Name: In vitro Synthese von modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in menschlichen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Lernen Sie die in-vitro-Synthese modifizierter mRNA zur Proteinexpression in menschlichen Zellen. Diese Methode nutzt PCR-Amplifikation, in-vitro-Transkription und Lipidkomplex-Transfektion ohne Genomintegration.

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Dieses Projekt wurde von dem Europäischen Sozialfonds in Baden-Württemberg, Deutschland finanziert.

1. Augmentation von Plasmiden, die gewünschten Codier- DNA-Sequenzen (CDS) <ol><li> Vorwärmen SOC-Medium, das in der Transformationssatz enthalten ist, auf Raumtemperatur, und die LB-Agarplatten, die 100 ug / ml Ampicillin und 37 ° C. Äquilibrieren das Wasserbad auf 42 ° C. </li><li> Tauwetter ein Fläschchen von chemisch Komponente E. coli auf Eis. </li><li> In 1-5 ul der Plasmid (10 pg bis 100 ng), die die CDS in das Fläschchen aus chemisch Komponente E. coli und vorsichtig mischen. Die Zellen nicht mischen durch Pipettieren. Nach der Zugabe von Plasmiden, mischen durch Antippen des Rohres sanft. </li><li> Inkubieren der Mischung auf Eis für 30 min. </li><li> Hitzeschock der E. coli für 30 sec bei 42 ° C in einem Wasserbad ohne Schütteln. </li><li> Stellen Sie die Durchstechflasche auf Eis für 2 min. </li><li> In 250 ul vorgewärmtes SOC-Medium in den E. coli und schüttelt die Bakterien horizontal bei 300 rpm über 1 Stunde bei 37 ° C in einem bakteriellen Inkubator. </li><li><html> Verbreiten Sie 100 ul und 150 ul von Transformationsansatz auf vorgewärmten LB-Agar-Platten, invertieren die Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Nachdem Kolonien sichtbar werden, zu inokulieren eine einzelne Kolonie von jeder Platte in eine 15 ml-Kulturröhrchen mit 5 ml LB-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin. Über Nacht inkubieren bei 37 ° C mit Schütteln bei 300 rpm, bis die Kultur in der späten log-Phase oder stationären. </li><li> Für die langfristige Lagerung von transformierten E. coli, Pipette 75 ul 100% Glycerin in die Kryoröhrchen. In 225 ul der Bakterienkultur (gefroren Lager werden 25% Glycerin), gut mischen und speichern die Kryoröhrchen bei -80 ° C. </li><li> Isolierung der Plasmide, die die erforderlichen CDS mit einem Plasmid Purification Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bestimmen Sie die Plasmidkonzentration mit einem Spektralphotometer. </li><li> Bereiten Aliquots von 20 ul und im Kühlschrank bei -20 ° C für längere Zeit. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. Amplifikation von Plasmid-Einsätze und Hinzufügen von Poly T-Leitwerk durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) <ol><li> HINWEIS: Um die DNA-Matrize für die in vitro Transkription (IVT), der CDS von Interesse, hier eGFP wird mittels PCR amplifiziert zu erhalten. Gleichzeitig wird ein Poly-T-Schwanz 120 Thymidin (T) an dem Einsatz unter Verwendung eines Reverse-Primer mit einem T 120 Erweiterung hinzugefügt. Dadurch werden die erzeugten mRNAs erhalten einen Poly-A-Schwanz mit definierter Länge nach dem IVT. </li><li> PCR-Gemisch herzustellen, wie in Tabelle 1 aufgeführt. </li><li> Mischen Sie das Reaktionsgemisch gründlich. HINWEIS: PCR-Produkt kann in 4-5 IVT-Reaktionen verwendet werden. Um die DNA-Matrize für die IVT Menge zu erhöhen, kann Gesamtvolumen des PCR-Gemischs erhöht werden. Mehrere PCR-Röhrchen, die jeweils 100 &amp; mgr; l PCR-Gemisch verwendet werden, um eine ausreichende Ausbeute an PCR-Produkt zu erhalten. </li><li> Legen Sie die PCR-Röhrchen in einem Thermocycler und führen Sie die PCR unter Verwendung des PCR-Zyklusprotokoll (Tabelle 2). </li><li> Bereinigen Sie die PCR-Reaktion unter Verwendung eines PCR-Reinigungs-Kit nach Herstellerangaben isoliert und eluiert die DNA unter Verwendung von 20 &amp; mgr; l Nuklease-freies Wasser. </li><li> Messen der Konzentration der DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers. HINWEIS: Die DNA-Konzentration nachgewiesen ist ungefähr 300 &amp; mgr; g / ml. Daher sollte die erwartete Gesamtmenge ~ 6 &amp; mgr; g. Die Menge an DNA für andere Proteine ​​können in Abhängigkeit von der Länge der CDS unterscheiden, die Menge an Plasmid für die PCR, Annealingtemperatur von Primern und Zykluszahl verwendet. </li><li> Frieren Sie die DNA bei -20 ° C für eine lange Zeit oder verwenden Sie es direkt für IVT. </li></ol> 3. Kontroll Schritt: Qualität der PCR Produkt <ol><li> Überprüfen Sie die Qualität des PCR-Produkts durch DNA-Gelelektrophorese. </li><li> Mischen Sie die gewünschte Menge an Agarose mit 1x TBE in einem Kolben. Für eine 1% Agarosegel mit 0,5 g Agarose in 50 ml 1x TBE. </li><li> Mikrowellen, bis die Agarose aufgelöst. Lassen Sie es nicht zu kochen. Sicherzustellen, dass die Agarose vollständig in Lösung. </li><li> In 5 ul Nukleinsäure Gel Fleck auf 50 ml Agarose-Gel. </li><li> Gießen Sie das Gel in einem Agarose-Gel-Box, stellen Sie den Kamm, und warten Sie etwa 1 Stunde, bis das Gel verfestigt. </li><li> Nehmen Sie den Kamm und platzieren Sie das Gel Box in einem Gelträger. </li><li> Mix 2 ul (200 ng) 80-10,000 bp DNA-Leiter und 200 ng PCR-Produkt mit jeweils 2 &amp; mgr; l Ladepuffer 6x in einem Gesamtvolumen von 12 ul. </li><li> DNA-Proben vorsichtig in die Vertiefungen des Agarosegels geladen. </li><li> Mit 1x TBE als Laufpuffer, führen Sie das Agarose-Gel bei 100 V für 1 Stunde. </li><li> Visualisierung der DNA-Banden auf einem Abbildungssystem (2). </li></ol> 4. In vitro-Transkription (IVT) <ol><li> HINWEIS: Nach der PCR wurde die Plasmid-Inserts verstärkt und ein Poly-T-Schwanz angefügt. Während der IVT wird genetische Information von der DNA zur RNA transkribiert. Die erzeugte mRNA-Transkript wird verwendet, um Proteine ​​in Zellen zu erzeugen. </li><li> Reinigen Sie die Arbeitsfläche und Pipetten mit einem RNase decontamination Lösung. Verwenden PCR clean und steril Dual-Filterpipettenspitzen und häufig Handschuhe wechseln, um eine Kontamination zu minimieren Reaktionsmischungen mit RNasen. </li><li> Bereiten Sie die NTP / cap analoge Mischung, wie in Tabelle 3 beschrieben. </li><li> Mischen Sie die NTP / cap analoge Mischung gründlich durch Vortexen und kurz abzentrifugieren. </li><li> Montieren Sie das IVT Reaktionsgemisch wie in Tabelle 4 beschrieben. </li><li> Mischen Sie das IVT Reaktionsgemisch gründlich durch sanftes Auf- und Abpipettieren. Anschließend zentrifugieren Sie das PCR-Röhrchen kurz, um das Gemisch am Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 3 Stunden in einem Thermomixer. HINWEIS: Die optimale Inkubationszeit hängt von der Länge der Einsätze und transkriptionale Effizienz der gegebenen Vorlage. Für kurze Einsätze (&lt;500 nt), kann eine längere Inkubationszeit von Vorteil sein. Ein Zeitverlaufsexperiment durchgeführt, um die optimale Inkubationszeit für maximale Ausbeute zu bestimmen. Daher up IVT Reaktionen gesetzt, für example für 1, 2, 3, 4, 6 h und Inkubation über Nacht und bestimmen die mRNA Menge. Die Kinetik der in vitro-Transkription zur Erzeugung von eGFP mRNA ist in Abbildung 3 dargestellt. </li><li> Um die Vorlage DNA zu entfernen, fügen 1 ul DNase (2 U / ul) an die IVT Reaktionsgemisch, gut mischen und Inkubation 15 min bei 37 ° C. </li><li> Reinige das Reaktionsgemisch mit Hilfe eines