Bestimmung genetischer Expressionsprofile in C. elegans Verwenden Microarray-und Real-time PCR

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Genexpressionsprofile zu untersuchen, die zahlreichen Phänotypen oder Stoffwechselwegen zugrunde liegen. Dies wird erreicht, indem zunächst mRNA von zwei kontrastierenden Nematodenstämmen isoliert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, CD NA zu synthetisieren, die entweder S SI drei oder SFI-Capture-Sequenzen enthält, und diese zu einem Microarray zu hybridisieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Microarray mit Anti-Capture-Sequenzen zu hybridisieren, die S SI drei und SCIFI Fluoro fours enthalten. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den Microarray zu scannen und die Daten mit bioinformatischen Tools wie der Software Magic Tool zu analysieren. Letztendlich werden Kandidatengene identifiziert, die das untersuchte biologische Phänomen vermitteln, und können durch alternative Techniken wie die real-time PCR validiert und quantifiziert werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da gefleckte Nukleotide für den Benutzer nicht sichtbar sind, so dass es schwierig ist, eine homogene Hybridisierungsmischung auf die über 23.000 zu legen. Einzigartig gedruckte Nukleotide Beginnen Sie mit dem Sammeln von RNA von gesunden, synchronisierten Nematoden. Zuerst werden sie gewaschen und in 15-Milliliter-Röhrchen resuspendiert, und pelletierte Wurmpellets werden in sieben Millilitern 0,1 molar Natriumchlorid und sieben Millilitern eiskalter Saccharose mit 60 Gew.-% resuspendiert.

Nach einer 15-minütigen Inkubation auf Eis werden die Würmer erneut pelletiert. Nun schwimmen bakterienfreie Würmer auf, werden gesammelt, in RNAs gewaschen, mit Wasser versorgt und pelletiert. Auch hier wird das saubere, locker verdichtete Granulat in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das 30 Sekunden lang mit maximaler Geschwindigkeit nach unten geschleudert wird.

Aspiriert und später in 10 Volumina RNA bei vier Grad Celsius gelagert, bis es zum Fortfahren bereit ist. Um Gesamt-RNA-Proben herzustellen, zentrifugieren Sie die vorbereiteten Pellets bei maximaler Geschwindigkeit, verwerfen Sie das Supernat und fügen Sie dem Pellet eine Prise molekulares Schleifharz hinzu. Frieren Sie dann die Mischung mit flüssigem Stickstoff mit einem Stößel ein.

Mahlen Sie die gefrorene Wurmsuspension zu einem feinen Pulver und flüssigem Stickstoff nach Bedarf, um das Pulver nach dem Mahlen kalt zu halten. Lege den Extrakt fünf Minuten lang auf Eis. Mischen Sie den Extrakt nach fünf Minuten mit 700 Mikrolitern R-L-T-B-M-E und 472 Mikrolitern 100% Ethanol insgesamt.

RNA kann nun mit einem kommerziell erhältlichen Kit auf ein Endvolumen von 60 Mikrolitern isolierter RNA pro biologischer Probe isoliert werden. Bevor Sie fortfahren, entfernen Sie eine mögliche genomische DNA-Kontamination durch Behandlung mit DNAS eins, gefolgt von der Verwendung eines kommerziell erhältlichen RNA-Aufreinigungskits. Vervollständigen Sie das Kit, indem Sie auf ein Volumen von 60 Mikrolitern anspielen.

Bestimmen Sie schließlich die RNA-Konzentration und bewerten Sie die Integrität der RNA durch Behandlung mit Glyoxal-Probenbeladung, Farbstoff- und Gelanalyse vor der Microarray-Hybridisierung. Mit herkömmlichen Methoden wird aufgereinigte RNA rückgängig gemacht, in komplementäre DNA transkribiert, die mit einem kommerziell erhältlichen Kit aus dem abgebauten Template aufgereinigt und auf ein Volumen von 60 Mikrolitern hingewiesen wird. Beginnen Sie die Microarray-Hybridisierung, indem Sie die Eleganz des Meeres blockieren. Microarray-Objektträger mit beschallter Lachsspermien-DNA Nach einer Stunde die blockierten Objektträger in doppelt destilliertes Wasser geben und schleudern.

