Kortikalen Aktin Fluss in T-Zellen durch Raum-zeitliche Bildkorrelationsspektroskopie von Structured Illumination Microscopy Daten Quantifizierte

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments besteht darin, die Dynamik des kortikalen Aktins mittels Bildkorrelationsspektroskopie zu quantifizieren, nachdem die Bilder mittels totaler innerer Reflexion, strukturierter Beleuchtungsbildgebung oder TURB-SIM gewonnen wurden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im biophysikalischen Bereich zu beantworten, beispielsweise welche Rolle der Fluss des kortikalen Aktins bei der Regulierung von Wechselwirkungen am immunologischen Synapsen spielt. Der Hauptvorteil der Technik liegt darin, dass sie eine Auflösung im Nanometerbereich mit Verträglichkeit für lebende Zellen kombiniert und es ermöglicht, kleinräumigere Prozesse im Vergleich zu herkömmlichen Lichtmikroskopieverfahren zu beobachten und zu analysieren.

Den hier gezeigten Versuchsaufbau wird George Ashdown, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren. Geben Sie als Testprobe fünf Mikroliter einer Stammlösung mit fluoreszierenden Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 100 Nanometern auf die Oberfläche eines frischen, unbeschichteten Deckgläschens. Verteilen Sie die Mikrokügelchen-Lösung anschließend mit einer Pipettenspitze auf dem Deckgläschen und lassen Sie sie trocknen.

Geben Sie 200 Mikroliter Einbettmedium auf das Test-Deckglas, um die Bildgebung vorzubereiten. Schalten Sie den Inkubator für die Objektivheizung des TURF-SIM-Systems ein und füllen Sie das Reservoir mit destilliertem Wasser, sodass die Basis des Heizelements vollständig bedeckt ist. Lassen Sie das Wasser auf 37 Grad Celsius eintemperieren. Verbinden Sie die Heizmanschette mit der Objektivlinse und stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein.

Befestigen Sie dann den mit dem Turb 4 88 kompatiblen Grauwert-Abstufungsblock im Lichtweg des Mikroskops, um sicherzustellen, dass der korrekte optische Pfad aktiviert ist. Schalten Sie den Kanalmodus auf der Laserbank in die Einzelposition. Wiederholen Sie diesen Vorgang für das Glasfaserkabel auf der Mikroskopbühne.

Es ist damit zu rechnen, dass im Softwarefenster eine Fehlermeldung erscheint, wenn diese Schritte nicht durchgeführt werden. Nachdem der Modus eingestellt wurde, senken Sie das Objektiv auf die niedrigste Z-Ebene ab und geben Sie einen Tropfen Öl darauf. Legen Sie die Deckglasprobe mit den fluoreszierenden Mikrokügelchen auf den Mikroskopständer.

Danach wählen Sie das Perfect Focus System (PFS) am Mikroskopkörper aus. Bewegen Sie das Objektiv allmählich entlang der Z-Achse nach oben und stoppen Sie, wenn die PFS-Taste aufhört zu blinken, was anzeigt, dass die Fokusebene in der Steuersoftware erreicht wurde. Wechseln Sie zur Live-Ansicht, um die Mikrosphären auf dem Bildschirm abzubilden.

Nehmen Sie feine Fokusverstellungen mithilfe des PFS-Mikromanipulatorrads vor. Achten Sie auf gleichmäßige Beleuchtung, wobei keine unscharfen fluoreszenten Signale über der 75 Nanometer betragenden Wellenlänge auftreten dürfen. Bestätigen Sie abschließend, dass strukturierte Beleuchtung erreicht ist, indem Sie ein schwankendes Beleuchtungsmuster in der Probe aus fluoreszierenden Mikrokügelchen zur T-Zell-Stimulation in den Kammern einer Acht beobachten.

Bedecken Sie die Deckglasmit 200 Mikrolitern einer Anti-CD3- und Anti-CD28-Antikörpermischung und inkubieren Sie das Deckglas zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Nach dem Waschen des Deckglases gemäß der schriftlichen Anleitung platzieren Sie es auf dem Mikroskopständer und stellen dann die turbulente Fokusebene ein. Danach pipettieren Sie vorsichtig 200 Mikroliter transfizierter T-Zellen in eine der Vertiefungen auf dem Deckglas.

Verwenden Sie die Epi-Fluoreszenz, um die GFP-Aktin-transfizierten Zellen zu verfolgen, während sie auf dem Deckglas auftreffen. Sobald sich die Zellen abgesetzt haben, wechseln Sie mit dem N SimPad in den Live-Modus und überprüfen Sie, ob die Zellen auf dem Monitor scharf gestellt sind. Um eine Zeitreihe aufzuzeichnen, öffnen Sie das ND-Aufnahme-Fenster und wählen Sie den Zeit-Tab aus.

