Name: Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung kortikalen Aktin-Flusses in T-Zellen mittels raum-zeitlicher Bildkorrelationsspektroskopie. Diese Methode ermöglicht nanometerskalige Auflösung zur Analyse immunologischer Synapsen.

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D.M.O. bestätigt das Stipendium Nr. 337187 des Europäischen Forschungsrats und das Marie-Curie Career Integration Grant Nr. 334303. P.W.W. erkennt das Discovery Grant-Programm des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada an.

Hinweis: Stufen 1 und 2 erfolgen vor dem Tag der Bildgebung; sicherzustellen, dass alle Medien und Ergänzungen vor oder am Tag der Bildgebung ins Gleichgewicht gebracht werden, verwendet werden. Gleichgewichtseinstellung wird durch Erwärmung von Medien und Ergänzungen zu 37 ° C in einem Inkubator, um 5% CO 2 gelöst. Alle Zellkulturarbeit und Deckbeschichtungsschritte erfolgen unter sterilen Bedingungen unter einer Sterilbank. 1. Zelltransfektion <ol><li> Transfektion die T-Zellen, um 24 Stunden abgebildet werden vor dem Versuch mit einem Plasmid kodiert eine fluoreszierende Fusionskonstrukt für F-Actin GFP Kennzeichnung und Bildgebung. Hinweis: Die Zellen sollten 24 Stunden vor der Transfektion (48 Stunden vor der Abbildung), um sicherzustellen, Zellen sind an eine optimale Gesundheit und in ihrer logarithmischen Wachstumsphase aufgeteilt werden. <ol><li> Zeigen 5 ml RPMI Ergänzung (RPMI 1640 plus 10% FBS und 1% Pen-Strep (optional)) in einer einzelnen Vertiefung einer 6-Well-Platte in den Inkubator ins Gleichgewicht. </li><li> Pellet 2 × 10 7 T-Zellen-Kultermittelt und mit 37 ° C + 5% CO 2 in RPMI Ergänzung unter Verwendung eines Zentrifugenröhrchen bei 327 x g für 5 min und waschen in einem gleichen Volumen von vorgewärmtem Elektroporation Medien. Hinweis: Die Elektroporation Medium eine verringerte Serum-Medium, das Puffern und Nahrungsergänzungsmittel (siehe Verbrauchsmaterialien). </li><li> Nach der Wieder Pelletierung bei 327 xg für 5 min, resuspendieren Zellen in 500 ul Elektroporation Medien und langsam zu einer Küvette, fügen 5 ug des Plasmids in PCR Grade dH 2 O für die Kennzeichnung F-Actin. </li><li> Klopfen Sie leicht die Küvette auf der Motorhaube Arbeitsbereich um die Entfernung von Luftblasen in den Medien, die Lichtbogenbildung der Elektrizität verursachen können, und um die Zellen gleichmäßig innerhalb der Medienformaten zu gewährleisten. </li><li> Schalten Sie den Elektroporationseinrichtung und setzen Spannung bis 300 V und die Kapazität bis 290 Ω. Elektroporieren Probe unter Verwendung eines exponentiellen Abfall für 20 ms. Anmerkung: Die Optimierung für unterschiedliche Zellen und verschiedene Plasmidkonstrukte erforderlich. </li><li> Sobald das Transfektionsprotokoll istkomplette, speichern Zellen auf Eis für 1 Minute, bevor Sie fortfahren. </li><li> Die Zellen vorsichtig zu übertragen aus der Küvette zu der 6-Well-Platte mit 5 ml RPMI äquilibriert Ergänzung von Schritt 1.1.1. </li><li> Die Zellen O / N bei 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Mantel Deckgläser und Pre-warmen Imaging Supplement <ol><li> Mantel Deckgläser mit Antikörpern gegen T-Zell-Stimulierung hervorzurufen. <ol><li> Coat jede Kammer eines 8-Well-Deckglas mit 1 ug / ml &amp; agr; CD3 und &amp; agr; CD28 in 200 ul PBS. </li><li> Lagerung bei 4 ° CO / N. Alternativ fällt Deck 2 h vor der Bilderzeugung und in einem Inkubator Halten bei 37 ºC, um eine Drift während des Abbildungsprozesses zu reduzieren durch Temperaturänderungen um das Deckglas zu minimieren. </li></ol></li><li> Erstellen Sie ein Deckglas Testprobe mit 0,1 um Unterbeugungs fluoreszierende Mikrosphären. <ol><li> Vortex-Stammlösung von Perlen, um Klumpen zu vermeiden. </li><li> Auf einem neuen, sauberen Deckglas von the gleichen Typ wie die in Schritt 2.1.1 verwendet, Pipette 5 ul fluoreszierende Mikrosphären-Stammlösung auf die Oberfläche (nach Herstellerangaben). </li><li> Verbreiten Mikrokugel-Lösung über das Deckglas mit Pipettenspitze. </li><li> Trocknen lassen, dann gelten 200 ul Eindeckmedium wie PBS. Hinweis: Das Eindeckmedium sollten übereinstimmen, dass für die Bildgebung Zellproben verwendet. </li></ol></li><li> Äquilibrieren HBSS (+ 20 mM HEPES, nachstehend &quot;HBSS Ergänzung &#39;) in einem Zentrifugenröhrchen, indem Sie in einem Inkubator vor, eine warme O / N bei 37 ° C + 5% CO 2. Hinweis: die Zugabe von HEPES ist in den Puffer CO 2, wenn mit Hilfe eines Inkubationskammer mit CO 2 Eingangs überspringen Sie diese Ergänzung. </li></ol> 3. Mikroskop Set-up <ol><li> Biegen Sie auf der Bühne-Top-Inkubator des TIRF-SIM-Mikroskop und Platz genug destilliertes Wasser in das Reservoir des Mikroskops, um die Basis des Heizelements vollständig abdecken. Damit das Wasser eine Equilibrate bis 37 ° C. Hinzufügen der Heizmanschette zu der Objektivlinse, die auch auf 37 ° C eingestellt. Hinweis: Wegen der Empfindlichkeit der Einrichtung, diese Schritte werden in der Nacht zuvor getan die optischen Komponenten bei einer stabilen Temperatur vor der Bildgebung. </li><li> Legen Sie die TIRF-488 kompatibel Gitterblock in den Strahlengang des Mikroskops und sicher am Platz. <ol><li> Schalten Sie den Kanal-Modus und das Glasfaserkabel an die &#39;Single&#39; Position auf dem Laser-Bett und Mikroskoptisch jeweils um die richtige optische Weg für die TIRF-SIM-Modus zu aktivieren. Hinweis: