Visualisierung und Quantifizierung der intrazellulären Wechselwirkungen von Neisseria meningitidis And Human α-Actinin durch konfokale Imaging

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, den Grad der Kolokalisation von internalisierten Bakterien, RIA Meningitidis, mit dem Zytoskelettprotein Alpha Actinin zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem kultivierte mikrovaskuläre Zellen des menschlichen Gehirns drei bis acht Stunden lang mit einer Bakterienkultur über Nacht infiziert werden, damit die Bakterien in die Zielzellen eindringen können. In einem zweiten Schritt werden Zellen mit intrazellulären Bakterien gewaschen, fixiert und dann permeatisiert, wodurch die infizierte Kultur für die Immunfärbung von internalisierten Bakterien und intrazellulärem Alpha-Actinin vorbereitet wird.

Nach der konfokalen Bildgebung und Anwendung von Kolokalisationssoftware können Bilder der intrazellulären Kolokalisation beobachtet und quantifizierte Ergebnisse erhalten werden, die zeigen, dass Meninga Croci OPC exprimiert und auch Membranprotein spezifisch mit intrazellulärem Alpha-Actinin interagieren kann, basierend auf konfokaler mikroskopischer Visualisierung und durch quantitative Kolokalisationsanalyse. Hallo, ich bin Isel Maria von Professor Mata TI Lab an der Abteilung für Zelluläre Molekulare Medizin an der Universität Bri. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Schätzung des Col-Gehalts, des Verhältnisses von intrazellulären Bakterien zu Zytoskelettproteinen.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um eine Interaktion von Myzel-Meningitis, die ein Automembranprotein OPC exprimiert, mit dem Zytoskelettprotein alpha Aktin zu untersuchen. Fangen wir also an. Diese Arbeit muss in einem geeigneten Sicherheitslabor durchgeführt werden.

Zwei Tage vor der Immunfärbung impfen Sie den interessierenden Bakterienfleck auf der Gehirn-Herz-Infusion. Agarplatten, die mit 10 % erhitztem Pferdeblut ergänzt werden, wachsen am Tag vor der Immunfärbung über Nacht bei 37 Grad Celsius in einer 5 %igen Kohlendioxidatmosphäre. Verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Kulturschlaufe, um eine Suspension der Bakterienkultur über Nacht herzustellen.

Lassen Sie die Suspension in zwei Millilitern PBSB fünf Minuten lang bei Raumtemperatur stehen, damit sich große Bakterienaggregate absetzen können. Übertragen Sie anschließend den oberen Milliliter der Suspension in ein steriles Röhrchen, ohne das Pellet zu stören Solubilisieren Sie Bakterien, indem Sie einen Milliliter 1% SDS 0,1 molares Natriumhydroxid in zwei Fläschchen mit 20 Mikrolitern Bakteriensuspension geben und das Röhrchen zum Mischen umdrehen. Zur Schätzung der Bakterienzahl.

Messen Sie den Nukleinsäuregehalt, indem Sie die Absorption der Lösung bestimmen. Bei 216 Antern wird die bakterielle Suspension auf die erforderliche Dichte im Infektionsmedium eingestellt, um die mikrovaskulären Endothelzellen des menschlichen Gehirns zu infizieren. Mikrovaskuläre Endothelzellen des menschlichen Gehirns oder H-B-M-E-C-A, die zwei Tage vor der Immunfärbung ausgesät wurden, legten 16 Millimeter große Glasdeckfolien in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte und säten HBME-Meere bei 50 %Konfluenz auf den Deckgläsern, inkubieren über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxidatmosphäre am folgenden Tag.

Infizieren Sie Zellen mit der frisch zubereiteten Bakteriensuspension in unserem Labor. Routinemäßig wird ein Infektionsverhältnis von 200 bis 300 koloniebildenden Einheiten pro Zielzelle verwendet. Inkubieren Sie am Ende der Infektionsperiode drei bis acht Stunden bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und fixieren Sie 500 Mikroliter 2%para-Formaldehyd für 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Abwaschen des para-Formaldehyds permieren Sie die paraldehydfixierten Zellen, indem Sie sie 10 Minuten lang in 0,1%Triton X 100 verdünnt in PBS inkubieren. Waschen Sie die Proben abschließend dreimal mit PBS und fahren Sie mit der Immunfärbung wie gezeigt fort. Anschließend kann die Färbung von intrazellulären Bakterien und dfor-Actinin gleichzeitig durchgeführt werden.

