Name: CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Erfahren Sie das CUBIC-Protokoll zur Visualisierung von Proteinen in vollständigen Mäusehautbiopsien mit Einzelzellauflösung. Diese Methode ermöglicht präzise 3D-Analysen der Hautanatomie und Pathologie.

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Wir danken australischen Bio-Ressourcen (Garvan Institute, Australien), die biologische Ressourcen Centre (UNSW Australien) und der Animal Care &amp; Ethik-Kommission für die Unterstützung bei Tierversuchen. Diese Arbeit wurde von der National Health and Medical Research Council of Australia (Projektstipendium APP1062720) unterstützt. Dr. Cesar P. Canales ist Empfänger eines CONICYT-Becas Chile Stipendium (# 72101076). Herr Bassem Akladios ist ein Empfänger der Universität International Postgraduate Award von UNSW Australien.

Ethikerklärung: Alle Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden folgen den Richtlinien der Animal Care and Ethics Committee (ACEC) bei UNSW Australien unter ACEC genehmigten Protokoll 13 / 64B. 1. Vorbereitung der Transparent-Maus Hautgewebe Anmerkung: Alle Mäuse in dieser Studie verwendet wurden, waren auf einer C57BL / 6 genetischen Hintergrund <ol><li> Sammlung der Maushautgewebe. <ol><li> Human euthanize die Mäuse durch zervikale Dislokation. </li><li> Sorgfältig Haare aus dem jeweiligen Hautbereich zu entfernen mit einem Trimmer kümmert sich nicht um die Haut zu verletzen. </li><li> Haut mit 70% Ethanol in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) zu dekontaminieren. </li><li> Heben Sie dorsalen Halshaut mit einer Pinzette und machen Schnitt mit einer Schere. </li><li> Sezieren einen großen Bereich der dorsalen Haut von Mäusen (ca. 1,5 x 4 cm). </li><li> Flatten Haut Dermis-Seite nach unten auf einem Filterpapier, und notieren Sie sich die anterior-posteriore Ausrichtung der Probe. </li><li> Trim Filterpapier um den sezierten Haut und in einem 15 ml Röhrchen mit frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd (PFA) -Lösung in PBS gefüllt. </li><li> Fix für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht im Kühlschrank bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Haut 2 x 5 min in PBS in einem 15-ml-Tube. Hinweis: Die folgenden (1.1.10 - 1.1.12) sind optionale Schritte zur Langzeitlagerung von Gewebe. </li><li> Dehydratisieren seziert Haut in PBS mit einer Konzentration von Ethanol Erhöhung (25%, 50% 70%) in einem 15 ml-Röhrchen während 1-stündigen Waschschritte bei Raumtemperatur. </li><li> Lagern Sie dehydrierte Haut in 70% Ethanol in PBS in einem 15-ml-Röhrchen bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li><li> 4 Stunden vor dem Clearing, das Hautgewebe in PBS rehydriert mit Ethanolkonzentration abnimmt (70%, 50%, 25%, 0%) in einem 15-ml-Röhrchen während 1-stündigen Waschschritte bei Raumtemperatur. </li></ol></li><li> Löschen der Maus Hautbiopsien <ol><li> Bereiten Sie die CUBIC1 Klärlösung durch Auflösen 3,85 g Harnstoff und 3,85 g N, N, N &#39;, N&#39;Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin in 5,38 ml Wasser auf die Heizung auf 60 eingestellt destilliert - 70 ° C. Verwenden Sie einen heißen Rührer. </li><li> Hinzufügen, 2,31 g Polyethylenglykol-mono-p-isooctylphenylether / Triton X-100 zu der Lösung, wenn es klar ist, und auf Raumtemperatur abgekühlt. </li><li> Schneiden Sie die Haut von Mäusen mit einer scharfen Rasierklinge in Biopsien von ungefähren Abmessungen 0,2 x 0,5 cm, und in 5 ml CUBIC1 Clearing-Lösung in einem 15-ml-Röhrchen versenken. Um die Visualisierung der Haarfollikel zu optimieren, dass die längere Seite der Biopsie entlang der antero-posterioren