Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, die Proteinausprägung und deren Kolokalisation objektiv mittels multiskalaren Bildgebungsverfahren zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Grundlagenforschung und der diagnostischen Pathologie zu beantworten, beispielsweise wie sich die Expression und Lokalisation von Proteinen nach einer Behandlung oder im Verlauf einer Erkrankung verändern. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die vom Bediener abhängige Subjektivität beseitigt, die herkömmlichen Quantifizierungsmethoden inhärent ist.

Um den Quantifizierungsprozess zu beginnen, öffnen Sie die multispektrale Bildgebungssoftware, um eine Spektralbibliothek aus zuvor vorbereiteten Kontrollpräparaten zu erstellen, die jeweils mit einzelnen Chromogenen sowie dem mit Hämatoxylin gefärbten Präparat versehen sind. Öffnen Sie anschließend einen Bilddatensatz („image cube“), der von einem Kontrollpräparat aufgenommen wurde, und wählen Sie vier bis fünf positiv gefärbte Bereiche aus, um das Chromogen optisch zu definieren. Wiederholen Sie diese Schritte mit Bilddatensätzen von weiteren Kontrollpräparaten, bis eine vollständige Spektralbibliothek, die alle Chromogene repräsentiert, erstellt wurde, und speichern Sie anschließend die Spektralbibliothek.

Beginnen Sie ein neues Projekt in der multispektralen Bildgebungssoftware, indem Sie Multispectral oder im3 als Bildformat und Brightfield als Probentyp auswählen. Konfigurieren Sie das Projekt, indem Sie Gewebesegmentierung, Merkmalsfindung, Phänotypisierung, Bewertung und Export auswählen. Ändern Sie die Bildauflösung, um die Analysezeit bei Bedarf zu verkürzen.

Importieren Sie die zuvor erstellte Spektralbibliothek und wählen Sie alle Chromogene aus, die in die Analyse einbezogen werden sollen. Öffnen Sie die Bilddatenwürfel, die in den Trainingsdatensatz aufgenommen werden sollen, indem Sie die Option „Bilddatenwürfel öffnen“ auswählen. Wählen Sie mindestens 18 % der Gesamtanzahl der zu analysierenden Bilder aus, um die Genauigkeit des Trainings sicherzustellen.

Wählen Sie als Nächstes den Trainingsdatensatz mit Bildern aus. Verwenden Sie Bilder, die alle Krankheitszustände repräsentieren, um die Genauigkeit der Segmentierung zu erhöhen. Schließen Sie zahlreiche Bilder mit negativer Färbung in den Trainingsdatensatz ein, um Verzerrungen in diesem Schritt zu vermeiden.

Weißen Sie die Bilder im Trainingsset aus, indem Sie das Pipettenwerkzeug auswählen und einen weißen Bereich in einem Bild anklicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Weiter“, um zur Gewebesegmentierung zu wechseln. Verwenden Sie dann das Panel „Gewebekategorien“, um die zu analysierenden Gewebetypen auszuwählen. Für eine genauere Lokalisierung von Proteinen im Gewebe können Gewebekategorien ausgewählt werden.

Beginnen Sie mit der Erstellung des Algorithmus und der Definition von Gewebekategorien, indem Sie das Stift-Werkzeug verwenden und um Zellgruppen innerhalb der Trainingsbilder zeichnen. Wiederholen Sie diesen Schritt für andere Gewebekategorien, nachdem Sie eine Kategorie abgeschlossen haben. Achten Sie darauf, Zellgruppen innerhalb der Bilder auszuwählen, die typisch für den jeweiligen Gewebekategorietyp sind.

Wählen Sie die Komponenten aus, die in das Training für den Gewebesegmentierer einbezogen werden sollen. Wählen Sie einen geeigneten Musterskalenwert, um den Gewebesegmentierer zu trainieren. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche „Trainierter Gewebesegmentierer“.

Beobachten Sie ein Popup-Fenster, das die Genauigkeit des Anteils der Pixel in korrekt klassifizierten Trainingsbereichen anzeigt. Segmentieren Sie den gesamten Satz der Trainingsbilder, indem Sie auf „Bilder segmentieren“ klicken. Überprüfen Sie nach Abschluss des Vorgangs den Trainingsdatensatz, um falsch klassifiziertes Gewebe mit dem derzeitigen Trainingsalgorithmus zu identifizieren.

Wenn Sie mit den Ergebnissen des Gewebesegmentierungsalgorithmus zufrieden sind, wählen Sie die Schaltfläche „Weiter“. Stellen Sie sicher, dass Kerne bereits ausgewählt sind, um Zytoplasma und/oder Membran zu wählen. Wählen Sie den Reiter „Kerne“ und passen Sie die entsprechenden Einstellungen für die Kernsegmentierung an.

