Aversives assoziatives Lernen und Gedächtnisbildung durch Paarung zweier Chemikalien in Caenorhabditis elegans

Wir haben zuvor Protokolle für Caenorhabditis elegans entwickelt, um kurz- und langfristige assoziative Erinnerungen durch massiertes bzw. räumliches Training zu bilden. Hier werden detaillierte Protokolle für die Konditionierung von C. elegans beschrieben, indem 1-Propanol und Salzsäure als konditionierte bzw. unkonditionierte Stimuli gepaart werden, um ein aversives assoziatives Gedächtnis zu bilden.

Lernen und Gedächtnis sind für Tiere von entscheidender Bedeutung, um zu überleben und sich fortzupflanzen, indem sie effizient durch sich ständig verändernde Umgebungen navigieren. Es ist auch eines der Hauptfächer in den Neurowissenschaften. Caenorhabditis elegans ist ein attraktiver Organismus für das Studium des Lernens und des Gedächtnisses wegen der Einfachheit seines Nervensystems.

Auch die chemischen und elektrischen Schaltpläne sind komplett rekonstruiert. Die Verhaltensanalyse von Caenorhabditis elegans ist äußerst knifflig und wird von einer Reihe von Parametern wie chemischen, mechanischen und Temperaturbelastungen beeinflusst. Bereiten Sie zunächst sechs Zentimeter Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM-Platten vor, indem Sie 0,2 Milliliter einer E.coli OP50-Flüssigkultur in einem Luria-Bertani-Medium verteilen und bei Raumtemperatur für nicht länger als 24 Stunden inkubieren.

Am ersten Tag pflücken und platzieren Sie fünf gut gefütterte Gravidentiere auf jeder sechs Zentimeter großen NGM-Platte mit einem Platinwurmpflücker und lassen Sie sie drei Stunden lang bei Raumtemperatur etwa 50 Eier legen, um eine synchronisierte Population erwachsener Tiere zu erhalten. Um die Eiablage zu stoppen, entfernen Sie die Elterntiere mit einem Platinwurmpflücker von den Tellern. Kultivieren Sie die Tiere etwa fünf Tage lang bei Raumtemperatur, um das reife Erwachsenenstadium zu erreichen, nicht das junge Erwachsenenstadium.

Nach fünf Tagen sammeln Sie etwa 200 erwachsene Tiere in einem Tiersammler, indem Sie jede Platte mit einem Milliliter 0,25% wässriger Gelatine waschen, wodurch das Anhaften der Tiere an der Oberfläche von Kunststoffen wie Pipettenspitzen verhindert wird. Dann waschen Sie die Tiere, indem Sie den Kollektor zweimal in 10 Milliliter doppelt destilliertem Wasser vorsichtig auf und ab bewegen. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.

Tauchen Sie den Tiersammler mit rund 200 Tieren in 40 Milliliter einer Mischung aus 1%1-Propanol und Salzsäure bei pH 4 vorsichtig für eine Sekunde in eine Kristallisierschale. Waschen Sie die Tiere im Kollektor, indem Sie den Kollektor sehr vorsichtig einmal in eine Vertiefung seiner 6-Well-Gewebekulturplatte tauchen, die 10 Milliliter doppelt destilliertes Wasser enthält. Dann stellen Sie den Kollektor für 10 Minuten auf einen E.coli OP50-Rasen auf einer sechs Zentimeter großen NGM-Platte, damit sich die Tiere ausruhen können.

Als nächstes waschen Sie die Tiere im Kollektor mit 10 Milliliter doppelt destilliertem Wasser, indem Sie den Kollektor vorsichtig auf und ab bewegen. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal und fahren Sie mit dem Chemotaxis-Test fort. Waschen Sie die Tiere nacheinander in einem Kollektor mit Propanolmischung und doppelt destilliertem Wasser, jeweils einmal, wie zuvor gezeigt.

