Name: Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Lernen Sie die multiplexe Immunhistochemie mit multispektraler Bildgebung zur objektiven Quantifizierung von Proteinexpression und Co-Lokalisierung. Diese Methode eliminiert subjektive Bewertungen und verbessert die Reproduzierbarkeit in der Forschung.

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Die Autoren danken der University of Wisconsin Translational Forschungsinitiativen in der Pathologie Labor, teilweise durch die UW Abteilung für Pathologie und Labormedizin und UWCCC Zuschuss P30 CA014520 unterstützt, für die Benutzung ihrer Einrichtungen und Dienstleistungen.

<ol><li>Valdman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+redox+pathway+enzymes+in+human+prostatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Quant+Cytol+Histol%22%5BJournal%5D)">Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue.</a> Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).</li>
<li>Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+tissue+by+construction+of+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Amplification of tissue by construction of tissue microarrays.</a> Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).</li>
<li>Jonmarker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+PDX-1+in+prostate+cancer%2C+prostatic+intraepithelial+neoplasia+and+benign+prostatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue.</a> APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).</li>
<li>McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCarty%2C+KS+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22">Arch Pathol Lab Med</a>. 109 (8), 716-721 (1985).</li>
<li>Volante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatostatin+receptor+type+2A+immunohistochemistry+in+neuroendocrine+tumors%3A+a+proposal+of+scoring+system+correlated+with+somatostatin+receptor+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy.</a> Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).</li>
<li>Muris, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+profiling+of+caspase+signaling+pathways+predicts+clinical+response+to+chemotherapy+in+primary+nodal+diffuse+large+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas.</a> Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).</li>
<li>Jaraj, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-+and+interobserver+reproducibility+of+interpretation+of+immunohistochemical+stains+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer.</a> Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).</li>
<li>Nakane, P. K., Pierce, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-labeled+antibodies%3A+preparation+and+application+for+the+localization+of+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens.</a> J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).</li>
<li>Peters, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+tissue+organelles+by+a+combination+of+analytical+subcellular+fractionation+and+enzymic+microanalysis%3A+a+new+approach+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology.</a> J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser Capture Microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
<li>Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorful+future+of+quantitative+pathology%3A+validation+of+Vectra+technology+using+chromogenic+multiplexed+immunohistochemistry+and+prostate+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays.</a> Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).</li>
<li>Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Path%3A+A+Watson-Like+Visit+to+the+Pathology+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab.</a> Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).</li>
<li>Fiore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+multispectral+imaging+in+automated+quantitative+scoring+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry.</a> J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+A+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Rizzardi, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+immunohistochemical+staining+measured+by+digital+image+analysis+versus+pathologist+visual+scoring%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Pathol%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring.</a> Diagn Pathol. 7, 42(2012).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fibrillar+collagens+and+extracellular+matrix+of+glandular+benign+prostatic+hyperplasia+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules.</a> PLoS One. 9 (10), e109102(2014).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+is+elevated+in+human+benign+prostatic+hyperplasia+specimens+compared+to+histologically+normal+prostate+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Exp+Urol%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue.</a> Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).</li>
<li>Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+expression+predicts+biochemical+recurrence+after+prostatectomy+independent+of+histologic+and+pathologic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features.</a> BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).</li>
<li>Bauman, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finasteride+treatment+alters+tissue+specific+androgen+receptor+expression+in+prostate+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues.</a> Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).</li>
<li>Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+steroid+receptor+expression+and+localization+in+benign+prostatic+hyperplasia+varies+with+tissue+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment.</a> Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).</li>
<li>Taylor, C. R., Levenson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+II%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II.</a> Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).</li>
<li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li>
<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).</li>
<li>Ong, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-assisted+pathological+immunohistochemistry+scoring+is+more+time-effective+than+conventional+scoring%2C+but+provides+no+analytical+advantage%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage.</a> Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Die Verwendung von traditionellen Immunhistochemie zur Bewertung der Proteinexpression durch subjektive, semi-quantitative Methoden der Analyse 22,23 begrenzt. Advance-Plattformen sind für Hochdurchsatz-Analyse von Biomarkern Expression und Lokalisation erstellt. Detaillierte Segmentierung der beiden Gewebe und subzellulärer Kompartimente ermöglicht es Benutzern, Biomarker Ausdruck zu studieren, Lokalisierung und Co-Lokalisation mit anderen Markern von Interesse. In früheren Studien haben wir die Brauchbarkei...

