Name: Herstellung von Micro-Gewebe mit Modulen von Collagen Gel enthaltenden Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung modularer Mikrogewebe aus Collagen-Gelen mit Endothelzellen für Tissue-Engineering. Diese Methode ermöglicht in vitro- und in vivo-Studien zur Untersuchung zellulärer Interaktionen.

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Die Finanzierung wurde durch die National Institutes of Health (EB 001013), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada und Canadian Institutes of Health Research. Wir danken Herrn Dr. AP McGuigan für ihr Know-how und helfen bei der Entwicklung von Modulen.

1) Herstellung der Rohre <ol><li> Cut 2 bis 3 m Länge aus Polyethylen-Schlauch (0,76 mm ID x 1,22 mm OD). </li><li> Thema einem 20 G1 Nadel in das eine Ende des Schlauchs. </li><li> Coil den Schlauch und in einen Wandler selbst Dichtung Beutel (7 1 / 2 "x 13"). Die beiden Enden des Rohres sollte an der unverschlossenen Ende der Tasche platziert werden und mit Klebeband statt mit Gas-Sterilisation Band. </li><li> Seal Beutel und Gas sterilisieren. </li></ol> 2) Neutralisation von Collagen Anmerkung: 1 ml Kollagen füllt ca. 2 m von PE-Rohre. <ol><li> Legen Sie die erforderliche Menge von Kollagen für die gewünschte Länge des Schlauchs in ein konisches 15 ml Tube benötigt und halten auf dem Eis. </li><li> Mit 128 uL 10x α-MEM pro ml Kollagen mit dem Rohr und mischen durch mehrmaliges Pipettieren der Lösung. Hinweis: (1) Die Lösung sollte gelb wie die α-MEM gemischt ist in der angesäuerten Kollagen und (2) versuchen, Blasen zu minimieren beim Mischen. </li><li> Neutralisieren der Kollagen durch Zugabe von 0,8 M Natriumbicarbonat, bis das Kollagen hat einen pH von 7,4. Für eine allgemeine Schätzung des pH add Natriumbicarbonat, bis die gelbe Kollagenlösung wird eine hellrosa Farbe. Hinweis: Es dauert in der Regel 30 bis 60 ul pro ml Kollagen. </li><li> Halten Sie neutralisiert Kollagen auf Eis, bis bereit, als die neutralisierten Kollagen-Gel verwenden, wenn nicht bei 4 ° C gehalten </li></ol> 3) Einbettung der Zellen (Optional) Hinweis: Je nach Zelltyp können die Zellen bei einer Konzentration zwischen 1 Million Zellen pro ml bis 20 Millionen Zellen pro mL eingebettet werden. Verwenden Sie das Medium für die Zellen, die Sie einbetten möchten erforderlich. <ol><li> Entfernen Sie das Medium von den Zellen und wäscht mit 5 ml PBS. </li><li> Entfernen PBS und 3 mL Trypsin-EDTA. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Die Zellen in 7 mL Medien. </li><li> Zählen von Zellen. </li><li> Übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen für die Einbettung in ein 15 ml konischen Rohr. </li><li> Pellet die Zellen bei 300 xg für 5 min. </li><li> Saugen Sie Medien aus dem Zellpellet. </li><li> Resuspendieren der Zellen in der neutralisierten Kollagen und halten auf dem Eis. </li></ol> 4) Gelling von Collagen <ol><li> In einer biologischen Sicherheitswerkbank abgeschnitten verschlossenen Ende der Beutel mit der PE-Rohre. </li><li> Bringen Sie ein 3-ml-Spritze, die 20G Nadel in das eine Ende des Schlauchs mit sterilisierten Pinzette. Halten Sie den Schlauch in der Tasche. </li><li> Stecken Sie das andere Ende des Schlauches in der neutralisierten Kollagen, bis die Spitze ist an der Unterseite der konischen Rohr mit sterilisierten Pinzette. Halten Sie die konischen Rohr auf Eis. </li><li> Ziehen Sie das Kollagen in der Polyethylen-Rohr durch Zurückziehen der Kolben der Spritze langsam. Hinweis: Wenn das Kollagen in den Schlauch gezogen, um schnell dann Blasen in das Kollagen zu bilden. </li><li> Nach dem Herausziehen des Kollagens durch den Schlauch, ziehen Sie die 20G Nadel aus Schläuchen und legte beide Enden wieder in die Tasche. Kleben Sie die Tüte verschlossen. </li><li> Inkubieren Sie die Tasche bei 37 ° C für 60 min. Wenn das Kollagen enthält Zellen dann drehen Sie den Beutel über alle 15 min. so dass die Zellen