Osmotische Vermeidung in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function von zwei Genen, Orthologe der Menschenrechte NRXN1 Und NLGN1, Die als Kandidaten für Autismus

Hallo, mein Name ist Manuel Ruiz Rubio vom Genetik-Department der Universität Córdoba in Spanien. Wir verwenden den Fadenwurm als experimentelles Werkzeug in der Autismusforschung und nutzen dabei das vollständig charakterisierte Nervensystem von C. elegans. Wir untersuchen Mutanten des Fadenwurms, die in Genen defekt sind, die an neuronalen Synapsen beteiligt sind und mit Autismus in Verbindung gebracht wurden.

Rein-Regane sind Membranadhäsionsmoleküle, die im synaptischen Bereich vorkommen. Der Kopf von C. elegans enthält das Amfid, ein Sinnesorgan des Nematoden, das auf verschiedene Reize, einschließlich osmotischer Stärke, reagiert. Das Amfid besteht aus 12 sensorischen bipolaren Neuronen mit ciliären Dendriten und einem präsynaptischen terminalen Axon.

Zwei dieser Neuronen, ASHR und ASHL, sind besonders wichtig für die osmotische Sinnesfunktion, da sie wasserlösliche Abwehrstoffe mit hoher osmotischer Stärke erkennen. Hier zeigen wir eine Methode basierend auf einem 4M-Fructose-Ring, um die Osmotikvermeidung bei Synapsendefekt-Mutanten von C. elegans zu messen.

Um die Auswirkungen von Neurexin und Neuroligin auf die Vermeidung hoher osmotischer Stärke zu bewerten, berichteten wir über die unterschiedliche Reaktion von C. elegans-Mutanten, die defekt in den nrx-1- und nlg-1-Genen sind, unter Verwendung einer Methode, die auf einer viermolaren Fructose-Lösung basiert. Bereiten Sie am Tag des Experiments eine viermolare Stammlösung aus Fructose mit 1 % Congo rot vor und lösen Sie diese vollständig bei Raumtemperatur auf. Zeichnen Sie einen ringförmigen Kreis mit einem Durchmesser von einem Zentimeter auf die NGM-Platte, indem Sie ihn mittig auf das feste Medium aufzeichnen.

Verwenden Sie 15 Mikroliter der roten viermolaren Fructose-Lösung. Lassen Sie die Fructose etwa fünf Minuten in den Agar einziehen. Das Experiment sollte verblindet durchgeführt werden. Die Platte mit jedem Stamm, der getestet werden soll, sollte von einem zweiten Experimentator beschriftet werden.

Der SA wird mit diesen Markierungen durchgeführt, die unverlangt vorliegen. Wenn das Experiment beendet ist, etwa 24 Stunden vor der Durchführung des Verkaufs, ist es notwendig, jeweils vier Larven jedes Genotyps auszuwählen und auf eine AFL-NGM-Platte mit e coli-Bakterien zu überführen sowie bei 20 Grad Celsius aufzubewahren. Am nächsten Tag sollte das Experiment mit jungen adulten Tieren begonnen werden.

Platzieren Sie einen einzelnen Wurm jedes Stammes innerhalb des Ruhekreises und verfolgen Sie jedes Tier, um die Dauer seiner Reaktion auf die Tic-Barriere zu bestimmen. Es sollten 10 Tiere jedes Stammes und mindestens drei Wiederholungsexperimente durchgeführt werden, um ein aussagekräftiges Ergebnis zu erhalten. Tiere, die den roten Ring sechsmal hintereinander vermeiden, gelten als normal.

Diejenigen, die den Ring in weniger als sechs Versuchen verlassen, gelten als defekt in der Osmosereizwahrnehmung; ein Kontrollstamm muss in jedem SA Bristol verwendet werden, und zwei Tiere dienen als positive Kontrollen, da sie den Ringbarrieren ausweichen. Kontrollstämme reagieren, indem sie rückwärtsgehen, wenn sie auf eine osmotische Barriere treffen, die aus viermolarem Fructose besteht. Neuro-defiziente Mutanten weisen ein Verhalten auf, das diesen bezüglich der Osmotischen Stärke ähnlich ist.

Dagegen konnten NEUR-defiziente Mutanten diese osmotische Barriere nicht erkennen. Doppelmutanten in verschiedenen Allelen von neur und nlg-1 zeigten das Wildtyp-Phänotyp wieder, das auf die osmotische Stärke reagiert, um Of-down-Würmer durch RNA-Interferenz zu erhalten. Fütterungsisolate Kolonien von E. coli HD11,5-Stamm, die mit dem L4440-Vektor, der ein Fragment entsprechend dem Zielgen enthält, transformiert wurden. Die Bakterien werden am nächsten Tag auf LBA- oder Carbonat-Platten isoliert.

