Name: C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Analyse polarisierter Membranbiogenese und Lumenmorphogenese im C. elegans-Darm. Diese Techniken ermöglichen die Untersuchung zellulärer Polarität und Membrandomänen in vivo.

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Wir danken Mario de Bono (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK), Kenneth J. Kemphues (Cornell University, Ithaca, USA), Michel Labouesse (Institut de Biologie Paris Seine, Université Pierre et Marie Curie, Paris, Frankreich), Grégoire Michaux (Université deRennes 1, Rennes, Frankreich) und der CGC, gefördert vom NIH Büro Infrastruktur Forschungsprogramme (P40 OD010440), für Stämme und Antikörper. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse des NIH GM078653, MGH ist 224570 und SAA-223809, V.G.

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie standard der Verlustfunktion genetische/RNAi und (Kennzeichnung und mikroskopische) Ansätze um die Vorteile des Darmepithels C. Elegans als Modell für die visuelle und molekulare Zerlegung des in-vivo imaging kombinieren polarisierte Membran und Lumen Biogenese.
Kennzeichnung
Dieses Protokoll konzentriert sich auf Antikörper Färbung. In Situ durch Antikörper labeling ist eine hochspezif...

Die Generation zellulärer und subzellulärer Asymmetrien, z. B. die Bildung von polarisierten Membrandomänen ist entscheidend für die Morphogenese und Funktion von Zellen, Geweben und Organen1. Studien über polarisierte Membran Biogenese in Epithelien bleiben eine technische Herausforderung, da mehrere aufeinander folgende und deckungsgleich extrazellulären und intrazellulären Signale Richtungsänderungen bei der Zuweisung von subzelluläre Komponenten abhängen, die schwer zu trennen, bei den meisten Modellen und stark abhängig von dem Modellsystem. Das Modell präsentiert hier - die einschichtige Caenorhabditis Elegans Darm - ist ein Gewebe von exquisite Einfachheit. Zusammen mit den einzelligen C. Elegans Ausscheidungsorgane canal (siehe begleitende Papier auf polarisierte Membran Biogenese in C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanals)2, sondern bietet einige einzigartige Vorteile für die Identifizierung und Charakterisierung von Molekülen für polarisierte Membran Biogenese erforderlich. Die Erhaltung der molekulare Polarität Hinweise aus Hefe Mann machen dieses einfache Wirbellosen Organ eine ausgezeichnete"in Vivo Gewebe Kammer" Fragen von epithelialen Polarität, die von unmittelbarer Relevanz für das menschliche System sind die immer noch viel zu Hotel gelangen die visuelle Zerlegung dieser Ereignisse an der einzigen Zelle Ebene in Vivo.
Obwohl mehrere erhaltene Polarität Hinweise aus (1) die Extracelluar Matrix, (2) die Plasmamembran und Kreuzungen und (3) intrazellulären vesikuläre Menschenhandel identifiziert3, die zugrunde liegenden Prinzipien ihrer Integration in den Prozess der wurden polarisierten epithelialen Membran und Gewebe Biogenese ist schlecht verstandene4. Die klassische einzellige in-Vivo -Modelle (e.g.S. Cerevisiae und C. Elegans Zygote) haben maßgeblich bei der Festlegung der Grundsätze der polarisierten Zellteilung und anterior-posterioren Polarität und identifizierten kritischen membranassoziierten Polarität Determinanten (die kleinen GTPasen/CDC-42, die Partitionierung defekt PARs)5,6, aber sie hängen von einzigartiger Symmetrie brechen Cues (Knospe Narbe, Sperma-Eintrag) und keine Kreuzung gesichert Apicobasal Membrandomänen und vermutlich die entsprechende intrazelluläre Apicobasal Maschinen sortieren. Unsere aktuelle Kenntnisse über die Organisation des Handels mit polarisierten Epithelien, setzt jedoch in erster Linie auf Säugetier-2D Monokulturen7, fehlen die physiologischen extrazellulären und Entwicklungsstörungen Hinweise, die Positionen der Membran ändern können Domains und Richtungen der Menschenhandel Trajektorien (Umstellung von 2D auf 3D in-vitro- Kultur-Systeme allein genügt, um die Membran Polarität in MDCK (Madin Darby canine Kidney) Zellen zu invertieren)8. In Vivo Studien von epithelialen Polarität bei Wirbellosen Modellorganismen verliefen zunächst in flachen Epithelien, zum Beispiel in der Epidermis von Drosophila Melanogaster , wo sie die kritischen Beitrag identifiziert der Kreuzung Dynamik für polarisierte Zellwanderung und Zelle Blatt Satz9und endocytic Handel für Polarität Wartung10. 3D in Vitro und in Vivo Analyse der Lumen Morphogenese in röhrenförmigen Epithelien in MDCK-Zellen und im Darm C. Elegans haben bzw. vor kurzem das Erfordernis der intrazellulären Handel zum de identifiziert Novo (apikalen) Domäne und Lumen Biogenese und Positionierung11,12,13. Die Dicke der röhrenförmigen (im Gegensatz zu flach) Epithelzellen ist ein Vorteil für die 3D Analyse der subzellulären Asymmetrien da es eine überragende visuelle Unterscheidung der apikalen lumenal Membran, Apico-seitliche Abzweigungen, die seitlichen Membran ermöglicht und die Positionen der intrazellulären Organellen. Um diese visuellen Vorteile das C. Elegans Modell fügt in Vivo Einstellung, Entwicklungs-Achse, Transparenz, Einfachheit der Körper Plan, invariante und definierten Zelle Abstammung, analytische (genetische) und zusätzliche Vorteile beschrieben.