nicht auf eine Seite des Moduls zu begleichen. </li></ol> 5) Schneiden von Tubing mit der gelierten Collagen <ol><li> Autoclave Kopf-und Blade für die Schneidvorrichtung und Fach-Schlauch zu halten. </li><li> Montieren Sie die Schneidvorrichtung. </li><li> Legen Sie Schlauch in ein steriles Tablett vor Schneideinrichtung und laden Sie den Schlauch in die Schneidvorrichtung. </li><li> Richten Sie eine 50 ml konischen Röhrchen mit 25 ml Medien am Ausgang der Schneidvorrichtung, um den Schnitt-Module sammeln. Hinweis: Verwenden Sie Medien, die FBS auch für Kollagen-only-Module wie die Module nicht getrennt von den Schlauch ohne FBS in den Medien. Wenn die Module enthalten Zellen nutzen die Medien für den Embedded-Zellen erforderlich ist. Wenn es keine eingebetteten Zellen in den Modulen nutzen die Medien für den Endothelzellen. </li><li> Stellen Sie die Schneidevorrichtung zu 2 mm Rohrlängen zu senken und den Schlauch. </li><li> Inkubieren geschnitten Module bei 37 ° C für 60 min in der 50 ml konischen Rohr. </li></ol> 6) Entfernen Collagen-Module von Tubing <ol><li> Vortex 50 ml konische Röhrchen mit Modulen in den Schlauch für 10 sek. Hinweis: Seien Sie vorsichtig, wenn die Trennung Module mit hoher Zelldichte eingebettet, um ein Brechen zu vermeiden. </li><li> Lassen Sie Module an den Boden des Röhrchens absetzen. Gehzeit: ca. 5 min. </li><li> Mit einem breiten Mund 10 mL serologischen Pipette übertragen ständiger Module in ein 15 ml konischen Rohr. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 6,1 bis 6,3 zweimal. </li><li> Gehe zu 7 zu beschichten Module Schritt mit Endothelzellen oder Transfer-Module zu einer nicht-Gewebekulturen behandelte Platte. </li></ol> 7) Die Beschichtung der Module mit Endothelzellen <ol><li> Settle-Module in den Boden eines 15 ml konische Röhrchen mit 5 ml Medium für the eingebetteten Zellen. </li><li> Entfernen Sie das Medium von den Endothelzellen und wäscht mit 5 ml PBS. </li><li> Entfernen PBS und 3 mL Trypsin-EDTA. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin-EDTA für 5 min bei 37 ° C. </li><li> Die Zellen in 7 mL Medien. </li><li> Zählen von Zellen. Brauchen 5x10 6 Endothelzellen pro ml verpackt Module an der Unterseite der konischen Rohr. </li><li> Pellet die Zellen bei 300 xg für 5 min und Resuspendieren in 5 mL Endothelzellen Medien. </li><li> Fügen Sie die 5 mL der Medien mit Endothelzellen zu den Modulen. Hinweis: Dies ergibt eine 50:50-Verhältnis der beiden Medien-Typen, die wir gefunden haben, die für das Überleben und die Funktion der beiden Zelltypen zu arbeiten. Testen Sie die Verwendung eines Co-Kulturmedium, das die richtigen Wartung von Phänotypen der beiden Zelltypen vor der Verwendung zu gewährleisten. </li><li> Inkubieren Sie die Module mit den Endothelzellen sowohl statisch als auch dynamisch. </li><li> Für statische Inkubation Mix Module mit Endothelzellen durch Inversion, und setzen Sie die Röhre aufrecht bei 37 ° C für 15 min. Wiederholen. </li><li> Dynamisch Samen der Endothelzellen durch sanftes Schütteln der Röhre bei 37 ° C für 60 min. </li><li> Wiederholen Sie die statische Inkubation zweimal. </li><li> Halten Sie die Module in einer nicht-Gewebekulturen behandelte Platte beimpft und über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Am nächsten Tag legen Sie die Module in eine neue nicht-Gewebekulturen behandelte Platte mit frischem Medium (50:50 mischen, wenn mit Co-Kultur-System), um ungebundene endothelialen Zellen zu entfernen. </li><li> Inkubieren Module, die mit Endothelzellen beschichtet sind, bis sie 100% der Oberfläche der Module decken. Dies dauert in der Regel etwa 7 Tage. </li></ol> 8) repräsentative Ergebnisse: Die Module werden schauen zylindrischen, wenn sie zum ersten Mal aus der Tube entfernt werden. Wenn die Module eingebetteten Zellen enthalten und / oder sind mit Endothelzellen beschichtet sie Vertrag bis zu 50% im Volumen und entwickeln