Name: Toxin Induktions-und Protein-Extraktion aus Fusarium Spp. Kulturen für Proteom-Studien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-16T15:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Erfahren Sie die standardisierte Proteinextraktion aus Fusarium spp. für Proteom-Studien. Dieses Protokoll minimiert experimentelle Verzerrungen bei der Toxin-Induktion und gewährleistet reproduzierbare Ergebnisse nach MIAPE-Richtlinien.

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Wir danken Servane Contal und Boris Untereiner für ihre technischen Beitrag leisten. Wir erkennen die Unterstützung der FNR &quot;FUTOX&quot;-Projekt.

Das Protokoll benötigt 16 Tage für seine Vollendung. Der Zeitrahmen ist in Abbildung 1 dargestellt sind. Details zum Puffer Vorbereitung <ul><li> Vorbereitung der Lyse-Puffer (3 ml pro Probe). </li><li> Vorbereitung der Waschpuffer (50 mL pro Probe). Dieser Puffer sollte vorgekühlt werden und bei -20 ° C gelagert in der Tiefkühltruhe bis zur weiteren Analyse und auf Eis gehalten während des gesamten Verfahrens. </li><li> Vorbereitung des Niederschlags-Puffer (20 ml pro Probe). Dieser Puffer sollte vorgekühlt werden und bei -20 ° C gelagert in der Tiefkühltruhe, bis es gebraucht und auf Eis gehalten während des gesamten Verfahrens. </li><li> Die Arbeiten sollten vorzugsweise in die kalte Kammer durchgeführt werden bei 4 ° C. </li></ul> Pilzarten Drei Stämme für Proteom-Analysen verwendet wurden klassifiziert, um Fusarium graminearum auf der Grundlage ihrer morphologischen Merkmale und Translation-Elongationsfaktor Alpha-1-Analyse (O'Donnell et al., 1998) Diese Stämme gehörten zu den CRP-Gabriel Lippmann Sammlung und wurden gepflegt und gelagert bei - 80 ° C in 15% Glycerin. Vorbereitung der Myzelien Pilze wurden auf V8 für 4 Tage bei 25 ° C abwechselnd helle und dunkle Periode jeweils 12 Stunden kultiviert. Die Kulturen wurden fragmentiert mit einem sterilen Messer und Stücke von diesen Kulturen wurden verwendet, um 250 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml Toxin-induzierenden Medien zu impfen. Myzelien wurden nach 10 Tagen geerntet und von Medium durch Filtrieren der Kultur mit einer sterilen Filter abgeschieden. Myzelien wurden 3 mal mit sterilem Wasser gewaschen, um mittel-Rückständen und anderen Verbindungen zu entfernen. Wir haben dann sofort die Zellen durch Zugabe von flüssigem Stickstoff eingefroren und hielt die Proben bei -80 ° C. Allgemeine Beschreibung der Protein-Extraktions- Protein-Proben wurden extrahiert nach der Methode in der Figur 3A und 3B beschrieben. Der Fusarium-Proben wurden in flüssigem Stickstoff gemahlen und das Pulver wurde in 10 ml Teflon-Röhrchen gesammelt. Die Proben wurden dann 30 Minuten mit dem Lysepuffer inkubiert, 10 Minuten gekocht und zentrifugiert, 2 mal bei Raumtemperatur (12000g für 15 Minuten). Die Überstände wurden gesammelt und bei -20 ° C inkubiert mit Niederschlag Puffer über Nacht. Nach Zentrifugation bei 4 ° C 30000g für 45 Minuten, die Pellets der gefällten Proteine ​​wurden 3 mal mit kaltem Aceton enthält DTT gewaschen. Schließlich wurden die Pellets an der Luft getrocknet und die Proteine ​​wurden bei der Kennzeichnung Puffer resolubilisiert, Einstellung des pH auf 8. Eine Teilprobe von 30 ml wurde für Gesamt-Protein Quantifizierung entfernt und der verbleibende Überstand wurde bei -20 ° C bis Protein-Elektrophorese gespeichert. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Timeline des Verfahrens. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Scheme für mehrere Betreiber Probe-Verarbeitung. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3atmb.jpg" alt="Abbildung 3a" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3a"> Abbildung 3a. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig3btmb.jpg" alt="Abbildung 3b" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3b"> Abbildung 3b. Bitte <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3a.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Figur 3a, oder sehen <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig3b.jpg">Sie hier</a> für eine größere Version Bild 3b. Abb. 3a-b Flussdiagramme für die Protein-Extraktions-Verfahren (A: am ersten Tag; B: zweiter Tag).. <img src="/files/ftp_upload/1690/1690fig4tmb.jpg" alt="Abbildung 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. 1D Bild von Protein-Extrakten. Die Proteine ​​wurden bis zur vollständigen Migration von blau bis zum Ende des Gels, die mit Lava Lila gefärbten ausgeführt wurde. Bitte <a href="/files/ftp_upload/1690/1690fig4.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 4 zu sehen.

