Name: Osmotische Vermeidung in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function von zwei Genen, Orthologe der Menschenrechte NRXN1 Und NLGN1, Die als Kandidaten für Autismus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Erfahren Sie, wie osmotische Vermeidung in Caenorhabditis elegans zur Untersuchung synaptischer Funktionen von Neurexin- und Neuroligin-Mutanten eingesetzt wird. Diese Methode liefert Einblicke in Autismus-Kandidatengene.

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Wir möchten dankt Herrn Dr. Antonio Miranda-Vizuete für seine wertvolle Hilfe wollen. Wir möchten auch unseren Dank an Salma Boulayoune und Isabel Caballero Ausdruck für wertvolle technische Hilfe. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der Junta de Andalucía (BIO-272) finanziert. Diese Forschung wurde in Absprache mit den aktuellen Gesetzen genetische Experimente in Europa durchgeführt.

1: Osmotische Vermeidung Assay. <ol><li> Über 16-24 Stunden vor dem Test, Pick L4 Larvenstadium Tiere jeder Genotyp eine frische NGM-Platte mit OP50 E. coli andincubate es bei 20 ° C. Am nächsten Tag starten das Experiment mit jungen Erwachsenen. </li><li> Es wird empfohlen, die Durchführung des Tests "blind". Die Platten mit jeder Stamm zu untersuchenden sollte durch einen zweiten Experimentator neu etikettiert werden, der Durchführung des Tests mit dem neu etikettiert Platten, entlarvt als das Experiment beendet werden würde. </li><li> Der Tag des Tests, bereiten Sie einen 4M Stammlösung von Fructose mit 1% Kongorot Lösung auflösen und bei Raumtemperatur. Wir empfehlen, die Lösung vor jedem Test, da der Farbstoff mit der Zeit ausfallen könnte. </li><li> Kreisring (1 cm Durchmesser) auf NGM befindet sich auf der Mitte der festen Medium beschrieben, mit 15 ul der roten 4M Fructose-Lösung. Lassen Sie die Fructose-Lösung in den Agar einweichen, dies dauert in der Regel zwischen 2 und 5 Minuten. </li><li> Legen Sie einzelne junge erwachsene Tiere von jedem Stamm in den Ring und folgen in den nächsten 10 Minuten, um die Antwort auf die osmotische Barriere zu bestimmen. Tiere Vermeidung der Ring mehr als sechs Mal in Folge als normal eingestuft werden; Ausscheidenden am Ring in weniger als sechs Versuche sind als fehlerhaft in osmotische Empfindlichkeit. Hinweis: Die Steuerung Stammes muss in jedem Assay verwendet werden. N2 junge erwachsene Tiere werden als positive Kontrollen verwendet, da sie zu vermeiden entscheidend die Ringwallanlage. Tiere, die zuvor verhungert, ging durch Dauer-Larven oder aus Platten, die zu trocken kommen sollten nicht verwendet werden. Zu Beginn sollte der Kontrolltiere in zweifacher Ausfertigung ausgewertet werden, um zu bestätigen, dass die Assay-Platten und die Lösung korrekt sind. </li></ol> 2: Generierung von Knockdown Würmer durch RNAi Fütterung. <ol><li> RNAi Platten: NGM RNAi Fütterung Platten enthält pro Liter: 17 g Agar, 2,5 g Pepton, 3,0 g NaCl, 1 ml 5 mg ml -1 Cholesterin; füllen die Flasche zu 1 Liter mit H 2 O und Autoklaven. Nach Agar kühlt auf etwa 65 ° C, 25 ml 1 M KPO 4, pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 1M MgSO 4, 0,5 ml Carbenicillin (50 mg ml -1) und 1 ml 1M IPTG. Wenn Sie mit vorbereiteten soliden NGM beginnen, schmelzen festes Medium durch die Mikrowelle und anschließend mit Flüssigkeiten NGM auf der Bank zu kühlen und fügen Sie dann KPO 4, pH 6,0, CaCl 2, MgSO 4, Carbenicillin und IPTG wie zuvor angegeben. 10 ml NGM in jede 60 mm Petrischale. Abkühlen lassen und umkehren Platten Beibehaltung über Nacht bei RT vor dem Gebrauch. Die Platten können in einer Plastiktüte bei 4 ° C für ca. 4-5 Tage gelagert. </li><li> Bakterielle und Einleitung: Isolieren Sie Kolonien von E.coli HT115 (DE3)-Stamm, mit L4440 Vektor, der ein Fragment, das dem Ziel-Gen transformiert, auf Luria-Bertani (LB)-Agarplatten (17 g Agar, 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g NaCl pro Liter) mit Ampicillin (50 ug / ml) und Tetracyclin (15 ug / ml). Wählen Sie eine Kolonie von Bakterien und impfen in LB mit 50 pg / ml