Überspringen Sie diesen Schritt wird zu einem Fehler (Abbildung 1A) im Software-Fenster führen. </li></ol></li><li> Schalten Sie alle Mikroskop und Computer-Komponenten und öffnen Sie die Aufnahmesteuerung Software. <ol><li> Öffnen Sie das Bedienfeld OC, Ti Pad, N-SIM-Pad und ND Acquisition Fenster (Abbildung 1B). In der &#39;OC Panel&#39; die Option &#39;TIRF 488&#39; (2B, gelber Pfeil). </li&gt; <li> In der N-SIM-Pad-Fenster, wählen Sie die &#39;TIRF-SIM &quot;und&quot; Verschieben &quot;Einstellungen (2C, gelbe Pfeile). Wählen Sie die Schaltfläche Einstellungen (1C, gelber Kasten) und wählen Sie &quot;TIRF 488 (für 100x TIRF 488 nm)&quot; aus dem Dropdown-Menü, klicken Sie auf &#39;Übernehmen &quot;und&quot; OK &quot;. </li><li> Stellen Sie die Kamera-Einstellungen innerhalb der &quot;DU897-Einstellungen&quot; auf: Frame Rate 50 ms, Auslesemodus EM Gewinn 3 MHz bei 14 Bit, und EM-Gewinn-Multiplikator 300 mit einer Umwandlungsverstärkung 1 (1C, grüner Kasten). Hinweis: Siehe Repräsentative Ergebnisse für Bildrate Überlegungen. </li><li> Kalibrieren des Mikroskops Beleuchtung für TIRF-SIM, indem Sie die 100x 1,49 NA CFI Apochromat TIRF Ziel, auf der &quot;N-SIM-Pad &#39;schalten Sie den 488 nm Laserleistung bis 10%. Hinweis: Pixelgröße der Rohbilder ist 60 nm, mit einem 512 x 512 Pixel-Sichtfeld. </li><li> Reinigen Sie die Objektivlinse mit Linsenpapier, um Staub und Öl zu entfernen. </li></ol></li&gt; <li> Finden Sie die TIRF-SIM Brennebene. <ol><li> Beginnen Sie mit dem Ziel, in der niedrigsten möglichen z-Ebene. Geben Sie einen Tropfen Öl auf Linse des Objektivs und fügen Sie die fluoreszierenden Mikrokügelchen Probe aus Schritt 2.2 auf den Mikroskoptisch. </li><li> Wählen Sie die perfekte Focus System (PFS) Funktion auf dem Körper des Mikroskops befindet. </li><li> Bewegen sich langsam das Ziel, nach oben durch die z-Ebene, bis der PFS-Taste hört auf zu blinken, um die Brennebene bestätigen, wurde erreicht. </li><li> Wechseln Sie in den &quot;Live&quot; Blick auf die Steuerungssoftware und Bild die Mikrosphären für die endgültige Anpassungen mit Hilfe des PFS Mikromanipulator Rad gemacht. </li></ol></li><li> Die eine gleichmäßige Ausleuchtung zu beobachten ohne out-of-focus Fluoreszenzemission über der 75 nm abklingende Welle. Hinweis: Bestätigen strukturierten Beleuchtung wird durch die Beobachtung einer schwankenden Beleuchtungsmuster von der fluoreszierenden Mikrosphärenprobe erfüllt. </li><li> Messen Sie fluoreszierende Mikrokügelchen Probe und zu quantifizieren, die verbesserte Bildgebung resolutIonen durch die Beobachtung der Halbwertsbreite (FWHM) des Intensitätsprofils. <ol><li> Öffnen Sie die Analyze-Software (v4.20.01), mit der NIS-A N-SIM-Analyse-Modul installiert und wählen Sie &#39;Anwendungen&#39; -&gt; &#39;Show N-SIM-Fenster&#39;. </li><li> Mit der Beleuchtungsmodulationskontrast (IMC) und hochauflösende Rauschunterdrückung (HRNS) bis 1 für die TIRF-SIM-Datensätzen (Abbildung 2) gesetzt, rekonstruieren die Mikrosphärenprobe Bild, um ein rekonstruiertes Bild von 1.024 x 1.024 Pixeln bei einer Pixelgröße von 30 zu erzeugen, nm. </li><li> Verwenden der Linienprofilwerkzeug mit einer Breite von 1 Pixel (3A, gelber Kasten), ziehen Sie eine Linie durch die Mitte eines einzelnen Mikrokügelchen. </li><li> Wählen Sie das FWHM Taste (3B, gelber Kasten), und klicken Sie auf der Intensitätsmaxima der Gaußschen Verteilung, gefolgt von seiner Intensität Minima. </li><li> Bestätigen die FWHM der Mikrosphäre in einem Bereich von 100 nm (Figur 3C). Hinweis: die Auflösung achieved bei der Abbildung von biologischen Proben wird in Abhängigkeit von dem Signal-Rausch-Verhältnis von Markierungseffizienz und die Hintergrundfluoreszenz zu variieren. </li></ol></li></ol> 4. Probenvorbereitung für die Imaging <ol><li> Deckglas Vorbereitung. <ol><li> Abrufen &amp; agr; CD-beschichtete Deckglas aus Schritt 2.1 vom Kühlschrank oder Inkubator und entfernen PBS, das &amp; agr; CD3 und &amp; agr; CD28 aus jeder Vertiefung. </li><li> Fügen Sie 200 ul vorgewärmtes HBSS Ergänzung von Schritt 2.3 in jede Vertiefung des Deckglases. Waschen und zu entfernen, um eine minimale &amp; agr; CD3 gewährleisten und &amp; agr; CD28 wird in der Lösung belassen. Fügen Sie eine weitere 200 ul des HBSS Ergänzung zu den Deck Brunnen. </li><li> Reinigen Sie die Unterseite des Deckglases mit Linsenpapier, um Öl und Partikel zu entfernen. </li></ol></li><li> Decklage auf dem Mikroskoptisch und um die TIRF Brennebene des Deckglases unter Verwendung des PFS z-Ebene, wie in Schritt 3.4 festgestellt. </li><li> Zellpräparation. <ol><li> Je 200 &amp; mgr; l der Medien conTaining transfizierten Zellen aus Schritt 1.1.8 in einem Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Pellet-Zellen in einer Mikrozentrifuge bei 268 · g für 20 sec und entfernen Zellmedien. </li><li> Die Zellen in 200 ul vorgewärmtes HBSS Ergänzung von Schritt 2.3. </li></ol></li></ol> 5. Imaging Cells <ol><li> Nehmen zellhaltigen HBSS Ergänzung des Mikroskops und sanft Je 200 ul in einer der Vertiefungen. </li><li> Während in der TIRF Brennebene verbleibenden am Deckglas (im PFS-Modus), verwenden Sie den Mikroskopen Okular und Epifluoreszenz-Beleuchtung, um fluoreszierende Zellen Annäherung an das Deckglas zu verfolgen. </li><li> Sobald die Zellen landen auf dem Deckglas, um &quot;Live&quot; Modus in der N-SIM-Pad-Schalter, um das Bild auf