CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zellproliferation und die Proteinexpressionsmuster auf Einzelzellebene dreidimensional sichtbar zu machen und die Anatomie und Pathologie der Haut genau zu beurteilen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen darüber zu beantworten, wie zelluläre und molekulare Mechanismen die Entwicklung und Regeneration der Epidermis steuern und wie diese Mechanismen bei Hauterkrankungen gestört werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein technisch einfaches Protokoll zur Visualisierung einzelner Zellen in Hautbiopsien in voller Dicke in drei Dimensionen mit einer beispiellosen Genauigkeit handelt.

Die Methode ermöglicht auch die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Epidermis und Dermis in vollständigen Hautproben. Im Allgemeinen könnten Forscher, die neu in dieser Methode sind, etwas Schwierigkeiten haben, die kleinen flachen Hautbiopsien vorzubereiten, ohne die Haarfollikel zu beschädigen. Betty Maclarios, Doktorandin an der Abteilung für Entwicklungs- und regenerative Dermatologie an der UNSW Australien, wird das Verfahren vorführen.

Beginnen Sie damit, die Haare vom Hals einer eingeschläferten Maus mit Trimmern zu rasieren, und achten Sie darauf, die Haut nicht zu verletzen. Dann dekontaminieren Sie die Haut mit 70% Ethanol und PBS. Heben Sie anschließend die Haut des hinteren Halses mit einer Pinzette an und entfernen Sie mit einer Schere einen etwa 1,5 x 4 cm großen Bereich der dorsalen Maushaut.

Glätten Sie dann die Hautdermisseite nach unten auf einem Stück Filterpapier, notieren Sie sich die vordere hintere Ausrichtung der Probe und schneiden Sie das Papier um die präparierte Haut herum ab. Für eine optimale Bildgebung müssen die Hautproben flach und mit gleichbleibender Ausrichtung der Haarfollikel bleiben. Um die Proben in der richtigen vorderen hinteren Position zu halten, fixieren wir die Hautstücke in rechteckigen Biopsien auf dem Filterpapier.

Übertragen Sie die Proben in ein 15-ml-Röhrchen, das mit frisch zubereiteten 4%PFA und PBS gefüllt ist. Wenn sie fest auf dem Filterpapier fixiert sind, werden die Proben für zwei fünfminütige Wäschen in ein neues 15-ml-Röhrchen PBS umgefüllt. Um die Hautbiopsien zu entfernen, schneiden Sie das Gewebe nach dem zweiten Waschen mit einer scharfen Rasierklinge in etwa 0,2 x 0,5 cm große Stücke und achten Sie darauf, dass die längeren Seiten der Proben entlang der vorderen hinteren Richtung der Proben geschnitten werden.

Das Schneiden entlang der Seite der Biopsie parallel zur Ausrichtung der Haarfollikel hilft auch, umfangreiche Schäden an den Haarfollikeln zu vermeiden. Sie tauchen die Biopsien in 5 mL frisch zubereiteter cubic one Clearing-Lösung in ein neues 15 mL Röhrchen und legen das Röhrchen auf eine rotierende Plattform in einem Hybridisierungsofen bei 37 Grad Celsius. Sobald die Gewebestücke transparent sind, waschen Sie die Biopsien in 4 ml PBS für vier, sechsstündige Wäschen bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einer vierstündigen Wäsche bei 37 Grad Celsius in 20 % Gewicht pro Volumen, Saccharose und PBS.

Am Ende der Inkubation frieren Sie jede Probe in einer Verbindung mit optimaler Schneidtemperatur in einzelnen 15-ml-Röhrchen über Nacht bei 80 Grad Celsius ein, um die Durchlässigkeit des Gewebes für das Eindringen von Antikörpern zu erhöhen. Färben Sie die Hautproben am nächsten Morgen mit den entsprechenden Antikörpern und lebenswichtigen Farbstoffen. Dann inkubieren Sie die Proben in 1 ml frisch zubereiteter kubischer Zwei-Reinigungslösung in 2-ml-Röhrchen auf einem Schüttler für 24 Stunden im 37 Grad Celsius Ofen, um den Brechungsindex des Gewebes auszugleichen.