Ampicillin, gewachsen und für 6 8 h unter Schütteln bei 37 ° C; Samen ein Tropfen dieser Kultur auf die vorbereiteten Platten NGM und trocknen die Platten gründlich, bevor sie Inkubation über Nacht ( 12 24 h) bei Raumtemperatur, damit die Bakterien wachsen und der Induktion zu beginnen. Die Inkubation wurde im Dunkeln, weil Tetracyclin ist lichtempfindlich und kann die Variabilität der RNAi-Assays unter Platten beeinflussen. Es ist notwendig, um eine positive und eine negative Kontrolle für RNAi Fütterungsversuche verwenden. Die positive Kontrolle ist E.coli HT115 Zelle mit der L4440 Vektor, der die unc-22-Gen-Sequenz umgewandelt. Der Knockdown von unc-22-Gen produziert ein "Zucken Phänotyp". Die negative Kontrolle ist E.coli HT115 Zelle mit leeren L4440 transformiert. </li><li> Worm Handhabung und Scoring: Der erste Tag, Ort L4 Stadium Würmer aus einer NGM-Platte mit OP50 auf NGM-Platten ohne Bakterien und inkubieren ausgesät bei 20 ° C für 12 Stunden (Fasten). Am nächsten Tag, Transfer jungen Erwachsenen fasteten Zwitter auf einen Teller mit den Bakterien Ausdruck der spezifischen Zielgens RNAi seedded. Lassen Sie 40-48 Stunden bei 20 ° C bis F1-Nachkommen zu erzeugen. Dann legen Sie ein paar F1 erwachsenen Würmer auf eine andere Platte mit der gleichen Bakterien geimpft. Nach 24-48 Stunden, auszuwählen und zu isolieren, aus der F2-Nachkommen, junge Erwachsene (voll ausgebildete überstehende Vulva mit wenigen Eier) und Note für Phänotypen. Hinweis: der RNAi-Induktion in Neuronen haben einige Einschränkungen, weil der feuerfesten Eigenschaften der C elegans Nervensystem RNAi.. Zur Überwindung der Probleme dieser Ineffizienz in Neuron ist es empfehlenswert, die GebO-3-Stamm, eine hypersensible Hintergrund der Auswirkungen der RNAi in Neuronen 10 zu verwenden. In unseren Experimenten keine differences wurden zwischen Bristol N2 und RRF-3-Stämme für die Gene gefunden und den Phänotyp analysiert. </li></ol> 3: Die Stämme verwendet. Die C. elegans Stämme in dieser Arbeit sind in Tabelle 1 dargestellt. Mutanten-Stämme wurden gekreuzt gegen N2 Wildtyp - mindestens vier Mal, um unerwünschte zufällige Mutationen, die während der Mutagenese Protokoll erzeugt worden sein könnten, zu entfernen. .. OP50 E-coli-Stamm wurde von Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA E.coli HT115 (DE3) mit dem Plasmid pL4440 Durchführung NRX-1 (JA: C29A12.5) suppliied und NLG-1 (JA: C40C9.5 Gen)-Fragmente wurden durch Dr. Peter Askjaer, Centro Andaluz de Biología del Desarrollo (CABD), CSIC Universidad Pablo Olavide, Sevilla, Spanien zur Verfügung gestellt. 4: Repräsentative Ergebnisse. Illustrative Ergebnisse sind in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. Zehn Tiere von jedem Stamm und ein Minimum von drei Replika-Experimente wurden durchgeführt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/1616/1616Fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Experimente des osmotischen Vermeidungsverhalten. Control-Stämme und NRX-1 (ok1649 und tm1961) V mangelhaft mutantworms durch Umkehren rückwärts, wenn sie einen osmotischen Barriere (4M Fructose) Begegnung reagieren. NLG-1 (ok259 und tm474) X-Mutanten nicht, diese Barriere zu erkennen. Doppel-Mutanten in NLG-1 und NRX-1, Stämme CRR21 (ok1649; ok259) VX und CRR23 (tm1961; ok259) VX erholte sich der Wildtyp-Phänotyp. Der * zeigt signifikante Unterschiede (P ≤ 0,001) von t-Student-Test, in der Antwort von jedem Stamm der Bristol N2 Wildtyp von t-Student-Test <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/1616/1616Fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Experimente mit Knockdown Würmer durch RNAi Fütterung. E.coli HT115 (DE3) mit leeren pL4440 Vektor transformierte oder mit einem Fragment, das dem Zielgene NRX-1 oder NLG-1 wurden gefüttert anderer Wurm Stämme verwendet. Der * zeigt signifikante Unterschiede (P ≤ 0,001) von t-Student-Test, in der Reaktion des N2-Stamm mit Bakterien, die die pL4440 vector mit einem Fragment Targeting der NLG-1-Gens im Vergleich mit dem N2-Stamm mit leerem Vektor pL4440 eingespeist .