eine ovale Form (Abb. 1). Die Module werden auch zu dichter und undurchsichtig, wenn sie durch Licht-Mikroskopie (Abbildung 1) angesehen. Auch wenn die Endothelzellen konfluent auf der Oberfläche der Module gibt es eine Bildung von Tight Junctions, die durch Immunfluoreszenzfärbung von VE-Cadherin (Abb. 2) zu sehen ist. Stofftransport Analyse hat gezeigt, dass die Module unterstützen können hohe Zelldichten (8x10 7 Zellen / cm 3), ohne die Entwicklung einer nekrotischen Kern aufgrund unzureichender Sauerstoff zu transportieren, die oft in größeren Gewebe problematisch (zB Module mit großem Durchmesser, D = 1,4 sind mm) (Abbildung 3). <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1: Module Fertigung und Kontraktion. Module Kontraktion während der drei Tage nach der HUVEC-C (Endothel-Zelllinie) aufgetreten Aussaat Ergebnisse wesentlich kleineres Modul Durchmesser und Länge (p &lt;0,001) (A). Embedded HepG2-Zellen wurden gleichmäßig innerhalb von Modulen zum Zeitpunkt der Herstellung ausgeschüttete und einbehaltene hohe Lebensfähigkeit (B). [Live-Zellen grün; toten Zellen rot] [von Corstorphine 2010 angepasst] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2: VE-Cadherin Immunfluoreszenzfärbung der EG enge Zellkontakte von 10 Tagen nach RAEC, wo auf der Oberfläche eines Moduls beschichtet. Balken = 50 um. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3: Masson-Färbung von typischen Modulen (0,76 mm anfänglichen Durchmesser) und große Module (1,4 mm anfänglichen Durchmesser) zeigen die Wirkung der Sauerstoff-Diffusion Einschränkungen. Sieben Tage nach Herstellung, hatte eine große Anzahl von toten Zellen in den Kern der großen Modulen (unten rechts) gebildet, so dass nur ein dünner Rand (~ 200 um dick) der lebensfähigen Zellen. Umgekehrt erhalten die kleinen Module ein einheitliches und hohes Vertrieb von lebenden Zellen. [Module mit HepG2 Zellen eingebettet und beschichtet mit Endothelzellen.] [Von Corstorphine 2010 getroffen] <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4: (A) HMEC-1 ausgesät auf Poloxamin - Kollagen-Module. Nach Tag 1 der Aussaat der Poloxamin-Kollagen-Module behalten ihre zylindrische Form und gibt es nur begrenzte Zelladhäsion Eigenschaften im Vergleich zu Kollagen nur Module. Maßstab = 200 um. (B) Lichtmikroskopische Aufnahme einer Kollagen-Modul mit PLGA-biologisch abbaubaren Mikrosphären. Maßstab = 500 um. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig5.jpg" alt="Abbildung 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 5"> Abbildung 5: Beispiele für in-vitro-Assays. (A) Angiogenese-Assay: Kapillar-Formationen auf dem Modul mit Endothelzellen besiedelt werden leicht erkannt und quantifiziert werden nach 5 Tagen Inkubation mit aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen. (B) Konfokale Mikroskopie-Aufnahmen eines Live / Dead Assay On-Module, wo die sTaining für lebende Zellen ist grün und tote Zellen rot. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig6.jpg" alt="Abbildung 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 6"> Abbildung 6: Collagen-Module mit eingebetteten mesenchymalen Stammzellen und einer Oberflächenschicht aus Endothelzellen. Module wurden Schubspannung (~ 0,64 dyn / cm 2) für 7 Tage in einem mikrofluidischen Kammer ausgesetzt und beginnen zu Fusion am Berührungspunkte zeigen. Endothelzellen sind mit vWF (braun) gefärbt und mesenchymalen Stammzellen Kerne erscheinen blau (H &amp; E). Maßstab = 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2177/2177fig7.jpg" alt="Abbildung 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 7"> Abbildung 7: Hunderte von Kollagen-Module enthalten, aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen (ASC) und beschichtet mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC) werden unter die Haut von Mäusen zu ASC / HMEC Interaktion in vivo für Fett Regeneration Anwendungen Studie implantiert.