Danach wählen Sie aus, ob einzelne oder alle Gewebekategorien in die Segmentierung einbezogen werden sollen. Wählen Sie die objektbasierte Schwellenwertmethode für die Gegeneinfärbung, um mit einer vereinfachten Methode gute Ergebnisse zu erzielen. Anschließend wählen Sie die objektbasierte Schwellenwertmethode für eine zuverlässige nukleare Gegeneinfärbung aus.

Wählen Sie die parameterförmigen zytoplasmatischen Parameter aus, indem Sie den Zytoplasma-Tab auswählen. Wählen Sie anschließend den äußeren Abstand zum Kern. Danach wählen Sie die Mindestgröße aus.

Wählen Sie die nächste Optionskomponente mit primärer, sekundärer und als sekundäre Optionen ausgewählter tertiärer aus. Wechseln Sie zum Membran-Tab. Wählen Sie Erste für den verwendeten membranspezifischen Marker aus.

Stellen Sie die volle Skala der optischen Dichte oder OD ein, um eine Mindestschwelle oder ein positives Signal für jeden Marker auf den Zellmembranen zu finden. Setzen Sie unter der Registerkarte Membran die maximale Zellgröße fort. Nachdem Sie alle Optionen ausgewählt haben, wählen Sie „Alle segmentieren“.

Wenden Sie die Einstellungen auf die Bilder an und betrachten Sie diese. Wählen Sie „Weiter“, um zum Schritt der IHC-Bewertung zu gelangen, und wählen Sie eine Gewebekategorie zur Bewertung aus. Wählen Sie einen gewünschten Bewertungstyp und den Zellkompartiment aus, der für die Bewertungsanalyse verwendet werden soll.

Wählen Sie anschließend die Ansicht der Komponentendaten aus und bewegen Sie den Mauszeiger über die Trainingsbilder, um den geeigneten minimalen Schwellenwert der optischen Dichte der Färbung für positive Zellen bezüglich der interessierenden Komponenten zu ermitteln. Exportieren Sie die Daten des Trainingssets, um den Algorithmus zu testen, der durch Gewebesegmentierung, Zellsegmentierung und Bewertungswerte erstellt wurde; folgen Sie den Anweisungen, um einen neuen Ordner für das Exportverzeichnis anzulegen. Wählen Sie die Bilder und Tabellen aus, die erstellt und in die Analyse einbezogen werden sollen.

Führen Sie anschließend die Analyse durch, indem Sie „Export für alle“ auswählen. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Zellsegmentierungs- und Score-Daten für Bilder mit sowohl starker als auch schwacher Färbung, um die Genauigkeit der Einstellungen zu bewerten. Sobald Sie mit den Einstellungen zufrieden sind, klicken Sie auf den Reiter „Batch-Analyse“, um den Algorithmus in das aktive Projekt zu übertragen.

Danach wählen Sie ein neues Exportverzeichnis aus und selektieren die Bilder und Tabellen, die in die Analyse einbezogen werden sollen. Wählen Sie unter der Option Eingabedateien alle Bilder aus, die in die Batch-Analyse einbezogen werden sollen. Wählen Sie die Option Ausführen, um die Analyse durchzuführen.

Wenn abgeschlossen, wechseln Sie zum Register Überprüfung zusammenführen. Wählen Sie „Alle einbeziehen“ und anschließend „Zusammenführen“, um Datenblätter mit zusammengefassten Daten für die Analyse zu erstellen. Das Training wurde an Prostatagewebe durchgeführt, um Bilder in epitheliale und stromale Anteile zu segmentieren.

Zusammen mit einem Nicht-Gewebe-Kompartiment. Ein Satz von Trainingsbildern wurde in eine multispektrale Bildgebungssoftware importiert, die Gewebetypen und Krankheitszustände des gesamten Bildsatzes repräsentiert. Es wurden Gewebekategorien erstellt, einschließlich Stroma, Epithelien und Nicht-Gewebe, und die Kategorien wurden definiert, indem man manuell über die Trainingsbilder zeichnete.

Ein Algorithmus für die Gewebesegmentation wurde erstellt und auf den Trainingsdatensatz von Bildern angewendet. Die Gewebe wurden präzise segmentiert. Mithilfe der multiplex Immunhistochemie wurden Zellen, die positiv für den nukleären Ausdruck von ER-alpha (rot dargestellt) und AR (braun dargestellt) waren, trotz überlappender Farb- und Messsignale identifiziert. Die zellmembranspezifische Expression von CD-147 wurde quantifiziert, wobei E-Cadherin, das als schwarz dargestellt wird, als Markereiweiß verwendet wurde.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Quantifizierung der Proteinexpression und die Untersuchung der Ko-Lokalisation zur Informierung und Fixierung von in Paraffin eingebetteten Geweben durchgeführt wird.