<ol><li>Sudhof, T. C. Nature. 455 (7215), 903-903 (2008).</li>
<li>Fabrichny, I. P., Leone, P., Sulzenbacher, G. Neuron. 56 (6), 979-979 (2007).</li>
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<li>Bargmann, C. I., Thomas, J. H., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+Spring+Harbor+symposia+on+quantitative+biology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology.</a> 55, 529-529 (1990).</li>
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</ol>

Neurexine und Neuroligine übernehmen wichtige Rollen in der synaptischen Übertragung 11 und Differenzierung von synaptischen Verbindungen 12. Beide Moleküle haben als Kandidatengene für Autismus 13,14 identifiziert worden. In diesem Video zeigen wir eine einfache Methode, die uns um die Wirkung der Gene, die den osmotischen Vermeidung Antwort in C. Studie erlaubt elegans. Neuroligin Mutanten defekt sind bei der Aufdeckung von osmotischen Kra...

Tabelle 1. C. elegans Stämme. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Belastung </td><td> Gen </td><td> Allele </td><td> Quelle </td></tr><tr><td> Bristol N2 </td><td> - </td><td> - </td><td> ÖCGK </td></tr><tr><td> VC228 </td><td> NLG-1 </td><td> ok259 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> FX00474 </td><td> NLG-1 </td><td> tm474 </td><td> bNBP-JAPAN </td></tr><tr><td> VC1416 </td><td> NRX-1 </td><td> ok1649 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> FX1961 </td><td> NRX-1 </td><td> tm1961 </td><td> NBP-JAPAN </td></tr><tr><td> NL2099 </td><td> GebO-3 </td><td> pk1436 </td><td> CGC </td></tr><tr><td> CRR21 </td><td> NRX-1; NLG-1 </td><td> ok1649; ok259 </td><td> Diese Arbeit </td></tr><tr><td> CRR22 </td><td> NRX-1; NLG-1 </td><td> tm1961; ok259 </td><td> Diese Arbeit </td></tr></tbody></table> a. Caenorhabditis Genetic Center, University of Minnesota, USA. b. Nationale Bioresource Projekt für das Experimental Animal &quot;Nematoden C. elegans&quot;. Tokyo Womens Medical University, Japan.

osmotische vermeidung in caenorhabditis elegans: synaptic function von zwei genen, orthologe der menschenrechte nrxn1 und nlgn1, die als kandidaten für autismus