<ol><li>Chamberlain, M. D., Gupta, R., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+vessel+tissue+engineering+driven+by+endothelialized+modules%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chimeric vessel tissue engineering driven by endothelialized modules.</a> , (2010).</li>
<li>Corstorphine, L. E., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+factor+and+diffusion+limitations+in+collagen+gel+modules+containing+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Effectiveness factor and diffusion limitations in collagen gel modules containing HepG2 cells.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2010).</li>
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<li>Leung, B. M., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+tissue+engineering+construct+containing+smooth+muscle+cells+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A modular tissue engineering construct containing smooth muscle cells and endothelial cells.</a> Ann Biomed Eng. 35, 2039-2049 (2007).</li>
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<li>McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombogenicity+of+human+umbilical+vein+endothelial+cell+seeded+collagen+modules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The thrombogenicity of human umbilical vein endothelial cell seeded collagen modules.</a> Biomaterials. 29, 2453-2463 (2008).</li>
<li>Sosnik, A., Leung, B., McGuigan, A. P., Sefton, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen%2Fpoloxamine+hydrogels%3A+cytocompatibility+of+embedded+HepG2+cells+and+surface-attached+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Collagen/poloxamine hydrogels: cytocompatibility of embedded HepG2 cells and surface-attached endothelial cells.</a> Tissue Eng. 11, 1807-1816 (2005).</li>
</ol>

Wir haben verschiedene Mikro-Gewebe Verwendung von Modulen mit unterschiedlichen Zelltypen 1-11 embedded hergestellt. Wir haben erfolgreich primären Kardiomyozyten, Inselchen, Stammzellen aus Fettgewebe und mesenchymale Stromazellen sowie mehrere Zelllinien einschließlich HepG2, NIH 3T3 und Klon 9 Leberzellen eingebettet. Wir haben die Module mit mehreren Arten von Endothelzellen einschließlich Ratte Endothelzellen, HUVEC-Zellen und humanen mikrovaskulären Endothelzellen beschichtet. Die Module sind auch mit ...

<table><tbody><tr><td>Intramedikalisches Schlauchmaterial PE60</td><td>BD Biosciences</td><td>427416</td><td>Unterschiedliche Schlauchdurchmesser können verwendet werden, um den Durchmesser der Module zu verändern</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Purcol sauer reagierendes Kollagen, 3 mg/mL</td><td>Cedarlane Labs</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>20G-Nadel</td><td>BD Biosciences</td><td>305175</td><td>Der Durchmesser der Nadel muss dem Durchmesser des Schlauchmaterials ähnlich sein</td></tr><tr><td>3-mL-Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>15-mL-Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50-mL-Röhrchen</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Convertors Self-Seal Pouch 7 1/2&amp;#8221; x 13&amp;#8221;</td><td>Cardinal Health</td><td>92713</td><td></td></tr><tr><td>10-ml-Serologiepipette mit breiter Spitze</td><td>BD Biosciences</td><td>357504</td><td></td></tr><tr><td>10-ml-Serologiepipette</td><td>BD Biosciences</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>5-ml-Serologiepipette</td><td>BD Biosciences</td><td>357543</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von micro-gewebe mit modulen von collagen gel enthaltenden zellen

Fabrication of Micro-tissues using Modules of Collagen Gel Containing Cells

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von einer Art Mikro-Gewebe Module genannt. Die Modul-Ansatz generiert einheitliche, skalierbare und vaskularisierten Geweben. Die Module können von Kollagen sowie andere gelierbare oder vernetzbare Materialien hergestellt werden. Sie sind ca. 2 mm in der Länge und 0,7 mm Durchmesser auf Herstellung, sondern schrumpfen in Größe mit eingebetteten Zellen oder, wenn die Module sind mit Endothelzellen beschichtet. Die Module sind einzeln klein genug, dass die eingebetteten Zellen innerhalb der Diffusions-Limit von Sauerstoff und anderen Nährstoffen sind, sondern Module können zusammen verpackt werden, um größere Gewebe, perfundierbaren sind zu bilden. Diese Gewebe sind modular aufgebaut, da verschiedene Zelltypen in eingebettet werden kann oder beschichtet auf den Modulen, bevor sie zusammen, um komplexe Gewebe zu bilden verpackt werden. Es gibt drei wesentliche Schritte zu machen die Module: (1) Neutralisieren der Kollagen-und Einbettung Zellen in ihr, (2) Geliermittel das Kollagen in die Röhre und Schneiden der Module und (3) Beschichtung der Module mit Endothelzellen.