Trocknen Sie die Objektträger in konischen 50-Milliliter-Röhrchen, die mit einem Kim-Tuch gepolstert sind. Bereiten Sie nun einen Hybridisierungspuffer auf Basis von zwei x-Formen vor. Erwärmen Sie es zunächst 10 Minuten lang auf 55 Grad Celsius, um die Kristalle vollständig aufzulösen.

Dann zentrifugieren Sie es eine Minute lang bei 10.000 g. Mischen Sie als Nächstes 25 Mikroliter CD NA mit 25 Mikrolitern Hybridisierungspuffer und schnippen Sie die Mischung vorsichtig. Drehen Sie nun die Mischung kurz und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei 80 Grad Celsius.

Pipettieren Sie nach der Inkubation die gesamte CDNA-Probe vorsichtig auf den Microarray-Objektträger, ohne den Objektträger zu berühren. Um die Probe gleichmäßig auf dem Microarray-Objektträger zu verteilen. Senken Sie einen Deckglas mit einer Spritzennadel vorsichtig auf den Objektträger ab, bevor der Deckglas vollständig abgesenkt ist, ziehen Sie es mit der Nadel wieder nach oben und senken Sie es wieder ab, damit das Deckglas sanft an seinen Platz fallen kann.

Diese Technik minimiert die Bildung von Luftblasen. Legen Sie nun den Objektträger waagerecht in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen unterhalb des Objektträgers bei 50 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser und lassen Sie ihn am nächsten Tag über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Eine zweite Hybridisierung wird kurz nach dem Waschen des Objektträgers durchgeführt.

In SSC wird der zweite Puffer, der lichtempfindliche Capture-Reagenzien und ein Antifa-Reagenz enthält, mehrmals mit der gleichen Technik aufgetragen, gefolgt von einer kurzen Inkubation, weiteren Waschgängen und Trocknung. Anschließend kann die Folie gescannt werden. Bilder können mit der kostenlosen Software mit dem Open-Source-Tool Magic analysiert werden.

Erstellen und speichern Sie auf der Registerkarte Projekt kurz ein neues Projekt auf der Registerkarte Buildausdrucksprofil, wählen Sie Bildpaar laden aus, und wählen Sie die rote Bilddatei als rot und die grüne Bilddatei als grün aus. Wählen Sie dann die Registerkarte Buildausdrucksprofil aus. Wählen Sie "Genliste laden", um eine C-Elegance-Genlistendatei hochzuladen, die von der GCAT-Website abgerufen wurde, um das Microarray-Bild zu adressieren und zu rastern.

Wählen Sie die Registerkarte "Ausdrucksprofil erstellen" und die Option "Bearbeitungsraster erstellen" aus. Bearbeiten Sie nun das Raster. Richten Sie ein Dialogfeld ein, indem Sie 48 für die Anzahl der Raster, 22 Zeilen und 22 Spalten für jedes Raster verwenden und die Punkte von links nach rechts und von oben nach unten nummerieren.

Erhöhen Sie die prozentuale Kontraständerung und zoomen Sie in das Raster hinein, bis die einzelnen Punkte gut unterscheidbar sind. Erstellen Sie die Raster, indem Sie im linken Bereich die Option "Oberen linken Punkt festlegen" auswählen und dann auf die Mitte des oberen linken Punktes klicken, gefolgt von der oberen rechten Stelle und der unteren Reihe auf dem ersten Raster. Wiederholen Sie diesen Gittervorgang für jedes der 48 Raster, indem Sie von links nach rechts und von oben nach unten vorgehen.