<ol><li>Bridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Extraction+from+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Purification+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protein Extraction from Fungi.</a> Protein Purification Protocols. , 39-48 (1996).</li>
<li>Jiao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+carbon+sources+on+trichothecene+production+and+Tri+gene+expression+by+Fusarium+graminearum+in+liquid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Effects of different carbon sources on trichothecene production and Tri gene expression by Fusarium graminearum in liquid culture.</a> FEMS Microbiol Lett. 285, 212-219 (2008).</li>
<li>Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of filamentous fungi.</a> Trends in Biotechnology. 25, 395-400 (2007).</li>
<li>Milles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+proteomic+approach+to+monitor+protein+synthesis+in+mycotoxin+producing+moulds%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotoxin+Res%22%5BJournal%5D)">Development of a proteomic approach to monitor protein synthesis in mycotoxin producing moulds.</a> Mycotoxin Res. 23, 161-165 (2007).</li>
<li>Morrison, N., Field, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concept+of+sample+in+OMICS+technology%5BTitle%5D)+AND+%22OMICS%22%5BJournal%5D)">Concept of sample in OMICS technology.</a> OMICS. 10, 127-137 (2006).</li>
<li>O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+evolutionary+origins+of+the+fungus+causing+Panama+disease+of+banana%3A+Concordant+evidence+from+nuclear+and+mitochondrial+gene+genealogies%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies.</a> PNAS. 95, 2044-2049 (1998).</li>
<li>Paper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+of+extracellular+proteins+in+vitro+and+in+planta+from+the+pathogenic+fungus+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics of extracellular proteins in vitro and in planta from the pathogenic fungus Fusarium graminearum.</a> Proteomics. 7, 3171-3183 (2007).</li>
<li>Pasquali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+in+science.+Protocol+videos%3A+the+implications+for+research+and+society%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Video in science. Protocol videos: the implications for research and society.</a> EMBO Rep. 8, 712-716 (2007).</li>
<li>Taylor, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimum+information+about+a+proteomics+experiment+%28MIAPE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The minimum information about a proteomics experiment (MIAPE).</a> Nat Biotechnol. 25, 887-893 (2007).</li>
<li>Taylor, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analyses+of+Fusarium+graminearum+grown+under+mycotoxin-inducing+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analyses of Fusarium graminearum grown under mycotoxin-inducing conditions.</a> Proteomics. 8, 2256-2265 (2008).</li>
</ol>