dem Monitor zu bringen und überprüfen Sie die Zellen im Fokus auf dem Computerbildschirm. </li><li> Um Zeit-Kurse aufzunehmen, öffnen Sie das ND-Aufnahmefenster und wählen Sie die Registerkarte &#39;Time&#39;, klicken Sie auf &quot;Hinzufügen&quot;, und setzen Sie &quot;Interval&quot;, um keine Verzögerung, &#39;Dauer&#39;bis 10 min, &quot;Loops&quot; auf 1 gesetzt ist. Anmerkung: Die Dauer kann je nach Verfahren von Interesse verändert werden; die stics Software kann quantitative Ergebnisse mit Bild Stapel von ≈10 Frames zu extrahieren, wenn sie mit &quot;keine Verzögerung&quot; festgehalten. </li><li> Mit identischen Übernahme-Einstellungen an dem Wulst Probe, starten Sie die Aufnahme-Daten, indem Sie &quot;Jetzt ausführen&quot; in der ND-Aufnahmefenster. </li></ol> 6. Rekonstruktion SIM Bilder <ol><li> Nach der vollständigen Bildgebung ist, öffnen Sie die Analyze-Software (v4.20.01), mit der NIS-A N-SIM-Analyse-Modul installiert und wählen Sie &#39;Anwendungen&#39; -&gt; &#39;Show N-SIM-Fenster&#39;. </li><li> Mit der Beleuchtungsmodulationskontrast (IMC) und hochauflösende Rauschunterdrückung (HRNS) bis 1 für die TIRF-SIM-Datensätzen festgelegt (Abbildung 2), zu rekonstruieren, eine (oder mehrere mit der Batch-Tool) raw SIM-Datei um ein rekonstruiertes Bild SIM zu produzieren. </li><li> Bestätigen Sie die rekonstruierten Datei eine Pixelgröße von 30 nm, in der angegebenBildstatusleiste. Hinweis: Pixelgröße hat keinen Einfluss auf stics Analyse, aber es sollte mindestens 2x kleinere Abmessung als der PSF räumliche Auflösung, um räumliche Korrelation zwischen den Pixeln zu gewährleisten. </li><li> Exportieren Sie die Daten als TIFF-Dateien, bereit für stics Analyse. </li></ol> 7. stics Analysis <ol><li> Download und Dekomprimierung der STIC (C) S Matlab-Software-Paket (Wiseman Labor; als Zusatzinformation zur Verfügung). Das Skript stics_vectormapping.m ist der Kern eines einzelnen Kanals stics Analyse und die ersten 30 Zeilen Code werden verwendet, um die Eingangsparameter zu definieren, wie in Abschnitt 2.1 des Handbuchs definiert. Öffnen Sie dieses Skript und definieren Sie die Eingangsparameter für TIRF-SIM-Datenanalyse. Es wird vorgeschlagen, auch die STIC (C) S-Ordner mit Unterordnern hinzuzufügen, auf die lokale Maschine Matlab-Pfad, wie im Anhang dieses Handbuchs beschrieben. <ol><li> Definieren die Eingangsparameter für die Datenanalyse durch Bearbeiten der entsprechenden Linien des Code </li><li> Um ana führenLyse der TIRF-SIM-Daten auf 1-Vektor-Karte zu generieren, legen Sie die zeitliche Parameter, um die zeitliche Teilbereich in der Leitung 31 auf die maximale Anzahl der Bilder und der zeitlichen Verschiebung der Linie 32 bis 1. Um eine Zeitreihe von Vektorkarten zu erhalten, variieren diese Parameter . </li><li> Für die Immobile Entfernungsfilter, setzen Sie den Parameter &quot;Filterung&quot; (Linie 23) zu &quot;Gleitender Durchschnitt&quot; und stellen Sie die &#39;MoveAverage&#39; Parameter (Linie 24) bis 21. Hinweis: Diese Einstellung hat gezeigt, dass der vorausfahrende und großen Fluoreszenzsignale zu arbeiten, wie es auf Subtrahieren Serienrahmen aus dem Rahmen, die analysiert basiert. </li><li> Ändern Linien 33-38 den Namen der Ausgabedateien und Titel der Ausgangsvektorkarten, sowie die Ausgangsverzeichnispfad zu setzen und zu definieren, in welchem ​​Format die Vektorkarte Bilder gespeichert werden sollen. </li></ol></li></ol><table><tbody><tr><td> Pixelgröße (um) </td><td> 0,03 um </td><td> Linie 19 </td></tr><tr><td> Bildrate (sec) </td><td> 1 Sek </td><td> Line 20 </td></tr><tr><td> Maximale Verzögerungszeit (Frames) </td><td> 20 Rahmen </td><td> Zeile 21 </td></tr><tr><td> Subregion Größe (Pixel) </td><td> 8 Pixel </td><td> Zeile 29 </td></tr><tr><td> Subregion Abstand (Pixel) </td><td> 1 Pixel </td><td> Zeile 30 </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Öffnen Sie die Skript run1ChannelSTICS in der Matlab-Editor-Fenster. Laden Sie das Bild-Serie von Laufleitungen 1-23 von diesem Skript. Hinweis: Dieses Skript kann verwendet werden, um zu laden und Pre-Prozessabbild-Serie, zeichnen Sie die Vektorkarten und Geschwindigkeit Histogramme und führen Sie eine Stapelverarbeitung für viele Dateien werden. Falls erforderlich, das Bild zuschneiden, um einen interessierenden Bereich unter Verwendung der Linie 24-26 dieses Skripts. <ol><li> Führen Linien 29-35 von run1ChannelSTICS zu stics Analyse zu starten. Wählen Sie bei Aufforderung ein Polygon, eine bestimmte Region of Interest (ROI) anzugeben, falls gewünscht. Stellen Sie sicher, dass der ROI nicht mit dem Zellenrand überlappen, als Randartefakte auftreten, wenn stics analysiert diese WiederRegionen. </li><li> Führen Linien 38-52, um die Vektorkarten anzuzeigen. Um die Größenordnung der Geschwindigkeit Histogramm darstellen, führen Linien 53-72. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Diese Technik wird Forschern, die dem Bild zu ermöglichen und zu quantifizieren, bisher nicht auflösbaren Details in Zellen Fluoreszenz exprimieren. In unseren Ergebnissen zeigen wir, dass F-Actin fließt in einer symmetrischen Art und Weise aus der Zellperipherie in Richtung der Zellzentrum in der T-Zelle. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Ergebnissen von 1D Linienprofil kymograph Daten 13 und erstrecken sich die Kapazität der Analyse, um 2D- und Super-Resolution-Daten. Die vo...