C. Elegans selbst ist ein Fadenwurm röhrenförmige Struktur, deren Transparenz und einfache Architektur ihre ebenso röhrenförmigen inneren Organe für die visuelle Analyse von Rohr- und Lumen Morphogenese direkt zugänglich machen. Die zwanzig Zellen der seinen Darm (21 oder 22 Zellen gelegentlich)14 stammen aus einer einzigen Stammvater Zelle (E) und entwickeln sich aus einem zweischichtigen Epithel durch Interkalation schrittweise in eine bilateral symmetrisch Tube neun INT Ringe (vier Zellen in der ersten Ring; Abbildung 1 schematische)14,15,16. Den Darm Abstammung und Gewebe Analyse, zunächst bestimmt durch Nomarski Optik über nukleare Identitäten17und anschließend durch Fluoreszenz-Mikroskopie über beschriftete Membranen, lieferte wichtige Einblicke in die Morphogenese, in insbesondere die Zelle-autonome und Zelle-nichtautonomen Anforderungen für seine gerichtete Zellteilungen und Bewegungen (z.B.Interkalation, rechts-links-Asymmetrien, vordere und hintere Röhre Drehung)14,18 . Frühe endodermische Zelle Spezifikation und Steuerung der Entwicklung dieses Organs klonalen Modell gen regulatorischen Netzwerk sind gut charakterisierten19,20. Hier konzentriert sich jedoch auf die Analyse der polarisierten Membran und Lumen Biogenese in röhrenförmigen Einzelzellen und die intrazellulären Asymmetrien des Zytoskeletts Strukturen, Endomembranes und Organellen, die diesen Prozess begleiten. Die Analyse wird durch die Einfachheit dieses Rohres erleichtert, wo alle apikale Membranen (auf der Ultrastrukturforschung Ebene zeichnen sich durch Mikrovilli) Gesicht das Lumen und alle basalen Membranen stellen die äußeren Rohroberfläche mit seitlichen Membranen Kontakt mit einander, durch Kreuzungen von der apikalen Membran getrennt (Abbildung 1 Schaltplan; siehe Referenzen (16,21) für C. Elegans-spezifische Organisation von engen und Adherens Junction Komponenten). Apikale Membran Biogenese ist also deckungsgleich mit Lumen Morphogenese. Darüber hinaus die Größe der Erwachsenen Darmzellen - die größten Zellen dieses kleinen Tieres (mit Ausnahme der Ausscheidungsorgane Zelle) - ungefähr die Größe einer Säugerzelle in Vivo visuelle Verfolgung der subzellulären Elemente, z. B. bei schönem Vesikel Bahnen, das ist in der Regel versucht in Vitro in der Kulturschale.
Für die Zwecke dieser Analyse zellulärer und subzellulärer ist eine entsprechende Kennzeichnung entscheidend. Intestinale Endo oder Plasmamembran Domänen, Kreuzungen, ZellskelettStrukturen, Kerne und andere subzellularen Organellen können visualisiert werden, indem Sie ihre spezifischen molekularen Komponenten beschriften. Viele dieser Komponenten wurden charakterisiert und entdeckt werden (Tabelle 1 zeigt ein paar Beispiele und bezieht sich auf Ressourcen). Beispielsweise wurden verschiedene Moleküle unterscheiden die röhrenförmigen und/oder vesikuläre Fächer des intestinalen Endomembrane Systems, von der ER, Golgi per Post-Golgi-Vesikel, die Plasmamembran identifizierten22. Die spezifische Proteine (sowie Lipide und Zucker) können entweder direkt oder indirekt beschriftet werden über verbindliche Proteine. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die in Situ Antikörper Färbung des festen Proben, einer der beiden standard-Kennzeichnung-Techniken (siehe begleitende Papier auf Ausscheidungsorgane Kanal Tubulogenesis für eine Beschreibung der anderen Technik2 - Kennzeichnung in Vivo über fluoreszierende Protein Fusionen - die auf den Darm direkt anwendbar ist; Tabelle 2 enthält Beispiele für Darm-spezifische Promotoren, die verwendet werden können, Ausdruck von solchen Fusionsproteinen in den Darm zu fahren). Doppel- und mehrfache Beschriftung mit beiden Ansätzen oder mit einer Kombination aus beiden plus zusätzliche chemische Färbung, ermöglicht größere eingehende visuelle Auflösung und die Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Veränderungen im Co Lokalisierung und Rekrutierung von spezifischen Moleküle oder subzelluläre Komponenten (Abbildung 2). Die Fixierung und Färbung in diesem Protokoll Unterstützung Erhaltung des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Kennzeichnung während Immunostaining Verfahren beschriebene Verfahren. Für die Bildgebung, wichtige Punkte der Detektion und Charakterisierung von Phänotypen über mikroskopische Standardverfahren (sezierenden und konfokale Fluoreszenzmikroskopie) sind Tubulogenesis beschrieben ()Abbildung 3, 4). Dies können zu höheren Auflösung imaging Ansätze für Instanz Superresolution Mikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie (hier nicht beschrieben) erweitert werden.
Eine wesentliche Stärke dieses Systems ist die Fähigkeit, Polarität in einzelnen Zellen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien von Embryogenese bis ins Erwachsenenalter zu analysieren. Zum Beispiel kann apikale Membran Domain und Lumen Biogenese während der Entwicklung auf der Ebene der einzelligen nachverfolgt werden, über Etikettierung mit ERM-1, einer hoch konservierten Membran-Aktin-Linker der Ezrin-Radixin-Moesin Familie23,24 . ERM-1 visualisiert apikale Membran Biogenese (1) während der embryonalen Rohr Morphogenese, tritt es begleitend mit polarisierten Zellteilung und Migration (Zellen bewegen, apikal Lumen während Interkalation)15; (2) während der späten embryonale und larvale Rohrverlängerung, die in der Abwesenheit von Zellteilung oder Migration verläuft; (3) in den Erwachsenen Darm, wo polarisierte Membrandomänen (Abbildung 1 bestehen). In der expandierenden Post-mitotische Larven Epithel, de Novo Membran polarisiert Biogenese kann somit von polarisierten Gewebe Morphogenese, die nicht in den meisten in Vivo und in Vitro epithelialen Polarität Modellen möglich ist, getrennt werden einschließlich derjenigen mit einzelligen Auflösung (z. B. die 3D MDCK Zyste Modell8). Mit Kennzeichnung für andere Komponenten, diese Einstellung bietet die Möglichkeit (vor allem bei den L1 Larvenstadium wenn Zellen einen höheren Anteil von Zytoplasma/Kern haben), die intrazellulären Veränderungen zu unterscheiden, die speziell für polarisiert Membran Biogenese ( z.B. die Neuausrichtung der Menschenhandel Trajektorien) von denen begleitend für polarisierte Zellteilung und Migration erforderlich.
Die genetische Vielfalt von C. Elegans ist bekannt25und macht es ein leistungsfähiges Modell-System für die molekulare Analyse von biologischen Fragen. Eine Studie über die Morphogenese, kann zum Beispiel mit einem Wildtyp Stamm, eine transgene Sorte beginnen wo die Struktur von Interesse (z.B. eine Membran) mit einem fluoreszierenden Marker oder einen Verlust oder Gewinn-of-Function-Mutanten mit einem Defekt in diesem gekennzeichnet ist Struktur. Eine typische reverse genetische Studie kann eine Mutante, wo das gen des Interesses gelöscht wird, in die Keimbahn (z.B. durch eine gezielte Löschung), geändert durch Mutagenese (in der Regel produzieren Punktmutationen mit Verlust, Minderung oder Gewinn an Funktion generieren des Gens) oder wo seine Abschrift von RNAi reduziert. Die Leichtigkeit der RNAi durch Fütterung in C. Elegans26 eignet sich auch für die Gestaltung der gezielten Bildschirme, die eine größere Gruppe von Genen von Interesse zu untersuchen. Eine genetische Modellorganismus wohl größte Stärke ist die Fähigkeit, in Vivo vorwärts Bildschirme (z.B. Mutagenese, systematische oder genomweiten RNAi-Bildschirme) durchzuführen, die eine unvoreingenommene Untersuchung über die molekulare Ursache für ein Phänotyp der erlauben Interesse. Zum Beispiel eine unvoreingenommene visuelle C. Elegans RNAi Tubulogenesis Bildschirm, beginnend mit einer transgenen Tieres mit ERM-1 benannt apikalen Membranen, entdeckte eine faszinierende reversible Darm Polarität Konvertierung und ektopische Lumen Phänotyp, verwendet hier als Beispiel für diese Art der Analyse. Dieser Bildschirm identifiziert die Erschöpfung der Glykosphingolipide (GSLs; obligat Membranlipide, über ihre GLS-biosynthetischen Enzyme identifiziert) und Bestandteile des Vesikels Mantel Clathrin und die AP-1-Adapter als die spezifischen molekularen Defekte verursachen diese Polarität Konvertierung Phänotyp, Queues dadurch charakterisieren diesen Menschenhandel Moleküle als in Vivo für die apikale Membran Polarität und Lumen Positionierung12,13. Beim Starten mit einer bestimmten genetischen Mutation/Morphogenese Phänotyp können solche Bildschirme (oder einzelne genetische/RNAi Interaktion Experimente) auch funktionelle Interaktion zwischen zwei oder mehreren Genen von Interesse (siehe begleitende Papier auf die Ausscheidungsorgane untersuchen Kanal für ein Beispiel einer solchen Analyse)2. Dieses Protokoll konzentriert sich auf RNAi bietet, neben seiner Fähigkeit, das Gen direkt zu identifizieren, deren Verlust den Phänotyp in vorwärts-Bildschirme, verursacht, spezifische Vorteile für die Analyse der Morphogenese. Da Genprodukte Regie Morphogenese oft in einer Dosis-abhängigen Weise arbeiten, ist RNAi in der Regel erfolgreich bei der Generierung ein Spektrum von Phänotypen. Die Möglichkeit, informative teilweise Verlustfunktion Phänotypen erzeugen hilft auch zur Behebung des Problems, dass die Mehrheit der wichtigen Tubulogenesis Gene entscheidend sind und dass ihre Verluste Sterilität und frühen embryonalen Tödlichkeit verursachen. Dieses Protokoll enthält bedingte RNAi-Strategien, um diese Schwierigkeit zu überwinden und zeigt Wege zu einer Generation von einem breiteren Spektrum von Phänotypen, wie z. B. ein Allel Serie von Mutagenese zu optimieren.

