In vitro Synthese von modifizierten mRNA zur Induktion der Proteinexpression in menschlichen Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die in vitro Synthese von modifizierter mRNA zur Induktion der Proteinexpression in Zellen. Dies wird erreicht, indem zuerst das Plasmid-Insert oder die kodierende DNA-Sequenz amplifiziert und ein Poly-T-Schwanz aus 120 Thymidin unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion hinzugefügt wird. Der zweite Schritt ist die in vitro Transkription der erzeugten DNA in mRNA mit Polyadenin-Schwänzen.

Als nächstes wird die Matrizen-DNA durch D'S-Behandlung des in vitro Transkriptionsreaktionsgemisches entfernt. Der letzte Schritt ist die antarktische Phosphatase-Behandlung der produzierten mRNA, um fünf Hauptphosphate zu entfernen. Letztendlich werden die Zellen durch die erzeugte mRNA, die Lipidkomplexe, transfiziert.

Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie werden verwendet, um die Synthese von verstärktem GFP in Zellen zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der viralen Transfektion ist die fehlende Integration in das Genom der Wirtszelle, wodurch das Risiko einer Onkogenese verhindert wird. Diese Methode kann helfen, fehlende oder defekte Proteine in Zellen herzustellen und kann zur Impfung und Behandlung von genetischen Störungen eingesetzt werden.

Und im Bereich der regenerativen Medizin wird Steinle, ein Doktorand aus meinem Labor, das Verfahren demonstrieren. Vor Beginn dieses Verfahrens wurden die Plasmide, die die erforderlichen kodierenden DNA-Sequenzen oder CDS enthalten, in E. coli amplifiziert und isoliert, wie im Protokolltext beschrieben. In diesem Beispiel ist das CDS von Interesse ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein oder EGFP, um das CDS von EGFP gleichzeitig zu amplifizieren und um ein Polydetail zu erweitern.

Bereiten Sie eine PCR-Mischung vor, wie im Protokolltext beschrieben. Legen Sie das PCR-Röhrchen in einen Thermocycler und führen Sie das PCR-Cycling-Protokoll aus, das im Protokolltext beschrieben ist. Wenn die PCR-Reaktion abgeschlossen ist, reinigen Sie die PCR-Reaktion mit einem handelsüblichen PCR-Aufreinigungskit und verdünnen Sie die DNA mit 20 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser.

Um die Qualität des PCR-Produkts zu überprüfen, führen Sie eine DNA-Gelelektrophorese durch und visualisieren Sie die DNA-Banden auf einem Bildgebungssystem. Eine klare DNA-Bande mit einer Länge von etwa 1.100 Basenpaaren sollte während der In-vitro-Transkription oder IVT nachgewiesen werden. Die zuvor erzeugte DNA wird in mRNA transkribiert.

Bereiten Sie die analoge Mischung der NTP-Kappe vor, wie hier gezeigt. Mischen Sie die analoge Mischung der NTP-Kappe gründlich durch Vortexen. Dann schleudern Sie es herunter Montieren Sie kurz das IVT-Reaktionsgemisch wie in dieser Tabelle beschrieben.

Mischen Sie das IVT-Reaktionsgemisch gründlich durch, indem Sie es vorsichtig auf und ab pipettieren. Zentrifugieren Sie dann das PCR-Röhrchen kurz, um die Mischung am Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren Sie das IVT-Reaktionsgemisch bei 37 Grad Celsius für drei Stunden in einem Thermomischer.

Entfernen Sie nach drei Stunden die Matrizen-DNA, indem Sie der IVT-Reaktionsmischung einen Mikroliter DNAs hinzufügen. Gut mischen und 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Reinigen Sie das Reaktionsgemisch mit einem RNA-Aufreinigungskit und verdünnen Sie das modifizierte MR NA von der Spin-Säulenmembran zweimal mit 40 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser, die durch IVT erzeugte modifizierte mRNA muss mit Phosphatase behandelt werden, um fünf erstklassige Triphosphate zu entfernen, was zu einer Immunaktivierung führen kann.

Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie neun Mikroliter 10 x antarktischen Phosphatase-Reaktionspuffer zu 79 Mikrolitern einer gereinigten mRNA-Lösung hinzu. Fügen Sie anschließend zwei Mikroliter antarktische Phosphatase hinzu und mischen Sie die Probe vorsichtig. Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Nach 30 Minuten reinigen Sie das Reaktionsgemisch mit einem RNA-Aufreinigungskit und verdünnen die modifizierte mRNA von der Spin-Säulenmembran zweimal mit 50 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser. Nachdem Sie die Konzentration der modifizierten mRNA gemessen haben, stellen Sie die Konzentration auf 100 Nanogramm pro Mikroliter ein, indem Sie nukleasefreies Wasser hinzufügen. Überprüfen Sie die Qualität der synthetisierten modifizierten mRNA durch RNA-Gelelektrophorese und visualisieren Sie die Leiter und mRNA-Verbote auf einem UV-Trans-Illuminator.