<html> Immunhistochemie (IHC) ist eine Standardlaborverfahren zum Nachweis von Protein in Gewebe und IHC ist immer noch weit verbreitet in Forschung und Diagnose der Pathologie verwendet. Die Auswertung der IHC-Färbung ist oft semi-quantitative, Potentialvorspannung in die Interpretation der Ergebnisse einzuführen. Viele semi-quantitative Ansätze wurden die 1-4 sowohl Färbeintensität und Färbung Ausmaß in die endgültige Diagnose integrieren entwickelt. Andere Systeme sind Scoring - Intensität und subzellulären Ort, um eine bessere Ausdruck 5 lokalisieren. Der Einbau von Durchschnittswerte von mehreren Zuschauern wird häufig genutzt , um die Auswirkungen der einzelnen Betrachter Bias 6 zu minimieren. Trotz dieser Bemühungen bei der Analyse, Subjektivität noch bleibt, vor allem bei der Bewertung des Ausmaßes der 7 - Färbung. Protokoll Standardisierung und zur Minimierung der Subjektivität von menschlichen Input ist von größter Bedeutung genaue, reproduzierbare IHC Ergebnisse zu schaffen. Inhalt &quot;&gt; Es gibt andere Optionen neben IHC für die Proteinexpression in Geweben zu bestimmen. Im Rahmen des Forschungs Einstellung hat Immunhistochemie traditionell als Mittel angesehen Proteinlokalisierung 8, während andere Techniken wie Immunoblotting angesehen werden als Goldstandard für die Untersuchung von Protein - Expression zu untersuchen , . Bestimmung Gewebe oder Zellkompartiment spezifische Expression ist schwierig , ohne fortgeschrittene Techniken wie Zell Fraktionierung oder Laser Mikrodissektion 9,10 enthält. Die Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern auf Gewebeschnitten einen vernünftigen Kompromiß bietet, aber aufgrund NADPH Hintergrund - Autofluoreszenz, Lipofuscine, retikuläre Fasern, Kollagen und Elastin kann 11 genaue Quantifizierung erschweren. Automatisierte Rechen Pathologie Plattformen sind eine vielversprechende Richtung für mehr objektive Quantifizierung der Pathologie Färbung 12-15. Die Kombination von multispektrale Bild mit Gewebe-Mikroarrayserleichtert Hochdurchsatz-Analyse der Proteinexpression in großen Stichprobengrößen. Mit diesen Techniken Analyse von Protein - Co-Lokalisation, Färbungs Heterogenität und Gewebe und subzelluläre Lokalisierung ist möglich , während im Wesentlichen sowohl inhärent vorspannt und die Zeit , die zur Analyse zu reduzieren, während die Daten in einem kontinuierlichen und nicht kategorische Format 16 zurückkehrt. Daher war das Ziel dieser Studie zur Durchführung einer Multiplex-Immunhistochemie mit Analyse die Nützlichkeit und die Methodik zu veranschaulichen, multispektrale Abbildungssoftware. Dieses Protokoll wird für die manuelle, multiplex immunhistochemische Färbung eines einzigen Gewebeschnitt Schlitten mit vier optimierte monoklonalen Antikörpern geschrieben. Als ein repräsentatives Experiment werden Kern anti-Kaninchen-Östrogenrezeptor alpha (ER &amp; agr;) und Androgen-Rezeptor (AR) gemultiplext mit membrangebundenen anti-Maus-CD147 und membrangebundenen anti-Maus-E-Cadherin. Jeder Antikörper der Wahl kann Substituted für die aufgeführten Antikörper hier, aber jede Kombination von Antikörpern erfordert getrennte Optimierung. Vorbehandlung für alle Antikörper müssen identisch sein. Die AR und CD147-Antikörper sollten einzeln und dann als Cocktail optimiert werden. Jeder Antikörper erkannt wird ein Biotin freie Polymersystems und eines von 4 einzigartigen Chromogene verwendet wird.