Das Ziel des Experiments ist es, Bild und Charakterisierung der molekularen Strömung von filamentous- (F-) Aktin in lebenden T-Zellen, jenseits der Beugungsgrenze, um die Strömungsrichtung und die Größe bei immunologischen Synapse (IS) Bildung zu etablieren. Diese Technik wird unter Verwendung einer strukturierten Beleuchtung Mikroskop (SIM) in Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF)-Modus durchgeführt werden, die Abbildung Jurkat T-Zellen bilden eine künstliche Synapse zur Aktivierung Deckgläser mit Anti-CD3- und anti-CD28-Antikörper beschichtet. Der IS Formen zwischen einer T-Zelle und dessen Ziel; eine Antigen-präsentierende Zelle (APC) bei der T-Zell-Rezeptor (TCR) Aktivierungs 1,2. Da dies der erste Schritt bei der Bestimmung, ob das adaptive Immunsystem eine Immunantwort auf eine Infektion, können die Folgen von Fehl auf Stimuli an einer Reihe von Krankheiten verursachen. Die Bedeutung der T-Zell-APC-Wechselwirkung ist gut dokumentiert, jedoch die Rolle (n) des reifen nach dem erstmaligen TCR signal Internalisierung sind noch nicht vollständig verstanden werden. Wie das Zytoskelett wird angenommen, dass zwei Prozesse zur TCR-Aktivierung (die Bewegung von Molekülen in der Plasmamembran und die Steuerung der Signalmoleküle abhängig Aktinzytoskeletts 3,4), zu verstehen, wie das Zytoskelett umlagert räumlich und zeitlich verknüpft unterstützen wird die Schritte erläutern molekularer Reorganisation während der Synapsenbildung. Die retrograde Strom von F-Aktin ist gedacht, um TCR-Cluster in Richtung der Mitte der immunologischen Synapse Koppel, wird diese Translokation angenommen Vitalsignal Aufhören und Recycling zu sein; Hilfe für die feine Balance der T-Zellaktivierung 5. Während Standard-Fluoreszenzmikroskopie ist ein flexibles Werkzeug, um einen Einblick zu vielen biologischen Ereignisse, einschließlich Zell-Zell-Interaktionen bieten weiterhin, wird es durch die Fähigkeit des Systems, mehrere Fluorophore genau aufzulösen Wohnsitz näher als die diffr begrenztAktionsgrenze (≈200 nm) voneinander. Wie viele molekularen Ereignisse innerhalb von Zellen beinhalten dichten Populationen von Molekülen und weisen dynamische Umlagerung entweder in Ruhe oder auf ausdrückliche Anregung, keine konventionellen Lichtmikroskopie nicht die vollständige Bild. Die Verwendung von Super Resolution Imaging konnten Forscher die Beugungsgrenze unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken zu umgehen. Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) wie PALM und STORM 6,7 hat die Fähigkeit, die Position von Molekülen bis zu einer Genauigkeit von etwa 20 nm zu beheben, aber diese Techniken beruhen auf langen Erfassungszeiten, den Aufbau eines Bildes über viele Frames . Im Allgemeinen erfordert diese Proben fest oder für die Strukturen, die geringe Mobilität aufweisen, so einzelne Fluorophore nicht als mehrere Punkte fehlinterpretiert. Während Stimulated Emission Depletion (STED) Bildgebung ermöglicht Super-Resolution durch sehr selektiv konfokale Anregungs 8, die erforderliche ScanAnsatz kann über die ganze Zellfelder langsam sein. STED zeigt auch signifikante Photo hohen Auflösung aufgrund der Erhöhung der Leistung des Verarmungsstrahls. Strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM 9) stellt eine Alternative zu diesen Verfahren in der Lage, die Verdoppelung der Auflösung eines Standard-Fluoreszenzmikroskop und ist mit Live Cell Imaging ist als aktuelle SMLM Techniken kompatibel. Es nutzt niedrigere Laserleistungen, auf einem Weitfeldsystem für Ganzzellfelder; Versehen erhöhten Akquisitionsgeschwindigkeiten und ist mit Standard-Fluorophor Kennzeichnung kompatibel. Die Weitfeld Natur der SIM gestattet auch die Verwendung von interner Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) für hochselektive Anregung mit Eindringtiefen in axialer Durchmesser von &lt;100 nm. Bildkorrelationsspektroskopie (ICS) ist ein Verfahren zum Korrelieren von Fluktuationen der Fluoreszenzintensität. Eine Weiterentwicklung des ICS; Raum-Zeit-imAlter Korrelationsspektroskopie (STICs 10) korreliert intrazellulären Fluoreszenzsignale in Zeit und Raum. Durch die Korrelation Pixelintensitäten mit umgebenden Pixeln in rückständigen Rahmen über eine Korrelationsfunktion wird Informationen über Strömungsgeschwindigkeiten und Direktionalität gewonnen. Um sicherzustellen, statische Objekte nicht mit dem STICs Analyse stören, ist ein unbewegliches Objekt-Filter implementiert, das durch Subtrahieren des gleitenden Durchschnitts der Pixelintensitäten funktioniert. Die hier vorgestellte Technik wird angenommen, dass die erste Demonstration von Bildkorrelationsspektroskopie an superauflösende Mikroskopie Daten angewendet, um die molekulare Strömung in lebenden Zellen 11 quantifizieren. Dieses Verfahren verbessert beugungsbegrenzte Abbildung von F-Actin Fluss über STICs Analyse 12 und würde Forschern, die zweidimensionale molekulare Strömung in lebenden Zellen zu bestimmen, von der bei räumlichen Auflösungen jenseits der Beugungsgrenze von Licht erfaßten Daten Wunsch zu entsprechen.