Das gegenwärtige Interesse an Proteomik Ansätze innerhalb der Pilz-Biologie-Domain zu einer erhöhten Zahl von Veröffentlichungen mit dieser Technik (wie in Kim et al., 2007 reviewed) geführt. Verfahren zur Extraktion der Proteine ​​setzen auf eine Kombination von Extraktionsverfahren, sie sind oft kaum in der methodischen Abschnitten beschrieben und erfordern Fachkenntnisse im Umgang mit den potentiellen Methoden zur Fehlerbehebung. Wie bei anderen &quot;omics&quot; Ansätze, Standards für die Probe und Datenverarbeitung ist, um verlässliche wissenschaftliche Daten zu generieren unerlässlich. Außerdem Proben und Verfahren der Manipulation soll adäquat beschrieben werden, um gemeinsame Interpretation der Ergebnisse zwischen den verschiedenen &quot;omics&quot; Experimente erlauben. Dies wäre wichtig für eine optimale Nutzung Potentialität der Cross-Data-Mining in der Genomik, Proteomik, Metabolomik, ... (Morrison et al., 2006). Minimum Informationen über ein Proteom-Experiment wurde ausgearbeitet und Arbeitsgruppen wurden eingerichtet, um alle Aspekte eines Experiments (Gel-Elektrophorese, Massenspektrometrie, Molekulare Wechselwirkungen, Protein Modifikationen, Proteomics Informatik, Sample Processing) zu bewältigen. Zur Zeit sind keine definierten Informationen finden Sie auf Probe Verarbeitungsverfahren. Angesichts der Bedeutung der Protein-Extraktions-Verfahren bei der Bestimmung der endgültigen Qualität der Proteom-Studien, um die Verfahren, dass die Standardisierung im Rahmen der MIAPE Richtlinien zu erhöhen (Taylor et al., 2007) implementieren können, haben wir vorgeschlagen, die Verwendung eines Video-Protokoll detailliert Probe Verarbeitung. Video Beschreibung von Experimenten kann wesentlich dazu beitragen, die Zahl der Informationen über die Probenaufbereitung, die in einer besseren Reproduzierbarkeit der &quot;omics&quot; Experimente (Pasquali, 2007) Ergebnis erhöhen können. In der Tat ist die Reproduzierbarkeit in Labors eine Grundvoraussetzung, um die Gültigkeit Ergebnisse aus der Proteomik (http://www.fixingproteomics.org) zu gewährleisten. Verschiedenen Besetzungen und verschiedenen Betreibern Manipulation Proben: Das Kreuz-Labor-Reproduzierbarkeit wird durch zwei Faktoren beeinflusst. In dem beschriebenen Protokoll, schlagen wir vor, führen biologische Replikate mit mehreren Betreibern (Abbildung 2 und Video), um die Zuverlässigkeit der Daten (dh technische Variation der Ergebnisse ist zu berücksichtigen) zu erhöhen. Das Verfahren zur Extraktion der Proteine ​​beschrieben wird, auf SDS und Heizung auf. Dies war bisher gezeigt, dass eine gute Reinheit und Menge der Proteine ​​(Bridge 1996) zu gewährleisten. SDS mit kochendem gekoppelt löst die Zellwände, hydrophobe Proteine ​​und verhindert die Bildung von Oligomeren, die abort Fällung von Proteinen. Boiling ermöglicht auch die Inaktivierung von Proteasen. Der gleiche Effekt wird auch durch EDTA, PMSF und komplette Mini-Protease-Inhibitor produziert. DTT entfernt Disulfidbrücken in und zwischen Proteinen erleichtern Protein Solubilisierung. Um SDS vor IEF zu entfernen, sind Proteine, die durch Aceton / TCA / DTT gefällt. Darüber hinaus ermöglicht Aceton / TCA / DTT Niederschlag Entfernen einiger Schadstoffe wie Lipide, Nukleinsäuren, Salze und / oder Phenol-Verbindungen, wenn diese Verbindungen vorhanden sind. Wie SDS, verhindern, dass diese Moleküle eine gute Migration während IEF. Nach diesem Niederschlag, ist es notwendig, die ausgefallenen Proteine ​​durch Aceton / DTT, zu waschen, um TCA zu entfernen, da es mit IEF stören können. Eine gute Vorbereitung der Proben ist der Schlüssel zu guten Ergebnissen. Dafür ist es auch wichtig, um eine Verunreinigung von Proteinen aus dem Umfeld der Arbeit mit puderfrei Handschuhe und Respekt für eine gute Laborpraxis zu vermeiden. Aus technischer Sicht innerhalb der beschriebenen Protokoll werden die wichtigsten Schritte für den Erhalt ausreichender Menge und Reinheit von Proteinen in zwei Phasen. Erstens, die Schleif-Phase, in der völligen Zerstörung der Zelle ist von grundlegender Bedeutung, um Proteine ​​Release, und zweitens, die Reinigung des gesamten Proteine, eine Phase umfasst die Entfernung von der Mehrheit der Lipide, DNA und andere Verunreinigungen, die mit der Migration der Proteine ​​stören können.

