Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Hier demonstrieren wir das Protokoll für die Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Bakterienzellen, um funktionelle molekulare Komplexe detektieren, verfolgen und quantifizieren zu können. Dieses Protokoll beginnt mit dem Anzüchten von Bakterien, die ein Protein exprimieren, das mit einem fluoreszierenden Farbstoffmolekül markiert ist. Nach vier bis sechs Stunden wird ein kleines Volumen an Zellen aus der Kultur entnommen und deren Flagellenfilamente durch Scherkräfte verkürzt.

Ein Glas-Deckglas innerhalb einer Durchflusszelle wird beschichtet, um Zellen die Anheftung an der Oberfläche zu ermöglichen. Zellen werden in die Durchflusszelle injiziert und über einen Gellar-Stub befestigt, der mittels Laseranregungs-Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht wird. Eine Kamera mit hoher Quantenausbeute nimmt anschließend helle Durchlicht- und Fluoreszenzbilder der markierten molekularen Komplexe auf.

Hallo, mein Name ist Ian Doy und ich arbeite mit Mark Lee am Fachbereich Biochemie der Universität Oxford. Ich bin Alex Robertson und arbeite mit Mark Lee im Physikdepartment. Ich bin Nick De aus dem Leak-Labor, das ebenfalls im Physikdepartment angesiedelt ist.

Heute zeigen wir Ihnen das Verfahren zur Visualisierung einzelner molekularer Komplexe in lebenden Bakterien mittels fortschrittlicher Fluoreszenzmikroskopie. Wir verwenden dieses Verfahren, um diese in einem funktionellen Zustand zu untersuchen. Außerdem nutzen wir es, um die Dynamik natürlicher biologischer Maschinen in Echtzeit und im Nanometerbereich zu erforschen.

Beginnen wir. Zum Start 50 Mikroliter gefrorener Stämme von E. coli-Bakterien auftauen. Diese wurden genetisch verändert.

Um ein Protein mit einem fluoreszierenden Farbstoffmolekül zu markieren, impfen Sie fünf Milliliter LB-Nährmedium an und kultivieren die Bakterien über Nacht bei 37 Grad Celsius unter aeroben Bedingungen mit Schütteln. Am nächsten Morgen entnehmen Sie 50 Mikroliter der gesättigten Kultur und überimpfen diese in minimales M 63 Glucose-Nährmedium, das bei 30 Grad Celsius vier bis sechs Stunden inkubiert wird. Hier werden zwei verschiedene Zellstämme verwendet.

Ein Cytochrom, das an GFP fusioniert ist und Elektronen transportiert, wird exprimiert. Das andere exprimiert ein Protein, das an der bakteriellen Flagellenmotorfunktion beteiligt ist. Die an GFP fusionierten Zellen können entweder direkt aus der wachsenden Subkultur gewonnen werden, wenn sie als immobilisierte Proben betrachtet werden sollen, oder sie können abgeschert werden, um die bakteriellen Flagellen zu verkürzen, falls sie unter gebundenen Bedingungen untersucht werden.

Um die Bakterien zu scheren, geben Sie ein bis fünf Milliliter der Subkultur mittels steriler Schläuche in eine Vorrichtung bestehend aus zwei sterilen Spritzen. Wechseln Sie ab, indem Sie jeweils den Kolben jeder Spritze betätigen, um die Kultur etwa 50 bis 100 Mal je nach gewünschtem Schergrad durch die enge Schläuche zu pressen. Zentrifugieren Sie anschließend die Kultur, um die Zellen zu pelletieren, und resuspendieren Sie die Zellen in minimalem Medium, um Flagellenfragmente zu entfernen. Sobald die Zellen bereit sind, bereiten Sie gereinigte BK7-Glasdeckgläser vor, indem Sie sie 20 Minuten lang in eine gesättigte Lösung aus Kaliumhydroxid und Ethanol eintauchen.

Gründlich mit entionisiertem Wasser und Ethanol spülen und mindestens eine Stunde lang an der Luft trocknen lassen. Als Nächstes eine einfache Durchflusszelle zur Aufnahme der Zellen im Mikroskop konstruieren. Dazu Linien aus Paraffin-Fett auf einem BK7-Glas-Objektträger aufzeichnen und dann einen Tunnel-Sandwich aufbauen, indem eine der gereinigten Deckgläser oben aufgesetzt wird.

Drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette nach unten. Dadurch sollte ein Flusszellenvolumen von fünf bis 10 Mikrolitern entstehen. Um immobilisierte Zellen zu beobachten, füllen Sie die Flusszelle, indem Sie eine 0,1-%-ige Lösung von Poly-L-Lysin injizieren, und lassen Sie sie mindestens eine Minute bei Raumtemperatur inkubieren.

Als Nächstes spülen Sie die Flusszelle aus, indem Sie 100 Mikroliter Minimalmedium von einem Ende der Flusszelle injizieren und gleichzeitig das Medium durch die Flusszelle hindurch mit Zellstoffpapier vom anderen Ende abziehen. Danach geben Sie 20 Mikroliter einer 1:500-Verdünnung von Latex-Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 200 Nanometern in Minimalmedium zu, um die Oberfläche der Deckglas zu markieren. Stellen Sie die Flusszelle in eine einfache Feuchtkammer und inkubieren Sie sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Die Flusszelle wird dabei invertiert, sodass das Deckglas nach unten zeigt.