<table><tbody><tr><td>Verbrauchsmaterialien:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jurkat E6.1 Zellen</td><td>APCC</td><td>ATTC TIB-152</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F7524-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Strepromycin&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>&nbsp; Life Technologies</td><td>14025-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 8-Well-Labtek-Deckgläser</td><td>NUNC, Labtek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>LifeAct GFP-Konstrukt</td><td>Ibidi</td><td>60101</td><td></td></tr><tr><td>OptiMem</td><td>Life Technologies</td><td>51985-042</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD28</td><td>BD Bioscience / Insight Biotechnologie</td><td>555725</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>Linsenöl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Ausrüstung:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulsar Xcell System</td><td>BioRad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>Küvette (0,4cm)</td><td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge (5810R)</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5805 000.327</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge (Heraeus)</td><td>Biofuge Pico</td><td>75003235</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Stage-Top-Inkubator</td><td>Tokai Hit</td><td>INUH-TIZSH</td><td></td></tr><tr><td>Nikon N-SIM Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Firma</td><td></td></tr><tr><td>kontaktieren Nikon Analysesoftware</td><td>Nikon</td><td>Firma</td><td></td></tr><tr><td>kontaktieren Inkubator ( 190D)</td><td>LEEC</td><td>Unternehmen</td><td></td> kontaktieren</tr></tbody></table>