Speichern Sie dann, indem Sie die Registerkarte Datei auswählen und das aktuelle Raster so speichern, wie es einmal gespeichert wurde. Wählen Sie die Registerkarte "Fertig" aus, um alle nicht verwandten Punkte aus der Analyse zu entfernen. Öffnen Sie die Registerkarte "Buildausdrucksprofil", und wählen Sie unter der Option "Adressierungsraster" die Option "Spot-Flagging" aus.

Markieren Sie nun alle Streifenflecken oder Hintergrundfluoreszenz und speichern Sie, indem Sie Aktuelle Flags speichern auswählen. Wie auf der Registerkarte "Datei" sollten die markierten Dateien segmentiert werden. Analysieren Sie abschließend Gene, die durch einen bestimmten Faktor induziert oder unterdrückt werden, indem Sie auf der Registerkarte "Expression" die Option "Erkunden" auswählen.

Legen Sie im Dialogfeld "Erkunden" die Kriterien für feine Gene fest, die den Kriterien entsprechen. Die Anzahl der Verdoppelungen erhöht oder verringert sich in der Ausprägung. Die Intensität wird als x bezeichnet, und der Wert von X ist das Kriterium für die Ausdrucksänderung.

X wird bei induzierten Genen unter einem Maximalwert größer als X und bei unterdrückten Genen unter einem Minimalwert kleiner als x eingegeben. In diesem Experiment wird eine Farbstoffaustauschkontrolle durchgeführt: Die beiden unabhängigen Gesamt-RNA-Isolierungen von Larven im dritten und vierten Stadium werden entweder als grüne Mutante und als roter Wildtyp hybridisiert, während rote Mutante und grüner Wildtyp zur Bestätigung von Genexpressionsänderungen drei unabhängige Gesamt-RNA-Isolierungen unter Verwendung desselben Verfahrens durchführen: CDNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit synthetisieren. und für jede Zöliakie-NA-Probe eine Echtzeit-PCR durchführen und dreifach mit drei Housekeeping-Genen als Kontrollen verdreifachen. Zur Veranschaulichung untersuchen die folgenden Ergebnisse die in VSM one induzierte Genexpression.

AK 1468-Mutanten sind ein Nematodenstamm, der sich durch eine erhöhte synaptische Form auszeichnet. Vor der Durchführung der Microarray-Analyse wird die Qualität der extrahierten RNA mittels Gelelektrophorese überprüft. Das Vorhandensein von zwei intakten ribosomalen Untereinheiten vor und nach der Behandlung einer ist ein Hinweis auf eine gute RNA-Probe im Microarray: Wildtyp-CDNA ist rot und VSM eins mutierte CD NA ist grün markiert. In diesem der 48 analysierten Gitter pro Microarray repräsentiert jedes kleine Quadrat ein einzelnes gedrucktes Oligonukleotid in jedem Array, jedes einzigartige Oligonukleotid ist repräsentiert.

Nachdem die Microarray-Analyse von Transkripten, die aus Larven des vierten Stadiums isoliert wurden, zeigt, dass Gene, die für die wichtigsten Spermienproteine oder MSP kodieren, in VSM-1-Mutanten induziert werden, zeigt die Microarray-Analyse von Larven des dritten Stadiums auch Expressionsänderungen innerhalb derselben Genfamilie in der Mutante. Testen. Vorhersagen aus dem Microarray durch realtime PCR-Analyse zeigen, dass ein Mitglied der M ms P Genfamilie MS P 32 in den VSM one Mutanten induziert wird. Die Daten stellen den Durchschnitt von drei Replikaten der Real-Time-PCR aus derselben RNA-Sammlung dar.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit bioinformatischen Werkzeugen für die genomweite Analyse umgeht, insbesondere wenn man bedenkt, dass der wissenschaftlichen Gemeinschaft viele bioinformatische Open-Source-Softwareprogramme zur Verfügung stehen.