C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

Das übergeordnete Ziel dieser Kombination von Standardmethoden ist es, zu zeigen, wie der C.elegans-Darm für die in vivo-Analyse der polarisierten Membranbiogenese und der Lumenmorphogenese auf einzelzelliger und subzellulärer Ebene verwendet werden kann. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Polarität und Biogenese zu beantworten, z. B. wie apikale vs. basolaterale Membrandomänen und andere subzelluläre Asymmetrien während und nach der Morphogenese etabliert und aufrechterhalten werden. Der Hauptvorteil dieses Modellsystems besteht darin, dass diese transparente Einzelschicht von nur 20 Zellen in vivo die Gewebekammer überleben kann, um die polarisierte Membran- und Lumenbiogenese einzelner Zellen zu entschlüsseln.

Die Techniken können auf die Analyse anderer C.Elegans-Morphogenese-Phänotypen ausgeweitet werden, wobei der Schwerpunkt hier auf der Analyse der Membranbiogenese liegt, insbesondere auf der apikalen Membran- und Lumenbiogenese. Die Verfahren umfassen verfeinerte bildgebende Verfahren bei fixierten und lebenden Tieren, um Membrandomänen und subzelluläre Komponenten zu unterscheiden und Lumen-Morphogenese-Phänotypen in einem C.elegans-Darm zu identifizieren. Dieses Video über die intestinale Tubulogenese wird von einem Video über die Tubulogenese des Ausscheidungskanals begleitet, die sich gegenseitig informierende Modelle, in denen die in vivo Analyse der polarisierten Membranbiogenese.

Im Hinblick auf die Markierung wird die Erzeugung transgener Tiere mit fluoreszenzmarkierten Fusionsproteinen für die Live-Bildgebung im begleitenden Video zur Analyse der Tubulogenese des Ausscheidungskanals beschrieben. Solche Tiere können direkt in RNAi-Experimenten eingesetzt werden. Die dritte Generation ist in der Regel der erste Schritt in dieser Kombination von Verfahren.

Dieses Video beginnt mit der alternativen Markierungsmethode Antikörperfärbung, für die Tiere fixiert werden müssen. Die verschiedenen Markierungsverfahren können mit der Immunhistochemie kombiniert werden, die typischerweise für die abschließende bildgebende Analyse verwendet wird. Dieses Protokoll enthält auch Beispiele für darmspezifische Membranmarker, Promotoren und andere Ressourcen, die für beide Markierungsverfahren nützlich sind.

Nach der Demonstration der Immunhistochemie wird in diesem Video ein transgener Stamm verwendet, der die apikale Darmmembran mit ERM-1 GFP markiert, um mit RNAi nach Phänotypen der Polarität und der Lumenmorphogenese zu suchen. Bereiten Sie zunächst eine Folie vor, um die Würmer zu fixieren. Pipettieren Sie 30 Mikroliter Poly-L-Lysin auf einen Objektträger und setzen Sie dann einen zweiten Objektträger auf den anderen und lassen Sie sie zusammen fallen, um die Lösung gleichmäßig auf beide zu verteilen.

Schälen Sie nun die beiden Objektträger auseinander und lassen Sie sie 30 Minuten an der Luft trocknen. Lege dann einen flachen Metallblock in einen Behälter, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist. Waschen Sie die Platten mit M9-Lösung und übertragen Sie etwa 10 Mikroliter M9, das die Würmer enthält.

Alternativ können Sie die Würmer auswählen und M9 auf die Folie geben. Sobald die Würmer übertragen sind, lassen Sie vorsichtig einen Deckglas quer über die Würmer auf sie fallen, so dass der Deckglas an einer Kante hängt. Drücken Sie dann vorsichtig auf den Deckglas, ohne seitliche Bewegungen zu machen.

Übertragen Sie nun den Objektträger sofort in flüssigem Stickstoff auf den Metallblock und lassen Sie ihn einfrieren. Nach fünf Minuten schnippen Sie den Deckglas mit der überhängenden Kante ab. Tun Sie dies schnell, um den richtigen Riss der Nagelhaut zu erhalten.