Richtung der Probe geschnitten wird. </li><li> Platzieren auf einer rotierenden Plattform in einem Hybridisierungsofen bei 37 ° C. </li><li> Ändern Sie den Clearing-Lösung nach 7 Tagen. Bereiten Sie frische CUBIC1 Lösung vor der Verwendung. </li><li> Überprüfen Sie die Transparenz des Gewebes nach 7 Tagen. Bei Bedarf lassen Biopsien in CUBIC1 Clearing-Lösung, bis das Gewebe vollständig transparent ist. </li><li> Sobald die Hautbiopsie ist transparent,Entfernen Sie die CUBIC1 Lösung und 4 ml 1 × PBS, das Gewebe 4 mal 6 Stunden bei 37 ° C zu waschen. </li><li> Waschen Sie die Hautgewebe in 20% w / v Sucrose in PBS in einem 15 ml Röhrchen für 4 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Frieren Sie das Gewebe in Eindeckmediums optimale Schnitt Temperatur (OCT) Verbindung in einem 15-ml-Röhrchen über Nacht in einem -80 ° C Gefrierschrank. Hinweis: Dieser Schritt der Biopsie der Permeabilität für die Antikörper-Penetration in den nachfolgenden Schritten wird zunehmen. </li></ol></li></ol> 2. Immunfluoreszenzanfärbung <ol><li> Auftauen Gewebe aus 1.2.9) auf Raumtemperatur für 2 - 3 Stunden. </li><li> Wasch Gewebe in der 15-ml-Röhrchen mit 5 ml PBS für 8 h bei Raumtemperatur OCT-Verbindung zu entfernen. </li><li> Transfer Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, und Inkubieren Gewebe in 1 ml Kaninchen-anti-Keratin14 oder Kaninchen-Anti-Ki67-Antikörper, beide verdünnt 1: 100 in PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) für 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 ° C heißen Ofen. </li><li> Transfer-Biopsien in ein 15-ml-Röhrchen, einnd waschen Gewebe 4 mal für 6 Stunden in 5 ml PBST auf einem Schüttler in einem 37 ° C-Ofen. </li><li> Transfer-Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, 1 ml Anti-Kaninchen-Alexa594 sekundären Antikörper 1: 100 verdünnt in PBST und Inkubation 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 ° C warmen Ofen. </li><li> Transfer Biopsien in ein 15 ml-Röhrchen und wasche 4 Mal Gewebe für 6 Stunden in 5 ml PBST auf einem Schüttler in einem 37 ° C-Ofen. </li><li> Transfer-Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, 1 ml 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Kern counterstain Lösung (1: 1000) in PBST und Inkubation über Nacht auf einem Schüttler in einem 37 ° C warmen Ofen. </li><li> Entfernen DAPI Gegenfärbelösung und 1 ml PBST auf die 2-ml-Röhrchen Gewebe 4 mal 6 Stunden auf einem Schüttler in einem 37 ° C warmen Ofen zu waschen. Hinweis: Optional Schritt: Biopsien können im Dunkeln in 1x PBS mit 0,02% Natriumazid für mindestens 3 Wochen gelagert werden. </li></ol> 3. Nil-Rot-Färbung <ol><li> Auflösen Nile Red Pulver in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml </li><li> 1 &amp; mgr; l Nile Red Lösung auf 1 ml PBS auf eine Endkonzentration von 1 &amp; mgr; g / ml. </li><li> Auftau-Gewebe aus 1.2.9) auf Raumtemperatur für 2 bis 3 h und wasche mit 5 ml PBS für 8 h bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen und unterzutauchen Gewebe in 1 ml Nile Red Färbelösung 2,5 h bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Hautbiopsien in der 2-ml-Röhrchen mit 1 ml PBST 4 mal für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen PBST-Lösung aus dem 2-ml-Röhrchen, 1 ml DAPI Kern Gegenfärbelösung (1: 1000) in PBST und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Entfernen DAPI Gegenfärbelösung, und fügen Sie 1 ml PBST im 2-ml-Röhrchen das Hautgewebe 4 mal 6 Stunden bei Raumtemperatur zu waschen. Hinweis: Optional Schritt: Biopsien können im Dunkeln in 1x PBS mit 0,02% Natriumazid für mindestens 3 Wochen gelagert werden. </li></ol> 4. Imaging <ol><li> Bereiten Sie die CUBIC2 Clearing-Lösung, die 50 enthält% (W / v) Saccharose, 25% (w / v) Harnstoff, 10% (w / v) 2,2 &#39;, 2&#39; &#39;- Nitrilotriethanol und 0,1% (v / v) Triton X-100. </li><li> Inkubiere das Hautgewebe in 1 ml CUBIC2 Lösung in einem 2-ml-Röhrchen auf einem Schüttler für 24 h in einem 37 ° C-Ofen. Dieser Schritt wird der Brechungsindex des Gewebes gleichmäßig. </li><li> Überprüfen Sie die Klarheit des Gewebes. Sobald es klar ist, positionieren die gesamte Hautbiopsie (0,2 x 0,5 cm) an seiner längeren Seite auf einem Deckglas, so dass die Richtung der Länge der Haarfollikel ist parallel zur Deckfläche (# 1 24 x 60 mm) Hinweis: Optional Schritt: Antikörper-gefärbten Biopsien für ungefähr 7 Tage in CUBIC2 Lösung gelagert werden. Nile Red-gefärbten Biopsien können nur für bis zu 1 Tag in CUBIC2 Lösung gelagert werden und sollte so schnell wie möglich abgebildet werden. </li><li> Bereiten Abbildungskammer (Abbildung 1) Hinweis: Verbrauchsmaterialien für die Herstellung der Abbildungskammer erforderlich sind: blau tack, Knete oder ähnlich, und zwei Deckgläser (24 x 50 mm) (Fild 1A). <ol><li> Bereiten Sie zwei dünne Streifen blau Tack (Durchmesser ca. 1 mm x 2 cm) und zwei Deckgläser (1B). </li><li> Legen blau tack Streifen auf einem Deckglas, so dass genügend Platz für die Hautbiopsie (1C). 4.4.3) </li><li> Platzieren Hautbiopsie in zwischen den Streifen auf dem Deckglas in einem Tropfen CUBIC2 Lösung (1C). </li><li> Bedecken Hautbiopsie mit dem zweiten Deckglas (1D). </li></ol></li><li> Setzen Sie die Druckkammer mit der montierten Hautbiopsie auf die Bühne eines konfokalen Mikroskops und das Gewebe in den Lichtweg zu bewegen. </li><li> Scannen Sie die Probe unter Verwendung eines Quecksilber oder Halogen - Lichtquelle und Standard - Epifluoreszenz - Filter (zB DAPI / GFP / Cy3 / Cy5) zu fluoreszierend gefärbten Regionen von Interesse zu identifizieren. </li><li> Bildbereiche von Interesse unter Verwendung eines 10X und 20X Objektiv (NA 0,75) und Standard - konfokale Fluoreszenz - Imaging - Techniken (z. B. mit DAPI gefärbten Proben beleuchten mit einem 405-nm-Laser und sammeln Fluoreszenzsignal zwischen 425-475 nm und mit Alexa Fluor 594 oder Nile Red-gefärbten Proben beleuchten mit einem 561-nm-Laser und sammeln Fluoreszenzsignal zwischen 570-620 nm). </li><li> Generieren Bild Z-Stapel jeder Region von Interesse unter Verwendung des Mikroskops Z-Stapel Bildaufnahme - Software (z. B. unter Verwendung von NIS Elemente Imaging Software 4.13 wie unten beschrieben). <ol><li> Sorgen für eine optimale Laserleistung und PMT HV / Offset-Einstellungen ausgewählt wurden Probenfluoreszenz zu sammeln. </li><li> Öffnen Sie die &quot;ND Acquisition&quot; Symbolleiste &quot;Acquisition Controls&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Z-Serie Setup&quot; Register (sicherzustellen, dass alle anderen Registerkarten nicht ausgewählten) sind. </li><li> Während Live-Scannen, den Fokus auf das obere Ende der Probe und drücken Sie die &quot;Top&quot; Taste. </li><li> Fokus auf der Unterseite der Probe und drücken Sie die &quot;Unten&quot; -Taste. </li><li> Eingabe erforderlich Schrittgröße (oder drücken Schrittgröße Taste optimiert). </li><li> Vorss die &quot;Run now&quot; klicken. </li><li> Speichern resultierende Z-Stapel als einzelne Tiff Bildstapel (1 Fluorochrom pro Bild Z-Stack). </li></ol></li><li> Verwenden Bild Z-Stapel 3D - Volumen Regionen von Interesse mit Hilfe von 3D - Analyse - Software zu rekonstruieren (z. B. unter Verwendung von Imaris x64 7.2.3 wie unten beschrieben). <ol><li> Starten Sie Analyse-Software. </li><li> Wählen Sie &quot;Surpass&quot; Button in der Toolbar für 3D-Volumen Generation. </li><li> Öffnen erstes Farbbild Z-Stapel (z. B. DAPI). </li><li> Verwenden Sie den &quot;Channel hinzufügen&quot; Tool zusätzliche Farbkanäle hinzuzufügen, einen Kanal pro Fluorochrom. So wird eine Probe sowohl DAPI und Alexa Fluor 594 Fluorochrome enthalten, werden zwei Kanäle erfordern. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Bild-Eigenschaften&quot; Werkzeug richtig Pixel (Voxel) Dimensionen (XYZ) zu setzen, wie in 4.7 oben bestimmt. </li><li> Verwenden Sie &quot;Display - Einstellung&quot; Werkzeugkanal Farben nach Bedarf zu ändern (zB Set DAPI Kanal zu blau, Alexa Fluor 594 - Kanal rot). </li><li> Um position das 3D-Volumen im Bildfenster, verwenden Sie die Computer-Maus nach Bedarf durch Klicken und Ziehen Volumen. </li><li> Verwenden Sie den &quot;Snapshot&quot; Werkzeug in der Werkzeugleiste Screenshots des 3D-Bild zu erzeugen. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Animation&quot; in der Werkzeugleiste Filme von 3D-Probenrotation zu erzeugen. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+the+surface+of+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).</li>
<li>Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells: an update.</a> Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).</li>
<li>Hardy, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secret+life+of+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The secret life of the hair follicle.</a> Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).</li>
<li>Lim, X., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+in+skin+development%2C+homeostasis%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).</li>
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<li>Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
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<li>Fuchs, E., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+keratin+gene+expression+during+terminal+differentiation+of+the+keratinocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte.</a> Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).</li>
<li>Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Hamilton, E., Potten, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+hair+plucking+on+the+turnover+time+of+the+epidermal+basal+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Kinet%22%5BJournal%5D)">Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer.</a> Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).</li>
<li>Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+a+slowly+cycling+subpopulation+of+adult+murine+epidermal+cells+retains+carcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen.</a> Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).</li>
<li>Schweizer, J., Marks, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+study+of+the+distribution+and+frequency+of+Langerhans+cells+in+relation+to+formation+of+patterning+in+mouse+tail+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis.</a> J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. (88), e51749(2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die regulatorischen Mechanismen steuern Haut Entwicklung und Homöostase werden am häufigsten in 2D untersucht unter Verwendung von Gewebe Schnitte und histologischen Färbung oder die Markierung mit Antikörpern, die nur eine eingeschränkte Anerkennung der Hautmorphologie, Zellpopulationen oder Proteinexpression ermöglicht. Eine Anzahl von Verfahren wurden die Visualisierung der räumlichen Organisation von Zellen und Proteinen an Einzelzellauflösung in 3 Dimensionen in epidermal ganze Halterungen 10-13 zu verbe...