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexine und Neuroligine sind Zelladhäsionsmoleküle in erregenden und hemmenden Synapsen, und sie sind für die korrekte neuronales Netzwerk-Funktion 1 erforderlich. Diese Proteine ​​sind an der präsynaptischen und postsynaptischen Membranen 2 gefunden. Studien an Mäusen zeigen, dass Neurexine und neurologins eine wesentliche Rolle in der synaptischen Übertragung 1 haben. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass einer veränderten neuronalen Verbindungen während der Entwicklung des menschlichen Nervensystems könnten die Basis für die Ätiologie der zahlreichen Fälle von Autismus-Spektrum-Störungen 3 bilden. Caenorhabditis elegans konnte als experimentelles Werkzeug, um die Untersuchung der Funktionsweise der synaptischen Komponenten zu erleichtern verwendet werden, wegen seiner Einfachheit für Labor-Experimente, und da sein Nervensystem und synaptische Verkabelung wurde vollständig charakterisiert. In C. Elegans NRX-1 und NLG-1-Gene sind orthologen die menschliche NRXN1 und NLGN1 Gene, die alpha-Neurexin-1 und Neuroligin-1-Proteine, bzw. zu codieren. Bei Menschen und Nematoden, ist die Organisation von Neurexine und Neuroligine ähnlich in Bezug auf die funktionellen Domänen. Der Kopf des Nematoden enthält die amphid, ein Sinnesorgan des Nematoden, die Antworten vermittelt auf verschiedene Reize, einschließlich osmotische Stärke. Die amphid ist von 12 sensorischen Neuronen bipolar mit Flimmerepithel Dendriten und ein Axon präsynaptischen Terminal 4. Zwei von diesen Neuronen, genannt ASHR und ASHL sind besonders wichtig in osmotischen sensorische Funktion, Aufdeckung wasserlösliche Repellents mit hohen osmotischen Stärke 5. Die Dendriten der beiden Neuronen an der Spitze des Mundes zu verlängern und die Axone zu verlängern, um den Nerv Ring, wo sie synaptische Verbindungen mit anderen Neuronen Bestimmung der Verhaltensreaktion 6 machen. Zur Beurteilung der Auswirkungen der Neurexin und Neuroligin in hohen osmotischen Kräfte Vermeidung, zeigen wir die verschiedenen Reaktion von C. elegans-Mutanten in NRX-1 und NLG-1-Gene, mit einer Methode auf einem 4M Fructose Ring 7 basiert. Die Verhaltens-Phänotypen wurden bestätigt mit spezifischen RNAi-Klone 8. In C. elegans, kann die dsRNA erforderlich, um RNAi auslösen durch die Fütterung 9 verabreicht werden. Die Lieferung der dsRNA durch Nahrung induziert die RNAi Interferenz des Gens von Interesse so dass die Identifizierung von genetischen Komponenten und Netzwerk-Pfade.

Neurexine und Neuroligine sind Membran-Neuron Haftung Proteine, die wichtige Rollen in synaptic Differenzierung und die Übertragung durchzuführen. Neuroligin defizienten Mutanten von<em&gt; C. elegans</em&gt; Defekt sind bei der Aufdeckung von osmotischen Kraft, aber wenn sie enthalten auch eine Mutation im Gen Neurexin, erholen sie den Wildtyp-Phänotyp.

Osmotische Vermeidung in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function von zwei Genen, Orthologe der Menschenrechte NRXN1 Und NLGN1, Die als Kandidaten für Autismus