<table><tbody><tr><td><stark>Antikörperfärbung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P5899</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949SK-4</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-213-612</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Milchpulver</td><td>Sigma</td><td>MT409-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Primärantikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MH27 (Maus)</td><td></td><td></td><td>Konzentration: 1:20 Ressourcen: Entwicklungsstudien Hybridoma-Bank.</td></tr><tr><td>MH33 (Maus)</td><td></td><td></td><td>Konzentration: 1:10 Ressourcen: Entwicklungsstudien Hybridom Bank.</td></tr><tr><td>anti-ICB4 (Kaninchen)</td><td></td><td></td><td>Konzentration: 1:5 Ressourcen: Ein Geschenk von Mario de Bono (Medical Research Council, England)</td></tr><tr><td>anti-PAR-3 (Kaninchen)</td><td>Konzentration: 1:50 Ressourcen: Ein Geschenk von Kenneth J. Kemphues (Cornell University)</td>Sekundäre AntikörperAlexa Floor 568 (anti-Kaninchen)ABCam <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>AB175471</td><td>Konzentration: 1:200</td></tr><tr><td>Cy5 (Anti-Maus)</td><td>Life Technologies</td><td>A10524</td><td>Konzentration: 1:200</td></tr><tr><td>TRITC (Anti-Kaninchen)</td><td>Invitrogen</td><td>T2769</td><td>Konzentration: 1:200</td></tr><tr><td>FITC (Anti-Maus)</td><td>Sigma</td><td>F9006</td><td>Konzentration: 1:100</td></tr><tr><td>Markierte Chemikalien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-Phalloidin</td><td></td><td></td><td>Konzentration: 1:100 Ressourcen: Molekulare Sonden-T7471</td></tr><tr><td>Materialien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vakuumfett Silikon</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>4448</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopdeckgläser (22x22-1)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans verwandt</stark></td><td></td><td></td><td>siehe Referenz29 für Standard-C. elegans Kultur- und Wartungsverfahren.</td></tr><tr><td>LB Medium und plates</td><td></td><td></td><td>siehe Referenz29 für Protokolle.</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0116</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912</td><td></td></tr><tr><td>M9 Medium</td><td></td><td></td><td>siehe Referenz29 für Protokolle.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>NGM-Platten</td><td></td><td></td><td>siehe Referenz29 für Protokolle.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>RNAi Plates</td><td></td><td></td><td>siehe Referenz30 für Protokolle.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Acros Organics</td><td>611845000</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biological</td><td>I8500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2648</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhypochlorit</td><td>Fisher Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 Bakterien</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT115 Bakterien</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Genomweite RNAi-Bibliotheken Ahringer genomweite RNAi Feeding Library (ref 30,49,50)</td><td>Quelle: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51)</td><td>Quelle: BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging related</td>Natriumazid, <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9221-500</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ-U</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop ausgestattet mit einem Hochleistungs-Stereo-Fluoreszenzaufsatz (Kramer Scientific), CCD-Kamera mit Q-Capture-Software und X-Cite-Leuchtstofflampe (Photonic Solutions)</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Leica Microsystem</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>konfokales Laser-Scanning montiert auf einem invertierten ECLIPSE Ti-E Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>C2</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans darm als ein modell für die interzelluläre lumen morphogenese und in vivo polarisiert membrane biogenesis ebene der einzelligen: kennzeichnung durch antikörper färbung, rnai verlustfunktion analyse und bildgebung