<table><tbody><tr><td>Xylol</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3F1GAL</td><td>NFPA-Bewertung: Gesundheit &ndash; 2, Feuer &ndash; 3 , Reaktivität &ndash; 0</td></tr><tr><td>Ethylalkohol-200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>4355223</td><td>NFPA-Bewertung: Gesundheit &ndash; 0, Feuer &ndash; 3 , Reaktivität &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>NFPA-Bewertung: Gesundheit &ndash; 2, Feuer &ndash; 0 , Reaktivität &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tris Hydroxymethylaminomethan HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td>NFPA-Bewertung: Gesundheit &ndash; 2, Feuer &ndash; 0 , Reaktivität &ndash; 0</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Chem-Impex</td><td>1512</td><td>NFPA-Bewertung: Gesundheit &ndash; 0, Feuer &ndash; 1 , Reaktivität &ndash; 0</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2944-100</td><td>NFPA-Rating: Gesundheit &ndash; 1, Feuer &ndash; 0 , Reaktivität &ndash; 0</td></tr><tr><td>Peroxidazed</td><td>Biocare Medical</td><td>PX968</td><td>Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. Kann Hautreizungen und Augenschäden verursachen.</td></tr><tr><td>Östrogenrezeptor alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific-Labvision</td><td>RM9101</td><td>Nicht als gefährlich eingestuft</td></tr><tr><td>Androgenrezeptor</td><td>SCBT</td><td>sc-816</td><td>Nicht als gefährlich</td></tr><tr><td>eingestuft CD147</td><td>Biodesign</td><td>P87535M</td><td>Nicht als gefährlich</td></tr><tr><td>eingestuft E-Cadherin</td><td>Dako</td><td>M3612</td><td>Nicht als gefährlich</td></tr><tr><td>eingestuft Renoir Red Andibody Diluent</td><td>Biocare Medical</td><td>PD904</td><td>Es wurde speziell für die Arbeit mit Tris-basierten Antikörpern entwickelt</td></tr><tr><td>.</td><td>Biocare Medical</td><td>Modell DC2002</td><td>Treffen Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen für die Verwendung eines Schnellkochtopfs</td></tr><tr><td>Barrier Pen-Immuno Edge&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Denaturierungskit-Elutionsstufe</td><td>Biocare Medical</td><td>DNS001H</td><td>Nicht als gefährlich eingestuft</td></tr><tr><td>Mach 2 Ziege Anti-Kaninchen HRP Polymer</td><td>Biocare Medical</td><td>RHRP520</td><td>Nicht als gefährlich eingestuft</td></tr><tr><td>Mach 2 Ziege Anti-Kaninchen AP Polymer</td><td>Biocare Medical</td><td>RALP525</td><td>Nicht als gefährlich eingestuft</td></tr><tr><td>Mach 2 Ziege Anti-Maus HRP Polymer</td><td>Biocare Medical</td><td>M3M530</td><td>Nicht als gefährlich eingestuft</td></tr><tr><td>Betazoid DAB Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BDB2004</td><td>1. DAB steht im Verdacht, krebserregend zu sein. 2. Setzen Sie DAB-Komponenten keinem starken Licht oder direkter Sonneneinstrahlung aus. 3. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung und -kleidung. 4. DAB kann zu einer Sensibilisierung der Haut führen. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut und Augen. 5. Beachten Sie alle Umwelteinflüsse auf Bundes-, Landes- und kommunaler Ebene in Bezug auf die Entsorgung</td></tr><tr><td>Warp Red Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>WR806</td><td>Corrosive. Säure, die Hautreizungen oder Augenschäden verursachen kann.</td></tr><tr><td>Vina Green Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BRR807</td><td>Gesundheitsschädlich bei Verschlucken</td></tr><tr><td>Bajoran Purple Chromogen Kit</td><td>Biocare Medical</td><td>BJP807</td><td>Entzündliche Flüssigkeit. Von Hitze, Flammen und Funken fernhalten. Gesundheitsschädlich durch Verschlucken oder Absorption. Vermeiden Sie den Kontakt mit Haut oder Augen und vermeiden Sie das Einatmen.</td></tr><tr><td>Katze Hämatoxylin</td><td>Biocare Medical</td><td>CATHE</td><td>Lila &nbsp; Lösung &nbsp; mit &nbsp; a &nbsp; mild &nbsp; Essigsäure & nbsp; Säure &nbsp; (Essig) &nbsp; Duft. &nbsp; Mai &nbsp; be &nbsp; irritierend &nbsp; bis &nbsp; Haut &nbsp; oder &nbsp; Augen. &nbsp; Vermeiden &nbsp; Kontakt &nbsp; mit &nbsp; Haut &nbsp; und &nbsp; Augen. &nbsp; Vermeiden &nbsp; Ingestion.</td></tr><tr><td>XYL Eindeckmedien</td><td>Richard Allen</td><td>8312-4</td><td>NFPA-Bewertung: Gesundheit &ndash; 2, Feuer &ndash; 3 , Reaktivität &ndash; 0</td></tr><tr><td>1,5 Deckgläser</td><td>Fisher Brand</td><td>22266858</td><td>Scharfe Kanten</td></tr><tr><td>Inkubation (Feuchtigkeit)Kammer</td><td>veraltet</td><td>veraltet</td><td>Mehrere Anbieter verfügbar</td></tr><tr><td>Konvektionsofen</td><td>Stabil - Therm</td><td>C-4008-Q</td><td></td></tr><tr><td>Hintergrund Punisher Blocking Reagenz</td><td>Biocare Medical</td><td>BP974</td><td>Dieses Produkt ist nicht als gefährlich eingestuft.</td></tr><tr><td>inForm-Software</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS135781</td><td>Primäre multispektrale Bildgebungssoftware, die in Manuskripten verwendet</td></tr><tr><td>wird Nuance-Software</td><td>PerkinElmer</td><td>Nuance EX</td><td>Software zur Erstellung von Spektralbibliotheken innerhalb von Manuskripten</td></tr><tr><td>Vectra-Mikroskop und Objektträgerscanner</td><td>PerkinElmer</td><td>VECTRA</td><td>Automatisierter Objektträgerscanner und Mikroskop zur Erstellung von IM3-Bildwürfeln</td></tr></tbody></table>

