Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Dynamik des kortikalen Aktins durch Bildkorrelationsspektroskopie nach Aufnahme durch Totalreflexion, strukturierte Beleuchtungsbildgebung oder Turf-Simulation zu quantifizieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im biophysikalischen Bereich zu beantworten, z. B. welche Rolle der kortikale Aktinfluss bei der Regulierung von Interaktionen an der immunologischen Synapse spielt. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass sie eine Auflösung im Nanometerbereich mit der Kompatibilität des Lebensstils kombiniert, so dass Prozesse auf kleinerer Skala im Vergleich zu herkömmlichen Instanzmikroskopietechniken beobachtet und analysiert werden können.

Diese Technik wird von George Ashdown, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Für eine Testprobe geben Sie fünf Mikroliter einer Unterbeugungsfluoreszenz-Mikrosphären-Stammlösung mit einem Durchmesser von 100 Nanometern auf die Oberfläche eines frischen, unbeschichteten Deckglases. Verteilen Sie dann die Mikrosphärenlösung mit einer Pipettenspitze auf dem Deckglas und lassen Sie sie trocknen.

Geben Sie 200 Mikroliter Eindeckmedium auf den Testabdeckglas, um die Bildgebung vorzubereiten, schalten Sie den Inkubator für die Bühnenheizung des Rasen-SIM-Systems ein und füllen Sie den Behälter mit destilliertem Wasser, um den Boden des Heizelements vollständig zu bedecken. Lassen Sie das Wasser auf 37 Grad Celsius ausgleichen. Verbinden Sie die Heizmanschette mit der Objektivlinse und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein.

Befestigen Sie dann den Turf 4 88-kompatiblen Gradierblock im Strahlengang des Mikroskops, um sicherzustellen, dass der richtige Strahlengang eingerastet ist. Schalten Sie den Kanalmodus am Laserbett auf die Einzelposition. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das Glasfaserkabel auf dem Mikroskoptisch.

Rechnen Sie mit einem Fehler im Softwarefenster, wenn diese Schritte nicht ausgeführt werden. Nachdem Sie den Modus eingestellt haben, senken Sie das Objektiv auf die unterste Z-Ebene ab und geben Sie einen Tropfen Öl darauf. Legen Sie den Deckglas der Probe mit den fluoreszierenden Mikrosphären auf den Mikroskoptisch.

Wählen Sie dann das perfekte Fokussystem oder die PFS-Funktion am Mikroskopgehäuse aus. Bewegen Sie das Objektiv allmählich durch die Z-Ebene nach oben und stoppen Sie, wenn die PFS-Taste aufhört zu blinken, was anzeigt, dass die Fokusebene in der Steuerungssoftware erreicht wurde. Wechseln Sie in die Live-Ansicht, um die Mikrosphären auf dem Bildschirm abzubilden.

Nehmen Sie Feineinstellungen am Fokus vor, indem Sie das PFS-Mikromanipulatorrad verwenden. Beobachten Sie eine gleichmäßige Ausleuchtung ohne unscharfe Fluoreszenzeinwirkung oberhalb der 75-Nanometer-Duftwelle. Bestätigen Sie schließlich, dass eine strukturierte Beleuchtung erreicht wird, indem Sie ein fluktuierendes Beleuchtungsmuster aus der fluoreszierenden Mikrosphärenprobe für die T-Zell-Stimulation in den Kammern einer Acht beobachten.

Füllen Sie den Deckglas mit 200 Mikrolitern Anti-CD 3- und Anti-CD 28-Antikörpermischung aus und inkubieren Sie den Deckglas zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie das Deckglas wie im Textprotokoll beschrieben gewaschen haben, legen Sie es auf den Mikroskoptisch und suchen Sie dann die Rasenbrennebene. Pipettieren Sie anschließend vorsichtig 200 Mikroliter transfizierter T-Zellen in eine der Vertiefungen auf dem Deckglas.

Verwenden Sie Epi-Fluoreszenz, um die GFP-Aktin-transfizierten Zellen zu verfolgen, während sie auf dem Deckglas landen. Sobald sich die Zellen gesetzt haben, wechseln Sie mit dem N SimPad in den Live-Modus und überprüfen Sie, ob die Zellen auf dem Monitor scharf sind. Um einen Zeitverlauf aufzuzeichnen, öffnen Sie das ND-Erfassungsfenster und wählen Sie die Registerkarte Zeit.

Klicken Sie dann auf Hinzufügen und stellen Sie das Intervall auf keine Verzögerung ein. Legen Sie die Dauer auf 10 Minuten fest. Starten Sie abschließend die Aufzeichnung der Daten, indem Sie im ND-Erfassungsfenster die Option Jetzt ausführen auswählen.

Um die Bilder zu rekonstruieren, öffnen Sie zunächst die Analysesoftware, die das richtige Analysemodul enthält. Klicken Sie auf Anwendungen und wählen Sie dann das Fenster "End-SIM anzeigen" aus. Stellen Sie den Kontrast der Beleuchtungsmodulation und die hochauflösende Rauschunterdrückung auf eins ein und rekonstruieren Sie den Rasen-SIM-Datensatz, um ein vollständiges SIM-Bild aus der Bildstatusleiste zu erzeugen.

Vergewissern Sie sich, dass die Pixelgröße 30 Nanometer beträgt, und exportieren Sie die Daten dann als TIF-Dateien für die Stick-Analyse. Nachdem Sie das MATLAB-Softwarepaket der Sticks heruntergeladen und extrahiert haben, öffnen Sie das Skript. Definieren Sie dann die Eingabeparameter, wie sie im Textprotokoll für den unbeweglichen Entnahmefilter beschrieben sind.

Legen Sie in Zeile 23 den Filterparameter auf gleitenden Durchschnitt fest, und verwenden Sie in Zeile 24 21 als Parameter für den Bewegungsdurchschnitt, um eine Vektorkarte zu generieren. Legen Sie den temporalen Teilbereich in Zeile 31 auf die maximale Anzahl von Frames fest, in diesem Fall 63. Legen Sie dann in Zeile 32 die zeitliche Verschiebung auf eins in den Zeilen 33 bis 35 fest.

Geben Sie die Namen der Ausgabedateien, die Titel der Ausgabevektorkarten und den Pfad des Ausgabeverzeichnisses ein. Definieren Sie dann das Format, in dem die Vektorkartenbilder gespeichert werden sollen. In diesem Fall png.

Öffnen Sie im MATLAB-Editorfenster das Skript. Führen Sie einen Kanal aus, und laden Sie die Bildserie, indem Sie die Zeilen eins bis 23 des Skripts ausführen. Führen Sie als Nächstes die Zeilen 29 bis 35 von Run One Channel Sticks aus.

Um die Stick-Analyse zu starten, folgen Sie der Eingabeaufforderung und wählen Sie ein Polygon aus, um bei Bedarf einen Interessenbereich oder ROI zu definieren. Um die Vektorkarten anzuzeigen, fahren Sie die Linien 38 bis 52. Führen Sie dann die Zeilen 53 bis 72 aus, um das Geschwindigkeits-Größen-Histogramm darzustellen, das hier gezeigt wird, ist eine OT-T-Zelle, die GFP exprimiert, markiertes F-Aktin, das mit dem Turf-Sim-Protokoll abgebildet wurde.

Diskutiert wird im Text fünf Minuten nachdem diese Zelle auf ein Deckglas gebracht wurde, das mit Anti-CD 3- und Anti-CD 28-Antikörpern beschichtet ist, die die Bildung immunologischer Synapsen stimulieren sollen. Es wurde ein zeitlicher Verlauf genommen, so dass der molekulare Fluss des Aktins sichtbar gemacht werden konnte. Die anschließende Analyse dieser Daten mit diesem Sticks-Programm ermöglichte die Quantifizierung des molekularen Flusses des F-Aktins, wie er in dieser Vektorkarte dargestellt ist, die der geschachtelten Region der Zelle auf der linken Seite entspricht, die einen Teil der Synapsenperipherie darstellt.

Eine weitere Vergrößerung dieser Karte und der T-Zell-Unterregion verdeutlicht die Richtungsrichtung und Geschwindigkeit der Aktinströmung, die sowohl aus der Vektorlänge als auch aus dem Farbcode bestimmt werden kann. Die Geschwindigkeitsdaten können auch in einem Histogramm dargestellt werden, was eine statistische Analyse ermöglicht. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass in der immunologischen Synapse F Aktin symmetrisch von der Peripherie zum Zellzentrum fließt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie ts in Daten erfassen und die kortikale Aktindynamik mithilfe der Bildkorrelationsspektroskopie analysieren können.

Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in den Aktinfluss während der T-Zellmigration zu gewinnen, kann sie auch in anderen Systemen verwendet werden, bei denen der molekulare Fluss als wichtig erachtet wird, wie z. B. bei der Zellmigration.