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Vielzellige Röhren, Grundeinheiten der alle inneren Organe bestehen aus polarisierten epithelialen oder endothelialen Zellen mit apikalen Membranen Futter die Lumen und basolateralen Membranen Kontakt mit einander und/oder die extrazelluläre Matrix. Wie diese unverwechselbare Membran Asymmetrie ist eingerichtet und unterhalten während Orgel Morphogenese ist immer noch eine ungelöste Frage der Zellbiologie. Dieses Protokoll beschreibt den Darm C. Elegans als Modell für die Analyse von polarisierten Membran Biogenese während Rohr Morphogenese, mit Betonung der apikalen Membran und Lumen Biogenese. C. Elegans zwanzig-Zellen einschichtig Darmepithels ist in ein einfaches bilateral symmetrisch Rohr, schönem Analyse auf eine einzelne Zelle angeordnet. Polarisierung der Membran tritt begleitend mit polarisierten Zellteilung und Migration während der frühen Embryogenese, aber de Novo polarisiert Membran Biogenese während Larven Wachstums fortgesetzt wird, wenn die Zellen nicht mehr vermehren und bewegen. Diese Einstellung erlaubt es, subzelluläre Veränderungen zu trennen, die gleichzeitig diese verschiedenen polarisierende Prozesse, schwierig vermitteln, bei den meisten Modellen der Polarität zu unterscheiden. Apikalen-basolateralen Membran-, Knoten-, Zellskelett- und Endomembrane Komponenten können beschriftet und während der gesamten Entwicklung von Fusionsproteinen GFP verfolgt oder von in Situ Antikörper Färbung bewertet. Zusammen mit den Organismus genetische Vielseitigkeit bietet C. Elegans Darm somit eine einzigartige in Vivo Modell für die visuelle, Entwicklungs-, und molekulare genetische Analyse der polarisierten Membran und Rohr Biogenese. Die spezifische (alle standard) hier beschriebenen Methoden umfassen wie: beschriften Sie Darm subzelluläre Komponenten durch Antikörper Färbung; Gene, die im polarisierten Membran Biogenese Verlustfunktion-Studien, die in der Regel wesentlich Tubulogenesis Gene angepasst zu analysieren; Polarität Mängel während der verschiedenen Entwicklungsphasen zu beurteilen; Phänotypen durch Epifluoreszenz, differential Interferenz-Kontrast (DIC) und konfokalen Mikroskopie zu interpretieren; optische Mängel zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann jeder der Beteiligten oft hoch konservierte Moleküle zu analysieren in epithelialen Polarität, Membran Biogenese, Rohr- und Lumen Morphogenese angepasst werden.