Die Haut ist wichtig für unser Überleben. Es besteht aus drei Hauptschichten die äußeren Epidermis, die Dermis und die Hypodermis. Die Epidermis ist ein hoch regenerative Gewebe. Es ist ein Plattenepithelkarzinom geschichteten Epithels, bestehend hauptsächlich aus Keratinozyten. Keratinozyten sind in der basalen Schicht geboren und nach oben durch die Suprabasalschichten bewegen, während Differenzierung, und schließlich werden sie in der äußeren Hornschicht etwa einen Monat nach ihrer Geburt zu vergießen. Die Epidermis entsteht eine Reihe von Anhängsel einschließlich der Haarfollikel und Talgdrüsen. Die Haarfollikel regenerieren auch in einer zyklischen Art und Weise während des gesamten Lebens 1. Die regenerative Kapazität der Epidermis wird durch die Anwesenheit von Stamm- und Vorläuferzellen aktiviert , die in der Basalschicht der Epidermis und interfollikulären Haarfollikel 2 befinden. Viele Signalwege wurden in epidermalen Entwicklung und Regeneration gebracht. Einige davon treten innerhalbdie Epidermis nur, wie das Hedgehog-Weg. Andere Signalereignisse stattfinden zwischen Dermis und Epidermis 3. Zum Beispiel Wnt - Signale von der Dermis sind gedacht für Haarfollikel - Entwicklung wichtig zu sein, und sie werden von der dermalen Papille zu Beginn der anagenen sekretiert Haarfollikel Ausbuchtung Stammzellen / Vorläuferzellproliferation und Haarfollikel Wachstum 4 aktivieren. Es ist wichtig, die zellulären und molekularen Mechanismen zu verstehen, die den epidermalen Entwicklung und Regeneration zu steuern, besser zu verstehen, wie sie in der regenerativen Hautkrankheit gestört werden kann, wie Hautkrebs. Dieser Artikel beschreibt eine C lear, nobstructed U B regen I maging Cocktails und C omputational Analyse (kubisch) Protokoll 5-7 ganze Berg Hautpräparate zu klären und Proteinexpressionsmuster in drei Dimensionen auf Einzelzellauflösung durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen. Die CUBIC Verfahren beinhaltet das Eintauchen HautGewebe in zwei Aminoalkohol-basierten chemischen Cocktails. Diese Lösungen stellen Sie die Brechungsindizes in der Hautprobe, so dass das Gewebe transparent und die Proteine ​​intakt, so dass Immunnachweis auf Einzelzellauflösung. Mit diesem CUBIC-Protokoll, die basale und wuchernden Keratinozyten-Populationen in den interfollikulären Epidermis und im Haarfollikel wurden in Vollhautbiopsien von Wildtyp-Mäusen unter Verwendung von Anti-Keratin14 (K14) und Anti-Ki67-Antikörper abgebildet. Talgdrüsen in Wildtyp- Hautbiopsien wurden auch Färbung mit Nile Red sichtbar gemacht. Schließlich wurden 8 verglichen die basalen Keratinozyten - Populationen in Wildtyp- und hyperplastischem YAP2-5SA-&amp; Delta; C Hautbiopsien. Dieses CUBIC-Protokoll ermöglicht die visuelle Beurteilung der Proteinexpression in Vollhautbiopsien bei Einzelzellauflösung und ist ein wichtiges Instrument epidermalen Anatomie und morphologische Defekte in der Haut von gentechnisch veränderten zu schätzenMäuse und die zellulären und molekularen Mechanismen der epidermalen Entwicklung und Regeneration zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P6418</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96% (nicht denaturiert)</td><td>Chem-supply</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>Nilrot</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>72485-100MG</td><td></td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N' -Tetrakis (2-Hydroxypropyl)-, Ethylendiamin</td><td>, Merck Millipore</td><td>821940</td><td></td></tr>, <tr><td>Polyethylenglykolmono-p-isooctylphenylether</td>, <td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td>, <td>Merck Millipore</td><td>648462</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td>, <td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr>Compound <td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Keratin14-Antikörper</td> für optimale Schnitttemperatur (OCT) <td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ki67-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>Esel Anti-Kaninchen Alexa 594</td><td>Life Technologies</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Merck Millipore</td><td>66612</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;,2&prime; '-nitrilotriethanol</td><td>Merck Millipore</td><td>137002</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Nikon Instruments Inc Nikon A1</td><td>- Konfokalmikroskop</td><td></td></tr><tr><td>cruZer6 Gesichtstrimmer</td><td>Braun</td><td>Braun cruZer6 Gesicht</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td></td><td></td>438456</tr></tbody></table>

