Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik
8. April 2016
Immunhistochemie ist eine leistungsfähige Labortechnik zur Bewertung der Proteinlokalisierung und -expression in Geweben. Aktuelle halbautomatische Methoden zur Quantifizierung führen zu Subjektivität und führen oft zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen. Darin beschreiben wir Methoden zur Multiplex-Immunhistochemie und zur objektiven Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisierung mittels multispektraler Bildgebung.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Proteinexpression und Co-Lokalisierung mittels multispektraler Bildgebung objektiv zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Grundlagenforschung und der diagnostischen Pathologie zu beantworten, z. B. wie Proteine ihre Expression und Lokalisation nach der Behandlung oder beim Fortschreiten der Krankheit verändern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Subjektivität des Bedieners beseitigt, die traditionellen Quantifizierungsmethoden innewohnt.
Um mit dem Quantifizierungsprozess zu beginnen, öffnen Sie die multispektrale Bildgebungssoftware, um eine Spektralbibliothek aus zuvor präparierten Kontrollobjektträgern, die mit einzelnen Chromogenen gefärbt wurden, und dem mit Hämatoxylin-gefärbten Objektträger zu erstellen. Öffnen Sie als Nächstes einen Bildwürfel, der von einem Objektträger aufgenommen wurde, und wählen Sie vier bis fünf positiv gefärbte Bereiche aus, um das Chromogen optisch zu definieren. Wiederholen Sie die Schritte mit Bildwürfeln aus anderen Steuerungsfolien, bis eine vollständige Spektralbibliothek erstellt wurde, die alle Chromogene darstellt, und speichern Sie dann die Spektralbibliothek.
Beginnen Sie ein neues Projekt in der Multispektral-Imaging-Software, indem Sie Multispektral oder im3 für die Bildformatoption und Hellfeld für das Probenformat auswählen. Konfigurieren Sie das Projekt, indem Sie Gewebe segmentieren, Merkmale suchen, Phänotypisierung, Score und Export auswählen. Ändern Sie bei Bedarf die Bildauflösung, um die Analysezeit zu verkürzen.
Importieren Sie die zuvor erstellte Spektralbibliothek und wählen Sie alle Chromogene aus, die in die Analyse einbezogen werden sollen. Öffnen Sie die Bildcubes, die in das Trainingsdataset aufgenommen werden sollen, indem Sie die Option Bildwürfel öffnen auswählen. Wählen Sie mindestens 18 % der Gesamtzahl der zu analysierenden Bilder aus, um die Genauigkeit des Trainings zu gewährleisten.
Wählen Sie als Nächstes den Trainingssatz von Bildern aus. Bilder, die alle Krankheitszustände darstellen, um die Segmentierungsgenauigkeit zu erhöhen. Nehmen Sie reichlich negative Färbebilder in den Trainingssatz auf, um Verzerrungen während dieses Schritts zu vermeiden.
Gleichen Sie die Bilder im Trainingssatz mit dem Weißabgleich ab, indem Sie die Pipette auswählen und einen Bereich in einem Bild auswählen, der weiß ist. Wählen Sie die Schaltfläche "Vor" aus, um die Gewebesegmentierung zu verschieben. Verwenden Sie dann das Panel "Gewebekategorien", um die Gewebetypen auszuwählen, die für eine genauere Lokalisierung des Proteingewebes analysiert werden sollen.
Beginnen Sie mit der Erstellung des Algorithmus und der Definition von Gewebekategorien, indem Sie das Zeichenstiftwerkzeug verwenden und Zellgruppen in Trainingsbildern zeichnen. Wenn Sie mit einer Gewebekategorie fertig sind, wiederholen Sie den Schritt für andere Gewebekategorien. Achten Sie darauf, Zellgruppen innerhalb von Bildern auszuwählen, die für den Gewebekategorietyp charakteristisch sind.
Wählen Sie Komponenten aus, die in das Training für den Gewebesegmentierer einbezogen werden sollen. Wählen Sie eine geeignete Musterskala, um den Gewebesegmentierer zu trainieren. Wählen Sie dann die Schaltfläche für den trainierten Gewebesegmentierer aus.
Beobachten Sie ein Popup-Fenster, in dem die Genauigkeit des Anteils der Pixel innerhalb ordnungsgemäß klassifizierter Trainingsbereiche angezeigt wird. Segmentieren Sie den gesamten Trainingssatz von Bildern, indem Sie auf Bilder segmentieren klicken. Wenn Sie fertig sind, überprüfen Sie den Trainingssatz, um falsch klassifiziertes Gewebe mit einem aktuellen Trainingsalgorithmus zu finden.