In 12-Well-Platten blockieren Sie die Deckgläser mit den permeablen Zellen mit 500 Mikrolitern 3%B-S-A-P-B-S-T für 30 bis 60 Minuten. Bei Raumtemperatur nach dem Waschen mit PBS-Transfer wird jeder Deckglas in eine neue Trockenvertiefung in der 12-Well-Platte an den primären Antikörpern gegen Bakterien und Alpha-Actinin gleichzeitig 80 bis 100 Mikroliter Antikörper pro Deckglas gelegt, wenn es vorsichtig zugegeben wird, um die Oberfläche des Deckglases zu bedecken, eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren Am Ende der Inkubation, Geben Sie 200 Mikroliter PBS in die Vertiefung, heben Sie den Deckglas an und legen Sie ihn in eine neue Vertiefung mit 500 Mikrolitern PBS. Entfernen Sie nach fünf Minuten das PBS durch Pipettieren und fügen Sie dann frisches PBS hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal und übertragen Sie die Deckgläser in eine neue Trockenmulde.

Als nächstes fügen Sie die entsprechenden Sekundärantikörper hinzu, die an verschiedene Fluorochrome konjugiert sind, verdünnt in 1%B-S-A-P-B-S-T Inkubation bei Raumtemperatur für eine Stunde im Dunkeln am Ende der Inkubation Waschen ist zuvor gezeigt, dann Gegenfärbung DNA mit DPI für fünf Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln am Ende dieser Inkubation waschen Sie die Deckgläser einmal in PBS und montieren Sie dann mit einem Tropfen Halterung. Mittelgroße Deckgläser sollten im Dunkeln aufbewahrt werden, bis sie für die Betrachtung bereit sind. Unter dem Mikroskop beobachten und erfassen wir Bilder unserer immunmarkierten Proben mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das an einem inversen Epi-Fluoreszenzmikroskop befestigt ist.

Um das CLSM-Verfahren mit einem Tropfen Eintauchen in das Objektiv zu beginnen und die Objektträgerabdeckung zu platzieren, auf den Mikroskoptisch zu schlüpfen, das Mikroskop in den visuellen Modus zu versetzen und den interessierenden Bereich mit den Okularen des Mikroskops zu finden, sind wir nun bereit, die Leica Software zu verwenden. Wählen Sie den XY-Zed-Erfassungsmodus aus. Wählen Sie das Format fünf 12 x fünf 12 für Kolokalisierungsstudien aus.

Je höher die Auflösung, desto genauer das Bild. Wählen Sie dann den bidirektionalen X-Modus, der die Scangeschwindigkeit erhöht und das Ausbleichen von Fotos reduziert. Richten Sie Einstellungen für sequenzielles Scannen ein.

Klicken Sie in die Funktion SEC und wählen Sie dann zwischen den Zeilen aus. Wählen Sie die Laserstrahlen entsprechend den Fluorochromen aus, die an die Sekundärantikörper konjugiert sind. 4 0 5 Nanometer für DPI 4 88 Nanometer Für Alexa, Fluor 4 88 und 5 61 Nanometer.

Aktivieren Sie für trixy die Photomultiplier-Röhre eins, zwei bzw. drei. Richten Sie den oberen und unteren Rand des Z-Stapels oder der Z-Reihe ein. Nächster Satz, Zed-Schrittweite auf 0,2 Mikrometer.

RIA Mencius ist ein Diplo-Occus, und da jeder Caucus einen ungefähren Durchmesser von 0,5 Mikrometern hat, erhöht eine Z-Schrittweite von 0,2 Mikrometern die Wahrscheinlichkeit, dass jeder Caucus mindestens zweimal gescannt wird. Stellen Sie die endgültigen Scan-Parameter ein, indem Sie die Zeilenmittelung von drei auswählen, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern, indem Sie auf Start klicken. Doppelt oder dreifach gefärbte Bilder werden durch sequentielles Scannen bei verschiedenen Wellenlängen und durch Verwendung des Zwischenlinienmodus für jeden Kanal erhalten, um ein Übersprechen zwischen den verschiedenen Chromophoren zu vermeiden.

Um eine Kolokalisierung von zwei Fluorochromen anzuzeigen, wählen Sie die Überlagerungsfunktion, um ausgewählte Kanäle zu einem einzigen Bild zusammenzuführen. Zum Beispiel, wenn sowohl Alexa 4 88 als auch trissy Fluor Chromes co-lokalisieren gelbe Farbe erscheint im überlagerten Bild für Eine 2D-Rekonstruktion, die für die Visualisierung einer möglichen Kolokalisierung erforderlich ist, kompiliert einen Zed-Stapel oder eine Serie mit der maximalen Projektionsfunktion. Verarbeiten Sie nach der Erfassung des Z-Stapels oder der Z-Serie Ihre Daten, um ein orthogonales Bild zur Visualisierung der intrazellulären Lokalisierung verschiedener Elemente zu erhalten.