Neurexine und Neuroligine sind Zelladhäsionsmoleküle, die in erregenden und hemmenden Synapsen vorkommen und für die korrekte Funktion neuronaler Netzwerke erforderlich sind. Diese Proteine befinden sich an den prä- und postsynaptischen Membranen. Studien an Mäusen deuten darauf hin, dass Neurexine und Neuroligine eine wesentliche Rolle bei der synaptischen Übertragung spielen. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass veränderte neuronale Verbindungen während der Entwicklung des menschlichen Nervensystems die Grundlage für die Ätiologie zahlreicher Fälle von Autismus-Spektrum-Störungen bilden könnten. Caenorhabditis elegans könnte als experimentelles Instrument eingesetzt werden, um die Untersuchung der Funktion synaptischer Komponenten zu erleichtern, aufgrund seiner Einfachheit für Laborversuche und da sein Nervensystem sowie die synaptische Verschaltung vollständig charakterisiert wurden. In C. elegans sind die Gene nrx-1 und nlg-1 ortholog zu den menschlichen Genen NRXN1 und NLGN1, welche die Proteine Alpha-Neurexin-1 bzw. Neuroligin-1 kodieren. Bei Menschen und Nematoden ist die Organisation von Neurexinen und Neuroliginen hinsichtlich der funktionellen Domänen ähnlich. Der Kopf des Nematoden enthält das Amphid, ein Sinnesorgan des Nematoden, welches Reaktionen auf verschiedene Stimuli, einschließlich der osmotischen Stärke, vermittelt. Das Amphid besteht aus 12 sensorischen bipolaren Neuronen mit zilierten Dendriten und einem präsynaptischen terminalen Axon. Zwei dieser Neuronen, bezeichnet als ASHR und ASHL, sind besonders wichtig für die osmotische Sensorfunktion und detektieren wasserlösliche Repellentien mit hoher osmotischer Stärke. Die Dendriten dieser beiden Neuronen reichen bis zur Mundspitze und die Axone erstrecken sich bis zum Nervenring, wo sie synaptische Verbindungen mit anderen Neuronen eingehen, die die Verhaltensantwort bestimmen. Um die Auswirkungen von Neurexin und Neuroligin auf die Vermeidung hoher osmotischer Stärke zu bewerten, zeigen wir die unterschiedliche Reaktion von C. elegans-Mutanten mit Defekten in den nrx-1- und nlg-1-Genen unter Verwendung einer Methode, die auf einem 4M-Fruktose-Ring basiert. Die Verhaltensphänotypen wurden mithilfe spezifischer RNAi-Klone bestätigt. In C. elegans kann die zur Auslösung von RNAi erforderliche dsRNA durch Fütterung verabreicht werden. Die Zufuhr von dsRNA über die Nahrung induziert die RNAi-Interferenz des Zielgens und ermöglicht so die Identifizierung genetischer Komponenten und Netzwerkpfade.

