EIN Caenorhabditis elegans Nährwert-basierter Kupfer-Aversion-Assay

Das übergeordnete Ziel dieses auf dem Ernährungsstatus basierenden Kupferaversions-Assays besteht darin, das Ansprechen von Nematoden auf eine aversive Chemikalie und eine Nahrungsquelle über einen Zeitraum von vier Stunden zu bewerten. Dies ermöglicht die gleichzeitige Bewertung des Ernährungsstatus. Diese Methode kann dem Gebiet der Verhaltensneurowissenschaften helfen, indem sie Mutanten identifiziert, die trotz Hungerbedingungen nicht in der Lage sind, die Bewegungsmuster und die Reaktion auf eine aversive Chemikalie zu modulieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie über einen längeren Zeitraum durchgeführt werden kann, was eine Analyse des Ernährungszustands ermöglicht, da die Würmer im Laufe von vier Stunden immer mehr hungern. Um Versuchsorganismen für den Assay vorzubereiten, wählen Sie 24 Stunden vor Beginn des Assays 10 Nematoden im L4-Stadium pro Bach aus, um sicherzustellen, dass die Organismen zum Zeitpunkt des Tests junge Erwachsene sind. Für jede getestete Mutante oder Kontrollnematode werden 10 L4-Nematoden ausgewählt.

Pflegen Sie L4-Organismen mit Standardmethoden 24 Stunden lang auf Standard-Agarplatten, die mit OP50 E.Coli besiedelt sind. 24 Stunden vor dem Assay ziehen Sie mit einem Lineal und einem dicken Permanentmarker eine Linie auf der Unterseite eines zuvor vorbereiteten Nematodenwachstumsmediums oder einer NGM-Platte entlang des äußeren Randes. Markieren Sie eine Mittellinienbarriere, die gleich weit von jeder Kante der Platte entfernt ist.

Besäen Sie die Platte mit 50 Mikrolitern OP50 E.Coli auf nur einer Seite der Kupferbarriere, um einen gleichmäßigen Rasen zu schaffen. Verwenden Sie die markierten Linien auf der Unterseite der Platte, um sicherzustellen, dass die Bakterien nicht mit der Kupferlösung in Berührung kommen. Stellen Sie sicher, dass die Kupferlösung den Rand der Platte auskleidet und eine Mittellinienbarriere bildet, und übertragen Sie die Bakterien, damit die Kupferlösung nicht mit der Lebensmittelquelle in Berührung kommt.

Markieren Sie einen zweiten Satz Platten ohne OP50 E.Coli, der als Negativkontrolle dienen soll. Lassen Sie die Bakterien trocknen und inkubieren Sie die Platten dann über Nacht bei 37 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass die Bakterienpflaster nicht gestört werden, wenn Sie die Nematoden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator umfüllen.

Übermäßige Störungen können die Position oder Form des Futterpflasters verändern. Nach der Inkubation über Nacht nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und pipettieren Sie anhand der markierten Unterseite der Platte 100 Mikroliter frisch zubereiteter 0,5-molare Kupfer(II)sulfat-Lösung auf den Rand des Agars, um eine äußere Kupferbarriere zu schaffen. Pipettieren Sie 25 Mikroliter der Kupfer(II)sulfatlösung, um eine Mittellinienbarriere zu schaffen.

Stellen Sie sicher, dass die Kupfer(II)-sulfat-Lösung nicht mit dem Bakterienpflaster in Berührung kommt, und lassen Sie die Kupferlösung auf der Platte trocknen. Überprüfen Sie alle fünf Minuten nach dem Transfer mit einem Labortuch die Trockenheit, indem Sie die Lösung in der Nähe des Randes der Platte leicht abtupfen, um sie zu erkennen. Unmittelbar vor dem Assay werden die Versuchsorganismen auf eine bakterienfreie Agarplatte umgefüllt und die Nematoden eine Minute lang frei bewegen können, um überschüssige Bakterien zu entfernen.

Als nächstes pipettieren Sie mit jungen Erwachsenen einen Milliliter M9 auf die Platte, die 24 Stunden zuvor übertragen wurden, um die Würmer in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu waschen. Zentrifugieren Sie die Nematoden eine Minute lang bei 3.000 x G. Die Würmer sollten am Boden des Rohres ein Kügelchen bilden.

Aspirieren Sie die M9-Lösung, ohne das Wurmkorn zu stören. Geben Sie einen Milliliter M9-Lösung in das Wurmpellet. Drehen Sie das Rohr um, um die Würmer mit der Lösung zu mischen.

Wenn zunächst überschüssige Bakterien mit den Würmern übertragen wurden, wiederholen Sie dies insgesamt fünfmal. Nach der letzten Wäsche wird der Überstand abgesaugt, bis 100 Mikroliter M9-Lösung übrig bleiben und das Wurmpellet übrig bleibt. Übertragen Sie die Würmer sofort aus der Lösung, sobald die Spülvorgänge abgeschlossen sind.

Pipettieren Sie 20 Mikroliter des Wurmpellets vom Boden des Röhrchens auf die bakterienfreie Hälfte der Testplatte, stellen Sie sicher, dass 10 Würmer auf die Testplatte übertragen werden und dass keine kontaminierenden Lebensmittel vorhanden sind. Es sollten keine Bakterien auf die kupfernen Lebensmittelplatten übertragen werden. Entfernen Sie überschüssige M9-Lösung innerhalb einer Minute mit einem Labortuch aus den Nematoden.

Stellen Sie sicher, dass die M9-Lösung nicht mit der Kupfer(II)-sulfat-Lösung in Berührung kommt und dass die Würmer und die Agaroberfläche intakt bleiben. Entsorgen Sie Würmer, die versehentlich mit dem Laborgewebe entfernt wurden. Sobald die M9-Lösung entfernt wurde und alle Würmer begonnen haben, sich nicht flüssig fortzubewegen, d.h. wenn sie aufgehört haben zu schlagen.

Starten Sie die Stoppuhr des Assays. Wenn versehentlich zusätzliche Würmer enthalten waren, entfernen Sie sie, indem Sie sie mit Halogenkohlenwasserstofföl zupfen, um sicherzustellen, dass der Platte keine Bakterien hinzugefügt werden. Überprüfen Sie die Assay-Platten alle 30 Minuten. Für die Assay-Platten mit Bakterienpflastern bewerten Sie Organismen positiv, wenn sie das Lebensmittelpflaster über einen Zeitraum von vier Stunden erreichen.

Für die negativen Kontrollplatten bewerten Sie Organismen positiv, wenn sie die Barriere überschritten haben. Wir verwendeten die N2- und npr-9-Mutante für Funktionsverlust und einen npr-9-Überexpressionsstamm, der als npr-9 gain a function bezeichnet wird, um Reaktionen auf Hunger und Kupferaversion zu bewerten. Am Ende des Assays zogen 100 % der Wildtyp-Organismen in die Nahrungsquelle um, während die npr-9-Überexpressionsorganismen die Bewegungsmuster als Reaktion auf Nahrung nicht modulierten und die aversive Barriere auch nach Kontakt mit der Nahrungsquelle weiter überwanden.

Auf einem nahrungsfreien Teller überquerten n2- oder npr9-Organismen mit Funktionsverlust selten die Kupferbarriere, während die npr-9-Überexpressionsnematoden die Barriere wiederholt hin und her durchquerten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Kupferbarriere beim Transfer von Nematoden und M9 nicht zu stören und auch konsistente Bedingungen für jeden Stamm aufrechtzuerhalten, um Störfaktoren zu vermeiden.