Wenn Sie mit den Ergebnissen des Gewebesegmentierungsalgorithmus zufrieden sind, wählen Sie die Schaltfläche "Erweitert". Stellen Sie sicher, dass die Zellkerne bereits ausgewählt sind, um Zytoplasma und/oder Membran auszuwählen. Wählen Sie die Registerkarte Kerne und wählen Sie die entsprechenden Einstellungen für die Kernsegmentierung.
Wählen Sie dann aus, ob einzelne oder alle Gewebekategorien in die Segmentierung einbezogen werden sollen. Wählen Sie den objektbasierten Schwellenwertansatz für die Gegenfärbung, um eine vereinfachte Methode zu erhalten, um gute Ergebnisse zu erzielen. Wählen Sie als Nächstes den objektbasierten Schwellenwertansatz für eine zuverlässige nukleare Gegenfärbung aus.
Wählen Sie zytoplasmaförmige Parameter aus, indem Sie die Registerkarte Zytoplasma auswählen. Wählen Sie als Nächstes den äußeren Abstand zum Kern aus. Wählen Sie dann die Mindestgröße aus.
Wählen Sie die nächste Optionskomponente mit primären, sekundären Optionen aus, und wählen Sie tertiär als sekundäre Optionen aus. Wechseln Sie zur Registerkarte Membran. Wählen Sie zuerst den verwendeten membranspezifischen Marker aus.
Passen Sie die optische Dichte oder OD des Skalenendwerts an, um für jeden Marker auf den Zellmembranen einen minimalen Schwellenwert oder einen positiven Schwellenwert zu finden. Fahren Sie mit der Registerkarte Membran fort und wählen Sie die maximale Zellengröße aus. Nachdem Sie alle Optionen ausgewählt haben, wählen Sie Alle segmentieren.
Wenden Sie die Einstellungen auf die Bilder an und beobachten Sie diese. Wählen Sie "Erweitert" aus, um zum IHC-Schritt "Bewerten" zu gelangen, und wählen Sie eine Gewebekategorie aus, die bewertet werden soll. Wählen Sie einen gewünschten Scoring-Typ und wählen Sie das Zellkompartiment aus, das in der Scoring-Analyse verwendet werden soll.
Wählen Sie als Nächstes Komponentendaten anzeigen aus, und bewegen Sie den Cursor über die Trainingsbilder, um die geeignete optische Dichte und den minimalen Schwellenwert für die Färbung positiver Zellen für die interessierenden Komponenten zu finden. Exportieren Sie die Daten für den Trainingssatz, um den Algorithmus zu testen, der durch Gewebesegmentierung, Zellsegmentierung und Bewertungswerte erstellt wurde, folgen Sie den Anweisungen, um einen neuen Ordner für das Exportverzeichnis zu erstellen. Wählen Sie Bilder und Tabellen aus, die erstellt und in die Analyse einbezogen werden sollen.
Führen Sie als Nächstes die Analyse durch, indem Sie Für alle exportieren auswählen. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, zeigen Sie die Zellsegmentierungs- und Bewertungsdaten für Bilder mit hoher und niedriger Färbung an, um die Genauigkeit der Einstellungen zu bewerten. Wenn Sie mit den Einstellungen zufrieden sind, klicken Sie auf die Registerkarte Stapelanalyse, um den Algorithmus in das aktive Projekt zu kopieren.
Wählen Sie dann ein neues Exportverzeichnis aus und wählen Sie die Bilder und Tabellen aus, die in die Analyse einbezogen werden sollen. Wählen Sie unter der Option Eingabedateien alle Bilder aus, die in die Stapelanalyse einbezogen werden sollen. Wählen Sie die Option Ausführen aus, um die Analyse durchzuführen.
Wenn Sie fertig sind, wechseln Sie zur Registerkarte Seriendruck überprüfen. Wählen Sie Alle einschließen und dann Zusammenführen aus, um Datenblätter mit Zusammenfassungsdaten für die Analyse zu erstellen. Es wurde ein Training an Prostatagewebe durchgeführt, um die Bilder in epitheliale und stromale Teile zu segmentieren.
Zusammen mit einem Nicht-Gewebe-Kompartiment. Eine Reihe von Trainingsbildern wurde in eine multispektrale Bildgebungssoftware importiert, die Gewebetypen und Krankheitszustände des gesamten Bildsatzes darstellt. Es wurden Gewebekategorien erstellt, darunter Stroma, Epithel und Nicht-Gewebe, und Kategorien wurden durch manuelles Zeichnen auf Trainingsbildern definiert.