Wenn das Gewebe klar ist, positionieren Sie die Biopsien entlang der längeren Seite der einzelnen Glasdeckgrüsser so, dass die Richtung des Haarfollikelwachstums parallel zur Deckglasoberfläche verläuft. Geben Sie einen Tropfen Kubik-Zwei-Lösung auf das Gewebe. Legen Sie zwei 1 ml x 2 cm große Streifen blauen Klebers auf ein Deckglas und decken Sie dann die Biopsie mit einem zweiten Deckglas ab.

Stellen Sie dann die Bildgebungskammer auf einen konfokalen Mikroskoptisch und bewegen Sie das Gewebe in den Lichtweg. Scannen Sie die Probe mit der geeigneten Lichtquelle und Standard-Epifluoreszenzfiltern, um fluoreszierend gefärbte Bereiche von Interesse zu identifizieren, und nehmen Sie dann fluoreszierende konfokale Bilder der interessierenden Regionen auf. Mit dieser Methode können beide dorsalen Hautbiopsien von adulten Wildtyp-Mäusen geklärt und mit Antikörpern gegen den basalen Keratinozytenmarker Keratin 14 gefärbt werden.

Pappy-positive Kerne sind in der gesamten Probe sichtbar und ermöglichen die Würdigung einiger anatomischer Merkmale, wie z. B. der dermalen Papillen. Die K14-Färbung ist in der eine Zelle dicken Basalschicht der interfollikulären Epidermis sichtbar. Umriss der Talgdrüsen und der äußeren Wurzelscheiden der Haarfollikel und in den sekundären Haarkeimen, wobei nur geringe Mengen an K14-Expression im Wölbungsbereich der Haarfollikel nachgewiesen werden konnten.

Um die proliferierenden Zellen zu visualisieren, können Biopsien der dorsalen Haut in voller Dicke an Telogenen von adulten Wildtyp-Mäusen geklärt und gefärbt werden, wie gezeigt wurde, was das Vorhandensein von proliferierenden Keratinozyten in der basalen interfollikulären Epidermis und im Isthmus zeigt, jedoch nicht in der Wölbungsregion der Haarfollikel. Um die Talgdrüsen sichtbar zu machen, können Biopsien der dorsalen Haut in voller Dicke am Antigen adulter Wildtyp-Mäuse geklärt und gefärbt werden, was den Nachweis der Talgdrüsen im Isthmusbereich der Haarfollikel erleichtert. Um morphologische Veränderungen in der Epidermis und bei transgenen Tieren sichtbar zu machen, können Biopsien der dorsalen Haut in voller Dicke geklärt und gefärbt werden, die eine Hyperplasie der interfollikulären Epidermis und abnormale Haarfollikel mit K14-markierten Zellmassen zeigen, die sich proximal in die Dermis erstrecken und die vergrößerten transgenen Stammzellpopulationen repräsentieren.

Nachdem wir uns dieses Video angesehen haben, sollten wir ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hautproben aufbereitet und klärt und wie man Proteinexpressionsmuster mit Einzelzellauflösung in drei Dimensionen visualisiert. Diese Methode ist einfach durchzuführen und verwendet relativ sichere und kostengünstige Reagenzien. In Zukunft werden weitere Antikörper auf ihre Kompatibilität mit dieser Methode getestet, so dass diese Analyse erweitert werden kann, um mehr Proteine und bestimmte Arten von Interesse sichtbar zu machen.

Andere bildgebende Verfahren wie die Lichtblattmikroskopie können zur Visualisierung der Hautanatomie und der Proteinexpressionsmuster größerer Hautproben in drei Dimensionen durchgeführt werden. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Dermatologie ebnen, um die zellulären und molekularen Wechselwirkungen zwischen Dermis und Epidermis in der Hauthomöostase, in genetisch veränderten Mausmodellen und in einem unserer Modelle für Hautkrankheiten zu erforschen.