die quantifizierung der proteinexpression und co-lokalisation mit multiplexed immunhistochemischen anfärbung und multispektraltechnik

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunhistochemie ist eine häufig verwendete Nachweistechnik in klinischen und Forschungslaboren zur Untersuchung der Proteinexpression und -lokalisation in Geweben. Viele semiquantitative Systeme wurden für die Bewertung der Expression mittels Immunhistochemie entwickelt, aber die inhärente Subjektivität schränkt die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Ergebnisse ein. Darüber hinaus ist die Untersuchung von räumlich überlappenden Biomarkern wie z.B. nukleären Transkriptionsfaktoren mit den derzeitigen immunhistochemischen Techniken schwierig. Wir haben ein System zur gleichzeitigen Untersuchung mehrerer Proteine mit Hochdurchsatzmethoden der multiplexierten Immunhistochemie und multispektralen Bildgebung entwickelt und optimiert. Die Multiplex-Immunhistochemie wird durch sequentielle Applikation von Primärantikörpern mit Sekundärantikörpern durchgeführt, die an Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase konjugiert sind. Verschiedene Chromogene werden verwendet, um jedes Protein von Interesse zu erkennen. Gefärbte Objektträger werden in einen automatischen Objektträgerscanner eingelegt und ein Protokoll für die automatische Bildaufnahme erstellt. Eine Spektralbibliothek wird erstellt, indem ein Satz von Objektträgern mit jeweils einem einzelnen Chromogen gefärbt wird. Eine Teilmenge repräsentativer gefärbter Bilder wird in multispektrale Bildgebungssoftware importiert und ein Algorithmus zur Unterscheidung des Gewebetyps wird erstellt, indem Gewebekompartimente auf Bildern definiert werden. Subzelluläre Kompartimente werden durch die Verwendung von Hämatoxylin-Gegenfärbung und die Anpassung des intrinsischen Algorithmus segmentiert. Die Schwellenwertbestimmung wird angewendet, um die Positivität und die Proteinkolokalisation zu bestimmen. Der endgültige Algorithmus wird dann auf den gesamten Satz von Geweben angewendet. Die resultierenden Daten ermöglichen es dem Benutzer, die Proteinexpression basierend auf dem Gewebetyp (z. B. Epithelien vs. Stroma) und dem subzellulären Kompartiment (Zellkern vs. Zytoplasma vs. Plasmamembran) zu bewerten. Die Co-Lokalisationsanalyse ermöglicht die Untersuchung von doppelt positiven, doppelt negativen und einfach positiven Zelltypen. Die Kombination von multispektraler Bildgebung mit gemultiplexter Immunhistochemie und automatisierter Bildaufnahme ist eine objektive Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung von Biomarkern in Geweben.

In Figur 1 ist die Ausbildung auf Prostatagewebe zu segmentieren Bilder in Epithel- und Stroma - Abschnitte durchgeführt, zusammen mit dem nicht-Kompartiment. Unter Verwendung der epithelialen Membranmarker E-Cadherin, Zellsegmentierung durchgeführt , den Zellkern, Zytoplasma und Membranabschnitte zu trennen, die in 2 gezeigt. In einem Experiment haben wir gemultiplexten IHC verwendet , um die...

Immunhistochemie ist eine leistungsfähige Labortechnik zur Bewertung der Proteinlokalisierung und -expression in Geweben. Aktuelle halbautomatische Methoden zur Quantifizierung führen zu Subjektivität und führen oft zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen. Darin beschreiben wir Methoden zur Multiplex-Immunhistochemie und zur objektiven Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisierung mittels multispektraler Bildgebung.

Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, die Proteinausprägung und deren Kolokalisation objektiv mittels multiskalaren Bildgebungsverfahren zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Grundlagenforschung und der diagnostischen Pathologie zu beantworten, beispielsweise wie sich die Expression und Lokalisation von Proteinen nach einer Behandlung oder im Verlauf einer Erkrankung verändern. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie die vom Bediener abhängige Subjektivität beseitigt, die herkömmlichen Quantifizierungsmethoden inhärent ist.Um den Quantifizierungsprozess zu beginnen, öffnen Sie die multispektrale Bildgebungssoftware, um eine Spektralbibliothek aus zuvor vorbereiteten Kontrollpräparaten zu erstellen, die jeweils mit einzelnen Chromogenen sowie dem mit Hämatoxylin gefärbten Präparat versehen sind. Öffnen Sie anschließend einen Bilddatensatz („image cube“), der von einem Kontrollpräparat aufgenommen wurde, und wählen Sie vier bis fünf positiv gefärbte Bereiche aus, um das Chromogen optisch zu definieren. Wiederholen Sie diese Schritte mit Bilddatensätzen von weiteren Kontrollpräparaten, bis eine vollständige Spektralbibliothek, die alle Chromogene repräsentiert, erstellt wurde, und speichern Sie anschließend die Spektralbibliothek.Beginnen Sie ein neues Projekt in der multispektralen Bildgebungssoftware, indem Sie Multispectral oder im3 als Bildformat und Brightfield als Probentyp auswählen. Konfigurieren Sie das Projekt, indem Sie Gewebesegmentierung, Merkmalsfindung, Phänotypisierung, Bewertung und Export auswählen. Ändern Sie die Bildauflösung, um die Analysezeit bei Bedarf zu verkürzen.Importieren Sie die zuvor erstellte Spektralbibliothek und wählen Sie alle Chromogene aus, die in die Analyse einbezogen werden sollen. Öffnen Sie die Bilddatenwürfel, die in den Trainingsdatensatz aufgenommen werden sollen, indem Sie die Option „Bilddatenwürfel öffnen“ auswählen. Wählen Sie mindestens 18 % der Gesamtanzahl der zu analysierenden Bilder aus, um die Genauigkeit des Trainings sicherzustellen.Wählen Sie als Nächstes den Trainingsdatensatz mit Bildern aus. Verwenden Sie Bilder, die alle Krankheitszustände repräsentieren, um die Genauigkeit der Segmentierung zu erhöhen. Schließen Sie zahlreiche Bilder mit negativer Färbung in den Trainingsdatensatz ein, um Verzerrungen in diesem Schritt zu vermeiden.Weißen Sie die Bilder im Trainingsset aus, indem Sie das Pipettenwerkzeug auswählen und einen weißen Bereich in einem Bild anklicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Weiter“, um zur Gewebesegmentierung zu wechseln. Verwenden Sie dann das Panel „Gewebekategorien“, um die zu analysierenden Gewebetypen auszuwählen. Für eine genauere Lokalisierung von Proteinen im Gewebe können Gewebekategorien ausgewählt werden.Beginnen Sie mit der Erstellung des Algorithmus und der Definition von Gewebekategorien, indem Sie das Stift-Werkzeug verwenden und um Zellgruppen innerhalb der Trainingsbilder zeichnen. Wiederholen Sie diesen Schritt für andere Gewebekategorien, nachdem Sie eine Kategorie abgeschlossen haben. Achten Sie darauf, Zellgruppen innerhalb der Bilder auszuwählen, die typisch für den jeweiligen Gewebekategorietyp sind.Wählen Sie die Komponenten aus, die in das Training für den Gewebesegmentierer einbezogen werden sollen. Wählen Sie einen geeigneten Musterskalenwert, um den Gewebesegmentierer zu trainieren. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche „Trainierter Gewebesegmentierer“.Beobachten Sie ein Popup-Fenster, das die Genauigkeit des Anteils der Pixel in korrekt klassifizierten Trainingsbereichen anzeigt. Segmentieren Sie den gesamten Satz der Trainingsbilder, indem Sie auf „Bilder segmentieren“ klicken. Überprüfen Sie nach Abschluss des Vorgangs den Trainingsdatensatz, um falsch klassifiziertes Gewebe mit dem derzeitigen Trainingsalgorithmus zu identifizieren.Wenn Sie mit den Ergebnissen des Gewebesegmentierungsalgorithmus zufrieden sind, wählen Sie die Schaltfläche „Weiter“. Stellen Sie sicher, dass Kerne bereits ausgewählt sind, um Zytoplasma und/oder Membran zu wählen. Wählen Sie den Reiter „Kerne“ und passen Sie die entsprechenden Einstellungen für die Kernsegmentierung an.Danach wählen Sie aus, ob