Encyclopedia of Experiments: Biology
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- C. elegans est utilisé comme modèle expérimental d’infection par des pathogènes intestinaux qui causent la maladie, en partie, en perturbant la barrière intestinale, augmentant sa perméabilité. Quantifier l’intégrité de la barrière après l’exposition à une bactérie ou à un composé chimique d’intérêt, recueillir les vers en les lavant de leurs assiettes.
Ensuite, placez ces vers sur des assiettes d’agar avec des aliments étiquetés composés d’E. coli tué par la chaleur mélangé avec fitc-dextran, un polysaccharide de poids moléculaire élevé avec une étiquette fluorescente.
Permettre aux vers de manger les bactéries étiquetées. Ceux qui ont des barrières intestinales intactes vont rapidement dégager la nourriture, tandis que dans les vers avec des intestins plus perméables, le marqueur fluorescent pénétrera au-delà du lumen de l’organe.
Transférer les vers dans une solution de formaldéhyde pour fixer les animaux. Après 1 à 2 minutes, remplacer le formaldéhyde par des supports de montage.
Enfin, imagez les vers par microscopie fluorescente. Notez que les granules intestinaux C. elegans sont autofluorescents, de sorte qu’il y aura un signal de fond. Mais dans l’ensemble, une fluorescence intestinale plus élevée indique une perméabilité plus élevée.
Dans le protocole d’exemple, nous allons atténuer l’effet du traitement avec la biomolécule DIM sur la perméabilité intestinale des vers infectés par les bactéries pathogènes Pseudomonas aeruginosa.
- Préparer les plaques complétées par fitc-dextran en mélangeant 2 millilitres d’E inactivé par la chaleur. coli avec 4 milligrammes de FITC-dextran. Ajouter 100 microlitres du mélange à chacune des 20 plaques d’agar NGM fraîches et laisser sécher les plaques pendant une heure sur un banc de laboratoire propre. Après 48 heures de traitement, laver les vers avec S Buffer. Les transférer dans des assiettes complétées fitc-dextran et dans des plaques NGM sans FITC-dextran et incuber les plaques pendant la nuit.
Le lendemain, lavez les vers avec du tampon S et laissez-les ramper dans la plaque d’agar NGM fraîche pendant une heure. Ajoutez 50 microlitres de formaldéhyde de 4 % à chaque puits d’une plaque noire à fond plat de 96 puits et transférez environ 50 vers dans chaque puits. Après 1 à 2 minutes, retirez tout le formaldéhyde et ajoutez 100 microlitres de milieu de montage dans chaque puits.
- Le formaldéhyde est un produit chimique toxique et doit être manipulé avec soin.
