Name: Electron Cryotomography von Bakterienzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Elektronenkryotomographie zur hochaufgelösten 3D-Bildgebung bakterieller Zellen. Diese Methode nutzt Gefrierpräparation und computergestützte Rekonstruktion für native Ultrastrukturanalysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde teilweise durch National Institutes of Health Grants R01 AI067548, R01 GM081520, R01 GM086200, R01 AI049194 und P01 GM066521 zu GJJ sowie die Howard Hughes Medical Institute, die Beckman Institute am Caltech und Geschenke an Caltech aus den unterstützten Gordon und Betty Moore Foundation und Agouron Institute. MSL wird durch NIH 2R37-A1041239-06A1 an Pamela S. Björkman unterstützt. Leica Microsystems Inc. freundlicherweise zur Verfügung gestellt Videoinhalte von Gefrier-Sammlung. Die repräsentativen Ergebnisse der Treponema primitia wurden gesammelt und von Gavin E. Murphy verarbeitet und veröffentlicht in Molecular Microbiology mit dem Titel &quot;Novel Feinstrukturen der Treponema primitia und ihre Auswirkungen auf die Motilität&quot;. (Murphy, G. et al., Mol. Gen. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

<ol><li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li>
<li>Li, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography%3A+a+new+view+into+microbial+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+biological+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of biological complexity.</a> J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).</li>
<li>Iancu, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).</li>
<li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285-294 (2001).</li>
<li>Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+cryosectioning+of+cells%2C+facilitated+by+a+micromanipulator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator.</a> J. Microsc. 224, 129-134 (2006).</li>
<li>Pierson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography%3A+Electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> J. Struct. Biol. 169, (2009).</li>
<li>Suloway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).</li>
<li>Fernando, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+tomography%3A+an+approach+with+alignment+methods+that+preserve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution.</a> J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).</li>
</ol>

Wir zeigen in diesem Video Artikel, wie Sie ECT von Bakterienzellen zu tun. Begrenzt durch Raum und Zeit, wir zeigen nur die allgemeine Protokoll. Mehr Details finden Sie in Zeitungen, im Internet oder andere Informationen von den Herstellern der Geräte und Software-Entwicklern zur Verfügung gestellt und von ECT Forschungsgruppen gefunden werden. Abhängig von den verschiedenen Bakterienarten untersucht, die verwendete Ausrüstung und die strukturellen Interesse in den Zellen, müssen das Protokoll und die experimentellen Parameter getestet und optimiert werden.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>0,1%-ige Lösung</td></tr><tr><td>MKIII Vitrobot</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goldkolloidlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1527-25ml</td><td>10 nm</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Invitrogen</td><td>P2489</td><td>10%</td></tr><tr><td>Filterpapier Nr. 1</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1001 055</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31389</td><td>15–25%, MW 39000</td></tr><tr><td>Messing-Kappenplanchet</td><td>Swiss Precision Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bal-Tec HPm 010 Hochdruckgefriermaschine</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-Ultramikrotom UC6/FC6</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamant-Cryo-Trim 45</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Static Line II-Ionisator</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CX100 Dry-Shipper</td><td>Taylor-Wharton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSH-Ladestation</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti E/B inverses Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Custom</td></tr><tr><td>Cryo-LM-Stage</td><td>FEI</td><td></td><td>Custom</td></tr><tr><td>TF30-polara</td><td>FEI</td><td></td><td>Mit UltraCam von Gatan</td></tr><tr><td>Amira</td><td>Visage Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

