Electron Cryotomography von Bakterienzellen

In diesem Video werden 3D-Bilder von Bakterienzellen in nahezu nativen Zuständen mit molekularer Auflösung mittels Elektronen-Kryotomographie erzeugt. Dies wird durch das erste Taucheinfrieren intakter Zellen oder alternativ durch das Einfrieren unter hohem Druck und das Kryoschneiden der Zellpellets erreicht. Eine Reihe von M-Projektionsbildern wird aufgenommen und verwendet, um eine 3D-Rekonstruktion oder Tom Graham zu erzeugen, die segmentiert und weiter computergestützt analysiert wird.

Hallo, ich bin Grant Jensen von der Abteilung für Biologie am Caltech, und hier ist Sonya Chen, die unsere Präsentation organisiert hat. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie eine Elektronen-Kryo-Tomographie von Bakterienzellen durchführen können. Normalerweise würde eine einzelne Person das gesamte Verfahren durchführen, aber da unsere Protokolle durch gemeinsame Erfahrung entwickelt wurden, beziehen wir alle ein, die derzeit im Labor arbeiten.

Neben Sonya und mir sind auf dem Video auch Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, Mark Rodinsky und Jen zu sehen. Sie und andere Labormitglieder produzierten die Computer-Screenshots und halfen bei der Erstellung des begleitenden schriftlichen Protokolls, darunter Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova und Dylan Morris. Ariana beginnt damit, Ihnen zu zeigen, wie wir Bakterienzellen einfrieren.

Bei dünnen Bakterienzellen wird eine Suspension intakter Zellen über ein EM-Gitter eingefroren. Hier wird der Prozess mit einem handelsüblichen automatischen Tauchfroster demonstriert: Beginnen Sie mit der Untersuchung der Bakterienkulturen, um sicherzustellen, dass sie frei von Verunreinigungen sind, und entladen Sie bei entsprechender Konfluenz oder Konzentration das kohlenstoffbeschichtete EM-Gitter für zwei bis vier Minuten. Mischen Sie anschließend 100 Mikroliter kolloidale Goldlösung mit 25 Mikrolitern einer 5%igen BSA-Lösung.

Die Mischung bei 18.000 g 15 Minuten lang zentrifugieren. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und suspendieren Sie das Goldpellet wieder. Legen Sie das EM-Gitter in 20 Mikroliter Zelllösung bei 100 % Luftfeuchtigkeit in den Vitra-Bot.

Geben Sie dann vier Mikroliter des Zellgemisches auf das glühentladene EM-Gitter. Das Gitter wird automatisch von beiden Seiten mit Filterpapier abgetupft, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und dann schnell in ein flüssiges Gemisch aus Ethan und Propan getaucht, das mit flüssigem Stickstoff gekühlt wird. Entfernen Sie das Gitter vorsichtig aus dem Ethan-Propan-Gemisch und geben Sie es schnell in eine Gitterlagerbox, die unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt wird. Bei dickeren Zellen verhindert das Einfrieren unter hohem Druck die Kristallisation von Eis.

Nachfolgende Kryosektionen machen die Proben dünn genug für sie. Die Bildgebung beginnt mit der Zentrifugation von 15 Millilitern Zellen bei 1000 U/min für drei Minuten. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand entfernt, 0,5 Milliliter des restlichen Kulturpellets mit 0,5 Millilitern 20 %igem Dextrin-Kryoprotektivum gemischt.

Zentrifugieren Sie dann erneut bei 13.000 U/min für 15 Sekunden. Nachdem die Zellen pelletiert wurden, entfernen Sie die überstehende Pipette 0,1 Milliliter der Super-Pellet-Paste in eine heißversiegelte Mikropipettenspitze, die bereits 0,2 Milliliter 20 % Dextrin-Kryoprotektiv-Zentrifuge enthält. Die Mischung in der Mikropipettenspitze bei 13.000 RBM für 30 Sekunden.

Nach dem Schleudern den Überstand entfernen. An der versiegelten Spitze ist ein fünf bis 10 Mikroliter schweres Pellet zu sehen. Übertragen Sie die Paste auf eine halbe Kuppel eines teflonbeschichteten gewölbten Schrötchens aus Messing, das bereits im Halterungsarm des Hochdruck-Gefrierschranks montiert ist, und versiegeln Sie es dann mit dem flachen Partnerhut aus Messing.

Setzen Sie dann umgehend die Armbaugruppe in den vorbereiteten Hochdruckgefrierschrank ein. Bei einem Druck von 2100 bar wird die kombinierte Messing-Planche-Einheit, in der sich die Zellen befinden, durch einen Strahl aus flüssigem Hochdruckstickstoff schnell gekühlt. Nachdem die Zellen abgekühlt sind, entfernen Sie schnell die Armbaugruppe und tauchen Sie sie schnell in ein Bad mit flüssigem Stickstoff, um eine Erwärmung der Planchette zu verhindern.