Dieses Protokoll beschreibt die Molekular Analyse und Visualisierung von polarisierten Membran Biogenese und Lumen Morphogenese in C. Elegans Darm, auf die einzelne Zelle und subzellulärer Ebene. Die zwanzig-Zellen einschichtig C. Elegans Darm wird durch gezielte Zellteilung und Migration in der Mitte Embryogenese gebildet. In dieser Zeit, polarisierte Membran, die Domänen etabliert, doch de Novo polarisierte Membran Biogenese setzt sich in den Reifen aber Ausba...

Die transparente C. Elegans Darm kann als eine"in-Vivo Gewebe Kammer" für das Studium Apicobasal Membran und Lumen Biogenese einzellige und subzellulärer Ebene bei mehrzelligen Tubulogenesis dienen. Dieses Protokoll beschreibt die Standardbeschriftung kombinieren, Verlust der Funktion genetische/RNAi und mikroskopische Ansätze, diese Prozesse auf molekularer Ebene zu zergliedern.

C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Das übergeordnete Ziel dieser Kombination von Standardmethoden besteht darin, zu demonstrieren, wie der C.elegans-Darm für die in vivo-Analyse der polarisierten Membranbiogenese und der Lumina-Morphogenese auf einzelner Zell- und subzellulärer Ebene genutzt werden kann. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf den Gebieten der Polarität und Biogenese zu beantworten, beispielsweise, wie apikale im Vergleich zu basolateralen Membrandomänen sowie andere subzelluläre Asymmetrien während und nach der Morphogenese etabliert und aufrechterhalten werden. Der entscheidende Vorteil dieses Modellsystems liegt darin, dass diese transparente, lediglich aus 20 Zellen bestehende einlagige Schicht in vivo überlebt und somit die Untersuchung der polarisierten Membran- und Lumina-Biogenese auf Ebene einzelner Zellen ermöglicht.Die Techniken können auf die Analyse anderer C. elegans-Morphogenesephenotypen ausgedehnt werden; der Fokus liegt hier auf der Analyse der Membranbiogenese, insbesondere der apikalen Membran- und Lumenbiogenese. Die Verfahren umfassen verfeinerte Abbildungstechniken an fixierten und lebenden Tieren, um Membrandomänen und subzelluläre Bestandteile zu unterscheiden sowie Lumen-Morphogenesephenotypen im C. elegans-Darm zu identifizieren. Dieses Video zur intestinalen Tubulogenese wird begleitet von einem Video zur Tubulogenese des Exkretionskanals, zwei sich gegenseitig ergänzenden Modellen für die in-vivo-Analyse der polarisierten Membranbiogenese.Hinsichtlich der Markierung wird die Erzeugung transgener Tiere mit fluoreszenzmarkierten Fusionsproteinen für die Live-Bildgebung im begleitenden Video zur Analyse der Tubulogenese des Ausscheidungskanals beschrieben. Solche Tiere können direkt in RNAi-Experimenten verwendet werden. Die dritte Generation ist typischerweise der erste Schritt in dieser Kombination von Verfahren.Dieses Video beginnt mit der alternativen Markierungsmethode der Antikörperfärbung, für die die Tiere fixiert werden müssen. Die verschiedenen Markierungsverfahren können mit der Immunhistochemie kombiniert werden, die typischerweise für die abschließende bildgebende Analyse verwendet wird. Dieses Protokoll enthält außerdem Beispiele für darm-spezifische Membranmarker-Promotoren und andere Ressourcen, die für beide Markierungsverfahren nützlich sind.Nach der Demonstration der Immunhistochemie verwendet dieses Video einen transgenen Stamm, der die intestinale apikale Membran mit ERM-1-GFP markiert, um mittels RNA-Interferenz (RNAi) nach Polaritäts- und Lumen-Morphogenese-Phänotypen zu suchen. Bereiten Sie zunächst einen Objektträger vor, um die Würmer zu fixieren. Geben Sie 30 Mikroliter Poly-L-Lysin auf einen Objektträger und legen Sie einen zweiten Objektträger darauf; lassen Sie beide dann gemeinsam herunterfallen, um die Lösung gleichmäßig auf beiden Trägern zu verteilen.Nun die beiden Objektträger voneinander trennen und 30 Minuten lang an der Luft trocknen lassen. Danach einen flachen Metallblock in einen mit flüssigem Stickstoff gefüllten Behälter legen. Die Platten mit M9-Lösung waschen und etwa 10 Mikroliter M9, das die Würmer enthält, überführen.Alternativ die Würmer aufnehmen und M9 auf den Objektträger geben. Sobald die Würmer übertragen sind, vorsichtig ein Deckglas quer darauflegen, sodass es über eine Kante hinausragt. Anschließend das Deckglas behutsam herunterdrücken, ohne seitliche Bewegungen auszuführen.Überführen Sie den Objektträger nun unverzüglich auf den Metallblock in flüssigem Stickstoff und lassen Sie ihn gefrieren. Entfernen Sie nach fünf Minuten mithilfe der überstehenden Kante die Deckglasplatte mit einem schnellen Ruck, um einen sauberen Bruch des Cuticula-Anschnitts zu erzielen.Als Nächstes tauchen Sie den Objektträger in ein mit Methanol gefülltes Glas-Coplin-Gefäß bei minus 20 Grad Celsius. Nach fünf Minuten überführen Sie den Objektträger für weitere fünf Minuten in ein mit Aceton gefülltes Glas-Coplin-Gefäß bei gleicher Temperatur. Die Objektträger können direkt gefärbt oder bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden.Entfernen Sie die Objektträger aus Aceton und lassen Sie sie bei Raumtemperatur an der Luft trocknen. Markieren Sie anschließend die Position für eine kreisförmige Wand aus Vaseline auf der Unterseite des Objektträgers und bilden Sie dann die Vaseline-Wand auf. Reiben Sie die Vaseline während dieses Vorgangs nicht ab.Bereiten Sie als Nächstes eine feuchte Kammer in einem Behälter mit nassen Papiertüchern vor und stellen Sie den Objektträger in ein Gestell darin. Es darf weder Kontakt zwischen den Tüchern und dem Objektträger noch zwischen benachbarten Objektträgern bestehen. Geben Sie nun so viel PBS in den Gel-Kreis, dass die Fläche bedeckt ist.Platzieren Sie vorsichtig eine Pipettenspitze am Rand des Kreises und lassen Sie die Flüssigkeit gleichmäßig über die Würmer laufen. Danach schließen Sie den Deckel und warten fünf Minuten. Neigen Sie nach fünf Minuten die Objektträger und aspirieren langsam den PBS, wobei Sie darauf achten, dass keine Würmer vom Objektträger verloren gehen.Füllen Sie den Geliring anschließend vorsichtig mit frisch zubereiteter