Es wurde ein Algorithmus zur Gewebesegmentierung erstellt und auf den Trainingssatz von Bildern angewendet. Genaue Segmentierung des Gewebes. Mit Hilfe der Multiplex-Immunhistochemie-Technik wurden Zellen, die positiv für die nukleäre Expression von ER-alpha waren, die als rot und AR als braun gesehen wurden, trotz überlappender Farb- und metrischer Signale identifiziert. Die zellmembranspezifische Expression von CD-147 wurde unter Verwendung von E-Catherin, das als schwarz gesehen wird, als Markerprotein quantifiziert.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Proteinexpression und Co-Lokalisierung quantifiziert, in Paraffin eingebettetes Gewebe informiert und fixiert.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine Methode für die Multiplex-Immunhistochemie, die Multispektral-Bildgebung nutzt, um die Proteinexpression und -kolokalisation objektiv zu quantifizieren. Die Technik zielt darauf ab, die Subjektivität des Operateurs zu eliminieren, die in traditionellen Quantifizierungsmethoden gefunden wird, und so die Reproduzierbarkeit in der Forschung zu verbessern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Pathologie
- Immunhistochemie
Hintergrund
- Immunhistochemie bewertet Proteinlokalisation und -expression.
- Aktuelle Methoden führen oft Subjektivität und Nichtreproduzierbarkeit ein.
- Multispektral-Bildgebung bietet eine Lösung für diese Herausforderungen.
- Diese Methode kann sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der diagnostischen Pathologie angewendet werden.
Zweck der Studie
- Um Proteinexpression und -kolokalisation objektiv zu quantifizieren.
- Um Fragen bezüglich Proteinveränderungen nach Behandlung oder Krankheitsverlauf zu beantworten.
- Um die Genauigkeit von Quantifizierungsmethoden in der Forschung zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Erstellung einer spektralen Bibliothek aus Kontrollpräparaten, die mit einzelnen Chromogenen gefärbt sind.
- Verwendung von Multispektral-Bildgebungssoftware zur Analyse von Bildwürfeln von Kontrollpräparaten.
- Optische Definition von Chromogen-Bereichen zur Verbesserung der Quantifizierung.
- Speichern der spektralen Bibliothek für zukünftige Analysen.
Hauptergebnisse
- Die Methode entfernt erfolgreich die Subjektivität des Operateurs.
- Sie bietet eine zuverlässige Möglichkeit zur Beurteilung der Proteinlokalisation und -expression.
- Ergebnisse können in verschiedenen Experimenten reproduziert werden.
- Diese Technik kann das Verständnis in verschiedenen Forschungsgebieten voranbringen.
Schlussfolgerungen
- Multiplex-Immunhistochemie mit Multispektral-Bildgebung ist ein wertvolles Werkzeug.
- Die Methode erhöht die Objektivität der Proteinquantifizierung.
- Sie hat bedeutende Auswirkungen sowohl für die Forschung als auch für die klinische Diagnostik.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Quantitative multiplexed immunohistochemistry with multispectral imaging addresses the critical need for objective, reproducible protein expression and co-localization data in tissue-based discovery. By eliminating operator subjectivity, this workflow enhances predictive confidence at key inflection points in target validation and translational research. The approach supports robust biomarker evaluation, enabling risk-adjusted portfolio decisions in early and preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables objective quantitation of protein expression and spatial localization in tissue context.
- Supports functional target validation by distinguishing subcellular and tissue-specific expression patterns.
- Facilitates mechanistic de-risking through co-localization analysis of multiple biomarkers.
- Improves predictive confidence for advancing targets into downstream screening.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput image acquisition and analysis for assay reproducibility.
- Provides quantitative, compartment-specific readouts suitable for screening workflows.
- Enables robust comparison of compound effects on protein localization and expression.
- Supports platform scalability and reuse across diverse tissue models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biomarker quantitation with disease-relevant tissue and subcellular compartments.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting objective, cross-study comparisons.
- Reduces translational risk by enabling double-positive, single-positive, and negative cell population analysis.
- Facilitates data-driven advancement decisions for candidate biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed imaging workflow integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker assessment.
- Discovery Biology: Objectively quantifies protein expression and co-localization to clarify biological pathways and validate targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Generates compartment-specific, statistically robust measurements for cross-condition comparisons.
- Translational Research: Aligns biomarker analysis with disease-relevant tissue architecture and cell populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized imaging and analysis platform for multi-project deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and biomarker studies.
- Operational Value: Standardizes image acquisition and analysis, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets and biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, multispectral imaging, and image analysis software.
- Needs access to automated slide scanners and compatible multispectral imaging platforms.
- Demands cross-team standardization of staining protocols and analysis algorithms.
- Adaptation may be needed for different tissue types and disease models.
- Training set selection and algorithm validation are critical for robust, unbiased quantitation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:37
Automated Image Acquisition and Analysis
1:43
Tissue Segmentation
3:48
Cell Segementation
5:16
Scoring and IHC and Co-localization
5:50
Applying the Algorithm and Batch Analysis
7:08
Results: Successful Cell and Tissue Segmentation
8:18
Conclusion