electron cryotomography von bakterienzellen

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

Während ein Großteil ist bereits über die grundlegenden Stoffwechsel der bakteriellen Zellen bekannt sind, sind viele grundlegende Fragen immer noch unbeantwortet überraschend, darunter zum Beispiel, wie sie zu erzeugen und zu pflegen bestimmten Zelle Formen, zu etablieren Polarität, trennen ihre Genome und dividieren. Um diese Phänomene zu verstehen, sind bildgebende Verfahren erforderlich, die Brücke die Auflösung zwischen Fluoreszenz-Lichtmikroskopie und mit höherer Auflösung Methoden wie Röntgen-Kristallographie und NMR-Spektroskopie. Electron cryotomography (ECT) ist eine aufstrebende Technologie, die genau dies tut, so dass die Ultrastruktur von Zellen zu sein in einer nahezu nativen Zustand visualisiert, in drei Dimensionen (3D), mit &quot;makromolekularen&quot; Auflösung (~ 4 nm). 1, 2 In ECT, Zellen sind in eine glasartige abgebildet, &quot;frozen-hydratisiert&quot; Zustand in einem Kryo-Transmissionselektronenmikroskop (CryoTEM) bei niedriger Temperatur (&lt;-180 ° C). Für schlanke Zellen (bis zu ~ 500 nm Dicke 3), sind intakte Zellen stürzen eingefroren in Medien über EM-Gitter in Kryogenen wie Ethan oder Ethan / Propan-Mischungen. Dickere Zellen und Biofilme können auch in einem glasartigen Zustand, indem Sie zuerst &quot;Hochdruck-freezing&quot; und dann abgebildet werden, &quot;Kryo-Schnitte&quot; sie. Eine Reihe von zweidimensionalen Projektion Bilder werden dann durch die Probe gesammelt, wie es ist schrittweise entlang einer oder zwei Achsen gekippt. Eine dreidimensionale Rekonstruktion oder &quot;Tomogramm&quot; kann dann aus den Bildern berechnet werden. Während ECT erfordert teure Geräte, in den letzten Jahren hat es in ein paar Labors verwendet worden, um die Strukturen der verschiedenen externen Anhängsel zu offenbaren, die Strukturen der verschiedenen Zell-Umschläge, die Positionen und Strukturen der Filamente des Zytoskeletts und die Orte und Architekturen von großen makromolekularen Baugruppen wie Flagellen Motoren, Innenfächer und Chemorezeptor Arrays. 1, 2 In diesem Video-Artikel werden wir zeigen, wie Bild-Zellen mit ECT, einschließlich der Prozesse der Probenvorbereitung, Datenerfassung, Tomogramm Rekonstruktion und Interpretation der Ergebnisse durch Segmentierung und in einigen Fällen Korrelation mit der Lichtmikroskopie.

Wir zeigen hier, wie Elektronen cryotomography (ECT) zu verwenden, um auf die Ultrastruktur von Bakterienzellen in nahezu native Staaten zu studieren, &quot;makromolekularen&quot; (~ 4 nm) Auflösung.

Electron Cryotomography von Bakterienzellen

Obwohl bereits viel über den Grundstoffwechsel bakterieller Zellen bekannt ist, bleiben viele fundamentale Fragen überraschenderweise noch unbeantwortet, unter anderem für ...