RNA Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Eluieren die modifizierte mRNA aus dem Spin-Säule Membran zweimal mit 40 ul Nuklease-freies Wasser. HINWEIS: Die RNA-Konzentration nachgewiesen ist etwa 1500 &amp; mgr; g / ml. Daher sollte die erwartete Gesamtmenge ~ 120 &amp; mgr; g. Die Menge des synthetisierten mRNA für andere Proteine ​​können in Abhängigkeit von der Länge der CDS und der Menge des PCR-Produkts für die IVT unterscheiden. </li></ol> 5. Behandlung von gereinigten mRNA mit Antarctic Phosphatase <ol><li> HINWEIS: Der generierte mRNA wird mit Phosphatase behandelt, um 5 entfernen &#39;triPhosphate, die von RIG-I, um die Immunaktivierung erkannt und führen kann. Ferner verhindert die Phosphatase-Behandlung Wieder Zirkularisierung selbstLigaTionsReaktion. </li><li> In 9 ul 10x Antarctic Phosphatase Reaktionspuffer auf 79 ul gereinigte mRNA-Lösung. Anschließend fügen Sie 2 ul Antarctic Phosphatase (5 U / ul) und vorsichtig mischen die Probe. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Reinige das Reaktionsgemisch mit Hilfe eines RNA Purification Kit gemäß Herstellerangaben. Eluieren die modifizierte mRNA aus der Spinsäule Membran zweimal mit 50 &amp; mgr; l Nuklease-freies Wasser. </li><li> Messung der Konzentration der modifizierten mRNA unter Verwendung eines Spektrophotometers. Überprüfen Sie, ob das Verhältnis der Absorption bei 260 nm / 280 nm (A 260 / A 280) ist ≥ 1,8 und das Verhältnis von A 260 / A 230 ist 2,0, was Reinheit zeigt. HINWEIS: Die erwartete Gesamtrendite sollte etwa 90 ug werden, was sufficie istnt für ca. 36 mRNA Transfektionen. </li><li> Stellen Sie die Konzentration der mRNA bis 100 ng / ul durch Zugabe von Nuklease-freies Wasser. </li><li> Aliquot der modifizierten mRNA in Einweg Aliquots für Transfektionen und bei -80 ° C erforderlich. Vermeiden Sie mehrfaches Einfrieren und Auftauen. Richtig zubereitet und gelagert mRNA ist seit vielen Jahren stabil. Während der Arbeitszeit, immer das modifizierte mRNA auf Eis. </li></ol> 6. Steuer Schritt: Qualität synthetisierter Modifizierte mRNA <ol><li> Überprüfen Sie die Qualität der modifizierten mRNA durch RNA-Gelelektrophorese. </li><li> Mischen Sie die gewünschte Menge an Agarose mit 1x TBE in einem Kolben. Für eine 1% Agarosegel mit 0,5 g Agarose in 50 ml 1x TBE. </li><li> Mikrowellen, bis die Agarose aufgelöst. Lassen Sie es nicht zu kochen. Sicherzustellen, dass die Agarose vollständig in Lösung. </li><li> In 5 ul Nukleinsäure Gel Fleck auf 50 ml Agarose-Gel. </li><li> Gießen Sie das Gel in ein Agarose-Gel-Box, stellen Sie den Kamm, und warten Sie etwa 1 Stunde, bis das Gel solidified. </li><li> Nehmen Sie den Kamm und platzieren Sie das Gel Box in einem Gelträger. </li><li> Mix 3 &amp; mgr; l (3 &amp; mgr; g) von 0,5-10 kb RNA-Leiter und 200 ng der synthetisierten modifizierten mRNA mit jeweils 7 &amp; mgr; l Ladepuffer in einem Gesamtvolumen von 10 ul. Die Zusammensetzung des Ladepuffers ist in Tabelle 5 beschrieben. </li><li> Denaturieren der Leiter und die mRNA-Proben bei 70 ° C für 10 min. </li><li> Die Leiter und die mRNA-Proben auf dem 1% Agarosegel sorgfältig zu laden. </li><li> Führen Elektrophorese bei 100 V für 1 h mit 1x TBE als Laufpuffer. </li><li> Visualisieren Sie die Leiter und mRNA-Banden auf einem UV-Transilluminator und fotografieren mit einem Geldokumentationssystem (Abbildung 4). </li></ol> 7. Vorbereitung der Zellen für die Transfektion <ol><li> Platte 2 x10 5 Zellen (HEK293-Zellen) pro Vertiefung der Platte mit 12 Vertiefungen. </li><li> Die Zellen bei 37 ° C über Nacht inkubieren in einem Zellinkubator. HINWEIS: Am Tag der Transfektion wurden die Zellen sollten reac habenhed 