Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Hier demonstrieren wir das Protokoll für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Bakterienzellen, um funktionelle molekulare Komplexe zu detektieren, zu verfolgen und zu quantifizieren. Dieses Protokoll beginnt mit der Züchtung von Bakterien, die ein Protein herstellen, das an ein fluoreszierendes Farbstoffmolekül gebunden ist. Nach vier bis sechs Stunden wird ein kleines Volumen an Zellen aus der Kultur entnommen und ihre Flagellenfilamente durch Scheren abgeschnitten.

Ein Glasdeckel in einer Durchflusszelle ist beschichtet, damit die Zellen an der Oberfläche haften bleiben. Die Zellen werden in die Durchflusszelle injiziert und über einen Gellar-Stummel angebunden, der mit Hilfe der Laseranregungsmikroskopie in Fluoreszenz betrachtet wird. Eine Kamera mit hoher Quanteneffizienz zeichnet dann die hellen Hellfeld- und Fluoreszenzbilder der markierten Molekülkomplexe auf.

Hallo, mein Name ist Ian Doy und ich arbeite mit Mark Lee am Department of Biochemistry der University of Oxford zusammen. Ich bin Alex Robertson und arbeite mit Mark Lee in der Physikabteilung zusammen. Ich bin Nick De vom Leak Lab, der ebenfalls in der Physikabteilung angesiedelt ist.

Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie einzelne molekulare Komplexe in lebenden Bakterien mit Hilfe der fortschrittlichen Fluoreszenzmikroskopie sichtbar machen können. Wir verwenden dieses Verfahren, um dies in einem funktionsfähigen Zustand zu untersuchen. Wir verwenden auch, um die Echtzeitdynamik der natürlichen biologischen Maschine und der Nanometer-Linsenskala zu untersuchen.

Also lasst uns loslegen. Um mit dem Auftauen zu beginnen, tauen Sie 50 Mikroliter gefrorene Stängel von E-Coli-Bakterien auf. Diese wurden genetisch verändert.

Um ein Protein mit einem fluoreszierenden Farbstoffmolekül zu markieren, inokulieren Sie fünf Milliliter LB-Wachstumsmedium und züchten Sie die Bakterien aerob schüttelnd über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen nehmen Sie 50 Mikroliter der gesättigten Kultur und subkultivieren Sie sie in minimale M 63 Glukose-Kulturmedien, die vier bis sechs Stunden lang bei 30 Grad Celsius inkubiert werden. Dabei kommen zwei verschiedene Zellstämme zum Einsatz.

Eine exprimiert ein Elektron, das Cytochrom transportiert und mit GFP fusioniert ist. Das andere exprimiert ein Protein, das am bakteriellen Flagellenmotor beteiligt ist. Mit GFP-Zellen fusionierte Zellen können entweder direkt aus der wachsenden Subkultur geerntet werden, wenn sie als immobilisierte Proben betrachtet werden sollen, oder sie können geschoren werden, um bakterielle Flagellen zu kürzen, wenn sie unter angebundenen Bedingungen betrachtet werden.

Um die Bakterien zu scheren, geben Sie ein bis fünf Milliliter der Subkultur in ein Gerät, das aus zwei sterilen Spritzen besteht, durch sterile Rohrleitung. Abwechselndes Einschieben jeder Spritzenpumpe, um die Kultur je nach Grad der erworbenen Scherung etwa 50 bis 100 Mal durch den schmalen Schlauch zu drücken. Zentrifugieren Sie anschließend die Kultur, um die Zellen zu pelletieren, und resuspendieren Sie die Zellen dann in minimalem Medium, um Flagellenfragmente zu entfernen. Sobald die Zellen fertig sind, bereiten Sie die gereinigten BK Seven-Glasdeckgläser vor, indem Sie sie 20 Minuten lang in eine gesättigte Lösung aus Kaliumhydroxid und Ethanol tauchen.

Gründlich in entionisiertem Wasser und Ethanol abspülen und mindestens eine Stunde an der Luft trocknen lassen. Konstruieren Sie als Nächstes eine einfache Durchflusszelle, in der die Zellen im Mikroskop untergebracht sind. Zeichnen Sie dazu Linien aus Paraffinfett auf einen BK seven Glasobjektträger und erstellen Sie dann ein Tunnelsandwich, indem Sie eines der gereinigten Deckgläser darauf legen.

Mit einer Pinzette leicht nach unten drücken. Dies sollte ein Volumen der Durchflusszelle von fünf bis 10 Mikrolitern ergeben. Zur Beobachtung füllen immobilisierte Zellen die Durchflusszelle, indem Sie eine 0,1%ige Lösung von Poly-L-Lysin injizieren und mindestens eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren lassen.

Als nächstes spülte WIC die Durchflusszelle aus, indem 100 Mikroliter minimales Medium von einem Ende der Durchflusszelle injiziert wurden und das Medium gleichzeitig mit Seidenpapier vom anderen Ende durch die Durchflusszelle geleitet wurde. Anschließend warf WIC 20 Mikroliter einer Verdünnung von Latex-Mikrokugeln mit einem Durchmesser von 200 Nanometern in ein minimales Medium, um die Deckglasoberfläche zu markieren. Stellen Sie die Durchflusszelle in eine einfache Feuchtigkeitskammer und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Durchflusszelle wird so umgedreht, dass der Deckglas nach unten zeigt.