Tauchen Sie die Rutsche anschließend bei minus 20 Grad Celsius in ein mit Methanol gefülltes Coplin-Glas. Nach fünf Minuten geben Sie den Objektträger für weitere fünf Minuten bei der gleichen Temperatur in ein mit Aceton gefülltes Coplin-Glasgefäß. Die Objektträger können direkt gebeizt oder bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.

Nehmen Sie den Objektträger aus dem Aceton und lassen Sie ihn bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Markiere als Nächstes die Stelle für eine kreisförmige Wand aus Vaseline auf der Unterseite der Rutsche und baue dann die Geleewand auf. Reiben Sie das Gelee während dieses Vorgangs nicht ab.

Bereiten Sie dann eine Nasskammer in einem Behälter mit nassen Papiertüchern vor und legen Sie die Folie auf ein Gestell darin. Es sollte kein Kontakt zwischen den Handtüchern und der Rutsche oder zwischen benachbarten Rutschen bestehen. Pipettieren Sie nun so viel PBS in den Geleekreis, dass der Bereich bedeckt ist.

Platzieren Sie vorsichtig eine Pipettenspitze am Rand des Kreises und lassen Sie die Flüssigkeit gleichmäßig über die Würmer verteilen. Schließen Sie dann den Deckel und warten Sie fünf Minuten. Kippen Sie nach fünf Minuten die Rutsche und saugen Sie das PBS langsam an, wobei Sie darauf achten, dass keine Würmer von der Rutsche verloren gehen.

Füllen Sie anschließend den Geleekreis vorsichtig mit frisch zubereiteter Blockierlösung. Und lassen Sie die Folie 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Ersetzen Sie nach 15 Minuten die Blockierungslösung durch eine Blockierungslösung, die den primären Antikörper enthält.

Und inkubieren Sie die Folie über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie am nächsten Tag den primären Antikörper und waschen Sie den Objektträger, indem Sie die Blockierungslösung dreimal auftragen und entfernen. Lassen Sie jede Blockanwendung 10 Minuten lang inkubieren.

Fügen Sie dann den in Blockierungslösung verdünnten Sekundärantikörper hinzu und inkubieren Sie den Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Objektträger danach zweimal mit Blockierlösung und dann einmal mit PBS. Entfernen Sie dann so viel PBS wie möglich, ohne dass die Probe austrocknet, und entfernen Sie vorsichtig das Gelee um die Probe herum.

Tragen Sie einen Tropfen Eindeckmittel auf die Probe auf, gefolgt von einem Deckglas und einer Nagellackversiegelung. Lagern Sie die Dias dann im Dunkeln bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie die RNAi-Bibliotheksplatte von minus 80 Grad Celsius auf Trockeneis.

Entfernen Sie das Dichtungsband. Und übertragen Sie den gewünschten Klon auf eine selektive Schnecke. Streichen Sie dann den Klon aus und züchten Sie die Bakterien über Nacht.

Bevor Sie die Bibliotheksplatte wieder in den Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius stellen, bringen Sie neues Dichtungsband an. Am nächsten Tag inokulieren Sie die Kolonien von der Platte in einen Milliliter Aliquote flüssigen Mediums, das Ampicillin enthält. Dann etwa 14 Stunden bei 37 Grad Celsius schütteln.

Am nächsten Tag säen Sie 200 Mikroliter pro Klon auf separate RNAi-Platten. Lassen Sie die Platten trocknen und induzieren Sie die RNAi-Produktion mit einer Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. Einen Tag später übertragen Sie fünf Würmer im L4-Stadium auf jede RNAi-Platte, die mit dem spezifischen Gen markiert ist, auf das abgestimmt ist.

Dann werden die Platten in einen Inkubator gegeben, der in der Regel bei 20 Grad Celsius ist. Untersuchen Sie zunächst Kontroll- und RNAi-Tiere unter hellem Licht bei niedriger und hoher Vergrößerung. Als nächstes untersuchen Sie Kontroll- und RNAi-Tiere unter Fluoreszenzlicht unter den entsprechenden Filtern.