Als nächstes legen Sie den Kollektor für 10 Minuten auf einen E.coli OP50-Rasen auf einem NGM-Agar in einer sechs Zentimeter großen Petrischale, damit sich die Tiere ausruhen können. Als nächstes waschen Sie die Tiere dreimal, indem Sie den Kollektor vorsichtig zweimal in 10 Milliliter doppelt destilliertem Wasser auf und ab bewegen, um eine bakterielle Kontamination zu verhindern, und mit dem Chemotaxis-Test fortfahren. Bereiten Sie Schneckenplatten für den Chemotaxis-Assay in sechs Zentimeter großen Kunststoff-Petrischalen vor.

Verwenden Sie dann eine abgesägte Pipettenspitze mit einer Öffnung von mehr als einem Millimeter, um die Tiere aus dem Kollektor in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen, das einen Milliliter 0,25% wässrige Gelatine enthält. Nachdem sich die Tiere durch die Schwerkraft am Boden der Röhre niedergelassen haben, entfernen Sie den Überstand aus dem Rohr. Die Tiere werden in einem Milliliter Chemotaxis-Assay-Puffer resuspendiert und etwa eine Minute lang durch Schwerkraft auf den Boden des Röhrchens gesetzt.

Entfernen Sie dann so viel Überstand wie möglich durch Pipettieren. Als nächstes entdecken Sie diagonal vier Mikroliter 5% wässriges 1-Propanol an zwei Stellen und dann vier Mikroliter doppelt destilliertes Wasser an zwei anderen Stellen in der Petriplatte. Verwenden Sie dann eine abgesägte Pipettenspitze mit einer Öffnung von einem Millimeter, um sechs Mikroliter der Tiersuspension in einem Chemotaxis-Assay-Puffer zu erkennen, der etwa 60 Tiere in der Mitte von drei Platten enthält.

Entfernen Sie die Flüssigkeit so weit wie möglich mit einem Labortuchdocht, ohne die Tiere zu berühren. Legen Sie einen Deckel auf den Teller und lassen Sie die Tiere 10 Minuten bei Raumtemperatur frei auf dem Teller bewegen. Um die Chemotaxis zu stoppen, übertragen Sie diese Platte für drei Minuten in eine Glaspetrischale auf Eis.

Als nächstes stellen Sie den Teller in einen Kühlschrank, bis Sie die Anzahl der Tiere auf dem Teller zählen. Zählen Sie die Anzahl der Tiere in vier Abschnitten außer denen im Mittelkreis unter einem Stereomikroskop und berechnen Sie den Chemotaxis-Index anhand der Gleichung. Berechnen Sie aus den Chemotaxis-Indexwerten die Lernindexwerte als Differenz zwischen dem Chemotaxis-Indexwert der Referenztiere und dem Chemotaxis-Indexwert der konditionierten Tiere.

Im Chemotaxis-Assay werden Tiere, die mit der Mischung aus 1-Propanol und Salzsäure konditioniert sind, nicht von 5%1-Propanol angezogen, das auf Agarplatten gesichtet wird, während naive und Referenztiere von 5%1-Propanol angezogen wurden. Tiere, die durch das Abstandstraining mit einer Mischung aus wässrigem 1-Propanol und Salzsäure konditioniert wurden, wurden nicht mehr von 5%1-Propanol angezogen als Tiere, die mit 1%1-Propanol oder Salzsäure oder nur doppelt destilliertem Wasser behandelt wurden. Die Untersuchung der Wirkung von Mutationen auf das Gedächtnis zeigte, dass die Bildung des Kurzzeit- und Langzeitgedächtnisses davon abhängt, dass die Gene eine wesentliche Rolle bei der klassischen Konditionierung der Tiere spielen.

Nach jeder Konditionierung sollten die Tiere nur einmal vorsichtig mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen werden. Nachdem das Langzeitgedächtnis mit dem Verfahren gebildet wurde, können Kalziumbildgebung und Elektrophysiologie neuronale Schaltkreise identifizieren, die für das Gedächtnis verantwortlich sind. Durch genetische und Einzelneuronenanalysen können die Speicher- und Abrufprozesse des Gedächtnisses auf molekularer und Einzelzellebene adressiert werden.