Name: Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-08T16:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Erfahren Sie die Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung funktioneller molekularer Komplexe in lebenden Bakterienzellen. Diese Methode ermöglicht präzise Detektion, Tracking und Quantifizierung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir erkennen die Sachspenden von Bakterienstämmen aus den Gruppen von Prof. Judith Armitage (University of Oxford, UK) und Prof. Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London, UK). IMD wird gemeinsam von der Abteilung für Biochemie (Oxford University) und OCISB finanziert werden; AR wird durch ein Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) DTC-Stipendium finanziert werden; ND wird von der Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) finanziert werden; MCL ist finanziert durch ein Royal Society University Research Fellowship.

<ol><li> Zu Beginn dieses Verfahrens wurden 50 ul eingefroren Bestände fluoreszierendes Protein exprimieren Escherichia coli Bakterienzellen werden zunächst aufgetaut und aerob unter Schütteln in 5 ml LB Nährmedien über Nacht bei 37 Grad C. Am Morgen gewachsen ist 50 ul dieser gesättigten Kultur extrahiert und Subkultur in minimal M63 Glukose Kulturmedien, Inkubation bei 30 ° C für 4 bis 6 Stunden. Hier zeigen wir mit zwei verschiedenen Zell-Stämme, von denen ein Elektron-Transport drückt Cytochrom fusioniert an GFP, die andere, die ein Protein in der bakteriellen Flagellen Motor fusioniert an GFP beteiligt ausdrückt. </li><li> Zellen können entweder direkt aus dem wachsenden Subkultur geerntet, wenn sie anzusehen als immobilisierte Proben, oder sie können geschert, um bakterielle Flagellen abschneiden, wenn Anzeige unter &quot;angebunden&quot; Bedingungen. </li><li> Shearing geht darum, in der Regel 1-5ml der Subkultur in ein Gerät, bestehend aus zwei sterile Spritzen mit sterilen Rohrleitungen verbunden. Die Scherung wird durch wechselseitiges Drücken in jedem Spritzenpumpe, die Kultur durch die engen Schlauch schieben getan. Dies ist 50-100 mal getan, je nach Ausmaß der Scherung erforderlich. Die Kultur wird dann zu Pellets der Zellen, die in Minimalmedium resuspendiert ist Geißeln Fragmente zu entfernen zentrifugiert. </li><li> Wir bereiten dann BK7 Deckgläser durch Eintauchen in eine gesättigte Lösung von KOH in Ethanol für 20 min gereinigt, gründliches Waschen in deionisiertem Wasser und Ethanol und verlassen an der Luft trocknen für mindestens 1 h </li><li> Wir bauen einen einfachen Flow-Zelle, die Zellen im Mikroskop Haus. Dazu gehört das Zeichnen von Linien von Paraffin Fett auf BK7 Glas-Objektträger und dann eine Tunnel-Sandwich, indem Sie eine der gereinigten coverlips oben und nach unten drücken vorsichtig mit einer Pinzette, mit einer Liefermenge Zellvolumen von 5-10 ul . </li><li> Zur Beobachtung immobilisierten Zellen füllen wir den Fluss-Zelle durch Injektion mit einer 0,1% w / v Lösung von Poly-L-Lysin, und lassen Sie es bei Raumtemperatur für mindestens 1 min inkubieren. Wir haben dann spülen mit 100 ul minimal Medien durch Einspritzen von den Medien von einem Ende des Flow-Zelle und Feuchtigkeitsregulierung mit Seidenpapier von den anderen. </li><li> Wir haben dann bis 20 ul einer 1:500 Verdünnung von 200 nm Durchmesser Latexmikrokügelchen (Polysciences) in Minimalmedium zu dem Deckglas Oberfläche markieren Docht. Die Flow-Zelle wird invertiert, so