Erstellung von Mikro-Gewebe mit zylindrischen Kollagengelen, Module genannt, die eingebetteten Zellen und die Oberfläche enthalten ist mit Endothelzellen beschichtet.

Herstellung von Micro-Gewebe mit Modulen von Collagen Gel enthaltenden Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Art von Mikrogewebe, die als Module bezeichnet werden. Der Modul-Ansatz erzeugt gleichmäßige, skalierbare und vaskularisierte ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, modulare Mikrogewebe herzustellen, die für Gewebeengineering-Experimente verwendet werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst mithilfe einer Spritze die Kollagenlösung in einen Polyethylen-Schlauch eingebracht und anschließend das Kollagen verfestigt wird. Der zweite Schritt besteht darin, den Polyethylen-Schlauch in zwei Millimeter lange Abschnitte zu schneiden, um so die Mikrogewebe-Module zu bilden.Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Module von der Schläuchen zu trennen, und abschließend werden die Module mit endothelialen Zellen beschichtet. Letztendlich können die resultierenden Mikrogewebe für zelluläre In-vitro-Assays verwendet werden, um die Wechselwirkung von Zellen über eine mikrofluidische Kammer zu untersuchen. Außerdem können die Mikrogewebe implantiert werden, um Gewebe zu erzeugen, mit denen die Interaktion und Remodeling der Mikrogewebe in vivo untersucht werden können.Hallo, mein Name ist Brendan Long vom Sepan-Labor an der University of Toronto. Ein großes Hindernis bei der Herstellung großer dreidimensionaler Gewebeersatzstoffe ist der Mangel an schneller Gefäßversorgung nach der Implantation. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie man modulare Gewebestrukturen herstellt, die mit endothelialen Zellen beschichtet sind, um diese Einschränkung zu überwinden.Den Versuch wird Deem Chamberlain, ein Post-OP-Fellow aus dem Septin-Labor, demonstrieren. Die Menge an Kollagen, die neutralisiert werden muss, hängt von der Länge der Polyethylen-Röhre ab. In dieser Demonstration verwenden wir eine zwei Meter lange Polyethylen-Röhre mit einem Innendurchmesser von 0,76 Millimeter und einem Außendurchmesser von 1,22 Millimeter.Um die Tubing vorzubereiten, führen Sie eine 20-G-Nadel in ein Ende der Tubing ein und legen Sie die Tubing anschließend in eine selbstversiegelnde Beutelverpackung für die Gassterilisation. Da ein Milliliter Kollagen etwa zwei Meter Polyethylentubing füllt, werden wir einen Milliliter Kollagen neutralisieren. Geben Sie das Kollagen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und stellen Sie das Gefäß auf Eis.Fügen Sie 128 Mikroliter 10×-Alpha-MEM pro Milliliter Kollagen in das Reagenzglas hinzu und mischen Sie die Lösung durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Dabei sollten Sie darauf achten, die Bildung von Blasen zu minimieren; die Lösung sollte gelb werden, wenn das Alpha-MEM in das saure Kollagen eingemischt wird. Neutralisieren Sie anschließend das Kollagen durch Zugabe von 0,8 molarem Natriumbicarbonat. Als allgemeine Schätzung des pH-Werts fügen Sie so lange Natriumbicarbonat hinzu, bis die gelbe Kollagenlösung eine hellrosa Farbe annimmt.Um einen pH-Wert von 7,4 zu erreichen, werden typischerweise 30 bis 60 Mikroliter pro Milliliter Kollagen benötigt. Um zu verhindern, dass das neutralisierte Kollagen geliert, sollte es bis zur Verwendung auf Eis gehalten werden. Um mit dem Verfahren zur Gelierung des Kollagens zu beginnen, nehmen Sie die Tüte mit den sterilisierten Polyethylenschläuchen in einen biologischen Sicherheitswerkbank und schneiden Sie das versiegelte Ende der Tüte ab, wobei der Schlauch in der Tüte verbleibt.Verwenden Sie sterilisierte Pinzette, um eine Dreimilliliter-Spritze an die 20-Gauge-Nadel anzuschließen, die zuvor in ein Ende des Schlauchs eingeführt wurde. Führen Sie das andere Ende des Schlauchs in das neutralisierte Kollagen ein, bis die Spitze am