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- Die Haut ist ein komplexes Organ, das aus verschiedenen Zellpopulationen besteht, die in mehreren Schichten angeordnet sind. CUBIC, ein auf Gewebereinigung basierendes dreidimensionales Bildgebungsverfahren, hilft dabei, Proteinexpressionsmuster in diesen Hautzellen mithilfe von Ganzhautbiopsien zu visualisieren. Beginnen Sie damit, eine euthanasierte Maus zu nehmen und Haare aus der Nackenregion zu entfernen. Schneiden Sie ein Stück Haut heraus und schneiden Sie es in kleine Stücke.
Tauchen Sie die Stücke in eine CUBIC1 Reinigungslösung und inkubieren Sie. Hautzellen sind aufgrund des Vorhandenseins von Chromophoren und Lipiden, die Lichtstreuung verursachen, undurchsichtig. Die Chemikalien in der CUBIC-Lösung entfernen diese Moleküle, wodurch die Lichtstreuung reduziert und das Gewebe transparent wird.
Behandeln Sie anschließend das Gewebe mit den gewünschten Primärantikörpern, die spezifisch an ihre intrazellulären Zielproteine binden, die in Hautzellen exprimiert werden. Behandeln Sie ferner mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern, die an die Protein-Primärantikörper-Komplexe binden. Färben Sie das Gewebe mit einem DNA-bindenden Farbstoff, der den Zellkern färbt.
Tauchen Sie die Probe abschließend in eine CUBIC2-Lösung. Die Lösung reduziert die Lichtstreuung im Gewebe weiter und macht es für die Bildgebung transparenter. Beobachten Sie unter einem konfokalen Mikroskop, um fluoreszenzmarkierte Bereiche von Interesse in der dreidimensionalen Probe zu visualisieren. Das folgende Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Expression von Keratinozytenproliferationsmarkern in Ganzhautbiopsien unter Verwendung des CUBIC-Protokolls.
- Beginnen Sie damit, die Haare vom Hals einer eingeschläferten Maus mit Trimmern zu rasieren, und achten Sie darauf, die Haut nicht zu verletzen. Dekontaminieren Sie dann die Haut mit 70% Ethanol in PBS. Heben Sie anschließend die Haut des hinteren Halses mit einer Pinzette an und entfernen Sie mit einer Schere einen etwa 1,5 x 4 Zentimeter großen Bereich der dorsalen Maushaut. Glätten Sie dann die Haut mit der Dermisseite nach unten auf einem Stück Filterpapier, notieren Sie sich die anterior-hintere Ausrichtung der Probe und schneiden Sie das Papier um die präparierte Haut herum.
- Für eine optimale Bildgebung müssen die Hautproben flach bleiben und die Haarfollikel konsistent ausgerichtet sein. Um die Proben in einer korrekten antero-posterioren Position zu halten, fixieren wir die Hautstücke in rechteckigen Biopsien auf Filterpapier.
- Übertragen Sie die Proben in ein 15-Milliliter-Röhrchen, das mit frisch zubereitetem 4% PFA in PBS gefüllt ist. Wenn sie fest mit dem Filterpapier verbunden sind, werden die Proben für zwei 5-Minuten-Wäschen in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen PBS umgefüllt.
Um die Hautbiopsien nach dem zweiten Waschen zu entfernen, schneiden Sie das Gewebe mit einer scharfen Rasierklinge in etwa 0,2 x 0,5 Zentimeter große Stücke und achten Sie darauf, dass die längeren Seiten der Proben entlang der anterior-hinteren Richtung der Proben geschnitten werden.
- Das Schneiden der längeren Seite der Biopsie parallel zur Ausrichtung der Haarfollikel hilft auch, umfangreiche Schäden an den Haarfollikeln zu vermeiden.
- Tauchen Sie dann die Biopsien in 5 Milliliter frisch zubereiteter CUBIC1-Reinigungslösung in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen und legen Sie das Röhrchen auf eine rotierende Plattform in einem Hybridisierungsofen bei 37 Grad Celsius. Sobald die Gewebestücke transparent sind, waschen Sie die Biopsien in 4 Millilitern PBS für vier 6-stündige Wäschen bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einer 4-stündigen Wäsche bei 37 Grad Celsius in 20 % Gewichtsprozent pro Volumensaccharose in PBS.
Am Ende der Inkubation frieren Sie jede Probe in einer Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur in einzelnen 15-Milliliter-Röhrchen über Nacht bei minus 80 Grad Celsius ein, um die Durchlässigkeit des Gewebes für das Eindringen von Antikörpern zu erhöhen.
Färben Sie die Hautproben am nächsten Morgen mit den entsprechenden Antikörpern und lebenswichtigen Farbstoffen. Anschließend werden die Proben in 1 Milliliter frisch zubereiteter CUBIC2-Reinigungslösung in 2-Milliliter-Röhrchen auf einem Schüttler 24 Stunden lang im 37 Grad Celsius heißen Ofen inkubiert, um den Brechungsindex des Gewebes auszugleichen.
Wenn das Gewebe klar ist, positionieren Sie die Biopsien entlang der längeren Seite der einzelnen Glasdeckgläser so, dass die Richtung des Haarfollikelwachstums parallel zur Deckglasoberfläche verläuft. Geben Sie einen Tropfen CUBIC2-Lösung auf das Gewebe. Legen Sie zwei 1 Millimeter x 2 Zentimeter große Streifen blauen Klebers auf ein Deckblatt. Decken Sie dann die Biopsie mit einem zweiten Deckglas ab.
Stellen Sie dann die Bildgebungskammer auf einen konfokalen Mikroskoptisch und bewegen Sie das Gewebe in den Lichtweg. Scannen Sie die Probe mit der geeigneten Lichtquelle und Standard-Epifluoreszenzfiltern, um fluoreszierend gefärbte Bereiche von Interesse zu identifizieren. Nehmen Sie dann fluoreszierende konfokale Bilder der interessierenden Regionen auf.