Scannen Sie systematisch eine Platte mit RNAi-Tieren von links oben nach rechts unten auf der gesamten Platte auf der Suche nach Phänotypen. Halten Sie Ausschau nach interessanten Tieren. Für eine genauere Untersuchung der ausgewählten RNAi-Phänotypen konzentrieren Sie sich auf den Darm und verwenden Sie den Zoom, um die Phänotypen der Tubulogenese und der Lumenmorphogenese zu beurteilen.

Um die interessierenden Würmer unter konfokaler Mikroskopie zu untersuchen, montieren und immobilisieren Sie sie zunächst mit der Hand, machen Sie einen dünnen Kreis aus Vakuumfett oder Vaseline auf einem Objektträger. Die Fettschicht sollte dünnflüssig sein, nicht dicker als 0,1 Millimeter. Geben Sie als nächstes etwa 3,5 Mikroliter 10 Millimolar Natriumazid in die Mitte des Kreises.

Pflücken Sie dann unter einem Präpariermikroskop schnell interessante Würmer in die Lösung, bevor die Lösung trocknet. Anschließend vorsichtig einen Decklader aufkleben und die Tiere innerhalb von 30 Minuten abbilden. Verwenden Sie leichten Druck und überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Würmer nicht in Lösung schwimmen.

Unter dem konfokalen Mikroskop finden Sie die Würmer bei geringer Vergrößerung und Schärfe. Verwenden Sie dann ein 60- oder 100-faches Ölimmersionsobjektiv, um den Darm zu betrachten und abzubilden. Untersuchen Sie anschließend das Tier unter Fluoreszenzlicht mit dem entsprechenden Kanal, um Bereiche auszuwählen, die den interessierenden Zelldefekt aufweisen.

Bewegen Sie sich schnell, um ein Ausbleichen der Fotos zu vermeiden. Wechseln Sie dann zum Laserscanning und beschränken Sie das Bild auf den Darm, indem Sie Scangrenzen an seiner dorsalen und ventralen Seite festlegen. Erfassen Sie eine Bildserie und fügen Sie die Bilder später zu einem einzigen Projektionsbild zusammen.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Biogenese der polarisierten Membran im sich entwickelnden C.elegans-Darm, wo die Morphogenese der apikalen Membran und des Lumens zusammenfällt, molekular analysiert und visuell zerlegt werden kann. Apikale und basolaterale Membrandomänen, membranassoziierte Verbindungen und das Darmlumen konnten aufgeklärt und ihre Beziehung zueinander während der gesamten Entwicklung untersucht werden. Diese subzellulären Komponenten könnten durch fluoreszenzmarkierte Antikörper oder fluoreszierende Fusionsproteine markiert werden, um eine doppelte oder dreifache Markierung zu ermöglichen, wie in der Begleitarbeit beschrieben.

Grobe Lumendefekte konnten mit Hilfe eines Präparierfluoreszenzmikroskops schnell gescannt werden. Der an GFP gekoppelte Zytoskelett-Linker ERM-1 der apikalen Membranen ist ein robust exprimierter Marker, der für ein RNAi-Screening nützlich ist. Bei der Verwendung dieses Markers wurde eine Reihe neuer Phänotypen der Darmlumen-Morphogenese und -Polarität zusammen mit den ihnen zugrunde liegenden Gendefekten aufgedeckt.

Dann wurden Bilder mit höherer Vergrößerung, die mit einem konfokalen Laserscanning aufgenommen wurden, verwendet, um die Phänotypen genauer zu untersuchen und die zugrunde liegenden Defekte besser zu verstehen. Einige Phänotypen konnten quantifiziert werden. Die Quantifizierung wurde verwendet, um solche Defekte zu vergleichen und ihren Fortschritt während der Entwicklung zu verfolgen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Darmmembran- und Endomembrankompartimente durch Immunfärbung markiert und wie man die Funktion der RNAi-Phänotypen der polarisierten Membran- und Lumenbiogenese analysiert.