kortikalen aktin fluss in t-zellen durch raum-zeitliche bildkorrelationsspektroskopie von structured illumination microscopy daten quantifizierte

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentösen -Actin spielt eine entscheidende Rolle bei der Mehrheit der Zellprozesse einschließlich Motilität und in Immunzellen, die Bildung eines Schlüssels Zell-Zell-Interaktion als der immunologischen Synapse bekannt. F-Actin ist auch spekuliert, eine Rolle bei der Regulierung des Molekular Verteilungen auf der Membran von Zellen einschließlich der Unter membranöse Vesikel Dynamik und Protein Clustering spielen. Während Standard-Lichtmikroskop-Techniken ermöglichen verallgemeinert und beugungsbegrenzte Beobachtungen gemacht werden, treten viele zellulären und molekularen Ereignisse, einschließlich Clusterbildung und molekulare Strömung in der Bevölkerung auf Längenskalen weit unter dem Auflösungsvermögen des Standard-Lichtmikroskopie. Durch die Kombination interner Totalreflexion Fluoreszenz mit dem Superauflösungsabbildungsverfahren strukturierten Beleuchtung Mikroskopie wurde die zweidimensionale molekulare Strömung von F-Aktin an der Immun Synapse von T-Zellen aufgezeichnet. Räumlich-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie (stics), wurde dann angewendet, die quantifizierbar Resul erzeugtts in Form von Geschwindigkeits Histogramme und Vektorkarten, die Strömungsrichtungs und Größenordnung. Dieses Protokoll beschreibt die Kombination von superauflösenden Abbildung und STICs Techniken zur Strömungsvektoren an Unterbeugungsdetailniveaus zu erzeugen. Diese Technik wurde verwendet, um ein Aktin-Strömung, die symmetrisch ist und retrograde zentripetalen der gesamten Peripherie der T-Zellen bei der Synapsenbildung zu bestätigen.

Mikroskopeinstellungen Nach der erfolgreichen Verwirklichung aller Schritte der Forscher muss erreicht strukturierten Beleuchtung (SIM) Abbildung von F-Actin Fluss in einer T-Zelle Synapse (Video 1), und quantifiziert diese Molekularströmung durch raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie (4 11). Vor der Aufnahme von Bildern, sicherzustellen, dass die Probenbeleuchtung ist einheitlich über die ne...