In diesem Video werden dreidimensionale Aufnahmen bakterieller Zellen in annähernd nativen Zuständen mit molekularer Auflösung mittels Elektronen-Kryo-Tomographie erzeugt. Dies wird erreicht, indem intakte Zellen zunächst durch Schnelltauchgefrierung fixiert werden oder alternativ durch Hochdruckgefrierung und Kryoschnitte von Zellpellets. Eine Serie von M Projektionsaufnahmen wird aufgenommen und zur Erstellung einer dreidimensionalen Rekonstruktion, oder Tom Graham, verwendet, die segmentiert und anschließend computergestützt analysiert wird.Hallo, ich bin Grant Jensen aus der Abteilung für Biologie am Caltech, und das ist Sonya Chen, die unsere Präsentation organisiert hat. Heute werden wir Ihnen zeigen, wie man die Elektronen-Kryo-Tomographie von bakteriellen Zellen durchführt. Üblicherweise führt eine einzelne Person das gesamte Verfahren durch, aber da unsere Protokolle auf gemeinsamer Erfahrung basieren, werden wir alle Personen einbeziehen, die derzeit im Labor arbeiten.Neben Sonya und mir im Video werden Sie Megan Dobro, Ariana, Bri, Miguel, Alistair McDowell, Mark Rodinsky und Jen sehen. Weitere Labormitglieder erstellten die Bildschirmaufnahmen am Computer und halfen bei der Erstellung des begleitenden schriftlichen Protokolls, darunter Morgan Bebe, Martin Piller, Jane Ding, Joe Lee, Lou GaN, Aliza Tova und Dylan Morris. Ariana wird uns einleiten, indem sie Ihnen zeigt, wie wir bakterielle Zellen schockgefrieren. Für dünne bakterielle Zellen wird eine Suspension intakter Zellen über ein EM-Gitter hinweg schockgefroren. Hier wird der Vorgang anhand eines kommerziellen automatischen Schockfriergers veranschaulicht: Beginnen Sie mit der Untersuchung der Bakterienkulturen, um sicherzustellen, dass sie frei von Kontaminationen sind und eine geeignete Konfluenz oder Konzentration aufweisen. Entladen Sie das mit Kohlenstoff beschichtete EM-Gitter zwei bis vier Minuten lang. Mischen Sie anschließend 100 Mikroliter einer kolloidalen Goldlösung mit 25 Mikrolitern einer 5-%-BSA-Lösung.Zentrifugieren Sie die Mischung bei 18.000 G für 15 Minuten. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und resuspendieren Sie das Gold-Pellet. Geben Sie das EM-Gitter in 20 Mikroliter Zelllösung in die Vitra-Bot bei 100 % Luftfeuchtigkeit. Tragen Sie anschließend vier Mikroliter der Zellmischung auf das glühentladene EM-Gitter auf. Das Gitter wird automatisch von beiden Seiten mit Filterpapier abgeblottet, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und dann schnell in eine flüssige Mischung aus Ethan und Propan eingetaucht, die mit flüssigem Stickstoff gekühlt wird. Entfernen Sie das Gitter vorsichtig aus der Ethan-Propan-Mischung und überführen Sie es umgehend in eine Gitterlagerbox, die unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt wird. Bei dickeren Zellen verhindert die Hochdruckgefriermethode die Kristallisation von Eis.Die anschließende Kryoschnittherstellung macht Proben dünn genug für die EM. Die Bildgebung beginnt mit dem Zentrifugieren von 15 Millilitern Zellen bei 1000 U/min für drei Minuten. Nach der Zentrifugation wird der Überstand entfernt und 0,5 Milliliter des verbleibenden Zellpellets mit 0,5 Milliliter 20%igem Dextrin-Kryoschutzmittel gemischt.Danach erneut 15 Sekunden bei 13.000 U/min zentrifugieren. Nachdem die Zellen pelletiert wurden, entfernen Sie den Überstand und pipettieren Sie 0,1 Milliliter der Überstand-Pellet-Paste in eine hitzeversiegelte Mikropipettenspitze, die bereits 0,2 Milliliter 20 %igen Dextrin-Kryoprotektanz enthalten. Zentrifugieren Sie die Mischung in der Mikropipettenspitze 30 Sekunden bei 13.000 U/min.Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie den Überstand. Am versiegelten Ende ist ein kompaktes Pellet von fünf bis 10 Mikroliter sichtbar. Übertragen Sie die Paste auf eine der halbrunden Mulden einer teflonbeschichteten, kupfernen Muldenprobe, die bereits in dem Halterarm des Hochdruckgefriermikroskops befestigt ist, und verschließen Sie sie mit der flachen kupfernen Abdeckkappe.Danach sofort die Armvorrichtung in den vorbereiteten Hochdruckgefriermesser einsetzen. Bei einem Druck von 2100 bar wird die kombinierte Messingplancheneinheit, die die Zellen enthält, durch einen Strahl flüssigen Stickstoffs unter hohem Druck schnell abgekühlt. Nach dem Abkühlen der Zellen die