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26. Juli 2017
Hier präsentieren wir einen Caenorhabditis-Elegans- spezifischen Assay, der dazu bestimmt ist, Veränderungen des Kupfer-Aversionsverhaltens und die Fähigkeit, eine gemeinsame Nahrungsquelle zu lokalisieren, zu bewerten, da der Organismus von einem gut gefütterten bis hin zu verhungertem Ernährungszustand fortschreitet.
Das übergeordnete Ziel dieses auf dem Ernährungsstatus basierenden Kupferaversions-Assays besteht darin, die Reaktion von Nematoden auf eine aversive Chemikalie und eine Nahrungsquelle über einen Zeitraum von vier Stunden zu bewerten. Dies ermöglicht die gleichzeitige Bewertung des Ernährungsstatus. Diese Methode kann das Gebiet der Verhaltensneurowissenschaften unterstützen, indem Mutanten identifiziert werden, die trotz Hungerbedingungen keine lokomotorischen Muster und keine Reaktion auf eine aversive Chemikalie modulieren.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie über einen längeren Zeitraum durchgeführt werden kann, was eine Analyse des Ernährungszustands ermöglicht, während die Würmer über vier Stunden hinweg zunehmend verhungern. Um experimentelle Organismen für den Assay vorzubereiten, nehmen Sie 24 Stunden vor Beginn des Assays 10 L4-Stadium-Nematoden pro Strom und stellen sicher, dass die Organismen zum Zeitpunkt der Untersuchung junge Erwachsene sind. Für jeden getesteten Mutanten oder Kontroll-Nematoden nehmen Sie 10 L4s.
Halten Sie die L4-Organismen für 24 Stunden auf Standard-Agarplatten, die mit OP50 E.Coli besät sind, gemäß Standardmethoden. 24 Stunden vor dem Assay zeichnen Sie mit einem Lineal und einem dicken Permanentmarker eine Linie auf der Unterseite einer zuvor vorbereiteten Nematoden-Wachstumsmedien- oder NGM-Platte entlang des äußeren Randes. Markieren Sie eine mittlere Barriere, die gleich weit von jedem Rand der Platte entfernt ist.
Besäen Sie die Platte mit 50 Mikrolitern OP50 E.Coli nur auf einer Seite der Kupferbarriere, um eine gleichmäßige Rasenfläche zu erzeugen. Verwenden Sie die markierten Linien auf der Unterseite der Platte, um sicherzustellen, dass die Bakterien die Kupferlösung nicht berühren. Stellen Sie sicher, dass die Kupferlösung den Rand der Platte säumt und eine mittlere Barriere bildet, und übertragen Sie die Bakterien so, dass die Kupferlösung die Nahrungsquelle nicht berührt.
Markieren Sie einen zweiten Satz von Platten ohne OP50 E.Coli, um als negative Kontrolle zu dienen. Lassen Sie die Bakterien trocknen und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass die Bakterienflecken nicht gestört werden, wenn Sie die Nematoden in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius übertragen.
Übermäßige Störung könnte die Position oder Form des Nahrungsflecks verändern. Entfernen Sie nach der Übernachtinkubation die Platten aus dem Inkubator und pipettieren Sie unter Verwendung der markierten Unterseite der Platte als Führung 100 Mikroliter frisch zubereitete 0,5 molare Kupfer(II)sulfatlösung auf den Rand der Agar, um eine äußere Kupferbarriere zu erzeugen. Pipettieren Sie 25 Mikroliter der Kupfer(II)sulfatlösung, um eine mittlere Barriere zu erzeugen.
Stellen Sie sicher, dass die Kupfer(II)sulfatlösung den Bakterienfleck nicht berührt und lassen Sie die Kupferlösung auf der Platte trocknen. Überprüfen Sie alle fünf Minuten nach der Übertragung auf Trockenheit, indem Sie mit einem Labortuch die Lösung leicht in der Nähe des Randes der Platte tupfen, um sie zu erkennen. Übertragen Sie die Versuchsorganismen unmittelbar vor dem Assay auf eine bakterienfreie Agarplatte und lassen Sie die Nematoden eine Minute lang frei bewegen, um überschüssige Bakterien zu entfernen.
