Herstellung von Micro-Gewebe mit Modulen von Collagen Gel enthaltenden Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, modulare Mikrogewebe herzustellen, die für Gewebeengineering-Experimente verwendet werden können. Dies wird erreicht, indem zunächst mithilfe einer Spritze die Kollagenlösung in einen Polyethylen-Schlauch eingesaugt und anschließend das Kollagen verfestigt wird. Der zweite Schritt besteht darin, den Polyethylen-Schlauch in zwei Millimeter lange Abschnitte zu schneiden, um so die Mikrogewebe-Module zu bilden.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Module von der Schläuchen zu trennen, und abschließend werden die Module mit endothelialen Zellen beschichtet. Letztendlich können die resultierenden Mikrogewebe für zelluläre In-vitro-Assays verwendet werden, um die Wechselwirkung von Zellen über eine mikrofluidische Kammer zu untersuchen. Außerdem können die Mikrogewebe implantiert werden, um Gewebe zu erzeugen, mit denen die Wechselwirkung und Remodeling der Mikrogewebe in vivo untersucht werden können.

Hallo, mein Name ist Brendan Long vom Sepan-Labor an der University of Toronto. Ein großes Hindernis bei der Herstellung großer dreidimensionaler Gewebeersatzmaterialien ist das Fehlen einer schnellen Gefäßversorgung nach der Implantation. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie man modulare Gewebestrukturen herstellt, die mit endothelialen Zellen beschichtet sind, um diese Einschränkung zu überwinden.

Den Vorgang wird Deem Chamberlain, ein Post-OP-Fellow aus dem Septin-Labor, demonstrieren. Die Menge an Kollagen, die neutralisiert werden muss, hängt von der Länge der Polyethylen-Röhre ab. In dieser Demonstration verwenden wir eine zwei Meter lange Polyethylen-Röhre mit einem Innendurchmesser von 0,76 Millimeter und einem Außendurchmesser von 1,22 Millimeter.

Um die Tubing vorzubereiten, führen Sie eine 20-G-Nadel in ein Ende der Tubing ein und legen Sie die Tubing anschließend in eine selbstversiegelnde Umfüllbeutelverpackung zur Gassterilisation. Da ein Milliliter Kollagen etwa zwei Meter Polyethylen-Tubing füllt, werden wir einen Milliliter Kollagen neutralisieren. Geben Sie das Kollagen in ein 15-Milliliter-Konischgefäß und stellen Sie das Gefäß auf Eis.

Fügen Sie 128 Mikroliter 10×-Alpha-MEM pro Milliliter Kollagen in das Röhrchen hinzu und mischen Sie die Lösung durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Dabei sollten Sie darauf achten, die Bildung von Blasen zu minimieren; die Lösung sollte gelb werden, wenn das Alpha-MEM in das saure Kollagen eingemischt wird. Anschließend neutralisieren Sie das Kollagen durch Zugabe von 0,8 molarem Natriumbicarbonat. Als allgemeine Schätzung des pH-Werts fügen Sie so lange Natriumbicarbonat hinzu, bis die gelbe Kollagenlösung eine hellrosa Farbe annimmt.

Um einen pH-Wert von 7,4 zu erreichen, werden typischerweise 30 bis 60 Mikroliter pro Milliliter Kollagen benötigt. Um zu verhindern, dass das neutralisierte Kollagen geliert, lagern Sie es bis zur Verwendung auf Eis. Um mit dem Verfahren zur Gelierung des Kollagens zu beginnen, nehmen Sie die Tüte mit den sterilisierten Polyethylenschläuchen in einen生物-sicherheitswerkbank und schneiden Sie das versiegelte Ende der Tüte ab, wobei Sie den Schlauch in der Tüte belassen.

Verwenden Sie sterilisierte Pinzette, um eine Dreimilliliter-Spritze an die 20-Gauge-Nadel anzubringen, die zuvor in ein Ende des Schlauchs eingeführt wurde. Führen Sie das andere Ende des Schlauchs in das neutralisierte Kollagen ein, bis die Spitze am Boden des kegelförmigen Reaktionsgefäßes steht, das auf Eis gehalten wird. Diesen nächsten Schritt müssen Sie langsam durchführen, da sonst Luftblasen in das Kollagen gelangen.