Es sollte eine klare mRNA-Bande mit einer Länge von etwa 1.100 Basenpaaren nachgewiesen werden. Bereiten Sie die HEC 2 9 3 Zellen für die Transfektion mit der synthetisierten modifizierten mRNA vor, indem Sie sie zweimal plattieren. Zentrieren Sie die fünf Zellen pro Well einer 12-Well-Platte, inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Zellinkubator. Am nächsten Tag sollte die Zelle eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht haben.

Generieren Sie den Lipoplexus für die Transfektion. Bereiten Sie genügend Transfektionsmischung für alle zu transfizierenden Vertiefungen vor: Jede Vertiefung einer 12-Well-Platte erfordert 2,5 Mikrogramm modifizierte mRNA, zwei Mikroliter Lipidtransfektionsreagenz und 473 Mikroliter opt eins. Reduzieren Sie das Serummedium.

Mischen Sie die Komponenten vorsichtig durch Pipettieren als Negativkontrolle. Bereiten Sie eine Transfektionsmischung ohne Mr.NA vor und inkubieren Sie die Transfektionsmischungen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, um Lipoplexe zu erzeugen. Zur Transfektion.

Waschen Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern DPBS pro. Nun, geben Sie 500 Mikroliter Transfektionsmischung in jede Vertiefung der 12-Well-Platte, inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid nach vier Stunden, aspirieren Sie die Transfektionsmischung und fügen Sie einen Milliliter der vollständigen Zellkultur hinzu. Medium zu den Zellen in jeder Vertiefung.

Inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden im Zellinkubator. Führen Sie anschließend eine fluoreszenzmikroskopische Analyse der Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop durch, um die Zellen für die Durchflusszytometrie vorzubereiten. Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus den Vertiefungen und waschen Sie jede Vertiefung mit einem DPBS ohne Kalzium und Magnesium.

Fügen Sie 500 Mikroliter TRIPSIN EDTA pro Vertiefung hinzu, um die Zellen von der Oberfläche der Zellkulturplatten zu lösen. Fügen Sie anschließend 500 Mikroliter Trypsin-Neutralisationslösung pro Vertiefung hinzu, um die abgelösten Zellen zu inaktivieren, zentrifugieren Sie die abgelösten Zellen fünf Minuten lang bei 300-facher G-Raumtemperatur. Nach der Entfernung des Supinats Reese wird der Zellgaumen in 150 Mikrolitern Zellfixierungslösung suspendiert und die Zellsuspension in ein Durchflusszytometrieröhrchen überführt.

Analysieren Sie den Prozentsatz der EGFP-exprimierenden Zellen und die Fluoreszenzintensität unter Verwendung des geometrischen Mittels der Fluoreszenzintensität. Die Proteinexpression über die Zeit wird auch durch durchflusszytometrische Analyse der EGFP-exprimierenden Zellen ein, zwei und drei Tage nach der Transfektion bewertet. Wie im Protokolltext beschrieben, wurde die Funktionalität der generierten EGFP-mRNA durch Transfektion von HEC 2 9 3-Zellen getestet. Die Produktion von EGFP in den Zellen wurde 24 Stunden nach der Transfektion mittels Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen.

Hier wird ein Gesichtskontrastbild der Zellen neben einem Fluoreszenzbild der Zellen gezeigt. Die EGFP-Expression in den Zellen wurde ebenfalls 24 Stunden nach der Transfektion durchflusszytometrisch nachgewiesen. Die rosa Linie stellt Zellen ohne mRNA, Transfektion dar, und die blaue Linie stellt EGFP-positive Zellen dar.

Nach EGFP-mRNA-Transfektion waren 93,91 % aller gemessenen Zellen positiv, und das geometrische Mittel der Fluoreszenzintensität betrug 720,16. Die Dauer der Proteinexpression in den HC 2 93-Zellen wurde durch Messung der EGFP-Expression ein, zwei und drei Tage nach der mRNA untersucht. Die Transfektionsproteinexpression war in den Zellen 24 Stunden nach der Transfektion am höchsten.

Die Menge wurde an jedem folgenden Tag um das 1,6-fache reduziert, aber auch nach drei Tagen enthielten die Zellen EGFP Once mastered. Diese Technik kann in zwei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie stabilisierte modifizierte MRNA für die Induktion der gewünschten Proteinexpression in Zellen hergestellt werden kann.