Boden des kegelförmigen Reaktionsgefäßes steht, das auf Eis gehalten wird. Diesen nächsten Schritt müssen Sie langsam durchführen, da sonst Luftblasen in das Kollagen gelangen.Ziehen Sie den Kolben der Spritze langsam zurück, um das Kollagen in den Polyethylen-Schlauch zu ziehen. Sobald das Kollagen durch den Schlauch gezogen ist, ziehen Sie die 20-Gauge-Nadel heraus und stecken Sie beide Enden des Schlauchs zurück in die Tüte. Nachdem die Tüte mit Klebeband verschlossen wurde, inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Es wird ein vormontiertes Schneidgerät verwendet, um die Tubing zu schneiden. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die Tubing in ein steriles Tablett vor dem Schneidgerät legen und die Tubing am Ausgang des Schneidgeräts in das Gerät einlegen. Stellen Sie eine 50-Milliliter-Konusflasche bereit, die 25 Milliliter Endothelzell-Medien enthält. Um die geschnittenen Module zu sammeln, stellen Sie das Schneidgerät so ein, dass es zwei Millimeter lange Tubing-Abschnitte schneidet, und schneiden Sie anschließend die Tubing. Inkubieren Sie die geschnittenen Module im 50-Milliliter-Konischkolben bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Um die Kollagenmodule aus der Tubing zu entfernen, wirbeln Sie den 50-Liter-Konischkolben mit den Modulen für 10 Sekunden bei mittlerer Geschwindigkeit. Lassen Sie die Module anschließend etwa fünf Minuten lang auf den Boden des Kolbens absinken.Ein lockeres Pellet aus Modulen bildet sich am Boden des Reaktionsgefäßes, während die Tubing eine Schicht auf der Oberfläche des Mediums bildet. Nachdem sich die Module abgesetzt haben, überführen Sie sie mithilfe einer weiten, 10-Milliliter-Serologiepipette in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Vortexen Sie das 15-Milliliter-Konischgefäß und lassen Sie die Module anschließend noch zweimal absetzen.Die abgesetzten Module aus dem zweiten und dritten Wirbel werden ebenfalls in die 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Nachdem alle Module aus der Tubing entfernt und gesammelt wurden, wird das Volumen des Mediums im Röhrchen auf fünf Milliliter aufgefüllt. Die Module sind nun bereit, mit endothelialen Zellen beschichtet zu werden, wobei im Folgenden die Vorbereitung der endothelialen Zellen zur Beschichtung der Module gezeigt wird.Entfernen Sie zuerst das Medium von den Zellen und waschen Sie mit PBS. Nach dem Entfernen des PBS geben Sie drei Milliliter Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in sieben Milliliter Medium und überführen sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen.Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers; Sie benötigen fünf mal 10 hoch 6 endotheliale Zellen pro Milliliter gepackter Module am Boden des kegelförmigen Reaktionsgefäßes. Zentrifugieren Sie die Zellen mit 300 × g für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Zellenpellet in fünf Milliliter Endothelzellmedium.Geben Sie nun fünf Milliliter Medium, das endotheliale Zellen enthält, zu den Modulen hinzu. Die Module werden mit den endothelialen Zellen sowohl statisch als auch dynamisch inkubiert; für die statische Inkubation mischen Sie die Module mit den endothelialen Zellen durch Umstülpen, und stellen Sie das Röhrchen anschließend für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius aufrecht hin. Nach 15 Minuten stülpen Sie das Röhrchen erneut um und inkubieren es bei 37 Grad Celsius für weitere 15 Minuten.Um die Module dynamisch mit den Endothelzellen zu inkubieren, schwenken Sie das 15-Milliliter-Röhrchen vorsichtig bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Sobald die Inkubation mit den Endothelzellen abgeschlossen ist, überführen Sie die Module in eine nicht gewebekulturgeeignete Platte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag geben Sie die Module in eine neue, nicht gewebekulturgeeignete Platte mit frischem Medium, um nicht angeheftete