Herstellung von Micro-Gewebe mit Modulen von Collagen Gel enthaltenden Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, modulare Mikrogewebe herzustellen, die für Tissue-Engineering-Experimente verwendet werden können. Dies wird erreicht, indem die Kollagenlösung zuerst mit einer Spritze in einen Polyethylenschlauch gezogen und dann das Kollagen geliert wird. Im zweiten Schritt werden die Polyethylenschläuche in zwei Millimeter Länge geschnitten, um die Mikrogewebemodule zu bilden.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Module von den Schläuchen zu trennen und schließlich werden die Module mit Endothelzellen beschichtet. Letztendlich können die resultierenden Mikrogewebe für zelluläre In-vitro-Assays verwendet werden, um die Interaktion von Zellen über eine mikrofluidische Kammer zu untersuchen. Darüber hinaus können die Mikrogewebe implantiert werden, um Gewebe für die Untersuchung der Interaktion und des Umbaus der Mikrogewebe in vivo zu erzeugen.

Hallo, mein Name ist Brendan Long vom Sepan Lab hier an der University of Toronto. Ein Haupthindernis bei der Herstellung eines großen 3D-Gewebeersatzes ist das Fehlen einer schnellen Vaskularisierung nach der Implantation. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie modulares Gewebe herstellen können, das mit Endothelzellen beschichtet ist, um diese Einschränkung zu überwinden.

Die Demonstration des Verfahrens wird von Chamberlain, einem postoperativen Stipendiaten aus dem Septin-Labor, übernommen. Die Menge an Kollagen, die neutralisiert werden soll, hängt von der Länge des Polyethylenschlauchs ab. In dieser Demonstration verwenden wir einen zwei Meter langen Polyethylenschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,76 Millimetern und einem Außendurchmesser von 1,22 Millimetern.

Um den Schlauch vorzubereiten, fädeln Sie eine 20-G-Nadel in ein Ende des Schlauchs ein und legen Sie den Schlauch dann zur Gassterilisation in einen selbstheilenden Konverterbeutel. Da ein Milliliter Kollagen etwa zwei Meter Polyethylenschlauch füllt, werden wir einen Milliliter Kollagen neutralisieren. Geben Sie das Kollagen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und halten Sie das Röhrchen auf Eis.

Geben Sie 128 Mikroliter 10 x alpha, MEM pro Milliliter Kollagen in das Röhrchen und mischen Sie die Lösung durch wiederholtes Pipettieren. Unter Berücksichtigung der Blasenbildung sollte sich die Lösung gelb verfärben, wenn das Alpha-MEM mit dem angesäuerten Kollagen vermischt wird. Als nächstes neutralisieren Sie das Kollagen, indem Sie 0,8 molare Natriumbicarbonat hinzufügen Für eine allgemeine Schätzung des pH-Werts fügen Sie Natriumbicarbonat hinzu, bis die gelbe Kollagenlösung eine hellrosa Farbe annimmt.

In der Regel werden 30 bis 60 Mikroliter pro Milliliter Kollagen benötigt, um einen pH-Wert von 7,4 zu erreichen. Um zu verhindern, dass das neutralisierte Kollagen geliert, bewahren Sie es bis zur Verwendung auf Eis auf. Um mit dem Verfahren zum Geleeschießen des Kollagens zu beginnen, bringen Sie den Beutel mit dem sterilisierten Polyethylenschlauch zu einer biologischen Sicherheitswerkbank und schneiden Sie das versiegelte Ende des Beutels ab, während Sie den Schlauch im Beutel belassen.

Befestige mit einer sterilisierten Pinzette eine Drei-Milliliter-Spritze an der 20-Gauge-Nadel, die zuvor in ein Ende des Schlauchs eingeführt wurde. Führen Sie das andere Ende des Schlauchs in das neutralisierte Kollagen ein, bis sich die Spitze am Boden des konischen Schlauchs befindet, der auf Eis gehalten wird. Diesen nächsten Schritt musst du langsam machen, sonst bringst du Luftblasen in das Kollagen ein.

Ziehen Sie den Kolben der Spritze langsam zurück, um das Kollagen in den Polyethylenschlauch zu ziehen. Wenn das Kollagen durch den Schlauch gezogen wurde, ziehen Sie die 20-Gauge-Nadel heraus und stecken Sie beide Enden des Schlauchs wieder in den Beutel. Nachdem Sie den Beutel zugeklebt hatten, inkubierten Sie ihn 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Zum Schneiden der Schläuche wird eine vormontierte Schneidevorrichtung verwendet. Um diesen Vorgang zu starten, legen Sie den Schlauch in eine sterile Schale vor der Schneidevorrichtung und laden Sie den Schlauch in die Schneidevorrichtung am Ausgang der Schneidevorrichtung, stellen Sie ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit 25 Millilitern Endothelzellmedium auf. Um die geschnittenen Module zu sammeln, stellen Sie das Schneidegerät so ein, dass es zwei Millimeter lange Schläuche schneidet, und schneiden Sie dann die Schläuche ab.

Inkubieren Sie die geschnittenen Module im konischen 50-Milliliter-Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Um Kollagenmodule aus dem Schlauch zu entfernen, wirbeln Sie das konische 50-Liter-Rohr, das die Module enthält, bei mittlerer Geschwindigkeit ein. Lassen Sie das Modul 10 Sekunden lang am Boden des Rohrs einwirken, was etwa fünf Minuten dauert.

Am Boden des Rohrs bildet sich ein loses Pellet aus Modulen, während der Schlauch eine Schicht auf dem Medium bildet. Nachdem sich die Module abgesetzt haben, verwenden Sie eine serologische Weithalspipette von 10 Millilitern, um sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Vortexen, das konische 15-Milliliter-Rohr, und lassen Sie die Module dann noch zwei weitere Male absetzen.

Die abgesetzten Module aus dem zweiten und dritten Wirbel werden ebenfalls auf das 15-Milliliter-Rohr übertragen. Nachdem alle Module aus dem Schlauch entfernt und gepoolt wurden, bringen Sie das Volumen des Mediums im Rohr auf fünf Milliliter. Die Module sind nun bereit für die Beschichtung mit Endothelzellen, die als nächstes gezeigt werden, um Endothelzellen für die Beschichtung der Module vorzubereiten.

Entfernen Sie zuerst das Medium aus den Zellen und waschen Sie es mit PBS. Nach dem Entfernen des PBS drei Milliliter Trypsin EDTA hinzufügen und fünf Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Als nächstes reanimation durchführen, die Zellen in sieben Milliliter Medium suspendieren und in ein 15-Milliliter-Röhrchen umfüllen.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer, Sie benötigen fünfmal 10 bis sechste Endothelzellen pro Milliliter gepackter Module am Boden des konischen Röhrchens. Pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 g. Resuspendieren Sie das Zellpellet in fünf Millilitern Endothelzellmedium.

Geben Sie nun fünf Milliliter Medien mit Endothelzellen in die Module. Die Module werden mit den Endothelzellen sowohl statisch als auch dynamisch für die statische Inkubation inkubiert, Module durch Inversion mit Endothelzellen gemischt und dann das Röhrchen für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius aufrecht gestellt. