweiten Versuchsleiter beschriftet werden.

Die SA wird mit diesen Zeichen ausgeführt, dass sie ungefragt sind. Wenn das Experiment etwa 24 Stunden vor dem Verkauf abgeschlossen ist, ist es notwendig, L vier Larven jedes Genotyps zu pflücken und sie auf eine AFL NGM-Platte mit E-Coli-Bakterien zu übertragen und sie am nächsten Tag bei 20 Grad Celsius zu halten. Das Experiment sollte mit jungen Erwachsenen begonnen werden.

Setzen Sie einen einzelnen Wurm jedes Stammes in den Ruhekreis und verfolgen Sie jedes Tier bis zum Zeitpunkt seiner Reaktion auf die Tic-Barriere. 10 Tiere jedes Stammes und mindestens drei Wiederholungsversuche sollten wir durchführen, um ein schlüssiges Ergebnis zu erhalten. Diejenigen, die den roten Ring sechsmal hintereinander vermeiden, werden als normal eingestuft.

Diejenigen, die den Ring in weniger als sechs Versuchen verlassen, gelten als defekt in der Osmose-Empfindlichkeit, Kontrollstamm muss in jedem SA Bristol verwendet werden, und zwei Tiere werden als positive Kontrollen verwendet, weil sie vermieden werden Die Ringbarriere. Kontrollstämme Reagieren rückwärts, wenn sie eine osmotische Barriere finden, die aus viermolarer Fruktose besteht. Neurodefiziente mutierte Bomben haben ein ähnliches Verhalten wie diese in Bezug auf eine Typenstärke.

NEUR-defiziente Mutanten konnten diese osmotische Barriere jedoch nicht nachweisen. Doppelte Mutantenstärken car in verschiedenen ativen neur- und nout-Allelen wiederherstellten den Wildtyp-Phänotyp, der auf die osmotische Stärke reagiert, um von Daunenwürmern durch RNA-Interferenz zu erhalten, die Isolatkolonien von e coli HD 11 fünf Stamm füttern, der mit L 44 40 transformiert wurde, Vektor, der ein Fragment enthält, das dem Zielgen entspricht. Die Bakterien werden am nächsten Tag auf LBA oder Platte mit Kohlensäure isoliert.

Wählen Sie eine Bakterienkolonie aus und impfen Sie LV flüssiges Medium. Wachsen Sie etwa sieben Stunden lang bei 37 Grad geschüttelt weiter. Sehen Sie, wie diese Kultur auf eine NGM-Platte mit Kohlendioxiddecke und IPTG tropft und über Nacht bei Raumtemperatur wai, so dass die Bakterien wachsen können und die Induktion der Expression des Fragments des Zielgens beginnt.

Es ist notwendig, eine positive und eine nicht-negative Kontrolle für RNA-Interferenz zu verwenden. Fütterungsversuche. Die Negativkontrolle ist gleich.

I HT 11 fünf Stämme transformiert mit TL 44 40 Vektor. Die Positivkontrollen ELI HT 11 mit fünf Zellen transformierten mit dem L 44 40 Vektor, der eine 22-Gensequenz enthielt. Die Sperre dieses Gens ist ein schüttelnder Phänotyp, der unter dem sterilen Mikroskop leicht zu unterscheiden ist.

Der erste Tag. L vierstufige Proben aus NGM PLA mit Bakterien werden auf die Platte mit Bakterien und Kuwait bei 20 Grad Celsius während 12 Stunden übertragen. Dies ist eine Fastenzeit.

Am nächsten Tag setzen Sie den schnellen jungen Erwachsenen auf die Platte, die mit Bakterien geimpft ist, die das spezifische RNA-Interferenz-Zielgen exprimieren. Lassen Sie etwa 48 Stunden bei 20 Grad Celsius, um die F1-Nachkommen zu erhalten. Pflücken Sie dann in den nächsten zwei Tagen ein paar F1-Bomben für Erwachsene auf eine andere Platte, die mit denselben Bakterien geimpft wird.

Auswahl und Isolierung junger Erwachsener aus dem F zwei Nachkommen Scoring für Phänotypen Bristol N zwei Wildtyp Stamm Fett mit Bakterien auftretende Empathie. L 44 40 Vektor ging rückwärts, wenn es in Ordnung war. Die osmotische Barriere.

Bristol Und echter weißer Stamm gefüttert mit Bakterien, die ein Fragment des Neur-Gens exprimieren, aus der Eleganz nicht in der Lage waren, die Zehen für molare Lösungen zu erkennen. Eine Neuro-defiziente Mutante, die nicht in der Lage war, die osmotische Barriere zu erkennen, erlangte diese Fähigkeit jedoch wieder, wenn sie mit Bakterien gefüttert wurde, die ein Fragment des Nane-Gens exprimierten. In diesem Video zeigen wir eine einfache Methode, die es ermöglicht, die Wirkung von Genen zu untersuchen, die die osmotische Vermeidungsreaktion in der Eleganz des Meeres beeinflussen.

Ein Ring aus Fruktose, der mit Kongorot dicht ist, wird verwendet, um die Reaktion der Bombe auf osmotische Stärke zu analysieren. Die Neurologie bei defizienten Mutanten ist in dieser Reaktion defekt, jedoch sind NU-Mutanten nicht beeinträchtigt, um Tomo-Stress zu erkennen, was eine ähnliche Reaktion wie bei Wildtyp-Stämmen zeigt. Dieses Video zeigt, dass doppelmutierte Stämme, die unterschiedliche tive Knockout-Allele in ing- und freisetzenden Genen tragen, den Wildtyp-Phänotyp wiederherstellen, der auf osmotische Stärke reagiert.

Diese Beobachtungen wurden durch RNA-Interferenz und den Ansatz des Fütter-Lockdowns bestätigt. Auf diese Weise war der Wildtyp-Stamm in der Erkennung der osmotischen Barriere beeinträchtigt, wenn er mit Bakterien gefüttert wurde, die die entsprechende Sequenz des ING-Gens exprimierten. Auf der anderen Seite haben neurdefekte Mutanten, die nicht in der Lage sind, die vier weiteren Fruktoselösungen zu erkennen, dieses Verhalten wiederhergestellt, wenn sie mit Bakterien gefüttert wurden, die die entsprechende Sequenz des NNU-Gens exprimierten.

Die in diesem Experiment gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass n seeing und neur an der synaptischen Verbindung der Sensorneuronen des Fadenwurms beteiligt sein könnten und dass sie in einer Weise miteinander interagieren, die die synaptische Funktion beeinflusst. Okay, auf Wiedersehen und viel Glück bei Ihren Experimenten.