80-90% Konfluenz. </li></ol> 8. Durchführen von mRNA Transfektion von Zellen <ol><li> Auftauen modifizierten mRNA. </li><li> Generieren Sie die Lipoplexe für die Transfektion. </li><li> Hinzufügen von 25 ul (2,5 ug) der modifizierten mRNA und 2 &amp; mgr; l kationisches Lipid Transfektionsreagenz bis 473 &amp; mgr; l Opti-MEM (Minimal Essential Medium) I Serummedium, das Transfektionsgemisch zur Transfektion eine Vertiefung einer 12-Well-Platte zu erzeugen, reduziert. Scale up die Volumina entsprechend der Anzahl von Brunnen zu transfizierenden. Als negative Kontrolle, bereiten eine Transfektion Gemisch ohne mRNA. </li><li> Mischen Sie die Komponenten vorsichtig durch Pipettieren. Inkubieren der Transfektion Mischung bei Raumtemperatur für 20 min bis Lipoplexe zur Transfektion zu erzeugen. HINWEIS: Die Transfektion Mischung enthält keine Antibiotika. So kümmern sich um die Sterilität zu gewährleisten, während der Handhabung Zellen. </li><li> Wash-Zellen mit 500 ul DPBS / well. </li><li> Gib 500 ul Transfektionsgemisch in eine Vertiefung einer 12-Well-plate. </li><li> Inkubieren der Zellen für 4 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Saugen Sie das Transfektionsmischung und 1 ml komplettes Zellkulturmedium zu den Zellen. </li><li> Inkubieren der Zellen für 24 h in der Zelle Inkubator. </li><li> Zuführen fluoreszenzmikroskopische Analyse mit einem Fluoreszenzmikroskop (Abbildung 5). ANMERKUNG: Um die Expression von anderen Proteinen in Zellen, die durch Transfektion mit anderen mRNA als eGFP kodierende mRNA hergestellt werden untersuchen, können die Zellen auf Deckgläsern gezüchtet werden. Dann wird die Transfektion durchgeführt werden kann und die Zellen können mit geeigneten Antikörpern gefärbt und durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. </li></ol> 9. Durchflusszytometrische Analysen der eGFP-Expression in Zellen <ol><li> Entfernen Zellkulturmedium aus den Vertiefungen und Waschen jeder Vertiefung mit 1 ml DPBS (ohne Calcium und Magnesium). Gib 500 &amp; mgr; l Trypsin / EDTA pro Vertiefung, um die Zellen von der Oberfläche der Zellkulturplatten zu lösen. Anschließend fügen Sie 500ul TNS pro Well Trypsin inaktivieren. </li><li> Zentrifugieren der abgelösten Zellen 5 min bei 300 × g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand so dass nur die Pellets. Zellpellet in 150 ul Zellfixierungslösung und übertragen Sie die Zellsuspension in eine Durchflusszytometrie Röhre. </li><li> Analyse des Prozentsatzes der eGFP-exprimierenden Zellen und die Fluoreszenzintensität unter Verwendung von Geo Mittelwert (geometrischer Mittelwert der Fluoreszenzintensität) (Figur 6). </li></ol> 10. Die Messung der Proteinexpression im Laufe der Zeit <ol><li> Zuführen mRNA-Transfektion von Zellen in 3 Vertiefungen einer Platte mit 12 Vertiefungen, wie in Schritt 8 beschrieben Zusätzlich inkubieren 3 Vertiefungen von HEK293-Zellen mit dem Transfektionsgemisch ohne Zugabe von mRNA. </li><li> Messen der Expression des eGFP 1, 2 und 3 Tage nach der Transfektion, die Dauer der Protein-Expression (Figur 7) zu bewerten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die mRNA-Therapie hat ein enormes Potenzial im Bereich der regenerativen Medizin, Behandlung von Krankheiten und Impfungen. In diesem Video zeigen wir die Herstellung einer stabilisierten, modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in den Zellen. Unter Verwendung dieses Protokolls kann andere gewünschte mRNA erzeugt werden. Die in vitro Synthese von modifizierten mRNA erlaubt die Transfektion von Zellen mit der gewünschten mRNA die Expression von Zielproteinen zu induzieren. Dadurch wird das gewünsc...