Pipettieren Sie anschließend ein Milliliter M9 auf die Platte mit jungen Erwachsenen, die 24 Stunden zuvor übertragen wurden, um die Würmer in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu waschen. Zentrifugieren Sie die Nematoden bei 3.000 x G für eine Minute. Die Würmer sollten einen Pellet am Boden des Röhrchens bilden.
Saugen Sie die M9-Lösung ohne Störung des Wurmpellets ab. Fügen Sie einen Milliliter M9-Lösung zum Wurmpellet hinzu. Kehren Sie das Röhrchen um, um Würmer mit der Lösung zu mischen.
Wenn anfänglich überschüssige Bakterien mit den Würmern übertragen wurden, wiederholen Sie dies insgesamt fünfmal. Nach der letzten Wäsche saugen Sie das Überstand ab, bis 100 Mikroliter M9-Lösung und der Wurmpellet übrigbleiben. Übertragen Sie die Würmer sofort aus der Lösung, sobald die Wäsche abgeschlossen ist.
Pipettieren Sie 20 Mikroliter des Wurmpellets vom Boden des Röhrchens auf den bakterienfreien Teil der Assayplatte, stellen Sie sicher, dass 10 Würmer auf die Assayplatte übertragen werden und keine verunreinigenden Lebensmittel vorhanden sind. Keine Bakterien sollten auf die Kupfer-Nahrungsrennenplatten übertragen werden. Entfernen Sie überschüssige M9-Lösung von den Nematoden mit einem Labortuch innerhalb einer Minute.
Stellen Sie sicher, dass die M9-Lösung nicht mit der Kupfer(II)sulfatlösung in Kontakt kommt und dass die Würmer und die Agaroberfläche intakt bleiben. Entsorgen Sie Würmer, die versehentlich mit dem Labortuch entfernt wurden. Sobald die M9-Lösung entfernt wurde und alle Würmer nicht-flüssige Lokomotormuster begonnen haben, d.h. wenn sie aufgehört haben, sich zu winden.
Starten Sie die Stoppuhr des Assays, wenn versehentlich zusätzliche Würmer eingeschlossen wurden, entfernen Sie diese durch Auswählen mit Halocarbonöl, um sicherzustellen, dass keine Bakterien zur Platte hinzugefügt werden. Überprüfen Sie die Assayplatten alle 30 Minuten. Für die Assayplatten mit Bakterienflecken bewerten Sie Organismen positiv, wenn sie den Nahrungsfleck über einen Zeitraum von vier Stunden erreichen.
Für die negativen Kontrollplatten bewerten Sie Organismen positiv, wenn sie die Barriere überquert haben. Wir nutzten den N2- und npr-9-Loss-of-Function-Mutanto und einen npr-9-Überexpressionsstamm, der als npr-9-Gain-of-Function bezeichnet wird, um die Reaktionen auf Hunger und Kupferaversion zu bewerten. Am Ende des Assays zogen 100% der Wildtyp-Organismen zur Nahrungsquelle um, während die npr-9-Überexpressionsorganismen keine lokomotorischen Muster als Reaktion auf Nahrung modulierten und weiterhin die aversive Barriere überquerten, selbst nachdem sie die Nahrungsquelle kontaktiert hatten.
Auf einer futterfreien Platte überquerten n2- oder npr9-Loss-of-Function-Organismen selten die Kupferbarriere, während die npr-9-Überexpressions-Nematoden wiederholt die Barriere hin und her überquerten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Kupferbarriere beim Transfer von Nematoden und M9 nicht zu stören und auch konsistente Bedingungen für jeden Stamm aufrechtzuerhalten, um Störfaktoren zu vermeiden.
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Überblick
Diese Studie präsentiert einen Caenorhabditis elegans-spezifischen Test zur Bewertung des Kupferabwehrverhaltens und der Lokalisierung von Nahrungsquellen, wenn sich der Organismus von einem gut genährten in einen verhungernden Zustand überführt.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Verhaltensneurowissenschaft
- Nematodenbiologie
Hintergrund
- Der Test bewertet die Reaktionen von Nematoden auf eine aversive Chemikalie und Nahrungsquelle.