Klicken Sie anschließend auf Hinzufügen und stellen Sie das Intervall auf keine Verzögerung ein. Legen Sie die Dauer auf 10 Minuten fest. Starten Sie abschließend die Aufzeichnung der Daten, indem Sie im ND-Aufnahme-Fenster „Jetzt ausführen“ auswählen.

Um die Bilder zu rekonstruieren, öffnen Sie zuerst die Analyse-Software mit dem korrekten Analysemodul. Klicken Sie auf „Anwendungen“ und wählen Sie dann das Fenster „End-SIM“ an. Stellen Sie den Beleuchtungsmodulationskontrast und die Rauschunterdrückung mit hoher Auflösung auf eins ein und rekonstruieren Sie den Turf-SIM-Datensatz, um ein vollständiges SIM-Bild aus der Bildstatusleiste zu erzeugen.

Stellen Sie sicher, dass die Pixelgröße 30 Nanometer beträgt, und exportieren Sie die Daten anschließend als TIF-Dateien zur Stab-Analyse. Nach dem Herunterladen und Entpacken des Stäbe-MATLAB-Softwarepakets öffnen Sie das Skript. Definieren Sie dann die Eingabeparameter gemäß der schriftlichen Anleitung für den Filter zur Entfernung immobilisierter Partikel.

Stellen Sie in Zeile 23 den Filterparameter auf „moving average“ und verwenden Sie in Zeile 24 den Wert 21 als Parameter für den gleitenden Durchschnitt, um eine Vektorkarte zu erzeugen. Legen Sie in Zeile 31 den zeitlichen Teilbereich auf die maximale Anzahl an Bildern fest, in diesem Fall 63. Stellen Sie anschließend in Zeile 32 den zeitlichen Versatz auf eins in den Zeilen 33 bis 35 ein.

Geben Sie die Namen der Ausgabedateien, die Titel der Ausgabe-Vektorkarten und den Pfad zum Ausgabeverzeichnis ein. Legen Sie anschließend das Format fest, in dem die Vektorkarten-Bilder gespeichert werden sollen. In diesem Fall png.

Öffnen Sie im MATLAB-Editorfenster das Skript. Führen Sie „run one channel sticks“ aus und laden Sie die Bildserie, indem Sie die Zeilen 1 bis 23 des Skripts ausführen. Führen Sie anschließend die Zeilen 29 bis 35 von „run one channel sticks“ aus.

Um die Sticanaalyse zu beginnen, folgen Sie der Aufforderung und wählen Sie ein Polygon, um einen interessierenden Bereich oder ROI zu definieren, falls gewünscht. Um die Vektorkarten anzuzeigen, führen Sie die Zeilen 38 bis 52 aus. Führen Sie anschließend die Zeilen 53 bis 72 aus, um das hier gezeigte Histogramm der Geschwindigkeitsbeträge darzustellen, das eine OT-T-Zelle zeigt, die GFP-markiertes F-Aktin exprimiert und mit dem TURB-SIM-Protokoll abgebildet wurde.

Im Text besprochen fünf Minuten, nachdem diese Zelle auf einen Deckgläserabschnitt gebracht wurde, der mit anti-CD3- und anti-CD28-Antikörpern beschichtet war, um die Bildung immunologischer Synapsen zu stimulieren. Es wurde eine Zeitreihe aufgenommen, um den molekularen Fluss von F-Aktin sichtbar zu machen. Die anschließende Analyse dieser Daten mithilfe des Sticks-Programms ermöglichte die Quantifizierung des F-Aktin-Molekularflusses, wie durch diese Vektorkarte dargestellt, die dem markierten Bereich der Zelle links entspricht und einen Teil des synaptischen Randbereichs darstellt.

Eine weitere Vergrößerung dieser Karte und des T-Zell-Subbereichs verdeutlicht die Richtungsabhängigkeit und Geschwindigkeit des Aktinflusses, die anhand der Vektorlänge sowie der Farbcodierung bestimmt werden können. Geschwindigkeitsdaten können außerdem in einem Histogramm dargestellt werden, was eine statistische Analyse ermöglicht. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass im immunologischen Synapsenbereich F-Aktin symmetrisch von der Peripherie hin zur Zellmitte fließt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie man zeitaufgelöste Daten erfasst und kortikale Aktindynamik mittels Bildkorrelationsspektroskopie analysiert.

Obwohl diese Methode verwendet werden kann, um Einblicke in den Aktinfluss während der T-Zell-Migration zu gewinnen, lässt sie sich auch in anderen Systemen anwenden, in denen der molekulare Fluss als wichtig erachtet wird, beispielsweise bei der Zellmigration.