Die ungebundenen Kügelchen werden dann weggewaschen, indem 100 Mikroliter minimales Medium mit Seidenpapier durchgesaugt werden. Um angebundene Zellen zu beobachten, überspringen Sie stattdessen den Inkubationsschritt von Poly-L-Lysin, füllen Sie die Durchflusszelle mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Anti-Flag-Gellan-Antikörperlösung und legen Sie sie dann für 10 Minuten in eine Feuchtigkeitskammer. Spülen Sie die Durchflusszelle nach der Inkubation durch, indem Sie sie mit Seidenpapier reinigen.

Als nächstes werden 20 Mikroliter der Zellkultur mit Seidenpapier durch die Durchflusszelle geleitet, wobei entweder die gescherte Probe zur Beobachtung angebundener Zellen oder die nicht freigegebene Probe zur Betrachtung immobilisierter Zellen verwendet wird, die Durchflusszelle wird umgedreht und für 20 Minuten in die Feuchtigkeitskammer gestellt. Die ungebundenen Zellen werden dann durch den Docht durch 100 Mikroliter minimales Medium ausgewaschen. Geben Sie einen Tropfen Tauchöl in die Mitte der Oberseite des Deckglases.

Platzieren Sie die Durchflusszelle vorsichtig auf dem Probenhalter des speziell angefertigten Fluoreszenzmikroskops. Diese sollte optischen Kontakt mit der Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur herstellen. Schalten Sie anschließend die Elektronenvermehrungskamera des Mikroskops ein und stellen Sie die Kamera auf minus 70 Grad Celsius ein.

Die Software ist so eingestellt, dass sie Bilder mit einer typischen Bildrate von 25 Hertz aufnimmt. Im Frame-Übertragungsmodus. Schalten Sie die Hellfeldbeleuchtung ein und bringen Sie das Bild in den Fokus.

Wählen Sie eine geeignete Zelle oder Gruppe von Zellen aus, die abgebildet werden sollen, basierend darauf, dass sie an ihrer Längsachse feststecken. Passen Sie parallel zur Deckglasoberfläche den Fokus an, um sicherzustellen, dass die 200 Nanometer großen Latexperlen, die auf der Deckglasoberfläche haften, gerade scharf sind. Nehmen Sie eine Bildsequenz im Hellfeld auf, um den Umriss des Zellkörpers aufzunehmen.

Dann wird die Hellfeldbeleuchtung ausgeschaltet und die Kameraverstärkung für die Bildgebung mit Totalreflexionsfluoreszenz, auch Rasen genannt, auf ein Maximum eingestellt. Starten Sie die Kameraaufnahme und öffnen Sie den Laserverschluss, um die fluoreszierenden Proteine in den Bakterien anzuregen. Die Parameter für die Laserintensität und die Erfassungsgeschwindigkeit müssen für das jeweilige biologische System optimiert werden.

Die Proben in der Studie werden beleuchtet, bis sie lichtgebleicht sind, was in der Regel etwa 10 Sekunden dauert. Sobald die Daten gesammelt wurden, werden die Bilder in ein speziell geschriebenes Analyseprogramm eingespeist, das automatisch die Positionen der Fluoreszenzflecken in den Zellen mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern erkennt und deren Größe und Helligkeit extrahiert. Die Helligkeit der Photobleichspur in Bezug auf die Zeit des anziehenden molekularen Komplexes wird dann verwendet, um die Verwendung der Stöchiometrie abzuschätzen.

Mit dieser Methode ist das Bild der Zellen, die im Hellfeld betrachtet werden, sehr deutlich, so dass die Perimeter der Zellkörper dunkel gegen einen weißgrauen Zellkörper sind, wobei Fluoreszenz mit immobilisierten Zellen verwendet wird. Deutliche Intensitätspunkte von typischerweise 250 bis 300 Nanometern Breite sind hier in Falschfarben dargestellt. Gesunde angebundene Zellen können in Hellfeldbildern unter fluoreszierender Anregung beobachtet werden, wie sie sich um den Punkt der Tether-Bindung drehen.

Einige molekulare Komplexe könnten auch an der Anheftungsstelle gesehen werden, was auf eine Lokalisierung des getankten Proteins mit dem Geller-Motor hinweist. Bei diesen Flecken handelt es sich um einzelne molekulare Komplexe. Die Anzahl dieser Komplexe, die zu sehen sind, hängt vom verwendeten Beleuchtungsmodus ab und davon, wie viele der Komplexe tatsächlich gleichzeitig in der Zelle vorhanden sind.

Ist die Dichte der Spots zunächst sehr hoch, wie es bei den hier verwendeten markierten Cytochromen der Fall ist, kann eine erste Frap-Bleiche den Bildkontrast verbessern. Die Beweglichkeit der Spots hängt vom jeweiligen biologischen System ab. In der Studie, Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie einzelne molekulare Komplexe mit Hilfe der fortschrittlichen Fluoreszenzmikroskopie visualisieren können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, keine Scherzellen zu haben, da dies die Funktionalität des Flaggenmotors beeinträchtigen kann. Es ist auch wichtig, die Zellen nicht länger als eine Stunde auf den Objektträgern zu lassen, da sie sonst sauerstoffarm werden könnten. Eine Automatisierung ist erforderlich, um die besten Bildgebungsbedingungen zu finden.

Es kann hilfreich sein, nur gereinigtes GFP zu verwenden, um die richtige Laserleistung für Ihr spezielles Mikroskopsystem zu ermitteln. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.