Um die Strömungsgeschwindigkeiten und die Richtungsabhängigkeit von filamentösem Aktin an der immunologischen T-Zell-Synapse zu untersuchen, wird die hochauflösende Bildgebung lebender Zellen mit Totalreflexionsfluoreszenz kombiniert und mit räumlich-zeitlicher Bildkorrelationsspektroskopie quantifiziert.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Dynamik des kortikalen Aktins mittels Bildkorrelationsspektroskopie zu quantifizieren, nachdem die Bilder mittels totaler innerer Reflexion, strukturierter Beleuchtungsbildgebung oder TURB-SIM gewonnen wurden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im biophysikalischen Bereich zu beantworten, beispielsweise welche Rolle der Fluss des kortikalen Aktins bei der Regulierung von Wechselwirkungen am immunologischen Synapsen spielt. Der Hauptvorteil der Technik liegt darin, dass sie eine Auflösung im Nanometerbereich mit Verträglichkeit für lebende Zellen kombiniert und es ermöglicht, kleinräumigere Prozesse im Vergleich zu herkömmlichen Lichtmikroskopieverfahren zu beobachten und zu analysieren.Den hier gezeigten Versuchsaufbau wird George Ashdown, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Geben Sie als Testprobe fünf Mikroliter einer Stammlösung mit fluoreszierenden Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 100 Nanometern auf die Oberfläche eines frischen, unbeschichteten Deckgläschens. Verteilen Sie die Mikrokügelchen-Lösung anschließend mit einer Pipettenspitze auf dem Deckgläschen und lassen Sie sie trocknen.Geben Sie 200 Mikroliter Einbettmedium auf das Test-Deckglas, um die Bildgebung vorzubereiten. Schalten Sie den Inkubator für die Objektivheizung des TURF-SIM-Systems ein und füllen Sie das Reservoir mit destilliertem Wasser, sodass die Basis des Heizelements vollständig bedeckt ist. Lassen Sie das Wasser auf 37 Grad Celsius eintemperieren. Verbinden Sie die Heizmanschette mit der Objektivlinse und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein.Befestigen Sie dann den mit dem Turb 4 88 kompatiblen Grauwert-Abstufungsblock im Lichtweg des Mikroskops, um sicherzustellen, dass der korrekte optische Pfad aktiviert ist. Schalten Sie den Kanalmodus auf der Laserbank in die Einzelposition. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das Glasfaserkabel auf der Mikroskopbühne.Es ist damit zu rechnen, dass im Softwarefenster eine Fehlermeldung erscheint, wenn diese Schritte nicht durchgeführt werden. Nachdem der Modus eingestellt wurde, senken Sie das Objektiv auf die niedrigste Z-Ebene ab und geben Sie einen Tropfen Öl darauf. Legen Sie die Deckglasprobe mit den fluoreszierenden Mikrokügelchen auf den Mikroskopständer. Danach wählen Sie das Perfect Focus System (PFS) am Mikroskopkörper aus. Bewegen Sie das Objektiv allmählich entlang der Z-Achse nach oben und stoppen Sie, wenn die PFS-Taste aufhört zu blinken, was anzeigt, dass die Fokusebene in der Steuersoftware erreicht wurde. Wechseln Sie zur Live-Ansicht, um die Mikrosphären auf dem Bildschirm abzubilden.Nehmen Sie feine Fokusverstellungen mithilfe des PFS-Mikromanipulatorrads vor. Achten Sie auf gleichmäßige Beleuchtung, wobei keine unscharfen fluoreszenten Signale über der 75 Nanometer betragenden Wellenlänge auftreten dürfen. Bestätigen Sie abschließend, dass strukturierte Beleuchtung erreicht ist, indem Sie ein schwankendes Beleuchtungsmuster in der Probe aus fluoreszierenden Mikrokügelchen zur T-Zell-Stimulation in den Kammern einer Acht beobachten.Bedecken Sie die Deckglasmit 200 Mikrolitern einer Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpermischung und inkubieren Sie das Deckglas zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach dem Waschen des Deckglases gemäß der schriftlichen Anleitung platzieren Sie es auf dem Mikroskopständer und stellen dann die turbulente Fokusebene ein. Danach pipettieren Sie vorsichtig 200 Mikroliter transfizierter T-Zellen in eine der Vertiefungen auf dem Deckglas.Verwenden Sie die Epi-Fluoreszenz, um die GFP-Aktin-transfizierten Zellen zu verfolgen, während sie auf dem Deckglas auftreffen. Sobald sich die Zellen abgesetzt haben, wechseln Sie mit dem N SimPad in den Live-Modus und überprüfen Sie, ob die Zellen auf dem Monitor scharf gestellt sind. Um eine Zeitreihe aufzuzeichnen, öffnen Sie das ND-Aufnahme-Fenster und wählen Sie den Zeit-Tab aus.Klicken Sie anschließend auf Hinzufügen und stellen Sie das Intervall auf keine Verzögerung ein. Legen Sie die Dauer auf 10 Minuten fest. Starten Sie abschließend die Aufzeichnung der Daten, indem Sie im ND-Aufnahme-Fenster „Jetzt ausführen“ auswählen.Um die Bilder zu rekonstruieren, öffnen Sie zuerst die Analyse-Software mit dem korrekten Analysemodul. Klicken Sie auf „Anwendungen“ und wählen Sie dann das Fenster „End-SIM“ an. Stellen Sie den Beleuchtungsmodulationskontrast und die Rauschunterdrückung mit hoher Auflösung auf eins ein und rekonstruieren Sie den Turf-SIM-Datensatz, um ein vollständiges SIM-Bild aus der Bildstatusleiste zu erzeugen.Stellen Sie sicher, dass die Pixelgröße 30 Nanometer beträgt, und exportieren Sie die Daten anschließend als TIF-Dateien zur Stab-Analyse. Nach dem Herunterladen und Entpacken des Stäbe-MATLAB-Softwarepakets öffnen Sie das Skript. Definieren Sie dann die Eingabeparameter gemäß der schriftlichen Anleitung für den Filter zur Entfernung immobilisierter Partikel.Stellen Sie in Zeile 23 den Filterparameter auf „moving average“ und verwenden Sie in Zeile 24 den Wert 21 als Parameter für den gleitenden Durchschnitt, um eine Vektorkarte zu erzeugen. Legen Sie in Zeile 31 den zeitlichen Teilbereich auf die maximale Anzahl an Bildern fest, in diesem Fall 63. Stellen Sie anschließend in Zeile 32 den zeitlichen Versatz auf eins in den Zeilen 33 bis 35 ein.Geben Sie die Namen der Ausgabedateien, die Titel der Ausgabe-Vektorkarten und den Pfad zum Ausgabeverzeichnis ein. Legen Sie anschließend das Format fest, in dem die Vektorkarten-Bilder gespeichert werden sollen. In diesem Fall png.Öffnen Sie im MATLAB-Editorfenster das Skript. Führen Sie „run one channel sticks“ aus und laden Sie die Bildserie, indem Sie die Zeilen 1 bis 23 des Skripts ausführen. Führen Sie anschließend die Zeilen 29 bis 35 von „run one channel sticks“ aus.Um die Sticanaalyse zu beginnen, folgen Sie der Aufforderung und wählen Sie ein Polygon, um einen interessierenden Bereich oder ROI zu definieren, falls gewünscht. Um die Vektorkarten anzuzeigen, führen Sie die Zeilen 38 bis 52 aus. Führen Sie anschließend die Zeilen 53 bis 72 aus, um das hier gezeigte Histogramm der Geschwindigkeitsbeträge darzustellen, das eine OT-T-Zelle zeigt, die GFP-markiertes F-Aktin exprimiert und mit dem TURB-SIM-Protokoll abgebildet wurde.Im Text besprochen fünf Minuten, nachdem diese Zelle auf einen Deckgläserabschnitt gebracht wurde, der mit anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern beschichtet war, um die Bildung immunologischer Synapsen zu stimulieren. Es wurde eine Zeitreihe aufgenommen, um den molekularen Fluss von F-Aktin sichtbar zu machen. Die anschließende Analyse dieser Daten mithilfe des Sticks-Programms ermöglichte die Quantifizierung des F-Aktin-Molekularflusses, wie durch diese Vektorkarte dargestellt, die dem markierten Bereich der Zelle links entspricht und einen Teil des synaptischen Randbereichs darstellt.Eine weitere Vergrößerung dieser Karte und des T-Zell-Subbereichs verdeutlicht die Richtungsabhängigkeit und Geschwindigkeit des Aktinflusses, die anhand der Vektorlänge sowie der Farbcodierung bestimmt werden können. Geschwindigkeitsdaten können außerdem in einem Histogramm dargestellt werden, was eine statistische Analyse ermöglicht. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass im immunologischen Synapsenbereich F-Aktin symmetrisch von der Peripherie hin zur Zellmitte fließt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man zeitaufgelöste Daten erfasst und kortikale Aktindynamik mittels Bildkorrelationsspektroskopie analysiert.Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in den Aktinfluss während der T-Zell-Migration zu gewinnen, lässt sie sich auch in anderen Systemen anwenden, in denen der molekulare Fluss als wichtig erachtet wird, beispielsweise bei der Zellmigration.