Übertragen Sie dann die Planchette in ein vorgekühltes Kryo-Mikrotom-Schraubstock-ähnliches Futter, das sicher in der Kryo-Mikrotomkammer montiert ist, um die gut gefrorene Zellkuppel für das Schneiden freizulegen. Die beiden Messing-Planchen werden unter flüssigem Stickstoff vorsichtig getrennt. Eine perfekt gefrorene Zellkuppel sieht glasig aus und ist frei von Rissen und Eiskeimrissen.

Mit dem Kryomikrotom formen Sie den äußeren Kuppelbereich auf weniger als 0,2 Quadratmillimeter mit dem Diamant-Trimmwerkzeug mit einer schnellen Schnittgeschwindigkeit und einer Tiefe von etwa 200 Mikrometern mit antistatischem Spray, das auf das Messer mit niedrigem Winkel und die Kupferstützgitter gerichtet ist. Schieben Sie das Diamantmesser in unmittelbarer Nähe mit einer Schnittgeschwindigkeit von etwa 0,4 Millimetern pro Sekunde und einem schmalen Schneidfenster vorsichtig auf die polierte Blockfläche vor. Beginnen Sie mit dem Schneiden von 50 bis 350 Nanometer dicken Scheiben.

Manövrieren Sie einen feinen Wimpernapplikator, um die ersten Abschnitte zu verfangen, schieben Sie die Messerkante der Diamanten mit niedrigem Winkel ab und stützen und führen Sie die Bänder der Abschnitte über die Kupfergitterstütze. Sobald das Gitter geladen ist, verwenden Sie eine abgekühlte Sonde aus poliertem Silber, um die Farbbänder fest zu drücken. Lagern Sie die Gitter in den Gitterboxen in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Trockentransporter, bis das Mikroskop fertig ist.

Die Bakterienzellen auf dem Gitter können mit einem Kryo-Lichtmikroskop abgebildet werden. Hier wird ein speziell angefertigtes inverses Nikon-Mikroskop, TIB mit modifiziertem FEI-Kryotisch verwendet. Laden Sie die Gitter in Kartuschen an der Kryostation und befestigen Sie sie mit den Kupferclipringen, dann legen Sie die Kartusche zum Umfüllen in ein Röhrchen mit flüssigem Stickstoff

Legen Sie bis zu zwei Kartuschen in die vorgekühlte Kryostufe und schieben Sie das Gitter in das Sichtfenster. Senken Sie dann die Kondensorlinse ab und fokussieren Sie die Objektivlinse auf das Gitter. Suchen Sie die Zellen und nehmen Sie Bilder auf.

Für korrelierte LM- und EM-Studien. Das Gitter wird um den Bereich der Zellen herum abgetastet, um die Zellen später in em zu lokalisieren. Nachdem Sie das Gitter abgebildet haben, setzen Sie die Kartusche wieder in das Röhrchen ein und halten Sie das Röhrchen im flüssigen Stickstoff, bis es bereit ist, in EM abgebildet zu werden, um eine 3D-TOM der Bakterienzelle zu erhalten.

Eine Reihe von Projektionsbildern wird aufgenommen, während die Probe schrittweise entlang eines oder zwei Es im Kryo-TEM gekippt wird, hier wird das Verfahren unter Verwendung von Legon mit einem Kryo-T-E-M-F-E-I-T-F 30 polares Laden von bis zu sechs Kartuschen in einen Multi-Selection-Halter auf der Kryo-Station demonstriert. Verbinden Sie es dann mit der TF 30 Polar Select one Patrone und setzen Sie sie in die EM-Säule ein. Startlegende in der Client-Software auf dem EM-Computer.

Geben Sie die Bildbedingungen für die Legende in der Sitzung ein. Wählen Sie Ziele auf Bildern ab der niedrigsten Vergrößerung aus und leiten Sie sie zum nächsten Schritt mit höherer Vergrößerung weiter. Stellen Sie dann alle Ziele für die Erfassung der Neigungsreihen in die Warteschlange und senden Sie sie alle an den letzten Tomographieschritt.

Erfassen Sie eine Reihe von Bildern. Die Probe wird im Kryo-TEM schrittweise um eine oder zwei Achsen gekippt. Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, laden Sie die fertige Kippserie zur Rekonstruktion auf eine lokale Workstation herunter.

Tomo Grahams der Bakterienzellen werden mit einer speziellen Software berechnet. Das Programm Raptor wird verwendet, um Toms automatisch zu rekonstruieren, und e tomo kann verwendet werden, um dies halbautomatisch zu tun. Überprüfen Sie die Neigungsserie mit dem 3D-Mod-Viewer von Im MOD und verwerfen Sie alle, die aufgrund von Tracking- oder anderen Fehlern wahrscheinlich keine Fehler verursachen.