Armvorrichtung rasch entfernen und sie unverzüglich in ein Bad aus flüssigem Stickstoff eintauchen, um ein Erwärmen der Planchette zu verhindern.Als Nächstes überführen Sie die Planchette in eine vorab gekühlte, schraubstockartige Halterung für das Kryoschneidemikrotom, die sicher in der Kammer des Kryoschneidemikrotoms befestigt ist, um die gut eingefrorene Zellkuppel zum Schneiden freizulegen. Die beiden Messingplanchetten werden unter flüssigem Stickstoff vorsichtig voneinander getrennt. Eine perfekt eingefrorene Zellkuppel erscheint glasartig und ist frei von Rissen sowie Eiskristallisationsrissen.Formen Sie mit dem Kryomikrotom den äußeren Kuppelbereich auf weniger als 0,2 Quadratmillimeter, indem Sie das Diamantschleifwerkzeug mit einer hohen Schnittgeschwindigkeit verwenden und eine Tiefe von etwa 200 Mikrometern beibehalten; richten Sie dabei Antistatik-Spray auf das Messer mit geringem Neigungswinkel und die Kupferträgergitter. Bewegen Sie anschließend vorsichtig das Diamantmesser in unmittelbarer Nähe an die polierte Blockoberfläche heran, wobei Sie eine Schneidgeschwindigkeit von etwa 0,4 Millimetern pro Sekunde und ein enges Schneidfenster verwenden. Beginnen Sie mit dem Schneiden von 50 bis 350 Nanometer dicken Schnitten.Manövrieren Sie einen feinen Wimpern-Applikator, um die Anfangsabschnitte zu erfassen, die von der Diamantmesser-Schneide mit niedrigem Winkel abrutschen, und nutzen Sie ihn, um die Schnittbänder über der Kupfergitterunterlage zu stützen und zu führen. Sobald das Gitter beladen ist, verwenden Sie eine gekühlte polierte Silbersonde, um die Bänder fest anzudrücken. Lagern Sie die Gitter in den Gitterboxen in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Trockenversandbehälter, bis das Mikroskop bereit ist.Die bakteriellen Zellen auf dem Objektträger können mithilfe eines Kryo-Lichtmikroskops abgebildet werden. Hier wird ein angepasstes umgekehrtes Nikon-Mikroskop (TIB) mit einer modifizierten FEI-Kryostufe verwendet. Laden Sie die Objektträger in die Kassetten an der Kriostation ein und sichern Sie sie mit den Kupferclips. Anschließend wird die Kassette zur Übertragung in ein Rohr mit flüssigem Stickstoff gebracht.Laden Sie bis zu zwei Kassetten in die vorgekühlte Kryostufe ein und bewegen Sie das Gitter in das Sichtfenster. Senken Sie dann die Kondensorlinse und fokussieren Sie die Objektivlinse auf das Gitter. Suchen Sie die Zellen und nehmen Sie Bilder auf.Für die korrelative LM- und EM-Untersuchung. Das Raster wird im Bereich der Zellen abgescannt, um die Zellen später im EM zu lokalisieren. Nach der Bildaufnahme des Rasters setzen Sie die Patrone zurück in das Röhrchen und bewahren das Röhrchen bis zur Bildaufnahme im EM in flüssigem Stickstoff auf, um eine 3D-TOM der Bakterienzelle zu erhalten.Eine Reihe von Projektionsaufnahmen wird aufgenommen, während die Probe im Kryo-TEM schrittweise entlang einer oder zwei Achsen gekippt wird. Hier wird die Methode unter Verwendung von Legon mit einem Kryo-T-E-M-F-E-I-T-F 30 Polar demonstriert, wobei bis zu sechs Kassetten in einen Multiauswahlhalter an der Kryo-Station geladen werden. Anschließend wird dieser mit dem TF 30 Polar verbunden. Wählen Sie eine Kassette aus und führen Sie sie in die EM-Säule ein. Starten Sie Legon über die Client-Software auf dem EM-Computer.Geben Sie die Bilddaten für die Legende der Sitzung ein. Wählen Sie die Zielbereiche auf den Bildern beginnend mit der niedrigsten Vergrößerung aus und senden Sie sie in den nächsten Schritt mit höherer Vergrößerung. Stellen Sie anschließend alle Ziele für die Aufnahme der Kippreihen in die Warteschlange und reichen Sie sie alle für den endgültigen Tomographie-Schritt ein.Eine Reihe von Bildern aufnehmen. Die Probe wird im Kryo-TEM schrittweise entlang einer oder zwei Achsen gekippt. Nach Abschluss des Experiments die vollständige Kippserie auf eine lokale Workstation herunterladen, um die Rekonstruktion durchzuführen.Die Tomogramme der Bakterienzellen werden mithilfe spezialisierter Software berechnet. Das Programm Raptor wird verwendet, um Tomogramme automatisch zu rekonstruieren, und eTomo kann zur halbautomatischen Rekonstruktion genutzt werden. Untersuchen Sie die Kippreihen mit dem 3D-Mod-Viewer von IMOD und verwerfen Sie alle, die aufgrund von Tracking- oder anderen Fehlern voraussichtlich