Encyclopedia of Experiments: Biology
Ein Abonnement für JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt ansehen zu können. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- C. elegans anvendes som forsøgsmodel for infektion med tarmpatogener, der til dels forårsager sygdom ved at forstyrre tarmbarrieren og øge dens permeabilitet.
Placer derefter disse orme på agarplader med mærket mad sammensat af varme-dræbt E. coli blandet med FITC-dextran, et polysaccharid med høj molekylvægt med et fluorescerende tag.
Lad ormene spise de mærkede bakterier. Dem med intakte tarmbarrierer vil hurtigt rydde maden, mens den fluorescerende markør i orme med mere gennemtrængelige tarme vil trænge ind ud over organets lumen.
Overfør orme til en formaldehydopløsning for at fastgøre dyrene.
Endelig billede ormene ved fluorescerende mikroskopi. Bemærk, at C. elegans tarmgranulat er autofluorescerende, så der vil være baggrundssignal.
I eksempelprotokollen vil vi analysere effekten af behandling med biomolekyle-DIM på tarmgennemtrængeligheden af orme inficeret med patogene Pseudomonas aeruginosa bakterier.
- Forbered de FITC-dextran-supplerede plader ved at blande 2 milliliter varmeinaktiveret E. coli med 4 milligram FITC-dextran. Tilsæt 100 mikroliter af blandingen til hver af 20 friske NGM agar plader og lad pladerne tørre i en time på en ren lab bænk. Efter 48 timers behandling, vask orme med S Buffer. Overfør dem til FITC-dextran supplerede plader og til NGM plader uden FITC-dextran og inkuber pladerne natten over.
Den næste dag, vask orme med S Buffer og give dem mulighed for at kravle i den friske NGM agar plade i en time. Tilsæt 50 mikroliter af 4% formaldehyd til hver brønd af en sort 96-godt fladbundet plade og overføre ca 50 orme i hver brønd.
- Formaldehyd er et giftigt kemikalie og bør håndteres med forsigtighed.