Medien und Lösungen PDA: 39 g Kartoffel-Dextrose-Agar (Difco), 1 L destilliertem Wasser. V8-Agar: 200 ml V8 (Campbell, USA), 2g CaCO3 (Sigma), 16g Agar (Difco), 800 ml destilliertem Wasser Toxin induziert Medien: 1g K 2 HPO 4, 0,5 g KCl, 0,5 g MgSO 4 7H 2 O, 10 mg FeEDTA, 2g L Glutaminsäure, 10g Saccharose in 1L destilliertes Wasser. Lysis Buffer: <table border="1"><tr><td></td><td> 100ml </td><td> Endkonzentration </td><td></td></tr><tr><td> Tris-HCL pH 8 </td><td> 5 ml </td><td> 50mM </td><td> 1M </td></tr><tr><td> SDS </td><td> 2g bzw. 10 mL </td><td> 2% </td><td> 20% </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 500ml </td><td> 10 mM </td><td> 2M </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 20mL </td><td> 0,1 mM </td><td> 0,5 M </td></tr><tr><td> PMSF </td><td> 200ml </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Komplett mini Protease-Inhibitor </td><td> 1 Tablette </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Wasser </td><td> Qsp </td><td></td><td></td></tr></table> Niederschlag Buffer: <table border="1"><tr><td></td><td> 100ml </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> TCA </td><td> 20mL </td><td> 20% </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0,1 ml </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> Qsp </td><td></td></tr></table> Waschpuffer: <table border="1"><tr><td></td><td> 100ml </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0,1 ml </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> Aceton </td><td> 100ml </td><td></td></tr></table> Kennzeichnung Buffer (Lagerung bei -18 ° C in kleinen Portionen): <table border="1"><tr><td></td><td> 1ml </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> Harnstoff </td><td> 140 mg </td><td> 7M </td></tr><tr><td> Thioharnstoff </td><td> 50 mg </td><td> 2M </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> 40 mg </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Tris </td><td> 30 ul </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 1 mL </td><td></td></tr></table>

toxin induktions-und protein-extraktion aus fusarium spp. kulturen für proteom-studien

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusarien sind Fadenpilze in der Lage, verschiedene Toxine produzieren. Fusarium Mykotoxinen wie Deoxynivalenol, Nivalenol, T2, zearelenone, fusaric Säure, Moniliformin, etc. .. nachteilige Auswirkungen auf Mensch und Tier Gesundheit und einige werden als Pathogenitätsfaktoren angesehen. Proteomik-Studien erwies sich als wirksam zur Entschlüsselung Toxinproduktion Mechanismen (Taylor et al., 2008) sowie zur Identifizierung potentieller pathogenen Faktoren (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusarien. Es wird daher von grundlegender Bedeutung für zuverlässige Methoden für den Vergleich zwischen Proteom-Studien, um auf wahren Unterschiede in der Proteinexpression zwischen den Experimenten, Zerrungen und Labors gefunden verlassen zu etablieren. Das Verfahren, das beschrieben werden soll, um ein höheres Maß an Standardisierung der Proteom-Verfahren auf zwei Arten beitragen. Die gefilmten Protokoll wird verwendet, um das Niveau der Details, die genau beschrieben werden können, erhöht. Darüber hinaus bildet die Verfügbarkeit von standardisierten Verfahren zur Verarbeitung biologischer sollte eine höhere Robustheit der Daten zu gewährleisten, auch unter Berücksichtigung des menschlichen Faktors im Rahmen der technischen Reproduzierbarkeit der Extraktion. Das beschriebene Protokoll benötigt 16 Tage für seine Fertigstellung: 14 Tage für Kulturen und zwei Tage für die Protein-Extraktion (Abbildung 1). Kurz gesagt, Fusarium-Stämmen auf festen Medien für 4 Tage gewachsen, sie sind dann manuell fragmentiert und in eine modifizierte Toxin induziert Medien (Jiao et al, 2008.) Für 10 Tage. Myzel durch Filtration durch ein Miracloth Schicht gesammelt. Schleifen wird in einer Kältekammer durchgeführt. Verschiedene Betreiber durchgeführt Extraktion Wiederholungen (n = 3), um unter Berücksichtigung der Voreingenommenheit aufgrund technischer Veränderungen (Abbildung 2). Die Extraktion wurde auf einem SDS / DTT-Puffer wie in Taylor et al beschrieben ist. (2008) mit leichten Modifikationen. Insgesamt Proteinextraktion erforderte eine Fällung der Proteine ​​mit Aceton / TCA / DTT-Puffer über Nacht und Aceton / DTT Waschen (Abbildung 3a, 3b). Die Proteine ​​wurden schließlich in der Protein-Kennzeichnung Puffer resolubilisiert und quantifiziert. Die Ergebnisse der Extraktion wurden visualisiert auf einem 1D-Gel (Abbildung 4, SDS-PAGE), bevor Sie mit 2D-Gelen (IEF / SDS-PAGE). Das gleiche Verfahren kann für Proteom-Analysen auf anderen Kultursubstrate und andere Fadenpilze (Miles et al., 2007) angewendet werden.

Protein-Extraktion für Proteom-Analysen in Pilzarten erfordert ein hohes Maß an Standardisierung zu erfolgen gemäß den Mindestanforderungen Informationen über ein Proteom-Experiment (MIAPE) Richtlinien. Wir präsentieren ein Video-Protokoll, das ein Verfahren zur Minimierung der experimentellen Bias während Toxin Induktion und Extraktion der Proteine ​​aus schließt<em&gt; Fusarium spp.</em

Toxin Induktions-und Protein-Extraktion aus Fusarium Spp. Kulturen für Proteom-Studien

Fusaria sind filamentöse Pilze, die in der Lage sind, verschiedene Toxine zu produzieren. Fusarium-Mykotoxine wie Deoxynivalenol, Nivalenol, T2, Zearalenon, Fusarsäure, ...

Dieses Video beschreibt ein Verfahren zur Induktion der Toxinbiosynthese in einigen Arten, in diesem Fall für , sowie das Protokoll zur Gesamtproteingewinnung, das in unserem Labor für proteomische Studien verwendet wird. Die Dauer des Verfahrens beträgt 16 Tage, vier Tage für das Pilzwachstum, 10 Tage für die Toxinbiosynthese und zwei Tage für die Proteingewinnung. Nach vier Tagen wachsen die Kolonien noch aktiv in Richtung Rand der Platte.Typisches Luftmycel wird gebildet und unter dem laminaren Flussgehäuse mit einem Steroidmesser durch vorsichtiges Kratzen der Plattenoberfläche gesammelt. Das Mycel wird in fünf kleine Stücke geschnitten und einem frühen Mykol-Fläschchen mit 25 Milliliter Toxin-induzierendem Medium zugegeben. Die Toxininduktion ist effizienter als dunkler Staub.Der Kolben wird mit Aluminiumfolie abgedeckt. Die Kulturen werden anschließend 10 Tage lang bei 25 Grad Celsius mit 150 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Das Medium ist SAPH und enthält eine hochkonzentrierte S-Roh-Lösung.Ein Zusammendrücken zusammen mit Dunkelheit ist dafür bekannt, die Toxinbiosynthese in ria zu fördern. Das Mycel wird anschließend durch Filtration auf dem MI close Gewebe von der Toxin enthaltenden Flüssigkeit getrennt. Die Flüssigkeit kann zur Bestimmung des Toxingehalts verwendet werden, während das Mycel für die Proteingewinnung genutzt wird.Um eine Mitführung des Kulturmediums zu vermeiden, wird das Myzel dreimal mit steriler Wasser gewaschen. Das überschüssige Wasser sollte anschließend abgetrennt werden. Danach wird flüssiger Stickstoff zugegeben, und die Proben können bei minus 80 °C gelagert oder direkt zur Proteingewinnung verwendet werden. Das Verfahren zur Proteingewinnung basiert auf der Verwendung von SDS und TCA und umfasst mehrere verschiedene Lyse-Schritte.Er wird eine Methode vorschlagen, die mehrere Operatoren umfasst, die jeweils eine Durchführung übernehmen. Gleichzeitig erfolgt die Extraktion biologischer Replikate, wobei ein anderer Operator jedes Replikat bearbeitet. Dieses Vorgehen berücksichtigt Unterschiede im Extraktionsverfahren, die durch verschiedene Operatoren entstehen können, die die Replikate verarbeiten.Daher sollte es eine höhere Robustheit aufweisen, wenn biologische Replikate verglichen werden, da die Bedienervariable in das Replikat einbezogen wird. Gleichzeitig reduziert die Verwendung mehrerer Bediener die Verarbeitungszeit. Die Probe wird in einem sterilen Mörser unter Verwendung von flüssigem Stickstoff gemahlen, bis das Mycel ein feines Pulver ist.Dieser Schritt ist entscheidend für die Qualität und Menge der Proteine. Mycel wird in 10-Milli-Teflon-Röhrchen im Verhältnis von vier Zehnteln des Gesamtvolumens der Röhrchen gesammelt. Anschließend wird ein Puffer mit SDS und verschiedenen Proteaseinhibitoren hinzugefügt.Die Röhrchen werden dann geschüttelt, bis eine homogene Lösung erhalten ist. Anschließend werden die Proben 30 Minuten im Kühlschrank geschüttelt, um eine weitere Homogenisierung zu erreichen; danach werden die Proben erhitzt, um die Zellwände und hydrophoben Proteine aufzulösen. Das Vorhandensein von SDS verhindert die Bildung von Oligomeren, die die Präzipitation von Proteinen behindern würden.Ein Zentrifugationsschritt trennt drei Phasen. Die Proteine sind in der transparenten Lösung suspendiert, die in einem neuen, auf Eis gehaltenen Gefäß gesammelt wird. Die Palette wird anschließend verwendet, um einen zweiten Ly-Schritt durchzuführen, wobei das Vortexen, Erhitzen und Zentrifugieren wiederholt wird.Die SNAT aus den beiden Lysevorgängen wird kombiniert, um die Präzipitation mit eisiger Präzipitationspufferlösung, die Aci-ton, Triessigsäure und DTT enthält, durchzuführen. Die Proben werden anschließend über Nacht für 16 Stunden bei minus 20 Grad Celsius gelagert, um die Proteinpräzipitation zu ermöglichen. Die präzipitierten Proteine setzen sich am Boden der Röhrchen ab, was die Präzipitation verbessert.Die Röhrchen werden 45 Minuten lang bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert. Das Pellet ist nun gut sichtbar. Die Überstände können mit einem fünf Milliliter fassenden Pipettenpad entsorgt werden.Die TCA wird anschließend durch Zugabe von 25 Milliliter eisgekühltem Waschpuffer, der Aceton und DTT enthält, entfernt. Anschließend wird gründlich und kräftig geschüttelt. Danach wird ein neuer Zentrifugationsschritt durchgeführt.Das Protein-Palat schwebt nun, daher sollte darauf geachtet werden, den Snat zu entfernen. Ein zweiter Waschschritt wird durchgeführt, indem Waschpuffer zugegeben, geschüttelt und zentrifugiert wird. Das SUP-Reagenz wird entfernt und die Probe wird mit einem Speedbag getrocknet.Wenn die Probe trocken ist, weist das Protein eine pulverartige Konsistenz auf. Zum Aufbewahren sollte das Probenprotein aus dem Röhrchen entnommen werden, um die elektrostatische Interferenz durch Kunststoff zu verringern.Eine elektrostatische Pistole wird verwendet und das Proteinpulver mit einem Metallspatel gesammelt. Die Proteine werden dann direkt im Markierungspuffer resuspendiert. Verwendet für 2D – 30 Minuten bei 800 Gramm pro Minute.Es genügt zur Löslichkeit des Proteins, bevor mit der kostspieligen 2D-Markierung fortgefahren wird. Die Proteinqualität wird mittels eindimensionalem SDS-Page-Gel getestet, wie ersichtlich ist.Das Fehlen signifikanter Schmierstellen am Rand einer Spur deutet auf eine gute Qualität der Probe hin.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zur Untersuchung der Entwicklungsprozesse von Ascosporen in Gibberella zeae, ein Verfahren für die Sammlung unter sterilen Bedingungen gefilmt wird, um ein Höchstmaß an Informationen für die Protokoll-Beschreibung zu generieren. Dies sollte die Reproduzierbarkeit der Experimente, ein entscheidender Aspekt, wenn sie voll Genom Expressionsprofil Tests durchgeführt werden.

Gibberella zeae Ascosporen Produktion und Sammlung für Microarray-Experimente.

Die Verwüstung von Getreide durch Samen-Pilzresistenz hat zahlreiche Forschungsarbeiten zum besseren Verständnis Pflanze-Pathogen-Interaktionen dazu aufgefordert werden. Um Saatgut-Pilz-Interaktionen in einem Labor untersuchen, entwickelten wir eine robuste Methode zur Quantifizierung von Pilz-Reproduktion, Biomasse und Mykotoxinkontamination mit Kernel Bioassays.

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

Mitglieder der Gattung Burkholderia sind Erreger von klinischer Bedeutung. Wir beschreiben ein Verfahren zur bakteriellen Gesamtproteinextraktion unter Verwendung mechanischer Aufbruch-und 2-D-Gelelektrophorese für nachfolgende Proteomanalyse.