dass das Deckglas nach unten zeigt, auf einer Plattform deutlich von der Oberfläche in eine einfache feuchte Kammer gelegt, und über Nacht bei Raumtemperatur für 5 min. Unbound Kügelchen werden dann entfernt Feuchtigkeitstransport durch 100 ul Minimalmedium gewaschen. </li><li> Wenn wir angebunden Zellen zu beobachten, wollen wir auslassen des Poly-L-Lysin Schritt und stattdessen füllen Sie das Flow-Zelle mit 5 mg / ml anti-Flagellin-Antikörper. Die Flow-Zelle ist in der feuchten Kammer für 10 min und wird dann durch durch Feuchtigkeitsregulierung gespült. </li><li> 20 ul der Zellkultur wird dann durch das Flow-Zelle böse, entweder über die geschert Probe, wenn die Beobachtung angebunden Zellen oder die ungescherten Probe in Betrachtung immobilisierten Zellen. </li><li> Die Flow-Zelle wird umgedreht und in der feuchten Kammer für 20 min. Unbound Zellen werden dann durch Feuchtigkeitsregulierung durch 100 ul Minimalmedium gewaschen. </li><li> Ein Tropfen Immersionsöl ist in der Mitte der Oberseite des Deckglases gesetzt und die Flow-Zelle wird dann sanft auf den Probenhalter des custom built Fluoreszenzmikroskop platziert, wodurch optischen Kontakt mit der hohen numerischen Apertur Objektiv. </li><li> Das Mikroskop Elektron-Multiplikation Kamera eingeschaltet ist und die Kamera auf bis -70 Grad C gekühlt werden, ist die Software gesetzt, um Bilder in einem typischen Bildrate von 25 Hz in Frame-Transfer-Modus zu erwerben, zunächst disenabling den Gain-Regler auf der Kamera. </li><li> Die Hellfeldbeleuchtung wird eingeschaltet und das Bild wird in den Mittelpunkt gerückt, die Auswahl einer geeigneten Zelle oder Gruppe von Zellen auf der Grundlage ihres Seins mit ihrer Längsachse parallel zur Oberfläche Deckglas geklebt abgebildet werden. Der Schwerpunkt liegt dabei fein eingestellt, um sicherzustellen, dass die 200 nm Latexkügelchen hielt sich an die Oberfläche Deckglas gerade im Fokus sind. </li><li> Eine Bildsequenz in Hellfeld erworben, um den Umriss der Zellkörper aufnehmen. Das Hellfeld ist ausgeschaltet und die Kamera zu gewinnen ist auf maximal aktiviert. </li><li> Für einen Standard-Akquisition mit Total Internal Reflection Fluorescence (oder TIRF) mit einem Laserstrahl über entsprechende Wellenlänge (hier grün fluoreszierende Protein Anregung verwenden wir eine 473 nm-Laser) wird so in der hinteren Brennebene fokussiert werden voreingestellt das Objektiv, sondern seitlich von der optischen Achse verschoben, um eine evaneszente Feld für Fluoreszenzanregung in die Zelle Probe zu erzeugen. </li><li> Die Kamera Übernahme wird gestartet und der Laser Shutter geöffnet, um den fluoreszierenden Proteinen innerhalb der Bakterien erregen. Die Parameter für die Laser-Intensität und Geschwindigkeit des Erwerbs müssen für das jeweilige biologische System Gegenstand von Ermittlungen durch das Experimentieren mit verschiedenen Werten optimiert werden, aber eine typische Reichweite rELEVANT zu studieren mobilen Protein-Komplexe in der Zellmembran sind 1-10 mW Laserleistung über einen kreisförmigen Anregungsbereich mit einem Durchmesser von ~ 30 um, mit einer Belichtungszeit pro Einzelbild von 5-40 ms. Die Proben werden bis gebleicht, in der Regel für ~ 10 s. beleuchtet </li><li> Dieses Protokoll kann sowohl für die angebundenen Zellen, in denen die Körper der Zelle über einen Punkt der Befestigung zwischen dem Deckglas und Flagellen Stub dreht, und für immobilisierte Zellen, die fest mit dem Deckglas Oberfläche fixiert werden. </li><li> Einige Zellen Stämme, die eine hohe Kopienzahl von Komplexen aus einer anfänglichen beugungsbegrenzt fokussierten Laser Bleichmittel auf dem einen Pol der Zelle vor der TIRF Bildgebung profitieren. Das Bleichmittel ist gleichbedeutend mit, dass in Fluorescence Recovery After Photobleaching (oder FRAP) verwendet. Mit unseren Kunden Mikroskop einige der Anregung Laserlicht in ein zweites unabhängiges Pfad für FRAP-type Bleichen eingesetzt eingespeist werden. In der Regel 1-10mW Laserleistung verwendet wird, mit einem typischen Bleiche Zeit im Bereich 10-300 ms. Dies führt zu viel höheren Bildkontrast in der gebleichten Zone der Zelle ermöglicht einzelnen Komplexe, die anschließend in diesem Bereich diffuse leichter sichtbar gemacht werden. </li><li> Zur Visualisierung Komplexe im Zytoplasma der Zelle, die viel schneller als die in der Zellmembran eine andere Beleuchtung Modus namens &quot;slimfield&quot; beschäftigt ist diffus. Hier wird ein fokussierter Laserstrahl wird erweitert seitlich nur umfassen eine einzelne Zelle. Dadurch entsteht ein sehr intensives Feld ermöglicht viel schneller Aufnahmen von typisch einer Millisekunde zu ergreifen. </li><li> Nach der Datenerfassung werden die Bilder in eigens geschriebenen Software (codiert in LabVIEW 8.5) zugeführt. Dieser erkennt automatisch die Position der fluoreszierenden Flecken in den Zellen zu einer Genauigkeit von typischerweise wenigen Nanometern und Auszüge ihrer Größe und Helligkeit. Die brightnessof die photobleaching Trace mit Bezug auf die Zeit von ein Kettenfahrzeug molekularen Komplex dann verwendet wird, um die Stöchiometrie Schätzung, dh wie viele einzelne fluoreszierende Proteine ​​bilden eine einzelne molekularen Komplex. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Wenn das Protokoll korrekt ausgeführt wird, die Bilder der Zellen im Hellfeld betrachtet wird sehr deutlich, mit dem Perimeter der Zellkörper dunkel gegen einen weiß / grau Zellkörper (Abb. 1a). In Fluoreszenz mit immobilisierten Zellen, können wir sehen deutliche Flecken Intensität, der typischerweise 250-300 nm in der Breite (Abb. 1b). Gesunde, gefesselte Zellen gesehen, um den Punkt der Leine Anlage im Hellfeld Bilder zu drehen. Unter Fluoreszenzanregung einige molekulare Komplexe in unserem Fall könnte auch an der Stelle der Befestigung zu sehen, was auf eine Lokalisierung des markierten Proteins mit der Flagellen-Motor. Diese Spots werden einzelne molekulare Komplexe und die Anzahl von ihnen gesehen wird auf die Beleuchtung Modus verwendet werden und wie viele der Komplexe sind tatsächlich in der Zelle anwesend zu einem beliebigen Zeitpunkt ab. Die Mobilität der Spots ist abhängig von der spezifischen biologischen untersuchte System. Wenn die Dichte der Flecken ist anfänglich sehr hoch, wie es der Fall mit den markierten Cytochrome hier verwendeten dann eine anfängliche FRAP Bleichmittel kann der Bildkontrast zu verbessern. <img src="/files/ftp_upload/1508/1508Figure1tmb.jpg" border="0" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. (A) Hellfeld-und (B) TIRF Bild (Fehlfarben) für eine immobilisierte Escherichia coli Zelle, die ein Protein fusioniert, um grün fluoreszierende Protein (GFP), die bekanntlich in der Flagellen-Motoren von Bakterien beteiligt ist. Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1508/1508Figure1.jpg">klicken Sie hier,</a> um eine größere Version der Abbildung 1 zu sehen.

<ol><li>Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+turnover+in+single%2C+functioning+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li>
<li>Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+stoichiometry+of+the+TatA+component+of+the+twin-arginine+protein+transport+system+observed+by+in+vivo+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+titin+molecules+using+a+two-bead+optical+tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay.</a> Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).</li>
<li>Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elasticity+of+single+kettin+molecules+using+a+two-bead+laser-tweezers+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay.</a> FEBS Lett. , 535-555 (2003).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+clustering+and+dynamics+of+cytochrome+bd+complexes+in+the+Escherichia+coli+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane.</a> Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).</li>
<li>Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+Escherichia+coli+OXPHOS+complexes+concentrated+in+specialised+zones+within+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+measurements+of+Membrane+Potential%2C+Sodium-Motive+Force+and+Flagellar+Motor+Speed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli.</a> Biophys. 93, 294-302 (2007).</li>
<li>Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+measurement+of+intracellular+sodium+concentration+in+single+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells.</a> Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Offenlegungen vorzunehmen.

Es muss darauf geachtet nicht &quot;über shear&quot; Zelle für das Betrachten angebunden Bakterien, da dies die Funktionalität des Flagellen-Motoren beeinträchtigt werden. Es ist wichtig, um Zellen viel länger als eine Stunde einmal den Einsatz auf dem Objektträger, da sie sich möglicherweise Sauerstoff verbraucht. Erhebliche Optimierung erforderlich, um den besten Mikroskop Imaging Bedingungen gesorgt, spezifische biologische System untersucht werden. Es kann klug sein, um die Imaging unter Verwendung von gereinigten G...

visualizing einzelne molekulare komplexe in vivo verwenden der erweiterten fluoreszenzmikroskopie

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Vollen Einblick in die Mechanismen der lebenden Zellen kann nur durch die Untersuchung der wichtigsten Prozesse, und entlocken direkte Ereignisse auf zellulärer Ebene erreicht werden. Bis heute ist die Scher-Komplexität biologischer Systeme ist präzise Einzel-Molekül-Experimente verursacht weit zu anspruchsvoll sein, anstatt sich auf Studien einzelner Systeme mit relativ groben Schüttgut Ensemble-gemittelten Messungen. Allerdings treten viele wichtige Prozesse in der lebenden Zelle auf der Ebene von nur einem oder einigen wenigen Molekülen, Ensemble-Messungen in der Regel Maske der stochastischen und heterogene Natur dieser Ereignisse. Hier, mit Hilfe modernster optischer Mikroskopie und analytische Bild-Analyse-Tools zeigen wir, wie Proteine ​​innerhalb einer einzelnen lebenden Bakterienzelle mit einer Genauigkeit von einzelnen Molekülen und wie können wir die Dynamik innerhalb molekulare Komplexe in funktionierenden biologischen Maschinen beobachten zu überwachen. Die Techniken sind direkt relevant physiologisch. Sie sind minimal-perturbative und nicht-invasive, um die biologische untersuchten Probe an und sind für Untersuchungen in lebenden Material abgestimmt, verfügt nicht ohne weiteres verfügbar zu anderen Einzel-Molekül-Ansätze der Biophysik. Darüber hinaus untersuchten die biologischen Proben alle produzieren Fluoreszenz-markierten Protein in Konzentrationen, die fast identisch mit den unveränderten Zellen Stämme (&quot;genomische encoding&quot;), im Gegensatz zu den häufigeren, aber weniger idealen Ansatz für die Erzeugung deutlich mehr Protein als würde natürlich vorkommen entgegengesetzt sind (&quot;Plasmid Ausdruck&quot;). So sind die tatsächlichen biologischen Proben, die untersucht werden soll deutlich näher an den natürlichen Organismen und damit die Beobachtungen mehr relevant echten physiologischen Prozessen.

Hier zeigen wir die Protokolle für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Bakterienzellen, damit funktionale molekulare Komplexe detektiert werden, verfolgt und quantifiziert.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Ein vollständiges Verständnis der Mechanismen lebender Zellen kann nur durch die Untersuchung der Schlüsselprozesse erreicht werden, welche Ereignisse auf zellulärer Ebene auslösen und steuern ...

Hier demonstrieren wir das Protokoll für die Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Bakterienzellen, um funktionelle molekulare Komplexe detektieren, verfolgen und quantifizieren zu können. Dieses Protokoll beginnt mit dem Anzüchten von Bakterien, die ein Protein exprimieren, das mit einem fluoreszierenden Farbstoffmolekül markiert ist. Nach vier bis sechs Stunden wird ein kleines Volumen an Zellen aus der Kultur entnommen und deren Flagellenfilamente durch Scherkräfte verkürzt.Ein Glas-Deckglas innerhalb einer Durchflusszelle wird beschichtet, um Zellen die Anheftung an der Oberfläche zu ermöglichen. Zellen werden in die Durchflusszelle injiziert und über einen Gellar-Stub befestigt, der mittels Laseranregungs-Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht wird. Eine Kamera mit hoher Quantenausbeute nimmt anschließend helle Durchlicht- und Fluoreszenzbilder der markierten molekularen Komplexe auf.Hallo, mein Name ist Ian Doy und ich arbeite mit Mark Lee am Fachbereich Biochemie der Universität Oxford. Ich bin Alex Robertson und arbeite mit Mark Lee im Physikdepartment. Ich bin Nick De aus dem Leak-Labor, das ebenfalls im Physikdepartment angesiedelt ist.Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Visualisierung einzelner molekularer Komplexe in lebenden Bakterien mittels fortschrittlicher Fluoreszenzmikroskopie. Wir verwenden dieses Verfahren, um diese in einem funktionellen Zustand zu untersuchen. Außerdem nutzen wir es, um die Dynamik natürlicher biologischer Maschinen in Echtzeit und im Nanometerbereich zu erforschen.Beginnen wir. Zum Start 50 Mikroliter gefrorener Stämme von E. coli-Bakterien auftauen. Diese wurden genetisch verändert.Um ein Protein mit einem fluoreszierenden Farbstoffmolekül zu markieren, impfen Sie fünf Milliliter LB-Nährmedium an und kultivieren die Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius unter aeroben Bedingungen mit Schütteln. Am nächsten Morgen entnehmen Sie 50 Mikroliter der gesättigten Kultur und überimpfen diese in minimales M 63 Glucose-Nährmedium, das bei 30 Grad Celsius vier bis sechs Stunden inkubiert wird. Hier werden zwei verschiedene Zellstämme verwendet.Ein Cytochrom, das an GFP fusioniert ist und Elektronen transportiert, wird exprimiert. Das andere exprimiert ein Protein, das an der bakteriellen Flagellenmotorfunktion beteiligt ist. Die an GFP fusionierten Zellen können entweder direkt aus der wachsenden Subkultur gewonnen werden, wenn sie als immobilisierte Proben betrachtet werden sollen, oder sie können abgeschert werden, um die bakteriellen Flagellen zu verkürzen, falls sie unter gebundenen Bedingungen untersucht werden.Um die Bakterien zu scheren, geben Sie ein bis fünf Milliliter der Subkultur mittels steriler Schläuche in eine Vorrichtung bestehend aus zwei sterilen Spritzen. Wechseln Sie ab, indem Sie jeweils den Kolben jeder Spritze betätigen, um die Kultur etwa 50 bis 100 Mal je nach gewünschtem Schergrad durch die enge Schläuche zu pressen. Zentrifugieren Sie anschließend die Kultur, um die Zellen zu pelletieren, und resuspendieren Sie die Zellen in minimalem Medium, um Flagellenfragmente zu entfernen. Sobald die Zellen bereit sind, bereiten Sie gereinigte BK7-Glasdeckgläser vor, indem Sie sie 20 Minuten lang in eine gesättigte Lösung aus Kaliumhydroxid und Ethanol eintauchen.Gründlich mit entionisiertem Wasser und Ethanol spülen und mindestens eine Stunde lang an der Luft trocknen lassen. Als Nächstes eine einfache Durchflusszelle zur Aufnahme der Zellen im Mikroskop konstruieren. Dazu Linien aus Paraffin-Fett auf einem BK7-Glas-Objektträger aufzeichnen und dann einen Tunnel-Sandwich aufbauen, indem eine der gereinigten Deckgläser oben aufgesetzt wird.Drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette nach unten. Dadurch sollte ein Flusszellenvolumen von fünf bis 10 Mikrolitern entstehen. Um immobilisierte Zellen zu beobachten, füllen Sie die Flusszelle, indem Sie eine 0,1-%-ige Lösung von Poly-L-Lysin injizieren, und lassen Sie sie mindestens eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren.Als Nächstes spülen Sie die Flusszelle aus, indem Sie 100 Mikroliter Minimalmedium von einem Ende der Flusszelle injizieren und gleichzeitig das Medium durch die Flusszelle hindurch mit Zellstoffpapier vom anderen Ende abziehen. Danach geben Sie 20 Mikroliter einer 1:500-Verdünnung von Latex-Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 200 Nanometern in Minimalmedium zu, um die Oberfläche der Deckglas zu markieren. Stellen Sie die Flusszelle in eine einfache Feuchtkammer und inkubieren Sie sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Die Flusszelle wird dabei invertiert, sodass das Deckglas nach unten zeigt.Die nicht gebundenen Perlen werden anschließend durch Kapillarwirkung mit 100 Mikrolitern Minimalmedium und Zellstoff entfernt. Um gebundene Zellen zu beobachten, überspringen Sie stattdessen den Inkubationsschritt mit Poly-L-Lysin, füllen die Durchflusszelle mit einer Anti-Flag-Gellan-Antikörperlösung mit fünf Mikrogramm pro Milliliter und stellen sie dann 10 Minuten lang in eine Feuchtekammer. Nach der Inkubation spülen Sie die Durchflusszelle durch Kapillarwirkung mit Zellstoff aus.Als Nächstes werden 20 Mikroliter der Zellkultur mithilfe von Papiertuch durch die Flusszelle geleitet, wobei entweder die gescherte Probe zur Beobachtung gebundener Zellen oder die ungescherte Probe zur Betrachtung immobilisierter Zellen verwendet wird; danach wird die Flusszelle umgedreht und 20 Minuten lang in die Feuchtkammer gestellt. Die nicht gebundenen Zellen werden anschließend durch Kapillarwirkung mit 100 Mikrolitern Minimalmedium ausgewaschen. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl in die Mitte der oberen Oberfläche des Deckgläschens. Platzieren Sie die Flusszelle vorsichtig auf dem Probenträger des speziell angefertigten Fluoreszenzmikroskops. Dadurch sollte optischer Kontakt mit der Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur hergestellt werden. Schalten Sie anschließend die elektronenvervielfachende Kamera des Mikroskops ein und stellen Sie die Kühlung der Kamera auf minus 70 Grad Celsius ein.Die Software ist so eingestellt, dass sie Bilder mit einer typischen Bildfrequenz von 25 Hertz aufnimmt. Im Frame-Transfer-Modus. Schalten