einzelne oder alle Gewebekategorien in die Segmentierung einbezogen werden sollen. Wählen Sie die objektbasierte Schwellenwertmethode für die Gegeneinfärbung, um mit einer vereinfachten Methode gute Ergebnisse zu erzielen. Anschließend wählen Sie die objektbasierte Schwellenwertmethode für eine zuverlässige nukleare Gegeneinfärbung aus.Wählen Sie die parameterförmigen zytoplasmatischen Parameter aus, indem Sie den Zytoplasma-Tab auswählen. Wählen Sie anschließend den äußeren Abstand zum Kern. Danach wählen Sie die Mindestgröße aus.Wählen Sie die nächste Optionskomponente mit primärer, sekundärer und als sekundäre Optionen ausgewählter tertiärer aus. Wechseln Sie zum Membran-Tab. Wählen Sie Erste für den verwendeten membranspezifischen Marker aus.Stellen Sie die volle Skala der optischen Dichte oder OD ein, um eine Mindestschwelle oder ein positives Signal für jeden Marker auf den Zellmembranen zu finden. Setzen Sie unter der Registerkarte Membran die maximale Zellgröße fort. Nachdem Sie alle Optionen ausgewählt haben, wählen Sie „Alle segmentieren“.Wenden Sie die Einstellungen auf die Bilder an und betrachten Sie diese. Wählen Sie „Weiter“, um zum Schritt der IHC-Bewertung zu gelangen, und wählen Sie eine Gewebekategorie zur Bewertung aus. Wählen Sie einen gewünschten Bewertungstyp und den Zellkompartiment aus, der für die Bewertungsanalyse verwendet werden soll.Wählen Sie anschließend die Ansicht der Komponentendaten aus und bewegen Sie den Mauszeiger über die Trainingsbilder, um den geeigneten minimalen Schwellenwert der optischen Dichte der Färbung für positive Zellen bezüglich der interessierenden Komponenten zu ermitteln. Exportieren Sie die Daten des Trainingssets, um den Algorithmus zu testen, der durch Gewebesegmentierung, Zellsegmentierung und Bewertungswerte erstellt wurde; folgen Sie den Anweisungen, um einen neuen Ordner für das Exportverzeichnis anzulegen. Wählen Sie die Bilder und Tabellen aus, die erstellt und in die Analyse einbezogen werden sollen.Führen Sie anschließend die Analyse durch, indem Sie „Export für alle“ auswählen. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Zellsegmentierungs- und Score-Daten für Bilder mit sowohl starker als auch schwacher Färbung, um die Genauigkeit der Einstellungen zu bewerten. Sobald Sie mit den Einstellungen zufrieden sind, klicken Sie auf den Reiter „Batch-Analyse“, um den Algorithmus in das aktive Projekt zu übertragen.Danach wählen Sie ein neues Exportverzeichnis aus und selektieren die Bilder und Tabellen, die in die Analyse einbezogen werden sollen. Wählen Sie unter der Option Eingabedateien alle Bilder aus, die in die Batch-Analyse einbezogen werden sollen. Wählen Sie die Option Ausführen, um die Analyse durchzuführen.Wenn abgeschlossen, wechseln Sie zum Register Überprüfung zusammenführen. Wählen Sie „Alle einbeziehen“ und anschließend „Zusammenführen“, um Datenblätter mit zusammengefassten Daten für die Analyse zu erstellen. Das Training wurde an Prostatagewebe durchgeführt, um Bilder in epitheliale und stromale Anteile zu segmentieren.Zusammen mit einem Nicht-Gewebe-Kompartiment. Ein Satz von Trainingsbildern wurde in eine multispektrale Bildgebungssoftware importiert, die Gewebetypen und Krankheitszustände des gesamten Bildsatzes repräsentiert. Es wurden Gewebekategorien erstellt, einschließlich Stroma, Epithelien und Nicht-Gewebe, und die Kategorien wurden definiert, indem man manuell über die Trainingsbilder zeichnete.Ein Algorithmus für die Gewebesegmentation wurde erstellt und auf den Trainingsdatensatz von Bildern angewendet. Die Gewebe wurden präzise segmentiert. Mithilfe der multiplex Immunhistochemie wurden Zellen, die positiv für den nukleären Ausdruck von ER-alpha (rot dargestellt) und AR (braun dargestellt) waren, trotz überlappender Farb- und Messsignale identifiziert. Die zellmembranspezifische Expression von CD-147 wurde quantifiziert, wobei E-Cadherin, das als schwarz dargestellt wird, als Markereiweiß verwendet wurde.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Quantifizierung der Proteinexpression und die Untersuchung der Ko-Lokalisation zur Informierung und Fixierung von in Paraffin eingebetteten Geweben durchgeführt wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