Gesamtproteinextraktion und 2-D Gelelektrophorese-Methoden für<em&gt; Burkholderia</em&gt; Arten

Wir zeigen, ein Verfahren zur Analyse von Aflatoxinen und die Transgen-Expression in Erdnusskerne, die die RNA-Interferenz-Signale zum Dämpfen Aflatoxin-Synthesegene in dem Pilz Aspergillus flavus enthalten. RNAi-vermittelte Kontrolle von Mykotoxinen in Pflanzen ist bisher nicht berichtet worden.

RNAi-vermittelten Kontrolle der Aflatoxine in Peanut: Methode, um Mykotoxinproduktion und Transgenexpression in der Erdnuss-Analyse /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

Hier präsentieren wir ein Protokoll um Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in Maiskörner mit dem Ausdruck einer antimykotischen Proteins zu analysieren.  Mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung überwacht wir die Infektion und die Ausbreitung des Pilzes in Reife Kerne in Echtzeit. Der Test ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar.

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Ziel dieses Protokolls ist es, verschiedene Clostridium perfringens toxinotypes in lokal gekauften Lebensmitteln, insbesondere Epsilontoxin produzierenden Stammtypen B und D, ohne verwendung von anaeroben Kammern zu erkennen.

Anreicherung und Nachweis von Clostridium perfringens Toxinotypes in Einzelhandels-Lebensmittelproben

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um das Zusammenspiel zwischen Wirt und Erreger während der Infektion durch Massenspektrometrie-basierte Proteomik zu profilieren. Dieses Protokoll verwendet die etikettenfreie Quantifizierung, um Veränderungen in der Proteinmenge sowohl von Wirten (z. B. Makrophagen) als auch von Erregern (z. B. Cryptococcus neoformans) in einem einzigen Experiment zu messen.

Etikettenfreier quantitativer Proteomik-Workflow für Discovery-gesteuerte Host-Pathogen-Interaktionen

Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Proteinen vor, die von genomisch sequenzierten pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit eigens entwickelter Software produziert werden. Metastabile Proteinionen fragmentieren aufgrund der Asparaginsäurewirkung und diese Spezifität wird für die Proteinidentifizierung ausgenutzt.

Identifizierung antibakterieller Immunitätsproteine in Escherichia coli mittels MALDI-TOF-TOF-MS/MS und Top-Down-Proteomanalyse

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das auf dem Mehlwurm (Tenebrio molitor) -Ködersystem basiert, das zur Isolierung und Auswahl entomopathogener Pilze (EPF) aus Bodenproben verwendet wurde. Eine effektive Konidienzahlformel (ECN) wird verwendet, um einen hoch stresstoleranten EPF basierend auf physiologischen Eigenschaften für die mikrobielle Schädlingsbekämpfung im Feld auszuwählen.

Isolierung und Selektion entomopathogener Pilze aus Bodenproben und Bewertung der Pilzvirulenz gegen Schadinsekten

Entomopathogene Pilzkolonien werden aus tropischen Bodenproben mit Tenebrio-Ködern, Galleria-Ködern sowie selektivem künstlichem Medium, d. H. Kartoffeldextrose-Agar, das mit Hefeextrakt angereichert ist, das mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid (CTC-Medium) angereichert ist, isoliert.

Vergleich von Methoden zur Isolierung entomopathogener Pilze aus Bodenproben

Der vorliegende Artikel zielt darauf ab, detaillierte und adäquate Protokolle für die Isolierung pflanzenassoziierter endophytischer Pilze, die Langzeitkonservierung von Isolaten, die morphologische Charakterisierung und die Gesamt-DNA-Extraktion für die anschließende molekulare Identifizierung und metagenomische Analyse bereitzustellen.

Isolierung, Charakterisierung und Gesamt-DNA-Extraktion zur Identifizierung endophytischer Pilze in mykoheterotrophen Pflanzen

Erfahren Sie die standardisierte Proteinextraktion aus Fusarium spp. für Proteom-Studien. Dieses Protokoll minimiert experimentelle Verzerrungen bei der Toxin-Induktion und gewährleistet reproduzierbare Ergebnisse nach MIAPE-Richtlinien.

Toxin Induktions-und Protein-Extraktion aus Fusarium Spp. Kulturen für Proteom-Studien

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