Sie die Hellfeldbeleuchtung ein und fokussieren Sie das Bild.Wählen Sie eine geeignete Zelle oder Zellgruppe für die Aufnahme aus, die mit ihrer langen Achse haften. Stellen Sie den Fokus so ein, dass die 200 Nanometer großen Latexkugeln, die an der Deckglasoberfläche haften, gerade scharf gestellt sind. Nehmen Sie eine Bildsequenz im Hellfeld auf, um den Umriss des Zellkörpers zu erfassen.Die Hellfeldbeleuchtung wird dann ausgeschaltet und die Kameraempfindlichkeit für die Aufnahme mittels Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie, auch bekannt als TIRF, auf das Maximum eingestellt. Starten Sie die Kameraaufnahme und öffnen Sie den Laserblendenverschluss, um die fluoreszierenden Proteine innerhalb der Bakterien anzuregen. Die Parameter für die Laserintensität und die Aufnahmegeschwindigkeit müssen für das jeweilige biologische System optimiert werden.Die zu untersuchenden Proben werden beleuchtet, bis sie photobleichen, was typischerweise etwa 10 Sekunden dauert. Sobald die Daten gesammelt wurden, werden die Bilder in ein speziell entwickeltes Analyseprogramm eingespeist, das automatisch die Positionen fluoreszierender Flecken in den Zellen mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern erkennt und deren Größe sowie Helligkeit extrahiert. Die Helligkeit der Photobleichkurve in Abhängigkeit von der Zeit des attraktiven Molekülkomplexes wird anschließend verwendet, um die Stöchiometrie zu bestimmen.Mithilfe dieser Methode ist das Bild der Zellen im Hellfeld sehr deutlich, sodass die Umrisse der Zellkörper dunkel vor einem weißen bis grauen Zellkörper erscheinen, wenn fluoreszierende, immobilisierte Zellen betrachtet werden. Deutlich abgegrenzte Intensitätsflecken mit typischerweise 250 bis 300 Nanometern Breite sind hier in Falschfarben dargestellt. Gesunde, verankerte Zellen sind im Hellfeld unter fluoreszenter Anregung dabei zu beobachten, wie sie sich um den Punkt der Verankerung drehen.Einige molekulare Komplexe könnten ebenfalls an der Anheftungsstelle sichtbar sein, was auf eine Lokalisation des markierten Proteins mit dem Geller-Motor hindeutet. Diese Flecken sind einzelne molekulare Komplexe. Die Anzahl dieser sichtbaren Komplexe hängt von dem verwendeten Beleuchtungsmodus sowie davon ab, wie viele der Komplexe zu einem bestimmten Zeitpunkt tatsächlich in der Zelle vorhanden sind.Wenn die Dichte der Flecken anfangs sehr hoch ist, wie dies bei den hier verwendeten markierten Cytochromen der Fall ist, kann eine anfängliche FRAP-Bleiche den Abbildungskontrast verbessern. Die Mobilität der Flecken hängt vom spezifischen biologischen System ab. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man einzelne molekulare Komplexe mittels fortschrittlicher Fluoreszenzmikroskopie sichtbar macht.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, keine Scherzellen zu erzeugen, da dies die Funktionalität des Flagellenmotors beeinträchtigen könnte. Außerdem sollte man die Zellen nicht länger als eine Stunde auf den Mikroskopobjektträgern belassen, da sie sonst unter Sauerstoffmangel leiden könnten. Eine Automatisierung ist erforderlich, um die optimalen Bildgebungsbedingungen zu finden.Die Verwendung von gereinigtem GFP allein kann helfen, die korrekte Laserleistung für Ihr spezielles Mikroskopsystem zu ermitteln. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

