Die Quantifizierung der Proteinexpression und Co-Lokalisation Mit Multiplexed immunhistochemischen Anfärbung und Multispektraltechnik

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Proteinexpression und Co-Lokalisierung mittels multispektraler Bildgebung objektiv zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Grundlagenforschung und der diagnostischen Pathologie zu beantworten, z. B. wie Proteine ihre Expression und Lokalisation nach der Behandlung oder beim Fortschreiten der Krankheit verändern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Subjektivität des Bedieners beseitigt, die traditionellen Quantifizierungsmethoden innewohnt.

Um mit dem Quantifizierungsprozess zu beginnen, öffnen Sie die multispektrale Bildgebungssoftware, um eine Spektralbibliothek aus zuvor präparierten Kontrollobjektträgern, die mit einzelnen Chromogenen gefärbt wurden, und dem mit Hämatoxylin-gefärbten Objektträger zu erstellen. Öffnen Sie als Nächstes einen Bildwürfel, der von einem Objektträger aufgenommen wurde, und wählen Sie vier bis fünf positiv gefärbte Bereiche aus, um das Chromogen optisch zu definieren. Wiederholen Sie die Schritte mit Bildwürfeln aus anderen Steuerungsfolien, bis eine vollständige Spektralbibliothek erstellt wurde, die alle Chromogene darstellt, und speichern Sie dann die Spektralbibliothek.

Beginnen Sie ein neues Projekt in der Multispektral-Imaging-Software, indem Sie Multispektral oder im3 für die Bildformatoption und Hellfeld für das Probenformat auswählen. Konfigurieren Sie das Projekt, indem Sie Gewebe segmentieren, Merkmale suchen, Phänotypisierung, Score und Export auswählen. Ändern Sie bei Bedarf die Bildauflösung, um die Analysezeit zu verkürzen.

Importieren Sie die zuvor erstellte Spektralbibliothek und wählen Sie alle Chromogene aus, die in die Analyse einbezogen werden sollen. Öffnen Sie die Bildcubes, die in das Trainingsdataset aufgenommen werden sollen, indem Sie die Option Bildwürfel öffnen auswählen. Wählen Sie mindestens 18 % der Gesamtzahl der zu analysierenden Bilder aus, um die Genauigkeit des Trainings zu gewährleisten.

Wählen Sie als Nächstes den Trainingssatz von Bildern aus. Bilder, die alle Krankheitszustände darstellen, um die Segmentierungsgenauigkeit zu erhöhen. Nehmen Sie reichlich negative Färbebilder in den Trainingssatz auf, um Verzerrungen während dieses Schritts zu vermeiden.

Gleichen Sie die Bilder im Trainingssatz mit dem Weißabgleich ab, indem Sie die Pipette auswählen und einen Bereich in einem Bild auswählen, der weiß ist. Wählen Sie die Schaltfläche "Vor" aus, um die Gewebesegmentierung zu verschieben. Verwenden Sie dann das Panel "Gewebekategorien", um die Gewebetypen auszuwählen, die für eine genauere Lokalisierung des Proteingewebes analysiert werden sollen.

Beginnen Sie mit der Erstellung des Algorithmus und der Definition von Gewebekategorien, indem Sie das Zeichenstiftwerkzeug verwenden und Zellgruppen in Trainingsbildern zeichnen. Wenn Sie mit einer Gewebekategorie fertig sind, wiederholen Sie den Schritt für andere Gewebekategorien. Achten Sie darauf, Zellgruppen innerhalb von Bildern auszuwählen, die für den Gewebekategorietyp charakteristisch sind.

Wählen Sie Komponenten aus, die in das Training für den Gewebesegmentierer einbezogen werden sollen. Wählen Sie eine geeignete Musterskala, um den Gewebesegmentierer zu trainieren. Wählen Sie dann die Schaltfläche für den trainierten Gewebesegmentierer aus.

Beobachten Sie ein Popup-Fenster, in dem die Genauigkeit des Anteils der Pixel innerhalb ordnungsgemäß klassifizierter Trainingsbereiche angezeigt wird. Segmentieren Sie den gesamten Trainingssatz von Bildern, indem Sie auf Bilder segmentieren klicken. Wenn Sie fertig sind, überprüfen Sie den Trainingssatz, um falsch klassifiziertes Gewebe mit einem aktuellen Trainingsalgorithmus zu finden.

Wenn Sie mit den Ergebnissen des Gewebesegmentierungsalgorithmus zufrieden sind, wählen Sie die Schaltfläche "Erweitert". Stellen Sie sicher, dass die Zellkerne bereits ausgewählt sind, um Zytoplasma und/oder Membran auszuwählen. Wählen Sie die Registerkarte Kerne und wählen Sie die entsprechenden Einstellungen für die Kernsegmentierung.