Blockierungslösung. Lassen Sie die Probe 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Ersetzen Sie nach 15 Minuten die Blockierungslösung durch Blockierungslösung, die den primären Antikörper enthält.Und inkubieren Sie den Objektträger über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag entfernen Sie den primären Antikörper und waschen den Objektträger, indem Sie dreimal Blocking-Lösung auftragen und wieder entfernen. Lassen Sie jede Blocking-Anwendung jeweils 10 Minuten lang inkubieren.Fügen Sie anschließend das sekundäre Antikörperreagenz, verdünnt in der Blockierungslösung, hinzu und inkubieren Sie das Objektträgerpräparat eine Stunde bei Raumtemperatur. Danach waschen Sie das Präparat zweimal mit der Blockierungslösung und anschließend einmal mit PBS. Entfernen Sie dann so viel von dem PBS wie möglich, ohne dass die Probe austrocknet, und nehmen Sie vorsichtig das Gel um die Probe herum weg.Tragen Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf das Präparat auf, gefolgt von einem Deckglas und einer Nagellackversiegelung. Bewahren Sie die Objektträger anschließend im Dunkeln bei vier Grad Celsius auf. Überführen Sie die RNAi-Bibliothekenplatte von minus 80 Grad Celsius auf Trockeneis.Entfernen Sie das Versiegelungsband und übertragen Sie den gewünschten Klon auf einen selektiven Agar. Stricheln Sie den Klon aus und lassen Sie die Bakterien über Nacht wachsen.Bevor Sie die Bibliotheksplatte in den minus 80 Grad Celsius tiefen Gefrierschrank zurückbringen, tragen Sie ein neues Versiegelungsband auf. Inokulieren Sie am nächsten Tag Kolonien von der Platte in Ein-Milliliter-Aliquots flüssigen Mediums, das Ampicillin enthält. Schütteln Sie diese anschließend etwa 14 Stunden bei 37 Grad Celsius.Am folgenden Tag 200 Mikroliter pro Klon auf separate RNAi-Platten aussäen. Die Platten trocknen lassen und die RNAi-Produktion durch eine Übernacht-Inkubation bei Raumtemperatur induzieren. Einen Tag später fünf Würmer im L4-Stadium auf jede RNAi-Platte übertragen, die mit dem spezifischen Zielgen beschriftet ist.Anschließend die Platten in einen Inkubator, üblicherweise bei 20 Grad Celsius, überführen. Zuerst Kontroll- im Vergleich zu RNAi-Tieren unter hellem Licht bei niedriger und hoher Vergr&ouml;&szlig;erung untersuchen. Danach Kontroll- im Vergleich zu RNAi-Tieren unter fluoreszierendem Licht mit den geeigneten Filtern untersuchen.Scannen Sie systematisch eine Platte mit RNAi-Tieren von oben links nach unten rechts der gesamten Platte, um nach Phänotypen zu suchen. Achten Sie auf Tiere von Interesse. Zur genaueren Untersuchung der ausgewählten RNAi-Phänotypen konzentrieren Sie sich auf den Darm und verwenden Sie die Vergrößerung, um Tubulogenese- und Lumenausbildungsphänotypen zu beurteilen.Um die Würmer von Interesse unter einem konfokalen Mikroskop zu untersuchen, montieren und immobilisieren Sie sie zunächst manuell, indem Sie einen dünnen Kreis aus Vakuumfett oder Vaseline auf einen Objektträger auftragen. Die Fettschicht sollte dünn sein, nicht dicker als 0,1 Millimeter. Geben Sie danach etwa 3,5 Mikroliter einer 10-Millimolar-Natriumazid-Lösung in die Mitte des Kreises.Dann die gewünschten Würmer unter dem Stereomikroskop zügig in die Lösung überführen, bevor diese trocknet. Vorsichtig ein Deckglas auflegen und die Tiere innerhalb von 30 Minuten abbilden. Leichten Druck ausüben und unter dem Mikroskop überprüfen, ob die Würmer nicht in der Lösung schwimmen.Unter dem konfokalen Mikroskop die Würmer bei niedriger Vergrößerung suchen und fokussieren. Anschließend ein 60- oder 100-fach-Ölimmersionsobjektiv verwenden, um den Darm zu betrachten und abzubilden. Danach das Tier unter fluoreszierendem Licht mit dem geeigneten Kanal untersuchen, um Bereiche auszuwählen, die den gewünschten zellulären Defekt zeigen.Bewegen Sie sich schnell, um eine Photo-Bleaching zu vermeiden. Wechseln Sie dann zur Laserscan-Aufnahme und beschränken Sie das Bild auf den Darm, indem Sie die Scan-Grenzen an dessen dorsaler und ventraler Seite festlegen. Nehmen Sie eine Bildserie auf und fügen Sie die Bilder später zu einem einzigen Projektionsbild zusammen.Dieses Protokoll beschreibt, wie man die molekulare Analyse und die visuelle Untersuchung der polarisierten Membranbiogenese im sich entwickelnden C.elegans-Darm durchführt, wo die Bildung der apikalen Membran und des Lumens zusammenfallen. Die apikalen und basolateralen Membranbereiche, membranassoziierte Zellkontakte sowie das Darm-Lumen konnten aufgelöst und ihre räumlichen Beziehungen zueinander während der gesamten Entwicklung untersucht werden. Diese subzellulären Strukturen konnten mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder fluoreszenten Fusionsproteinen für eine Doppel- oder Dreifachmarkierung, wie im begleitenden Artikel beschrieben, markiert werden.Grobe Lumendefekte konnten mithilfe eines Fluoreszenz-Dissektionsmikroskops schnell überprüft werden. Der an GFP gekoppelte apikale Membran-Zytoskelett-Linker ERM-1 ist ein robust exprimierter Marker, der sich gut für einen RNAi-Screen eignet. Mit Hilfe dieses Markers wurden eine Reihe neuartiger Phänotypen der intestinalen Lumen-Morphogenese und -Polarität sowie die zugrundeliegenden Gendefekte aufgedeckt.Dann wurden Aufnahmen mit höherer Vergr&ouml;&szlig;erung, die mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie gewonnen wurden, verwendet, um die Ph&auml;notypen genauer zu untersuchen und die zugrundeliegenden Defekte besser zu verstehen. Einige Ph&auml;notypen konnten quantifiziert werden. Die Quantifizierung diente zum Vergleich solcher Defekte und zur Verfolgung ihres Fortschreitens w&auml;hrend der Entwicklung.Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man intestinale Membran- und Endomembran-Kompartimente mittels Immunfärbung markiert und wie man die funktionellen RNAi-Phänotypen der polarisierten Membran- und Lumenausbildung analysiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Dieser Artikel beschreibt eine Technik zur Visualisierung der frühen Ereignisse der Embryogenese in den...