In Zellen, die Transkription von Messenger-RNA (mRNA) und die folgende Übersetzung der mRNA in die gewünschten Proteine ​​zu gewährleisten das reibungslose Funktionieren von Zellen. Angeborene oder erworbene genetische Störungen können zu einer unzureichenden und dysfunktionale Synthese von Proteinen führen und zu schweren Krankheiten. Somit ist ein neuer Therapieansatz, um die Produktion von fehlenden oder defekten Proteine ​​induzieren die exogene Lieferung von synthetischen modifizierten mRNA in Zellen, die für das gewünschte Protein. Dabei werden Zellen ausgelöst, um funktionelle Proteine, die sie normalerweise nicht produzieren oder wäre natürlich nicht nötig zu synthetisieren. Mit diesem Ansatz können genetische Erkrankungen, die durch Einführung von mRNA korrigiert werden, dass die für das defekte oder fehlende protein 1. Die mRNA-Therapie kann auch für die Impfung verwendet werden, um Protein-Antigene, die von Tumorzellen oder Pathogene exprimiert werden, zu synthetisieren sind. Dadurch kann Immunsystem des Wirts aktiviert werden, effektiv zu eliminieren oder zu verhindern, Tumorzellen InFEctions 2,3. Ferner ist in den letzten Jahren mRNA wurde erfolgreich verwendet, um induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) zu erzeugen. Zu diesem Zweck wurden Fibroblasten mit mRNAs transfiziert, um induzieren die Expression von Reprogrammierungsfaktoren 4-6 und sie in iPS-Zellen mit einem enormen Potenzial in der regenerativen Medizin zu konvertieren. Bisher wurde die Verwendung von herkömmlichen mRNA mit niedriger Stabilität und starke Immunogenität assoziiert. So wurden klinische Anwendungen der herkömmlichen mRNAs beschränkt. Aber der Austausch von Cytidin und Uridin durch 5-Methylcytidin und Pseudouridin in der mRNA-Moleküls durch Kariko und Kollegen gerendert mRNA-Molekülen in biologischen Flüssigkeiten stabil und drastisch reduziert Immunaktivierung 7-10, die nun ermöglicht die klinische Anwendbarkeit der modifizierten mRNA. Verwendung synthetisch hergestellte modifizierte mRNAs können gewünschte Gentranskripten vorübergehend in vivo 11 geliefert werdenoder in vitro, um die Proteinexpression zu induzieren. Die eingeführte mRNA unter physiologischen Bedingungen durch die zelluläre Translationsmaschinerie übersetzt. Aufgrund mangelnder Integration in das Wirtszellgenom Vergleich zu viralen Gentherapie-Vektoren, wird das Risiko einer Onkogenese verhindert 12,13. Somit wird die Therapie mit modifizierten Kunst mRNA besser klinische Akzeptanz in der Zukunft. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung der modifizierten mRNA (Figur 1), die Transfektion von Zellen mit mRNA und die Bewertung der Protein-Expression in transfizierten Zellen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Zellkultur</td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt</td><td>PAA</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>DPBS ohne Calcium und Magnesium&nbsp;</td><td>PAA</td><td>E15-002</td><td></td></tr><tr><td>0,04 % Trypsin / 0,03 % EDTA&nbsp;</td><td>Promocell</td><td>C-41020</td><td></td></tr><tr><td>TNS</td><td>Promocell</td><td>C-41120</td><td>Trypsin-Neutralisationslösung, 0,05 % Trypsin-Inhibitor in 0,1 % BSA</td></tr><tr><td>HEK-293 Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Verbrauchsmaterialien</td></tr><tr><td>Gewebekulturplatten, 12-Well&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflasche (75 cm2)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>DNase- und RNase-freie 1,5 ml sterile Mikrozentrifugenröhrchen&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.589</td><td>Safe-Lock, Biopur</td></tr><tr><td>15 ml konische Tuben&nbsp;</td><td>greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>PCR-saubere und sterile epT.I.P.S. Dualfilter-Pipettenspitzen&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>10 & micro; l: 022491202; 100 &Mikro; l: 022491237; 1.000 & Mikro; l: 022491253</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>greiner bio-one</td><td>122279-128</td><td>Cryo.s&nbsp;</td></tr><tr><td>14 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen für Bakterienkulturen</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Plasmidamplifikation und -reinigung</td></tr><tr><td>pcDNA 3.3_eGFP Plasmid&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>26822</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Top10 chemisch komponentiert Escherichia coli&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-10</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Wasser (Ampuwa)</td><td>Fresenius Kabi</td><td>1636071</td><td></td></tr><tr><td>LB medium (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td>25 g L-1 in sterilem Wasser auflösen.