cortical-actin-flow-t-cells-quantified-spatio-temporal-image

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die Aufspaltung der Proteine ​​entweder innerhalb der Plasmamembran oder in intrazellulären Orten eines Regulierungsmechanismus, stark beeinflussen können Signalisierung Ergebnisse, daher zu verstehen Signalisierung ist es wichtig, die räumliche und zeitliche Verhalten der beteiligten Proteine ​​zu untersuchen. Wir beschreiben hier eine TIRF-Mikroskopie basierendes System zur Signaltransduktion in T-Zellen zu studieren, aber ist breit anwendbar.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Dieses Video beschreibt TIRF, eine auf Totalreflexionsmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der Polymerisationsdynamik von Aktin und Mikrotubuli. Die Methode ermöglicht die hochauflösende Abbildung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in Echtzeit, was für das Verständnis zellulärer Wechselwirkungen unerlässlich ist.

TIRF-Mikroskopie zur Visualisierung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli

Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

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Interzellulären Kommunikation ist wichtig für die Steuerung verschiedener physiologischer Aktivitäten innerhalb und außerhalb der Zelle. Dieser Aufsatz beschreibt ein Protokoll zum Messen der räumlich-zeitliche Art der Einzelzellsekrete. Um dies zu erreichen, ist ein multidisziplinärer Ansatz verwendet, der markierungsfreien nanoplasmonische Erfassung mit Live Cell Imaging integriert.

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Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

Hier beschreiben wir einen kompletten Workflow für die qualitative und quantitative Analyse von immun Synapsen zwischen primären menschlichen T-Zellen und Antigen-präsentierenden Zellen. Die Methode basiert auf bildgebende Durchflusszytometrie, ermöglicht die Erfassung und Auswertung von mehreren tausend Zelle Bildern innerhalb relativ kurzer Zeit.

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

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Räumliche und zeitliche Steuerung der T-Zell-Aktivierung mit Hilfe einer Photoactivatable-Agonist

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für die Verwendung von STED-Mikroskopie, gleichzeitig Aktin Bildstrukturen, Mikrotubuli und Mikrotubuli-Plus-Ende-bindende Proteine in B-Zellen, die auf Deckgläsern beschichtet mit Antikörpern gegen den B-Zell-Rezeptor, ein Modell für die Anfangsphase verbreitet haben der immun Synapse Formation.

Visualisierung der Aktin und Mikrotubuli Cytoskeletons an der B-Zelle immun Synapse mit stimulierte Emission Depletion (STED) Mikroskopie

Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Lattice Light-Sheet-Mikroskopie verwendet wird, um die Dynamik von Oberflächenrezeptoren in lebenden Zellen vierdimensional zu visualisieren. Hier werden T-Zellrezeptoren auf CD4+ primären T-Zellen gezeigt.

Visualisierung der Oberflächen-T-Zell-Rezeptordynamik vierdimensional mit Lattice Light-Sheet-Mikroskopie

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Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Lernen Sie die Quantifizierung kortikalen Aktin-Flusses in T-Zellen mittels raum-zeitlicher Bildkorrelationsspektroskopie. Diese Methode ermöglicht nanometerskalige Auflösung zur Analyse immunologischer Synapsen.

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte (Video) | JoVE Journal

Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

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