visualizing-single-molecular-complexes-vivo-using-advanced

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die CLEM Technik angepasst worden, um ultrastrukturelle Morphologie der Membranen, Organellen und subzelluläre Strukturen mikroinjizierten Moleküle beeinflusst analysieren. Diese Methode kombiniert die leistungsstarke Techniken der Mikromanipulation / Mikroinjektion, konfokale Fluoreszenzmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu ermöglichen Millimeter bis multi-Nanometer-Auflösung. Diese Technik ist zugänglich für eine breite Vielzahl von Anwendungen.

Korrelative Licht-und Elektronenmikroskopie (CLEM) als Werkzeug zur Visualisierung mikroinjiziert Moleküle und ihre Eukaryotic Sub-zellulären Targets

Wir beschreiben eine korrelative Mikroskopie-Methode, die High-Speed-3D-Live-cell Fluoreszenzlichtmikroskopie und hochauflösenden Kryo-Elektronen-Tomographie vereint. Wir demonstrieren die Fähigkeit des korrelativen Verfahren durch Abbilden dynamisch kleine HIV-1-Partikeln Interaktion mit dem Host-HeLa-Zellen.

Korrelative Mikroskopie für 3D-Strukturanalyse von dynamischen Wechselwirkungen

Wir demonstrieren die Verwendung von Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM), um gleichzeitig mehrere Arten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in Zellen abzubilden. Die beschriebenen Techniken ermöglichen die Lokalisierung von Tausenden bis Hunderttausenden einzelner fluoreszierend markierter Proteine mit einer Genauigkeit von Dutzenden von Nanometern innerhalb einzelner Zellen.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Wir beschreiben die bildgebenden Verfahren verwenden wir, um die Verteilung und Mobilität der transfizierten fluoreszierenden Proteinen in das endoplasmatische Retikulum (ER) mittels des konfokalen Abbildung von lebenden Zellen resident untersuchen. Wir haben auch ultrastrukturell analysieren die Wirkung ihrer Expression auf die Architektur dieser subzellulären Kompartiment.

Visualisierung des endoplasmatischen Reticulum Subdomains in kultivierten Zellen

Photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), kombiniert mit Einzelmolekül-Tracking ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von DNA-Protein-Interaktionen in lebenden Escherichia coli-Zellen.

Visualisierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in der lebenden Bakterienzellen Verwendung Photoactivated Einzelmolekül-Tracking

Vierdimensionalen (4D)-Bildgebung verwendet werden, um das Verhalten und die Interaktionen zwischen den zwei Arten von Endosomen in lebenden Wirbeltier-Nervenenden zu studieren. Bewegung dieser kleinen Strukturen in drei Dimensionen gekennzeichnet, wodurch Bestätigung von Veranstaltungen wie Endosomen Fusion und Exozytose.

Visualisierung der Endosomen Dynamics in lebenden Nerven Klemmen mit Vier-dimensionale Fluoreszenz-Imaging

Eine Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) Methode gilt für virusbedingte intrazellulären Bildstrukturen über Elektronenmikroskopie (EM) in Zellen, die zuvor durch Lichtmikroskopie (LM) ausgewählt werden. LM und EM sind kombiniert als bildgebende Hybridansatz, eine integrierte Ansicht der Virus-Wirt Interaktionen zu erreichen.

Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) für die Verfolgung und Imaging virales Protein verbundenen Strukturen in den Cryo-immobilisierten Zellen

Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Anleitung für eine integrierte Mikroskopie Bausystem, das konventionelle Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte Höchstauflösung Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer imaging, in einer Aufspannung auf kostengünstige Weise.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie nach der Einbettung von Epon unter Verwendung eines fluoreszierenden Proteins namens mScarlet. Diese Methode kann die Fluoreszenz und die Ultrastruktur gleichzeitig aufrechterhalten. Diese Technik ist für eine Vielzahl biologischer Anwendungen geeignet.

Epon Post Embedding Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt einen Mechanismus zur Verwendung von korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie, um die Wechselwirkung von Mitochondrien und Lysosomen, die mit mEosEM bzw. APEX2 markiert sind, sichtbar zu machen.

Zweifarbige korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie zur Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen Mitochondrien und Lysosomen

Erfahren Sie die Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung funktioneller molekularer Komplexe in lebenden Bakterienzellen. Diese Methode ermöglicht präzise Detektion, Tracking und Quantifizierung.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Weitere Videos entdecken