Toxin Induktions-und Protein-Extraktion aus Fusarium Spp. Kulturen für Proteom-Studien

Dieses Video beschreibt ein Verfahren, das zur Induktion der Toxinsynese bei einigen Spezies verwendet wird, in diesem Fall für und das Protokoll für die Extraktion des gesamten Protes, das für proteomische Studien in unserem Labor verwendet wird. Die Dauer des Eingriffs beträgt 16 Tage, vier Tage für das Pilzwachstum, 10 Tage für die Toxinsynese und zwei Tage für die Proteinextraktion. Nach vier Tagen wachsen die Bienenvölker immer noch aktiv zum Rand der Platte hin.

Typisches oberirdisches Myzel wird gebildet und mit einer Steroidklinge unter der Lamina-Flow-Box durch sanftes Kratzen der Oberfläche der Platte gesammelt. Myzel wird in fünf kleine Stücke geschnitten und in einen frühen My-Kolben gegeben, der 25 Milliliter toxinauslösendes Medium enthält. Die Induktion von Toxinen ist effizienter als dunkler Staub.

Der Kolben ist mit Aluminium überzogen. Die Kulturen werden dann 10 Tage lang geschüttelt, 150 Umdrehungen pro Minute bei 25 Grad Celsius. Das Medium ist aus SAPH und enthält hochkonzentrierte S-Reihenlösung.

Bett zusammen mit Dunkelheit ist bekannt, um die Synese von Toxinen in Ria zu erleichtern. Das Myzel wird dann von der toxinhaltigen Flüssigkeit getrennt, indem auf dem MI-nahen Gewebe gefiltert wird. Die Flüssigkeit kann zur Messung des Toxingehalts verwendet werden, während das Myzel für die Proteinextraktion verwendet wird.

Um Medienverschleppungen zu vermeiden, wird meine Decke dreimal mit sterilem Wasser gewaschen. Das überschüssige Wasser sollte anschließend wie flüssiger Stickstoff zugegeben werden, und die Proben können bei minus 80° gelagert oder für die Proteinextraktion verwendet werden. Das Verfahren der Proteinextraktion basiert auf der Verwendung von SDS und TCA und besteht aus unterschiedlichen Lyseschritten.

Er wird eine Methode vorschlagen, die mehrere Operatoren umfasst, die durchgeführt werden sollen. Gleichzeitig mit der Extraktion biologischer Replikate führt ein anderer Bediener jedes Replikat durch. Bei dieser Prozedur werden Unterschiede in der Extraktionsprozedur berücksichtigt, die von verschiedenen Operatoren generiert werden können, die die Replikate verarbeiten.

Es sollte daher eine höhere Robustheit aufweisen, wenn biologische Replikate verglichen werden, da die Variable des Bedieners in das Replikat einbezogen wird. Gleichzeitig reduziert der Einsatz mehrerer Operatoren die Zeit der Verarbeitung. Die Probe wird in einem sterilen Mörser mit flüssigem Stickstoff gemahlen, bis das Myzel zu einem feinen Pulver wird.

Dieser Schritt ist entscheidend für die Qualität und Menge der Proteine. Myzel wird in 10 Milli Teflonröhrchen in einem Verhältnis von vier Zehnteln des Gesamtvolumens der Röhrchen gesammelt. Anschließend wird Lysepuffer mit SDS und verschiedenen Proteaseinhibitoren zugegeben.

Die Röhrchen werden dann geschüttelt, bis eine homogene Lösung entsteht. Dann werden die Proben 30 Minuten lang in der Codekammer geschüttelt, um weiter homogenisiert zu werden, Proben werden gekocht, um Zellwände und hydrophobe Proteine aufzulösen. Das Vorhandensein von SDS verhindert die Bildung von Oligomeren, die die Ausfällung von Proteinen abbrechen.

Ein Zentrifugationsschritt trennt drei Phasen. Die Proteine werden in der transparenten Lösung suspendiert, die in einem neuen Röhrchen auf Eis aufbewahrt wird. Die Palette wird dann für einen zweiten Schritt verwendet, wobei das Vortexen, Kochen und Zentrifugieren wiederholt wird.

Die Snat aus den beiden Lysesystemen werden kombiniert, um eine Fällung mit Gletscherfällung, Puffer mit Säuretonus, Trisaursäure und DTT durchzuführen. Die Proben werden dann über Nacht 16 Stunden bei minus 20 Grad Celsius gelagert, um Protein zu ermöglichen. Fällungsproteine befinden sich am Boden der Röhren, um die Ausfällung zu verbessern.

Die Röhrchen werden 45 Minuten lang bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert. Der Gaumen ist nun gut sichtbar. Überstände können mit einem Fünf-Milliliter-Rohrpad entsorgt werden.

TCA wird dann durch Zugabe von 25 Millilitern Gletscherwaschpuffer, der Aceton und DTT enthält, entfernt. Anschließend wird es gründlich und kräftig geschüttelt. Dann wird ein neuer Zentrifugationsschritt durchgeführt.

Der Proteingaumen schwimmt nun, so dass eine Spannung gezahlt werden sollte, um das Snat zu eliminieren. Ein zweiter Waschschritt wird durchgeführt, bei dem Waschen, Puffern, Schütteln und Zentrifugieren hinzugefügt werden. Das SUP-Mittel wird eliminiert und die Probe wird mit einem Speedbag getrocknet.

Wenn die Probe trocken ist, hat das Protein eine pulverartige Konsistenz. Zu lagern. Das Probenprotein sollte aus dem Röhrchen entnommen werden, um die elektrostatische Interferenz durch Kunststoff zu verringern.

Dabei kommt eine elektrostatische Pistole zum Einsatz und das Proteinpulver wird mit einem Metallspatel aufgefangen. Die Proteine werden dann direkt im Markierungspuffer suspendiert. Wird für 2D-Dash 30 Minuten bei 800 Gramm pro Minute verwendet.

Reicht zum Lösen aus. Das Protein, bevor Sie mit der teuren 2D-Strichmarkierung fortfahren. Die Proteinqualität wird auf der SDS-Seite One Dimension Gel getestet, wie zu sehen ist.

Das Fehlen signifikanter Abstriche am Rand einer Fahrspur deutet auf eine gute Qualität der Probe hin.