Ziehen Sie den Kolben der Spritze langsam zurück, um das Kollagen in den Polyethylen-Schlauch zu ziehen. Sobald das Kollagen durch den Schlauch gezogen ist, ziehen Sie die 20-Gauge-Nadel heraus und stecken Sie beide Enden des Schlauchs zurück in die Tüte. Nachdem die Tüte mit Klebeband verschlossen wurde, inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Es wird ein vormontiertes Schneidgerät verwendet, um die Tubing zu schneiden. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie die Tubing in ein steriles Tablett vor dem Schneidgerät legen und die Tubing am Ausgang des Schneidgeräts in das Gerät einlegen. Stellen Sie zudem ein 50-Milliliter-Kegelrohr bereit, das 25 Milliliter Endothelzell-Medien enthält. Um die geschnittenen Module aufzufangen, stellen Sie das Schneidgerät so ein, dass es die Tubing in zwei Millimeter lange Stücke schneidet, und schneiden Sie anschließend die Tubing.

Inkubieren Sie die geschnittenen Module in dem 50-Milliliter-Konischgefäß bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Um die Kollagenmodule aus der Tubing zu entfernen, wirbeln Sie das 50-Liter-Konischgefäß mit den Modulen für 10 Sekunden bei mittlerer Geschwindigkeit. Lassen Sie die Module anschließend etwa fünf Minuten lang auf den Boden des Gefäßes absinken.

Ein lockeres Pellet aus Modulen bildet sich am Boden des Röhrchens, während die Tubing eine Schicht auf der Oberfläche des Mediums bildet. Nachdem sich die Module abgesetzt haben, überführen Sie sie mithilfe einer weiten, 10-Milliliter-Serologiepipette in ein 15-Milliliter-Konischglas. Vortexen Sie das 15-Milliliter-Konischglas und lassen Sie die Module anschließend noch zweimal absetzen.

Die sedimentierten Module aus dem zweiten und dritten Wirbel werden ebenfalls in das 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Nachdem alle Module aus der Tubing entfernt und gesammelt wurden, wird das Volumen des Mediums im Röhrchen auf fünf Milliliter aufgefüllt. Die Module sind nun bereit, mit endothelialen Zellen beschichtet zu werden, wobei im Folgenden die Vorbereitung der endothelialen Zellen zur Beschichtung der Module gezeigt wird.

Entfernen Sie zuerst das Medium von den Zellen und waschen Sie mit PBS. Nach dem Entfernen des PBS geben Sie drei Milliliter Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in sieben Milliliter Medium und überführen sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen.

Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers; Sie benötigen fünf mal 10 hoch 6 endotheliale Zellen pro Milliliter gepackter Module am Boden des kegelförmigen Reaktionsgefäßes. Zentrifugieren Sie die Zellen mit 300 × g für fünf Minuten. Resuspendieren Sie das Zellenpellet in fünf Milliliter Endothelzellmedium.

Geben Sie nun fünf Milliliter Medium, das endotheliale Zellen enthält, zu den Modulen hinzu. Die Module werden mit den endothelialen Zellen sowohl statisch als auch dynamisch inkubiert; für die statische Inkubation mischen Sie die Module mit den endothelialen Zellen durch Umstülpen, und stellen Sie das Röhrchen dann für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius aufrecht. Nach 15 Minuten stülpen Sie das Röhrchen erneut um und inkubieren es bei 37 Grad Celsius für weitere 15 Minuten.