keine brauchbaren Ergebnisse liefern werden.Ein guter Tommo-Raptor wird über die Linux-Rechner im Labor verteilt mit den Basiseinstellungen ausgeführt. Die Erstellung des Tomogramms dauert je nach Größe der Datei 20 Minuten bis zwei Stunden. Wenn Raptor fehlschlägt oder ein Forscher sicherstellen möchte, dass die Rekonstruktion optimal ist, kann EMO verwendet werden, um die Bilder manuell sorgfältig auszurichten.Folgen Sie den Schritten jedes Tabs in der e-tomo-GUI, um die Tomographie von Tom Graham aus der Kippreihen-Datenreihe zu rekonstruieren. Wir verwenden eine webbasierte interne Datenbank, um die tomographischen Daten zu organisieren, zu speichern, zu durchsuchen und zu verteilen. Die Hauptübersichtsseite zeigt ein Vorschaubild und einen vorgestellten Film im Stil von YouTube.Für jeden Tomo Graham. Nachdem die Tomos erhalten wurden, können einzelne Merkmale segmentiert werden, um ihre Formen zu visualisieren. Bei der 3D-Segmentierung wird jedem Voxel des 3D-Bildes ein bestimmter Bereich oder Material zugeordnet.Hier wird eine Spiegel-Software verwendet, um ein Oberflächenmodell zu erzeugen, bei dem jeder Bereich mit einer anderen Farbe dargestellt wird und das in 3D-Filmen und Animationen der Tomographie betrachtet werden kann. Mit Graham-Verfahren können Projekte zusammengefasst und Ergebnisse in 3D-Grafiken veranschaulicht werden. Darstellung. Software wie Amira oder Kymera kann verwendet werden, um die einzelnen Standbilder des Films und des Werbespots zu rendern.Software zur Videobearbeitung wie Adobe Premiere kann verwendet werden, um den Film mit kommerzieller Software zu bearbeiten. Maya dient zur Erstellung der Animation. Es kann die Oberflächen aus Amira übernehmen, Schlüsselbilder erstellen und in einen Film rendern.Hier wird eine repräsentative Kippreihe von Ganzzell-Daten für das Spirochaeta Treponema Promesa gezeigt, gefolgt von einer Schicht-für-Schicht-Ansicht des rekonstruierten Tomogramms. Die Segmentierung der T-Promesa-Zelle unterscheidet ihre äußere Membran, innere Membran und Oberflächenstrukturen, einschließlich Oberflächenmulden und Oberflächenhaken-Arkaden. Die Bakterienzelle weist Flagellen und ein U-förmiges Motorapparat, einen periplasmatischen Kegel sowie Pili auf.Dieses mechanische Modell zeigt, wie das Spirochätenbakterium Treponema Promesa schwimmt, wobei ein innerer Zylinder oder Kern von einer äußeren Hülle umschlossen ist. Die Geißeln bewegen sich wie Farbroller zwischen dem inneren Zylinder und der äußeren Hülle. Während sich die Geißeln drehen, rotiert der innere Zylinder innerhalb der äußeren Hülle entgegengesetzt. In einer nicht zähen Umgebung dreht sich die Zelle nutzlos, doch in viskosen Umgebungen wie jenen, in denen T Promesa in der Natur vorkommt, widerstehen äußere Fasern oder andere Objekte der Drehung der äußeren Hülle, wodurch die Drehung des inneren Zylinders beschleunigt wird und Materialien bereitgestellt werden, gegen die die Zelle drücken kann, während sie sich vorwärts bohrt. Gezeigt sind hier echte T promeus-Zellen, wie sie mittels Lichtmikroskop beobachtet wurden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Elektronen-Kryo-Tomographie bakterieller Zellen durchführt.Natürlich ist uns bewusst, dass diese Art von Arbeit erhebliche Investitionen erfordert. Die Kryo-Elektronenmikroskope und die Fluoreszenzmikroskope sind anspruchsvoll und teuer, und sie müssen auch ordnungsgemäß zitiert werden. Beispielsweise beruht der Fundamentboden dieses Raums auf einer mehrere Fuß dicken, mechanisch isolierten Betonplatte, die auf speziell verdichtetem Untergrund ruht.Die Klimaanlage ist ebenfalls speziell konstruiert mit großen Kanälen und sanften Kurven, um eine konstante Temperatur ohne Zugluft oder Turbulenzen aufrechtzuerhalten. Die Vorhänge, die Sie sehen, sind zur Verringerung von akustischem Lärm angebracht. Und schließlich überprüfen wir, ob dieser Raum frei von störenden elektromagnetischen Feldern ist.Obwohl die an dem Mikroskop gezeigten Vorgänge heute größtenteils automatisiert sind, treten dennoch häufig Probleme auf, die einer fachkundigen Diagnose bedürfen. Dennoch hoffen wir, dass Ihnen das Anschauen dieses Films geholfen hat, die beteiligten Verfahren und die verwendete Instrumentierung besser zu verstehen. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.