Zeitraffer-Mikroskopie der frühen Embryogenese in Caenorhabditis elegans

Dieses Video beschreibt das Freeze-Cracking, eine Methode, um C. elegans-Gewebe für die Antikörperfärbung zugänglich zu machen, indem die Kutikula aufgebrochen wird.

Freeze-Cracking von Nematoden: Eine Methode zur Freilegung von innerem Wurmgewebe zur Färbung

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild teilenden Zellen innerhalb eines Gewebes in Caenorhabditis elegans Embryonen. Während mehrere Protokolle beschreiben, wie Bild der Zellteilung im frühen Embryo, beschreibt dieses Protokoll, wie man Bild der Zellteilung in einem Entwicklungs Gewebe während der Embryogenese Mitte spät.

Visualisierung Neuroblast Cytokinesis Während<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

Hier wird gezeigt, wie Entwicklungsprozesse in C. elegans verfolgt und quantifiziert werden können. Die vorgestellten Methoden basieren auf Open-Source-Tools, die einfach implementiert werden können. Es wird gezeigt, wie man 3D-Zellformmodelle rekonstruiert, wie man subzelluläre Strukturen manuell verfolgt und wie man die kortikale kontraktile Strömung analysiert.

Tracking und Quantifizierung von Entwicklungsprozessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Verwendung von Open-Source-Werkzeuge

Der C. Elegans Ausscheidungsorgane Kanal ist ein einzigartiges einzellige Modell für die optische in-Vivo -Analyse der de Novo polarisiert Membran Biogenese. Dieses Protokoll beschreibt eine Kombination aus standard genetische/RNAi und imaging-Ansätze, zur Identifizierung und Charakterisierung von Molekülen Regie einzelligen Tubulogenesis und apikale Membran und Lumen Biogenese anpassungsfähig.

C. Elegans Excretory Kanal als Modell für die intrazelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis in einer einzelnen Zelle: Kennzeichnung von GFP-Fusionen, RNAi Interaktion Bildschirm und Imaging

Wir präsentieren Protokolle zur Isolierung der intestinalen 3D-Strukturen aus in-Vivo -Gewebe und in-vitro- Keller-Matrix eingebettet, Organellen, und Detail verschiedene Fixierung und Färbung Protokolle für Immuno-Kennzeichnung von Mikrotubuli optimiert, centrosomal und Knoten Proteine sowie Handy-Marken einschließlich des Stammzell-Proteins Lgr5.

Immuno-fluoreszierende Etikettierung von Mikrotubuli und Centrosomal Proteine in Ex Vivo Darmgewebe und 3D In-vitro- Darm Organellen

Hier stellen wir einen kombinatorischen Ansatz vor, bei dem hochauflösende Mikroskopie, Rechenwerkzeuge und Einzellen-Beschriftungen in lebenden C. eleganischen Embryonen verwendet werden, um die Einzelzellendynamik während der Neuroentwicklung zu verstehen.

Isotrope Licht-Sheet-Mikroskopie und automatisierte Zelllineage-Analysen zu Katalog-Caenorhabditis elegans Embryogenese mit subzellulärer Auflösung

Diese Arbeit beschreibt ein semi-high-throughput-Protokoll, das eine gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Embryogenese in 80–100 C. elegans Embryonen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Darüber hinaus sind Bildverarbeitungs- und Visualisierungstools enthalten, um die Datenanalyse zu optimieren. Die Kombination dieser Methoden mit kundenspezifischen Reporterstämmen ermöglicht eine detaillierte Überwachung der Embryogenese.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

Darmmikroben, einschließlich extrazellulärer Bakterien und intrazellulärer Krankheitserreger wie dem Orsay-Virus und Mikrosporidien (Pilze), sind oft mit wilden Caenorhabditis-Nematoden assoziiert. Dieser Artikel stellt ein Protokoll zum Nachweis und zur Quantifizierung von Mikroben vor, die C. elegans-Nematoden besiedeln und/oder infizieren, und zur Messung der Erregerlast nach kontrollierten Infektionen im Labor.

RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Visualisierung mikrobieller Besiedlung und Infektion im Darm von Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll beschreibt die mikrofluidische Zeitraffer-Bildgebung von C. elegans über die gesamte postembryonale Entwicklung.

Hochauflösende Bildgebung von C. elegans in allen Larvenstadien

Erfahren Sie Methoden zur Analyse polarisierter Membranbiogenese und Lumenmorphogenese im C. elegans-Darm. Diese Techniken ermöglichen die Untersuchung zellulärer Polarität und Membrandomänen in vivo.

C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung (Video) | JoVE Journal

C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

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