Pick eine Bakterienkolonie aus und impfe flüssiges LV-Medium an. Lass es etwa sieben Stunden bei 37 Grad unter Schütteln weiterwachsen. Platziere einen Tropfen dieser Kultur auf eine NGM-Platte mit Kohlensäurehaltigem Deckel und IPTG und inkubiere über Nacht bei Raumtemperatur, um das Wachstum der Bakterien zu ermöglichen und die Expression des Fragments des Zielgens einzuleiten.

Für die RNA-Interferenz-Fütterungsexperimente ist es erforderlich, einen positiven und einen negativen Kontrollstamm zu verwenden. Die negative Kontrolle ist identisch.

Ich habe den Stamm HT 11 fünf mit dem Vektor TL 44 40 transformiert. Die positiven Kontrollen waren ELI HT 11 fünf Zellen, die mit dem Vektor L 44 40 transformiert wurden, der eine 22-Gen-Sequenz enthält. Die Störung dieses Gens führt zu einem Schüttelphänotyp, der leicht unter dem Stereomikroskop zu erkennen ist.

Der erste Tag. Vier Stadien eins von NGM PLA mit Bakterien werden 12 Stunden lang auf eine Platte mit Bakterien und Kuwait bei 20 Grad Celsius überführt. Dies ist eine Fastenphase.

Am nächsten Tag überführen Sie einen schnellen jungen Adulten auf eine Platte, die mit Bakterien besiedelt ist, die das spezifische Zielgen der RNA-Interferenz exprimieren. Belassen Sie diese etwa 48 Stunden bei 20 Grad Celsius, um die F1-Nachkommen zu erhalten. Anschließend entnehmen Sie in den folgenden zwei Tagen einige adulte F1-Exemplare und überführen sie auf eine weitere Platte, die mit denselben Bakterien besiedelt ist.

Wählen und isolieren Sie junge Erwachsene aus der F2-Nachkommenschaft unter Bewertung der Phänotypen der Bristol N2-Wildtyp-Stammfett mit bakterieller Besiedlung, die Empathie zeigt. Der L4440-Vektor zeigte rückwärts gerichtete Bewegung bei feiner Analyse. Die osmotische Barriere.

Der Bristol- und true-white-Stamm, der mit Bakterien gefüttert wurde, die ein Fragment des neur-Gens aus C. elegans exprimieren, konnte die Zehen nicht gegenüber molaren Lösungen erkennen. Dagegen erlangte der neur-defiziente Mutant, der ursprünglich nicht in der Lage war, die osmotische Barriere wahrzunehmen, diese Fähigkeit zurück, wenn er mit Bakterien gefüttert wurde, die ein Fragment des nane-Gens aus C. elegans exprimieren. In diesem Video stellen wir eine einfache Methode vor, die es ermöglicht, den Einfluss von Genen auf die osmotische Vermeidungsreaktion in C. elegans zu untersuchen.

Ein Ring aus formal festem Fructose mit Kongorot wird verwendet, um die Reaktion des Wurms auf osmotische Stärke zu analysieren. Mutanten, die an Neurologin defizient sind, weisen bei dieser Reaktion Defizite auf; NU-Mutanten hingegen sind nicht in der Lage, Turgordruck wahrzunehmen, und zeigen eine Reaktion, die der der Wildtyp-Stamm entspricht. Dieses Video zeigt, dass Doppelmutanten-Stämme, die verschiedene knock-out-Allele in Ein- und Ausgangs-Genen tragen, das Wildtyp-Phänotyp in der Reaktion auf osmotische Stärke wiedererlangen.

Diese Beobachtungen wurden mittels RNA-Interferenz unter Verwendung des Fütterungs-Blockadeansatzes bestätigt. Auf diese Weise war der Wildtyp-Stamm in seiner Fähigkeit beeinträchtigt, eine osmotische Barriere zu erkennen, wenn er mit Bakterien gefüttert wurde, die die entsprechende Sequenz des ING-Gens exprimieren. Umgekehrt erlangten neur-defekte Mutanten, die nicht in der Lage sind, die vierfach konzentrierte Fructose-Lösung wahrzunehmen, dieses Verhalten wieder, wenn sie mit Bakterien gefüttert wurden, die die entsprechende Sequenz des NNU-Gens exprimieren.

Die in diesem Experiment gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass nrx-1 und nlg-1 an der synaptischen Verbindung der sensorischen Neuronen des Nematoden beteiligt sein könnten und dass sie außerdem miteinander interagieren, wodurch die synaptische Funktion beeinflusst wird. Okay, auf Wiedersehen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.