</td></tr><tr><td>LB-Agar (Luria/Miller)&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td>40 g L-1 in sterilem Wasser auflösen.</td></tr><tr><td>Ampicillin Fertige Lösung</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5354</td><td>100 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Bausatz&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27104<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">mRNA production</td></tr><tr><td>HotStar HiFidelity Polymerase Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Bausatz&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>5-Methylcytidin-5&akut;-triphosphat&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1014</td><td>5-Methyl-CTP</td></tr><tr><td>Pseudouridin-5&akut;-triphosphat&nbsp;</td><td>Trilink</td><td>N1019</td><td>Pseudo-UTP</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5&acute;)ppp(5&akut;)G-RNA-Kappenstruktur analog&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td>40 U/&micro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>2 U/&Mikro; l (aus dem MEGAscript T7 Kit)</td></tr><tr><td>Antarktische Phosphatase&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>MO289S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini-Bausatz&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap-Lösung&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Transfektion</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Kationisches Reagenz zur Lipidtransfektion</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduziertes Serum Medien</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td>Verbessertes minimales essentielles Medium (MEM), das eine Reduzierung der Supplementierung mit fötalem Rinderserum (FBS) ermöglicht&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Geliertes Nukleinsäure-Gel-Färben</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>10.000x in Wasser&nbsp;</td></tr><tr><td>peqGOLD Range Mix DNA-Leiter&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>25-2210<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Durchflusszytometrische Analysen</td></tr><tr><td>CellFIX (1x)</td><td>BD Biosciences</td><td>340181</td><td>10x Konzentrat&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Primer für Insert-Amplifikation und Poly (T) Tail PCR</td></tr><tr><td>Forward Primer (HPLC-Qualität) 10 & Mikro; M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&akut;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3&akut;</td></tr><tr><td>Reverse Primer (HPLC-Qualität) 10 & Mikro; M</td><td>Ella Biotech</td><td></td><td>5&akut;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3&akut;</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Cell Inkubator</td><td>Binder</td><td></td><td>CO2 (5%) und O2 (20%)&nbsp;</td></tr><tr><td>CASY Zellzähler&nbsp;</td><td>Sch&auml; rfe System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Werkbank&nbsp;</td><td>BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bakterien-Inkubator&nbsp;</td><td>Incutec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScanDrop Spektralphotometer&nbsp;</td><td>Analytischer Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>peqlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Gerät für die Elektrophorese&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Dokumentationssystem&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACScan System&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phasenkontrast-Mikroskop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro synthese von modifizierten mrna zur induktion der proteinexpression in menschlichen zellen