Wählen Sie dann aus, ob einzelne oder alle Gewebekategorien in die Segmentierung einbezogen werden sollen. Wählen Sie den objektbasierten Schwellenwertansatz für die Gegenfärbung, um eine vereinfachte Methode zu erhalten, um gute Ergebnisse zu erzielen. Wählen Sie als Nächstes den objektbasierten Schwellenwertansatz für eine zuverlässige nukleare Gegenfärbung aus.

Wählen Sie zytoplasmaförmige Parameter aus, indem Sie die Registerkarte Zytoplasma auswählen. Wählen Sie als Nächstes den äußeren Abstand zum Kern aus. Wählen Sie dann die Mindestgröße aus.

Wählen Sie die nächste Optionskomponente mit primären, sekundären Optionen aus, und wählen Sie tertiär als sekundäre Optionen aus. Wechseln Sie zur Registerkarte Membran. Wählen Sie zuerst den verwendeten membranspezifischen Marker aus.

Passen Sie die optische Dichte oder OD des Skalenendwerts an, um für jeden Marker auf den Zellmembranen einen minimalen Schwellenwert oder einen positiven Schwellenwert zu finden. Fahren Sie mit der Registerkarte Membran fort und wählen Sie die maximale Zellengröße aus. Nachdem Sie alle Optionen ausgewählt haben, wählen Sie Alle segmentieren.

Wenden Sie die Einstellungen auf die Bilder an und beobachten Sie diese. Wählen Sie "Erweitert" aus, um zum IHC-Schritt "Bewerten" zu gelangen, und wählen Sie eine Gewebekategorie aus, die bewertet werden soll. Wählen Sie einen gewünschten Scoring-Typ und wählen Sie das Zellkompartiment aus, das in der Scoring-Analyse verwendet werden soll.

Wählen Sie als Nächstes Komponentendaten anzeigen aus, und bewegen Sie den Cursor über die Trainingsbilder, um die geeignete optische Dichte und den minimalen Schwellenwert für die Färbung positiver Zellen für die interessierenden Komponenten zu finden. Exportieren Sie die Daten für den Trainingssatz, um den Algorithmus zu testen, der durch Gewebesegmentierung, Zellsegmentierung und Bewertungswerte erstellt wurde, folgen Sie den Anweisungen, um einen neuen Ordner für das Exportverzeichnis zu erstellen. Wählen Sie Bilder und Tabellen aus, die erstellt und in die Analyse einbezogen werden sollen.

Führen Sie als Nächstes die Analyse durch, indem Sie Für alle exportieren auswählen. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, zeigen Sie die Zellsegmentierungs- und Bewertungsdaten für Bilder mit hoher und niedriger Färbung an, um die Genauigkeit der Einstellungen zu bewerten. Wenn Sie mit den Einstellungen zufrieden sind, klicken Sie auf die Registerkarte Stapelanalyse, um den Algorithmus in das aktive Projekt zu kopieren.

Wählen Sie dann ein neues Exportverzeichnis aus und wählen Sie die Bilder und Tabellen aus, die in die Analyse einbezogen werden sollen. Wählen Sie unter der Option Eingabedateien alle Bilder aus, die in die Stapelanalyse einbezogen werden sollen. Wählen Sie die Option Ausführen aus, um die Analyse durchzuführen.

Wenn Sie fertig sind, wechseln Sie zur Registerkarte Seriendruck überprüfen. Wählen Sie Alle einschließen und dann Zusammenführen aus, um Datenblätter mit Zusammenfassungsdaten für die Analyse zu erstellen. Es wurde ein Training an Prostatagewebe durchgeführt, um die Bilder in epitheliale und stromale Teile zu segmentieren.

Zusammen mit einem Nicht-Gewebe-Kompartiment. Eine Reihe von Trainingsbildern wurde in eine multispektrale Bildgebungssoftware importiert, die Gewebetypen und Krankheitszustände des gesamten Bildsatzes darstellt. Es wurden Gewebekategorien erstellt, darunter Stroma, Epithel und Nicht-Gewebe, und Kategorien wurden durch manuelles Zeichnen auf Trainingsbildern definiert.

Es wurde ein Algorithmus zur Gewebesegmentierung erstellt und auf den Trainingssatz von Bildern angewendet. Genaue Segmentierung des Gewebes. Mit Hilfe der Multiplex-Immunhistochemie-Technik wurden Zellen, die positiv für die nukleäre Expression von ER-alpha waren, die als rot und AR als braun gesehen wurden, trotz überlappender Farb- und metrischer Signale identifiziert. Die zellmembranspezifische Expression von CD-147 wurde unter Verwendung von E-Catherin, das als schwarz gesehen wird, als Markerprotein quantifiziert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Proteinexpression und Co-Lokalisierung quantifiziert, in Paraffin eingebettetes Gewebe informiert und fixiert.