Hallo, mein Name ist Manuel Ruiz Rubio vom Genetik-Department der Universität Córdoba in Spanien. Wir verwenden den Fadenwurm als experimentelles Werkzeug in der Autismusforschung und nutzen dabei das vollständig charakterisierte Nervensystem von C. elegans. Wir untersuchen Mutanten des Fadenwurms, die in Genen defekt sind, die an neuronalen Synapsen beteiligt sind und mit Autismus in Verbindung gebracht wurden.Rein-Regane sind Membranadhäsionsmoleküle, die im synaptischen Bereich vorkommen. Der Kopf von C. elegans enthält das Amfid, ein Sinnesorgan des Nematoden, das auf verschiedene Reize, einschließlich osmotischer Stärke, reagiert. Das Amfid besteht aus 12 sensorischen bipolaren Neuronen mit ciliären Dendriten und einem präsynaptischen terminalen Axon.Zwei dieser Neuronen, ASHR und ASHL, sind besonders wichtig für die osmotische Sinnesfunktion, da sie wasserlösliche Abwehrstoffe mit hoher osmotischer Stärke erkennen. Hier zeigen wir eine Methode basierend auf einem 4M-Fructose-Ring, um die Osmotikvermeidung bei Synapsendefekt-Mutanten von C. elegans zu messen.Um die Auswirkungen von Neurexin und Neuroligin auf die Vermeidung hoher osmotischer Stärke zu bewerten, berichteten wir über die unterschiedliche Reaktion von C. elegans-Mutanten, die defekt in den nrx-1- und nlg-1-Genen sind, unter Verwendung einer Methode, die auf einer viermolaren Fructose-Lösung basiert. Bereiten Sie am Tag des Experiments eine viermolare Stammlösung aus Fructose mit 1 % Congo rot vor und lösen Sie diese vollständig bei Raumtemperatur auf. Zeichnen Sie einen ringförmigen Kreis mit einem Durchmesser von einem Zentimeter auf die NGM-Platte, indem Sie ihn mittig auf das feste Medium aufzeichnen.Verwenden Sie 15 Mikroliter der roten viermolaren Fructose-Lösung. Lassen Sie die Fructose etwa fünf Minuten in den Agar einziehen. Das Experiment sollte verblindet durchgeführt werden. Die Platte mit jedem Stamm, der getestet werden soll, sollte von einem zweiten Experimentator beschriftet werden.Der SA wird mit diesen Markierungen durchgeführt, die unverlangt vorliegen. Wenn das Experiment beendet ist, etwa 24 Stunden vor der Durchführung des Verkaufs, ist es notwendig, jeweils vier Larven jedes Genotyps auszuwählen und auf eine AFL-NGM-Platte mit e coli-Bakterien zu überführen sowie bei 20 Grad Celsius aufzubewahren. Am nächsten Tag sollte das Experiment mit jungen adulten Tieren begonnen werden.Platzieren Sie einen einzelnen Wurm jedes Stammes innerhalb des Ruhekreises und verfolgen Sie jedes Tier, um die Dauer seiner Reaktion auf die Tic-Barriere zu bestimmen. Es sollten 10 Tiere jedes Stammes und mindestens drei Wiederholungsexperimente durchgeführt werden, um ein aussagekräftiges Ergebnis zu erhalten. Tiere, die den roten Ring sechsmal hintereinander vermeiden, gelten als normal.Diejenigen, die den Ring in weniger als sechs Versuchen verlassen, gelten als defekt in der Osmosereizwahrnehmung; ein Kontrollstamm muss in jedem SA Bristol verwendet werden, und zwei Tiere dienen als positive Kontrollen, da sie den Ringbarrieren ausweichen. Kontrollstämme reagieren, indem sie rückwärtsgehen, wenn sie auf eine osmotische Barriere treffen, die aus viermolarem Fructose besteht. Neuro-defiziente Mutanten weisen ein Verhalten auf, das diesen bezüglich der Osmotischen Stärke ähnlich ist.Dagegen konnten NEUR-defiziente Mutanten diese osmotische Barriere nicht erkennen. Doppelmutanten in verschiedenen Allelen von neur und nlg-1 zeigten das Wildtyp-Phänotyp wieder, das auf die osmotische Stärke reagiert, um Of-down-Würmer durch RNA-Interferenz zu erhalten. Fütterungsisolate Kolonien von E. coli HD11,5-Stamm, die mit dem L4440-Vektor, der ein Fragment entsprechend dem Zielgen enthält, transformiert wurden. Die Bakterien werden am nächsten Tag auf LBA- oder Carbonat-Platten isoliert.Pick eine Bakterienkolonie aus und impfe flüssiges LV-Medium an. Lass es etwa sieben Stunden bei 37 Grad unter Schütteln weiterwachsen. Platziere einen Tropfen dieser Kultur auf eine NGM-Platte mit Kohlensäurehaltigem Deckel und IPTG und inkubiere über Nacht bei Raumtemperatur, um das Wachstum der Bakterien zu ermöglichen und die Expression des Fragments des Zielgens einzuleiten.Für die RNA-Interferenz-Fütterungsexperimente ist es erforderlich, einen positiven und einen negativen Kontrollstamm zu verwenden. Die negative Kontrolle ist identisch.Ich habe den Stamm HT 11 fünf mit dem Vektor TL 44 40 