electron-cryotomography-of-bacterial-cells

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Quelle: Chetrit, D., et al. Anwendung von Lebendzellbildgebung und Kryo-Elektronentomographie zur Aufklärung räumlich-zeitlicher Merkmale des Legionella pneumophila dot/icm-Sekretionssystems. J. Vis. Exp. (2020)Das Video beschreibt, wie Legionella pneumophila-Proben für die Kryo-Elektronentomographie durch Kombination von Bakterienkultur, Markierung von Goldnanopartikeln und Vitrifikationstechniken vorbereitet werden. Das Verfahren bewahrt native zelluläre Strukturen und ermöglicht eine...

Aufbereitung von Legionella pneumophila für die kryogene Elektronentomographie

Neuronale Prozesse zur ultrastrukturellen Analyse zu erhalten, beschreiben wir ein Protokoll für die Beschichtung von primären Neuronen auf Elektronenmikroskopie Gitter gefolgt von einem Blitzgefrieren, wodurch Proben in einer Schicht von glasartigem Eis suspendiert. Diese Proben können mit einer Kryo-Elektronenmikroskop auf Strukturen im Nanometerbereich sichtbar zu prüfen.

Herstellung von primären Neuronen für die Visualisierung von Neuriten in einem tiefgefrorenen Zustand unter Verwendung von Kryo-Elektronentomographie

Wir präsentieren ein Protokoll, wie die Erfassung und Verarbeitung Kryo-Elektronenschichtaufnahmen von ganzen Mitochondrien. Die Technik liefert detaillierte Einblicke in die Struktur, Funktion und Organisation der großen Membranproteinkomplexen in nativen biologischen Membranen.

Visualisierung der ATP-Synthase-Dimere in den Mitochondrien durch Elektronen Cryo-Tomographie

Wir präsentieren ein Protokoll, wie Hochdurchsatz-Kryo-Elektronentomographie zu nutzen, um hochauflösende in situ Strukturen der molekularen Maschinen zu bestimmen. Das Protokoll unterstützt große Datenmengen zu verarbeiten sind, vermeidet gemeinsame Engpässe reduziert Ressourcenstillstandszeit, so dass der Benutzer auf wichtige biologische Fragen zu konzentrieren.