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

Die exogene Lieferung von Codierungs synthetischen Boten-RNA (mRNA) für die Induktion der Proteinsynthese in gewünschten Zellen hat ein enormes Potenzial in den Bereichen der regenerativen Medizin, Grund Zellbiologie, Behandlung von Krankheiten und Reprogrammierung von Zellen. Hier beschreiben wir eine Schritt für Schritt das für die Erzeugung der modifizierten mRNA mit verringerter Immunaktivierungspotential und eine erhöhte Stabilität, die Qualitätskontrolle des hergestellten mRNA, die Transfektion von Zellen mit mRNA und Verifizierung der Protein-Expression induziert durch Durchflusszytometrie. Bis zu 3 Tage nach einer einzigen Transfektion mit eGFP mRNA, die transfizierten HEK293 Zellen produzieren eGFP. In diesem Video-Artikel wird die Synthese von eGFP mRNA als ein Beispiel beschrieben. Jedoch kann das Verfahren für die Herstellung von anderen gewünschten mRNA angewendet werden. Verwendung des synthetischen modifizierten mRNA können Zellen induziert werden, um vorübergehend die gewünschten Proteine, die sie normalerweise nicht ausdrücken würde auszudrücken.

Mit einem pcDNA 3.3 Plasmid, das die CDS der eGFP wurde die Synthese von modifizierten eGFP mRNA hergestellt (Abbildung 1). Nach Einsatz von PCR-Amplifikation und Poly-T-Tailing ist eine klare Bande mit einer Länge von etwa 1.100 bp nachgewiesen (Abbildung 2). Erhöhen der IVT Zeit verstärkte die Ausbeute an mRNA (Figur 3). Nach der IVT wurde ein klares mRNA-Bande mit einer Länge von etwa 1.100 bp nachgewiesen, die auf die Länge des eGFP mRNA produziert werden (F...

In diesem Video-Artikel beschreiben wir die in vitro Synthese von modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in den Zellen.

In vitro Synthese von modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in menschlichen Zellen

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die in vitro Synthese von modifizierter mRNA zur Induktion der Proteinexpression in Zellen. Dies wird erreicht, indem zuerst das Plasmid-Insert oder die kodierende DNA-Sequenz amplifiziert und ein Poly-T-Schwanz aus 120 Thymidin unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion hinzugefügt wird. Der zweite Schritt ist die in vitro Transkription der erzeugten DNA in mRNA mit Polyadenin-Schwänzen.Als nächstes wird die Matrizen-DNA durch D'S-Behandlung des in vitro Transkriptionsreaktionsgemisches entfernt. Der letzte Schritt ist die antarktische Phosphatase-Behandlung der produzierten mRNA, um fünf Hauptphosphate zu entfernen. Letztendlich werden die Zellen durch die erzeugte mRNA, die Lipidkomplexe, transfiziert.Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie werden verwendet, um die Synthese von verstärktem GFP in Zellen zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der viralen Transfektion ist die fehlende Integration in das Genom der Wirtszelle, wodurch das Risiko einer Onkogenese verhindert wird. Diese Methode kann helfen, fehlende oder defekte Proteine in Zellen herzustellen und kann zur Impfung und Behan

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In der Post-Genom-Ära menschlicher, ist die Verfügbarkeit von rekombinanten Proteinen in nativer Konformation darauf an, strukturelle, funktionelle und therapeutische Forschung und Entwicklung. Hier beschreiben wir ein Test-und Proteomik-Expressionssystem in humanen embryonalen Nierenzellen 293T-Zellen, die verwendet werden, um eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen hergestellt werden können.

Eine bequeme und allgemein Expression Plattform für die Produktion von sekretierten Proteinen aus menschlichen Zellen

Die Expression rekombinanter Proteine durch Säugetiersysteme wird zu einer attraktiven Methode zur Herstellung von Proteinkomplexen für die Strukturbiologie. Hier stellen wir ein einfaches, aber hocheffizientes Expressionssystem vor, bei dem suspensionsgezüchtete Säugetierzellen zur Aufreinigung von Proteinkomplexen für Strukturstudien verwendet werden.