Ein guter Tommo Raptor wird verteilt auf die Linux-Rechner im Labor mit den Grundeinstellungen laufen lassen. Je nach Größe der Datei dauert es 20 Minuten bis zwei Stunden, um den Tomographen zu generieren. Wenn Raptor versagt oder ein Untersucher sicherstellen möchte, dass die Rekonstruktion optimal ist, kann EMO verwendet werden, um die Bilder sorgfältig von Hand auszurichten.

Befolgen Sie die Schritte der einzelnen Registerkarten in der e tomo-GUI, um den Tom Graham aus der Tilt-Serie zu rekonstruieren. Wir verwenden eine webbasierte hauseigene Datenbank, um die Filialsuche zu organisieren und die tomographischen Daten zu verteilen. Die Hauptbrowserseite zeigt ein Miniaturbild und einen vorgestellten YouTube-ähnlichen Film.

Für jeden Tomo Graham. Nachdem die Tommo, Grahams erhalten wurden, können einzelne Merkmale segmentiert werden, um ihre Formen zu visualisieren. Bei der 3D-Segmentierung versteht man den Prozess, bei dem jedes Bild eines bestimmten Bereichs oder Materials einem bestimmten Bereich oder Material zugewiesen wird.

Hier wird mit einer Spiegelsoftware ein Oberflächenmodell generiert, in dem jeder Bereich mit einer anderen Farbe dargestellt und in 3D-Filmen und Animationen des Tomos betrachtet wird. Grahams können erstellt werden, um Projekte zusammenzufassen und Ergebnisse in 3D-Grafiken zu veranschaulichen. Vertretung. Software wie Amira oder Kymera können verwendet werden, um die einzelnen Standbilder des Films und der Werbung zu rendern.

Filmbearbeitungssoftware wie Adobe Premier kann verwendet werden, um die kommerzielle Filmsoftware zu bearbeiten. Maya wird verwendet, um die Animation zu generieren. Es kann die Oberflächen von Amira übernehmen, Keyframes erstellen und in einen Film rendern.

Hier wird eine repräsentative Neigungsreihe von Ganzzelldaten für den Spiro Treponema Promesa gezeigt, gefolgt von einer Schicht-für-Schicht-Ansicht des rekonstruierten Tom Agram. Die Segmentierung der T-Promesa-Zelle unterscheidet ihre äußere Membran, ihre innere Membran und ihre Oberflächenstrukturen, einschließlich der Oberflächenschalen und der Oberflächenhakenarkade. Die Bakterien sind Flagellen und ularer Motor, periplasmatischer Kegel und Pillai.

Dieses mechanische Modell zeigt, wie die Spirochäte Treponema Promesa schwimmt und der innere Zylinder oder Kern von einer Außenhülle umschlossen ist. Die Geißeln bewegen sich wie Farbrollen zwischen dem inneren Zylinder und der äußeren Hülle. Wenn sich die Geißeln drehen, dreht sich der innere Zylinder innerhalb der Außenhülle gegenläufig.

In einer nicht viskosen Umgebung dreht sich die Zelle nutzlos, aber in viskosen Umgebungen, wie sie in der Natur vorkommen, widerstehen äußere Fasern oder andere Objekte der Drehung der äußeren Hülle, was die Drehung des inneren Zylinders beschleunigt und Materialien liefert, gegen die die Zelle drücken kann, während sie sich vorwärts bohrt. Hier sind echte T-Promeus-Zellen zu sehen, wie sie durch ein Lichtmikroskop betrachtet wurden. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man eine Elektronen-Kryo-Tomographie von Bakterienzellen durchführt.

Natürlich sind wir uns bewusst, dass diese Art von Arbeit große Investitionen erfordert. Die Kryo-Elektronenmikroskope und die Fluoreszenzmikroskope sind anspruchsvoll und teuer, und sie müssen auch richtig zitiert werden. Das Fundament dieses Raumes ist zum Beispiel eine mechanisch isolierte, mehrere Meter dicke Betonplatte, die auf einem speziell verdichteten Boden ruht.

Die Klimaanlage wurde ebenfalls speziell mit großen Kanälen und sanften Kurven entwickelt, um eine konstante Temperatur ohne Zugluft oder Turbulenzen aufrechtzuerhalten. Die Vorhänge, die Sie sehen, sind so platziert, dass akustische Geräusche reduziert werden. Und schließlich stellen wir sicher, dass dieser Raum frei von störenden elektromagnetischen Feldern ist.

Während die Operationen, die wir Ihnen am Mikroskop gezeigt haben, heute weitgehend automatisiert sind, treten immer noch häufig Probleme auf, die eine fachkundige Diagnose erfordern. Nichtsdestotrotz hoffen wir, dass das Anschauen dieses Films Ihnen geholfen hat, die Verfahren und die Instrumentierung zu schätzen, die mit dieser Art von Arbeit verbunden sind. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.