- Er beurteilt Verhaltensänderungen über einen Zeitraum von vier Stunden.
- Diese Methode identifiziert Mutanten, die ihre Lokomotormuster unter Hunger nicht anpassen.
- Er ermöglicht eine Analyse des Ernährungszustands, während sich die Würmer allmählich verhungern.
Zweck der Studie
- Um Veränderungen im Kupferabwehrverhalten von C. elegans zu bewerten.
- Um die Fähigkeit zur Lokalisierung von Nahrungsquellen unter verschiedenen Ernährungszuständen zu beurteilen.
- Um zum Verständnis von Verhaltensreaktionen unter Hungerbedingungen beizutragen.
Verwendete Methoden
- Der Test wird über einen Zeitraum von vier Stunden durchgeführt.
- Es werden Nematoden im L4-Stadium für Tests verwendet.
- Gleichzeitige Bewertung des Ernährungszustands und des Verhaltens.
- Auswahl von 10 Nematoden im L4-Stadium pro Strom für Experimente.
Hauptergebnisse
- Identifizierte Verhaltensänderungen als Reaktion auf Kupferabwehr.
- Demonstrierte die Fähigkeit der Nematoden, trotz Hunger Nahrungsquellen zu lokalisieren.
- Hervorgehobene Effektivität des Tests in der Verhaltensneurowissenschaftsforschung.
- Zeigte, dass der Test über einen längeren Zeitraum für eine umfassende Analyse erweitert werden kann.
Schlussfolgerungen
- Der Test ist ein wertvolles Instrument zur Untersuchung von Verhaltensreaktionen bei C. elegans.
- Er hilft bei der Identifizierung von Mutanten mit veränderten aversiven Reaktionen.
- Diese Methode verbessert das Verständnis der Auswirkungen des Ernährungszustands auf das Verhalten.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This assay enables behavioral neuroscience researchers to evaluate how nutritional status modulates aversive responses in a genetically tractable model. By tracking copper aversion and food-seeking behavior over time, it supports mechanistic de-risking of targets involved in sensory integration and feeding regulation. The method provides predictive confidence for target validation in pathways linking metabolic state to behavioral output.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses about how nutritional status gates aversive chemical responses.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring locomotory pattern modulation in response to combined sensory cues.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying mutants that fail to integrate starvation signals with aversion behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening of compounds affecting sensory integration.
- Operational Value: Standardizes quantitative behavioral readouts over extended time courses to improve assay reproducibility.
- Scalability: Permits increased sample size for simultaneous evaluation of large populations, enhancing screening throughput.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage behavioral phenotypes to preclinical models of feeding regulation and sensory processing.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing whether targets affect adaptive behavior under changing metabolic conditions.
- Mechanistic De-risking: Focuses on targets that modulate behavioral flexibility rather than static aversion or attraction.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for pathways linking nutritional state to behavioral output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of how metabolic cues modulate aversive responses in neural circuits.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible quantification of barrier-crossing behavior over four hours.
- Analytics: Generates time-dependent behavioral measurements that enable comparison of genetic or pharmacological conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling how nutritional status affects decision-making in simple nervous systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating multiple targets in sensory integration and feeding behavior pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by revealing dynamic behavioral responses to combined aversive and appetitive cues.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through timed scoring and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose modulation fails to adapt behavior under metabolic stress.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by distinguishing between static sensory defects and dynamic integration deficits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nematode handling, behavioral observation, and timed assay execution.
- Depends on standardized agar plates, copper sulfate solution preparation, and bacterial lawn control.
- Necessitates cross-team standardization of scoring criteria for food-patch arrival and barrier-crossing events.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different genetic backgrounds or environmental stressors.
- Includes practical limitations such as avoiding physical disruption of copper barriers during worm transfers and maintaining consistent incubation conditions.