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Dieses Protokoll beschreibt, wie die vorübergehende DNA-Verdichtung in Cyanobakterien zu visualisieren. Synchrone Anbau, Überwachung durch die Fluoreszenz-Mikroskopie, schnelles Gefrieren und hoher Spannung Cryo-Elektron Tomographie verwendet. Ein Protokoll für diese Methoden vorgestellt, und zukünftige Anwendungen und Entwicklungen diskutiert.

Visualisierung der DNA Verdichtung in Cyanobakterien durch Hochspannungs-Cryo-Elektron Tomographie

Die Bildgebung von Bakterienzellen ist ein aufkommendem systembiologischen Ansatz, der sich auf die Definition statischer und dynamischer Prozesse konzentriert, die die Funktion großer makromolekularer Maschinen diktieren. Hier wird die Integration von quantitativer Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronentomographie verwendet, um Legionella pneumophila Typ IV Sekretionssystemarchitektur und -funktionen zu untersuchen.

Anwendung von Live Cell Imaging und Cryo-Electron Tomography zur Auflösung der raumzeitlichen Merkmale des Legionella pneumophila Dot/Icm Sekretionssystems

Wir präsentieren ein Protokoll zur Lamellenpräparation von gefrorenen biologischen Proben mittels kryofokussiertem Ionenstrahl-Mikrobearbeitung für hochauflösende Strukturstudien von Makromolekülen in situ mit Kryo-Elektronentomographie. Das vorgestellte Protokoll enthält Richtlinien für die Herstellung von hochwertigen Lamellen mit hoher Reproduzierbarkeit zur strukturellen Charakterisierung von Makromolekülen innerhalb der Saccharomyces cerevisiae.

Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Zelladhäsion und das Wachstum auf gezielte Bereiche von Gittern für die Kryo-Elektronenmikroskopie zu lenken. Dies wird durch das Auftragen einer Antifouling-Schicht erreicht, die in benutzerdefinierten Mustern abgetragen wird, gefolgt von der Ablagerung von extrazellulären Matrixproteinen in den gemusterten Bereichen vor der Zellaussaat.

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Das vorliegende Protokoll beschreibt die hochauflösende Kryo-Elektronentomographie-Ferndatenerfassung mit Tomo5 und die anschließende Datenverarbeitung und Subtomogramm-Mittelung mittels emClarity. Apoferritin wird als Beispiel verwendet, um detaillierte Schritt-für-Schritt-Prozesse zu veranschaulichen, um eine Kryo-ET-Struktur bei 2,86 Å Auflösung zu erreichen.

Kryo-Elektronen-Tomographie Ferndatenerfassung und Subtomogramm-Mittelwertbildung

Die Kryo-STEM-Tomographie bietet eine Möglichkeit, Organellen intakter Zellen ohne Einbettung, Schnitt oder andere invasive Präparate sichtbar zu machen. Die erzielte 3D-Auflösung liegt derzeit im Bereich von wenigen Nanometern, mit einem Sichtfeld von mehreren Mikrometern und einer zugänglichen Dicke in der Größenordnung von 1 μm.

Visualisierung von Organellen in situ mittels Kryo-STEM-Tomographie

Dieses Protokoll standardisiert die Kryo-Elektronen-Tomographie (Kryo-ET) für dickes Gewebe, indem es Hochdruck-Gefrieren (HPF) mit der Waffelmethode, kryogenen Fokusionenstrahl (Cryo-FIB) Lift-out und dosissymmetrische, parallele Aufnahme integriert, wodurch gleichmäßig dünne Lamellen und vitrifizierte Proben für eine reproduzierbare In-situ-Analyse im Maus-Hippocampus entstehen.

Kryo-Elektronen-Tomographie-Workflow für dickes Gewebe demonstriert im Maus-Hippocampus

Erfahren Sie die Elektronenkryotomographie zur hochaufgelösten 3D-Bildgebung bakterieller Zellen. Diese Methode nutzt Gefrierpräparation und computergestützte Rekonstruktion für native Ultrastrukturanalysen.

Electron Cryotomography von Bakterienzellen

Weitere Videos entdecken