Endothelzellen zu entfernen. Inkubieren Sie die mit Endothelzellen beschichteten Module bei 37 Grad Celsius, bis die Zellen 100 % der Oberfläche der Module bedecken.Dies dauert normalerweise etwa sieben Tage. Die Module erscheinen zylindrisch, wenn sie erstmals aus der Röhre entnommen werden. Wenn sie mit endothelialen Zellen beschichtet sind, können sie sich bis zu 50 % in ihrem Volumen zusammenziehen, eine ovale Form annehmen und dichter sowie undurchsichtiger werden, was bei der Betrachtung mittels Lichtmikroskop sichtbar ist.In diesen Bildern werden der Durchmesser und die Länge der Module mit d bzw. l angegeben. Dieses nächste Bild zeigt eingebettete Hep-G2-Zellen, die zum Zeitpunkt der Herstellung gleichmäßig innerhalb der Module verteilt sind. Die Zellen wiesen eine hohe Vitalität auf, wie die grüne Färbung lebender Zellen zeigt.Tote Zellen wären rot gefärbt, wenn die endothelialen Zellen konfluent sind. Auf der Oberfläche der Module bildet sich enge Zellkontakte, die mittels Immunfluoreszenz sichtbar gemacht werden können. Die Färbung von VE-Cadherin zur Analyse des Massentransports hat gezeigt, dass die Module in der Lage sind, hohe Zelldichten zu unterstützen, ohne einen nekrotischen Kern aufgrund unzureichenden Sauerstofftransports zu entwickeln, was bei größeren Geweben häufig problematisch ist.In diesem Beispiel zeigt die Massen-Dreifach-Färbung typischer kleiner Module, dass die Module sieben Tage nach der Herstellung eine gleichmäßige und hohe Verteilung lebender Zellen beibehielten. Im Gegensatz dazu hatte sich im Kern der großen Module eine große Anzahl abgestorbener Zellen gebildet, sodass nur ein dünner Rand vitaler Zellen verblieb. Es wurden außerdem Module mit einer Mischung aus Kollagen und einem aminhaltigen Polymer oder mit drug-eluting Mikrosphären hergestellt.Hier, wenn h hm EC1-Zellen auf Palin-Collagen-Modulen angesiedelt werden, behalten die Module ihre zylindrische Form bei, und die Zelladhärenzeigenschaften sind im Vergleich zu reinen Kollagenmodulen begrenzt. Ein Lichtmikroskopbild eines Kollagenmoduls, das auf PLGA basierende biologisch abbaubare Mikrosphären enthält, ist hier dargestellt. Mehrere In-vitro-Assays haben sich als kompatibel mit diesen Modulen erwiesen.Beispielsweise können in einem Angiogenese-Assay kapillarähnliche Strukturen auf einem Modul, das mit endothelialen Zellen besiedelt ist, nach fünf Tagen Inkubation mit aus Fettgewebe stammenden Stammzellen leicht detektiert und quantifiziert werden. In einem weiteren Beispiel zeigen konfokale Mikroskopieaufnahmen eines Live-Dead-Assays auf Modulen lebende Zellen grün gefärbt und tote Zellen rot gefärbt. Schließlich wurden die Module ebenfalls in mikrofluidischen Kammern verwendet und in Mäuse und Ratten implantiert, um die Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen sowie die Umgestaltung der Mikrogewebe durch die Wirtsantwort zu untersuchen.Nach dem Verfahren können die Module in einer Petrischale oder anderen Gefäßen wie einem Bioreaktor oder einer mikrofluidischen Vorrichtung kultiviert werden. Diese Methode kann auch angepasst werden, um unterschiedliches Gewebe zu erzeugen, indem verschiedene Kombinationen von Zelltypen verwendet oder Schläuche mit unterschiedlichen Durchmessern eingesetzt werden. Vielen Dank fürs Zuschauen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Das folgende Protokoll stellt ein scherbasiertes Extrusionsverfahren zur Herstellung von Kollagen-Hydrogelen mit nanoskaligen strukturierten Fibrillen vor, das auf eine breite Palette von Tissue-Engineering-Anwendungen angewendet werden kann.

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Erfahren Sie die Herstellung modularer Mikrogewebe aus Collagen-Gelen mit Endothelzellen für Tissue-Engineering. Diese Methode ermöglicht in vitro- und in vivo-Studien zur Untersuchung zellulärer Interaktionen.

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