Die Quantifizierung der Kolokalisierung erfolgt mit der Vol City-Software aus der IMP-Bereitstellung. Um mit der Erstellung einer Bibliothek mit CLSM-Bildern zu beginnen, wählen Sie in der oberen Leiste aus dem Bild die Option "Erweiterter Fokus" aus. Dieses Tool kombiniert Zacks in einem 2D-Bild, das analysiert werden soll.

Wählen Sie nun das Werkzeug KOLOKALISIERUNG aus. Die beiden zu analysierenden Kanäle sollten die gleiche Farbtiefe haben. Wählen Sie den Bereich aus, der quantifiziert werden soll.

Legen Sie den Schwellenwert fest, um jeglichen Hintergrund zu entfernen. Erstellen Sie eine Kolokalisierungsausgabe, indem Sie Kolokalisierung generieren auswählen. Kolokalisierungsstatistiken werden für die zuvor ausgewählten Interessenregionen generiert.

Wählen Sie als Nächstes die Manderkoeffizienten R und ny aus. Schließlich können Sie die Werte exportieren oder Statistiken in ein Excel-Dokument erstellen, um die Datenpräsentation zu präsentieren, die hier repräsentative konfokale Bildgebungsergebnisse von menschlichen Gehirn-Endothelzellen zeigt, die acht Stunden lang mit Meninga Cockeye infiziert sind. Der Standort der Bakterien ist rot dargestellt.

Während die Position von Alpha-Actinin in grünen Sternen dargestellt ist, zeigen Pfeile Regionen an, in denen ein hohes Maß an Alpha-Actinin-Akkumulation in der Nähe von Bakterien stattgefunden zu haben scheint. In diesem Overlay-Bild gibt es mehrere Regionen, in denen gelb-orange Farbe erscheint, was auf eine Kolokalisation zwischen Meninga occi und Alpha-Actinin hindeutet. In diesem nächsten Bild zeigt die optische Dissektion einer infizierten H-B-M-E-C-Monoschicht eine Kolokalisation um intrazelluläre Bakterien, die sich an der Basis einer Zelle befinden.

Bei der Verarbeitung dreidimensionaler Bilder von infizierten H-B-M-E-C-Monolayern zeigt eine Schrägansicht der apikalen Oberfläche ein rot gefärbtes Durant-Bakterium, das durch den roten Pfeil gekennzeichnet ist, wo sich mehrere Bakterien in Richtung der basalen Oberflächen von Endothelzellen befinden, die durch den gelben Pfeil gekennzeichnet sind. Eine deutlich orangefarbene, gelbe Basalposition ist in diesem Endon XZ-Querschnitt deutlicher zu erkennen. Im Gegensatz zu afar zeigen Aktinin-Experimente, in denen die Markierung von internalisierten Bakterien und entweder Menton oder Aktin durchgeführt wurde, eine gelegentliche Kolokalisation mit Aktin, aber eine seltene Kolokalisation mit Fermentation in H-B-M-E-C-Zellen.

Wie in den vorangegangenen Experimenten beobachtet, konzentrierte sich Retin auf mehrere internalisierte Bakterien, die durch die weißen Pfeile gekennzeichnet sind. Die Daten wurden auch analysiert, um eine relative Überlappung zu erhalten. Koeffizient R, der nach Manda den wahren Grad der Kolokalisation IE darstellt, die Anzahl der Pixel, die kolokalisieren, verglichen mit der Gesamtzahl der Pixel und NY-Werte für Alpha-Actinin, Menting und Aktin insgesamt in H-B-M-E-C, die mit OPC-exprimierenden Meningokokken infiziert sind, wurde eine Überlappung der Zügel in einem Meningokokken von mehr als 25% erhalten.

Der Koeffizient und Y ist ein Maß für die Häufigkeit einer Währung des häufigeren Rein-Signals jedes Mal, wenn das weniger häufige Meninga-Kakao-Signal auftritt. Diese Messung zeigt ein auffälliges Ausmaß des Vorkommens von alpha-Actinin in der Nähe des internalisierten Meninga-Cockeye. Wir zeigen Ihnen lediglich, wie Sie die Einführung von internalisierten Bakterien mit Zytoskelettelementen in diesem Experiment visualisieren und quantifizieren können.

Es ist wichtig, daran zu denken, die Fixierungs- und Immunstammprotokolle strikt zu befolgen, um die Integrität der Strukturen zu erhalten und einen hohen Hintergrund zu vermeiden. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.