Expression rekombinanter Proteine ​​für Strukturbiologie in HEK 293F Suspensionszellen: eine neue und Barriere Ansatz

Die Produktion von eukaryotischen Proteinen im Labormaßstab mit entsprechender posttranslationaler Modifikation stellt ein erhebliches Hindernis dar. Hier ist ein robustes Protokoll mit schneller Etablierung und Durchlaufzeit für die Proteinexpression unter Verwendung eines Säugetier-Expressionssystems. Dieses System unterstützt die selektive Aminosäuremarkierung, die selektive Markierung von Proteinen und die kleinmolekulare Modulatoren der Glykanzusammensetzung.

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Generation der kationischen Nanoliposomes, basiert auf der Methode der trocken-Film und eignet sich für die sichere und effiziente Bereitstellung von in-vitro- Boten-RNA transkribiert.

Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA

Hier beschreiben wir eine klinisch relevante, hohem Wirkungsgrad, Feeder-free Methode, um menschliche primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen mit modifizierten mRNAs codieren Neuprogrammierung Faktoren neu zu programmieren und Reife MicroRNA-367/302 imitiert. Ebenfalls enthalten sind Methoden zur Beurteilung der Neuprogrammierung Effizienz klonalen iPSC Kolonien zu erweitern, und Ausdruck der Pluripotenz Markierung TRA-1-60 zu bestätigen.

RNA-basierten Reprogrammierung von menschlichen primäre Fibroblasten in induzierte pluripotente Stammzellen

Detaillierte Protokolle für beide in vitro und in-Cell selektive 2'-Hydroxyl-Acylation von Primer Extension (Form) Experimente zur Bestimmung der sekundären Struktur der Pre-mRNA-Sequenzen von Interesse im Beisein einer RNA-targeting niedermolekularer analysiert werden in diesem Artikel vorgestellt.

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

Makrophagen, insbesondere primäre Makrophagen, sind eine Herausforderung zu transfetieren, da sie sich auf die Detektion von Molekülen ohne Selbstherkunft spezialisieren. Wir beschreiben ein Protokoll, das eine hocheffiziente Transfektion von primären Makrophagen mit mRNA ermöglicht, die aus DNA-Vorlagen wie Plasmiden generiert werden.

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Dieses Protokoll beschreibt die Methode, Materialien, Ausrüstung und Schritte zur Bottom-up-Vorbereitung von RNA und Protein produzierenden synthetischen Zellen. Das innere wässrige Fach der synthetischen Zellen enthielt das in einer Lipid-Bilayer (d. h. stabile Liposomen) eingekapselte S30-Bakterienlysat, das mit einem Wasser-in-Öl-Emulsionstransferverfahren verkapselt war.

Herstellung von Proteinproduktion synthetischer Zellen mit zellfreien bakteriellen Extrakten, Liposomen und Emulsionstransfer

Ein selbstorganisiertes Peptid-Poloxamin-Nanopartikel (PP-sNp) wird unter Verwendung einer mikrofluidischen Mischvorrichtung entwickelt, um in vitro transkribierte Boten-RNA zu verkapseln und zu liefern. Die beschriebene mRNA/PP-sNp konnte kultivierte Zellen in vitro effizient transfizieren.

Effiziente Transfektion von in vitro transkribierter mRNA in kultivierten Zellen mit Peptid-Poloxamin-Nanopartikeln

Dieses Protokoll beschreibt das System der zellfreien Proteinsynthese (CFPS), das beim Aufbau synthetischer Zellen verwendet wird. Es skizziert Schlüsselphasen mit repräsentativen Ergebnissen in verschiedenen Mikrokompartimenten. Das Protokoll zielt darauf ab, Best Practices für verschiedene Labore in der synthetischen Zellgemeinschaft zu etablieren und den Fortschritt in der Entwicklung synthetischer Zellen voranzutreiben.

Zellfreies Proteinsynthesesystem für den Aufbau synthetischer Zellen

Lernen Sie die in-vitro-Synthese modifizierter mRNA zur Proteinexpression in menschlichen Zellen. Diese Methode nutzt PCR-Amplifikation, in-vitro-Transkription und Lipidkomplex-Transfektion ohne Genomintegration.

In vitro Synthese von modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in menschlichen Zellen

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