cubic protokoll visualisiert expression protein bei single cell resolution in ganze berge vorbereitung der haut

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

Die Haut ist wichtig für unser Überleben. Die äußere Schicht der Epidermis besteht aus den interfollikulären Epidermis, die eine geschichtete Plattenepithel ist die meisten unserer Körper abdeckt und epidermalen Anhangs wie die Haarfollikel und Schweißdrüsen. Die Epidermis erfährt Regeneration während des Lebens und in Reaktion auf eine Verletzung. Dies wird ermöglicht durch K14-exprimierenden basal epidermalen Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen, die von mehreren Regulationsmechanismen streng reguliert werden aktiv in der Epidermis und zwischen Epidermis und Dermis. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, mit voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und K14-Protein-Expressionsmuster visualisieren, Ki67 Zellen markiert wuchernden, Nile Red markierten Sebozyten und DAPI Kern Kennzeichnung auf Einzelzell Auflösung in 3D. Diese Methode ermöglicht eine genaue Bewertung und Quantifizierung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien. Das CUBIC-Protokoll ist the beste Methode bisher verfügbaren molekularen und zellulären Wechselwirkungen in Vollhautbiopsien bei einzelnen Zelle Auflösung zu untersuchen.

Volle Dicke dorsalen Hautbiopsien von erwachsenen Wildtyp - Mäuse wurden geklärt, gefärbt mit einem Antikörper - Bindung basalen Keratinozyten Marker Keratin14 (K14) und Kerne wurden counterstained mit DAPI - Färbelösung (Abbildung 2 und Film 1). DAPI-positiven Kerne sichtbar waren in der gesamten Probe (2A, C) und K14 - Färbung sichtbar war ausschließlich in der Ein-Zelle dick Basalschicht der interfollikulären Epidermis, und umreißt die Ta...

Dieser Bericht beschreibt ein kubischer Protokoll voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und Proteinexpressionsmuster, wuchernden Zellen und Sebozyten auf Einzelzell Auflösung in 3D visualisieren. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien.

CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Zellproliferation und die Proteinexpressionsmuster auf Einzelzellniveau in drei Dimensionen sichtbar zu machen und die Anatomie sowie Pathologie der Haut präzise zu beurteilen. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen darüber zu beantworten, wie zelluläre und molekulare Mechanismen die epidermale Entwicklung und Regeneration steuern und wie diese Mechanismen bei Hauterkrankungen gestört werden. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass es sich um ein technisch einfaches Protokoll handelt, mit dem einzelne Zellen in Vollhautbiopsien in drei Dimensionen mit beispielloser Genauigkeit visualisiert werden können.Die Methode erleichtert außerdem die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Epidermis und Dermis in vollen Hautproben. Im Allgemeinen könnten Forscher, die neu in dieser Methode sind, etwas Schwierigkeiten haben, die kleinen flachen Hautbiopsien vorzubereiten, ohne die Haarfollikel zu beschädigen. Die Durchführung des Verfahrens wird Betty Maclarios, eine Doktorandin an der Einheit für Entwicklung und regenerative Dermatologie an der UNSW Australia, demonstrieren.Beginnen Sie damit, mit einer Schere

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Biologie

Dieses Video beschreibt die CUBIC-basierte Visualisierungstechnik, eine gewebeclearingabhängige Bildgebungstechnik zur visuellen Beurteilung der Proteinexpression in Ganzsitz-Hautbiopsien mit Einzelzellauflösung in 3D. Dieses technisch einfache Protokoll ermöglicht die Visualisierung von Hautproteinen, ohne Hautschnitte vorzubereiten.

CUBIC-basierte Visualisierung der Proteinexpression: Ein Verfahren zur Visualisierung der Proteinexpression in Hautbiopsien von Mäusen in voller Dicke

Wir stellen eine Protokoll-Zellen abgeleiteten Matrices reich an extrazellulären Matrixproteinen zu erhalten, unter Verwendung von hochmolekularen Crowders (MMC). Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll, das MMC in 3D organotypischen Haut Co-Kultur-Generation enthält, die Kulturzeit reduziert, während Laufzeit von Konstrukt beibehalten wird.

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

Immunhistochemie ist eine leistungsfähige Labortechnik zur Bewertung der Proteinlokalisierung und -expression in Geweben. Aktuelle halbautomatische Methoden zur Quantifizierung führen zu Subjektivität und führen oft zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen. Darin beschreiben wir Methoden zur Multiplex-Immunhistochemie und zur objektiven Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisierung mittels multispektraler Bildgebung.

Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

Wir präsentieren eine Softwarelösung zur halbautomatischen Verfolgung der relativen Proteinkonzentration entlang der Länge der dynamischen zelligen Vorsprünge.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Diese Arbeit stellt ein neuartiges Verarbeitungs- und Abbildungsprotokoll für eine dicke, dreidimensionale Gewebequerschnittsanalyse dar, die die vollständige Ausnutzung konfokaler Bildgebungsmodalitäten ermöglicht. Dieses Protokoll bewahrt die Antigenität und stellt ein robustes System zur Analyse der Hauthistologie und potenziell anderer Gewebetypen dar.

Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Hier präsentieren wir Ihnen adressierbare Tröpfchen Microarrays (ADM-Dateien), ein Tröpfchen Array-basierte Methode absolute Protein Fülle in einzelnen Zellen zu bestimmen. Wir zeigen die Fähigkeit der ADM-Dateien, die Heterogenität im Ausdruck der Tumorsuppressor Protein p53 in einem menschlichen Krebs-Zell-Linie zu charakterisieren.

Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

Dieses Protokoll beschreibt, wie Hautkeratinozyten von Mausmodellen isoliert werden, mit metallmarkierten Antikörpern gefärbt werden und wie man gefärbte Zellen durch Massenzytometrie analysiert, um das Expressionsmuster von Proteinen zu profilieren, die in den verschiedenen Zellzyklusphasen von Interesse sind.

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

Morphologische Veränderungen treten in immunreagierenden Fibroblastenzellen nach aktivierung auf und fördern Veränderungen bei der Zellrekrutierung. Verwendung von 2-Photonen-Bildgebung in Verbindung mit einem gentechnisch veränderten Fibroblasten-spezifischen Protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) Mauslinie und grün fluoreszierend markiert Lipopolysaccharid-FITC, können wir hochspezifische Aufnahme von Lipopolysaccharid in dermalen Fibroblasten und morphologischen...

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Feinabstimmung von Regions of Interest (ROIs) für Spatial Omics-Technologien, um die Tumormikroumgebung besser zu charakterisieren und spezifische Zellpopulationen zu identifizieren. Für Proteomik-Assays können automatisierte, angepasste Protokolle die ROI-Auswahl leiten, während Transkriptomik-Assays mit ROIs von nur 50 μm fein abgestimmt werden können.

Räumliches Profiling der Protein- und RNA-Expression im Gewebe: Ein Ansatz zur Feinabstimmung der virtuellen Mikrodissektion

Eine kohärente Raman-Streubildgebungsmethodik zur Visualisierung und Quantifizierung pharmazeutischer Verbindungen in der Haut wird beschrieben. Dieses Papier beschreibt die Vorbereitung von Hautgewebe (Mensch und Maus) und die topische Formulierungsanwendung, die Bildaufnahme zur Quantifizierung der räumlich-zeitlichen Konzentrationsprofile und die vorläufige pharmakokinetische Analyse zur Beurteilung der topischen Arzneimittelabgabe.

Visualisierung und Quantifizierung pharmazeutischer Verbindungen in der Haut mittels kohärenter Raman-Streubildgebung

Die Kombination aus iterativem Bleaching-Extends-Multiplexity (IBEX) und einem kommerziellen Nukleotidmarkierungsassay (Click-iT EdU) ermöglicht den Nachweis und die Kategorisierung von sich teilenden Zelltypen in hochdynamischen Prozessen in fixierten gefrorenen murinen Gewebeschnitten. Darüber hinaus ermöglicht eine neuartige Open-Source-Bildverarbeitungspipeline eine Bilderfassung und -analyse mit hohem Durchsatz.

Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analyse-Workflow zur Bewertung von Hautzell-Phänotypen und Proliferationszuständen in Gewebeproben

Erfahren Sie das CUBIC-Protokoll zur Visualisierung von Proteinen in vollständigen Mäusehautbiopsien mit Einzelzellauflösung. Diese Methode ermöglicht präzise 3D-Analysen der Hautanatomie und Pathologie.

CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut

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