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Ein detailliertes Protokoll für ein sechs-Marker multiplex Immunfluoreszenz-Panel optimiert und durchgeführt ist, mit Hilfe einer automatisierten Stainer für konsistentere Ergebnisse und eine kürzere Verfahrensdauer. Dieser Ansatz kann direkt von jedem Labor für Immuno-onkologischen Studien angepasst werden.

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Hier beschreiben wir ein Protokoll für Multiplex-fluoreszierende immunhistochemische Färbung und imaging für die gleichzeitige Lokalisierung von mehreren Krebs-assoziierte Antigene in Lymphom. Dieses Protokoll kann für die NS1 Analyse von Biomarkern in allen Gewebeschnitte erweitert werden.

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Hier beschreiben wir eine einfache und zugängliche Strategie zur Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen in formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Tumorgewebeabschnitten. Diese Methode kombiniert vorhandene Bildgebungs- und digitale Analysetechniken mit dem Ziel, die Multiplexing-Fähigkeit und die Multiparameteranalyse von Imaging-Assays zu erweitern.

Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellpopulationen in der Tumormikroumgebung

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Eine schnelle Methode zur multispektralen Fluoreszenz-Bildgebung von tiefgefrorenen Gewebeabschnitten

Die Multiplex-Barcoding-Bildanalyse hat kürzlich die Charakterisierung der Tumormikroumgebung verbessert und ermöglicht umfassende Studien der Zellzusammensetzung, des funktionellen Zustands und der Zell-Zell-Interaktionen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Färbe- und Bildgebungsprotokoll unter Verwendung des Barcodings von Oligonukleotid-konjugierten Antikörpern und Zyklusbildgebung, das die Verwendung einer hochdimensionalen Bildanalysetechnik ermöglicht.

Multiplex-Barcoding-Bildanalyse zur Immunprofilierung und räumlichen Kartierung bei der Einzelzellanalyse von Paraffingewebeproben

In diesem Artikel wird ein Protokoll zur manuellen Tyramid-Signalverstärkung (TSA) Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) in Kombination mit Bildanalyse und räumlicher Analyse beschrieben. Dieses Protokoll kann mit formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Schnitten für die Färbung von zwei bis sechs Antigenen pro Objektträger verwendet werden, je nachdem, welcher Objektträgerscanner im Labor verfügbar ist.

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Multiplex-Immunhistochemie-Färbung für paraffineingebettetes Lungenkrebsgewebe

Dieser Bericht beschreibt ein automatisiertes Protokoll für Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays (mIF) auf einem automatisierten Objektträgerfärbegerät. Es demonstriert die hohe Reproduzierbarkeit der räumlichen Proteomik auf Standard-Hochdurchsatz-Gewebe-Autostainern und Ganzobjektträger-Fluoreszenz-Imagern, was ideal für kundenspezifische mIF-Assays über eine große Anzahl von Gewebeobjektträgern in der translationalen Forschung ist.

Automatisierte Hochdurchsatz-Multiplex-Immunfluoreszenz-Assays für die translationale Forschung

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Dual-modale molekulare Kartographie: Integration der Multiplex-mRNA-Detektion mit der Protein-Imaging-Massenzytometrie

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Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik (Video) | JoVE Journal

Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

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