transformiert. Die positiven Kontrollen waren ELI HT 11 fünf Zellen, die mit dem Vektor L 44 40 transformiert wurden, der eine 22-Gen-Sequenz enthält. Die Störung dieses Gens führt zu einem Schüttelphänotyp, der leicht unter dem Stereomikroskop zu erkennen ist.Der erste Tag. Vier Stadien eins von NGM PLA mit Bakterien werden 12 Stunden lang auf eine Platte mit Bakterien und Kuwait bei 20 Grad Celsius überführt. Dies ist eine Fastenphase.Am nächsten Tag überführen Sie einen schnellen jungen Adulten auf eine Platte, die mit Bakterien besiedelt ist, die das spezifische Zielgen der RNA-Interferenz exprimieren. Belassen Sie diese etwa 48 Stunden bei 20 Grad Celsius, um die F1-Nachkommen zu erhalten. Anschließend entnehmen Sie in den folgenden zwei Tagen einige adulte F1-Exemplare und überführen sie auf eine weitere Platte, die mit denselben Bakterien besiedelt ist.Wählen und isolieren Sie junge Erwachsene aus der F2-Nachkommenschaft unter Bewertung der Phänotypen der Bristol N2-Wildtyp-Stammfett mit bakterieller Besiedlung, die Empathie zeigt. Der L4440-Vektor zeigte rückwärts gerichtete Bewegung bei feiner Analyse. Die osmotische Barriere.Der Bristol- und true-white-Stamm, der mit Bakterien gefüttert wurde, die ein Fragment des neur-Gens aus C. elegans exprimieren, konnte die Zehen nicht gegenüber molaren Lösungen erkennen. Dagegen erlangte der neur-defiziente Mutant, der ursprünglich nicht in der Lage war, die osmotische Barriere wahrzunehmen, diese Fähigkeit zurück, wenn er mit Bakterien gefüttert wurde, die ein Fragment des nane-Gens aus C. elegans exprimieren. In diesem Video stellen wir eine einfache Methode vor, die es ermöglicht, den Einfluss von Genen auf die osmotische Vermeidungsreaktion in C. elegans zu untersuchen.Ein Ring aus formal festem Fructose mit Kongorot wird verwendet, um die Reaktion des Wurms auf osmotische Stärke zu analysieren. Mutanten, die an Neurologin defizient sind, weisen bei dieser Reaktion Defizite auf; NU-Mutanten hingegen sind nicht in der Lage, Turgordruck wahrzunehmen, und zeigen eine Reaktion, die der der Wildtyp-Stamm entspricht. Dieses Video zeigt, dass Doppelmutanten-Stämme, die verschiedene knock-out-Allele in Ein- und Ausgangs-Genen tragen, das Wildtyp-Phänotyp in der Reaktion auf osmotische Stärke wiedererlangen.Diese Beobachtungen wurden mittels RNA-Interferenz unter Verwendung des Fütterungs-Blockadeansatzes bestätigt. Auf diese Weise war der Wildtyp-Stamm in seiner Fähigkeit beeinträchtigt, eine osmotische Barriere zu erkennen, wenn er mit Bakterien gefüttert wurde, die die entsprechende Sequenz des ING-Gens exprimieren. Umgekehrt erlangten neur-defekte Mutanten, die nicht in der Lage sind, die vierfach konzentrierte Fructose-Lösung wahrzunehmen, dieses Verhalten wieder, wenn sie mit Bakterien gefüttert wurden, die die entsprechende Sequenz des NNU-Gens exprimieren.Die in diesem Experiment gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass nrx-1 und nlg-1 an der synaptischen Verbindung der sensorischen Neuronen des Nematoden beteiligt sein könnten und dass sie außerdem miteinander interagieren, wodurch die synaptische Funktion beeinflusst wird. Okay, auf Wiedersehen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Dieses Protokoll bewertet die funktionelle synaptische Aktivität zwischen definierten neuronalen Partnern in vivo im zentralen Nervensystem der Drosophila melanogaster-Larven mit genetisch codierten Werkzeugen. CsChrimson-vermittelte optogenetische Stimulation präsynaptischer cIVda-Sensorneuronen induziert eine calciumabhängige Photokonversion von CaMPARI in postsynaptischen Basin-4-Interneuronen.

Funktionelle Charakterisierung einzelner prä- und postsynaptischer Partner im zentralen Nervensystem der Drosophila-Larve mittels CaMPARI

Erfahren Sie, wie osmotische Vermeidung in Caenorhabditis elegans zur Untersuchung synaptischer Funktionen von Neurexin- und Neuroligin-Mutanten eingesetzt wird. Diese Methode liefert Einblicke in Autismus-Kandidatengene.

Osmotische Vermeidung in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function von zwei Genen, Orthologe der Menschenrechte NRXN1 Und NLGN1, Die als Kandidaten für Autismus (Video) | JoVE Journal

Osmotische Vermeidung in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function von zwei Genen, Orthologe der Menschenrechte NRXN1 Und NLGN1, Die als Kandidaten für Autismus

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