Um die Module dynamisch mit den endothelialen Zellen zu inkubieren, schwenken Sie das 15-Milliliter-Röhrchen vorsichtig bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Sobald die Inkubation mit den endothelialen Zellen abgeschlossen ist, überführen Sie die Module in eine nicht gewebekulturgeeignete Platte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag geben Sie die Module in eine neue, nicht gewebekulturgeeignete Platte mit frischem Medium, um nicht angeheftete endotheliale Zellen zu entfernen. Inkubieren Sie die mit endothelialen Zellen beschichteten Module bei 37 Grad Celsius, bis die Zellen 100 % der Oberfläche der Module bedecken.

Dies dauert normalerweise etwa sieben Tage. Die Module erscheinen zylindrisch, wenn sie erstmals aus der Röhre entnommen werden. Wenn sie mit endothelialen Zellen beschichtet sind, können sie sich bis zu 50 % in ihrem Volumen zusammenziehen, eine ovale Form annehmen und dichter sowie undurchsichtiger werden, was bei Betrachtung mittels Lichtmikroskop sichtbar ist.

In diesen Bildern werden der Durchmesser und die Länge der Module mit d bzw. l angegeben. Dieses nächste Bild zeigt eingebettete Hep-G2-Zellen, die zum Zeitpunkt der Herstellung gleichmäßig innerhalb der Module verteilt sind. Die Zellen wiesen eine hohe Vitalität auf, wie die grüne Färbung lebender Zellen zeigt.

Tote Zellen wären rot gefärbt, wenn die endothelialen Zellen konfluent sind. Auf der Oberfläche der Module bildet sich eine engmaschige Verbindung, die mittels Immunfluoreszenz sichtbar gemacht werden kann. Die Färbung von VE-Cadherin zur Analyse des Massentransports hat gezeigt, dass die Module in der Lage sind, hohe Zelldichten zu unterstützen, ohne einen nekrotischen Kern aufgrund unzureichenden Sauerstofftransports zu entwickeln, was bei größeren Geweben häufig problematisch ist.

In diesem Beispiel zeigt die Massen-Trichrom-Färbung typischer kleiner Module, dass die Module sieben Tage nach der Herstellung eine gleichmäßige und hohe Verteilung lebender Zellen beibehielten. Im Gegensatz dazu hatte sich im Kern der großen Module eine große Anzahl abgestorbener Zellen gebildet, sodass nur ein dünner Rand aus lebensfähigen Zellen verblieb. Es wurden außerdem Module mit einer Mischung aus Kollagen und einem a-ine-Polymer oder mit drug-eluting-Mikrosphären hergestellt.

Hier, wenn h hm EC-Zellen auf Palin-Kollagen-Modulen ausgesät werden, behalten die Module ihre zylindrische Form bei, und die Zelladhärenseigenschaften sind im Vergleich zu reinen Kollagenmodulen begrenzt. Ein Lichtmikroskopbild eines Kollagenmoduls, das auf PLGA basierende biologisch abbaubare Mikrosphären enthält, ist hier dargestellt. Es wurde gezeigt, dass mehrere In-vitro-Assays mit diesen Modulen kompatibel sind.

Beispielsweise können in einem Angiogenese-Assay kapillarähnliche Strukturen auf einem mit endothelialen Zellen besiedelten Modul nach fünf Tagen Inkubation mit aus Fettgewebe stammenden Stammzellen leicht detektiert und quantifiziert werden. In einem weiteren Beispiel zeigen konfokale Mikroskopieaufnahmen eines Live-Dead-Assays auf Modulen lebende Zellen grün gefärbt und tote Zellen rot gefärbt. Schließlich wurden Module zudem in mikrofluidische Kammern integriert und in Mäuse und Ratten implantiert, um die Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen sowie die Umgestaltung der Mikro-Gewebe durch die Wirtsreaktion zu untersuchen.

Nach dem Verfahren können die Module in einer Petrischale oder anderen Gefäßen wie einem Bioreaktor oder einer mikrofluidischen Vorrichtung kultiviert werden. Diese Methode kann auch angepasst werden, um unterschiedliches Gewebe zu erzeugen, indem verschiedene Kombinationen von Zelltypen verwendet oder Schläuche mit unterschiedlichen Durchmessern eingesetzt werden. Vielen Dank fürs Zuschauen.