Die nicht gebundenen Perlen werden anschließend durch Kapillarwirkung mit 100 Mikrolitern Minimalmedium und Zellstoff entfernt. Um gebundene Zellen zu beobachten, überspringen Sie stattdessen den Inkubationsschritt mit Poly-L-Lysin, füllen die Durchflusszelle mit einer Anti-Flag-Gellan-Antikörperlösung mit fünf Mikrogramm pro Milliliter und stellen sie dann 10 Minuten lang in eine Feuchtekammer. Nach der Inkubation spülen Sie die Durchflusszelle durch Kapillarwirkung mit Zellstoff aus.

Als Nächstes werden 20 Mikroliter der Zellkultur mithilfe von Papiertuch durch die Flusszelle geleitet, wobei entweder die gescherte Probe zur Beobachtung gebundener Zellen oder die ungescherte Probe zur Betrachtung immobilisierter Zellen verwendet wird; danach wird die Flusszelle umgedreht und 20 Minuten lang in die Feuchtkammer gestellt. Die nicht gebundenen Zellen werden anschließend durch Kapillarwirkung mit 100 Mikrolitern Minimalmedium ausgewaschen. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl in die Mitte der oberen Oberfläche des Deckgläschens.

Platzieren Sie die Flusszelle vorsichtig auf dem Probenträger des speziell angefertigten Fluoreszenzmikroskops. Dadurch sollte optischer Kontakt mit der Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur hergestellt werden. Schalten Sie anschließend die elektronenvervielfachende Kamera des Mikroskops ein und stellen Sie die Kühlung der Kamera auf minus 70 Grad Celsius ein.

Die Software ist so eingestellt, dass sie Bilder mit einer typischen Bildfrequenz von 25 Hertz aufnimmt. Im Frame-Transfer-Modus. Schalten Sie die Hellfeldbeleuchtung ein und fokussieren Sie das Bild.

Wählen Sie eine geeignete Zelle oder Zellgruppe für die Aufnahme aus, die mit ihrer langen Achse haften. Stellen Sie den Fokus so ein, dass die 200 Nanometer großen Latexkugeln, die an der Deckglasoberfläche haften, gerade scharf gestellt sind. Nehmen Sie eine Bildsequenz im Hellfeld auf, um den Umriss des Zellkörpers zu erfassen.

Die Hellfeldbeleuchtung wird dann ausgeschaltet und die Kameraempfindlichkeit für die Aufnahme mittels Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie, auch bekannt als TIRF, auf das Maximum eingestellt. Starten Sie die Kameraaufnahme und öffnen Sie den Laserblendenverschluss, um die fluoreszierenden Proteine innerhalb der Bakterien anzuregen. Die Parameter für die Laserintensität und die Aufnahmegeschwindigkeit müssen für das jeweilige biologische System optimiert werden.

Die zu untersuchenden Proben werden beleuchtet, bis sie photobleichen, was typischerweise etwa 10 Sekunden dauert. Sobald die Daten gesammelt wurden, werden die Bilder in ein speziell entwickeltes Analyseprogramm eingespeist, das automatisch die Positionen fluoreszierender Flecken in den Zellen mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern erkennt und deren Größe sowie Helligkeit extrahiert. Die Helligkeit der Photobleichkurve in Abhängigkeit von der Zeit des attraktiven Molekülkomplexes wird anschließend verwendet, um die Stöchiometrie zu bestimmen.

Mithilfe dieser Methode ist das Bild der Zellen im Hellfeld sehr deutlich, sodass die Umrisse der Zellkörper dunkel vor einem weißen bis grauen Zellkörper erscheinen, wenn fluoreszierende, immobilisierte Zellen betrachtet werden. Deutlich abgegrenzte Intensitätsflecken mit typischerweise 250 bis 300 Nanometern Breite sind hier in Falschfarben dargestellt. Gesunde, verankerte Zellen sind im Hellfeld unter fluoreszenter Anregung dabei zu beobachten, wie sie sich um den Punkt der Verankerung drehen.

Einige molekulare Komplexe könnten ebenfalls an der Anheftungsstelle sichtbar sein, was auf eine Lokalisation des markierten Proteins mit dem Geller-Motor hindeutet. Diese Flecken sind einzelne molekulare Komplexe. Die Anzahl dieser sichtbaren Komplexe hängt von dem verwendeten Beleuchtungsmodus sowie davon ab, wie viele der Komplexe zu einem bestimmten Zeitpunkt tatsächlich in der Zelle vorhanden sind.

Wenn die Dichte der Flecken anfangs sehr hoch ist, wie dies bei den hier verwendeten markierten Cytochromen der Fall ist, kann eine anfängliche FRAP-Bleiche den Abbildungskontrast verbessern. Die Mobilität der Flecken hängt vom spezifischen biologischen System ab. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man einzelne molekulare Komplexe mittels fortschrittlicher Fluoreszenzmikroskopie sichtbar macht.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, keine Scherzellen zu erzeugen, da dies die Funktionalität des Flagellenmotors beeinträchtigen könnte. Außerdem sollte man die Zellen nicht länger als eine Stunde auf den Mikroskopobjektträgern belassen, da sie sonst unter Sauerstoffmangel leiden könnten. Eine Automatisierung ist erforderlich, um die optimalen Bildgebungsbedingungen zu finden.

Die Verwendung von gereinigtem GFP allein kann helfen, die korrekte Laserleistung für Ihr spezielles Mikroskopsystem zu ermitteln. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.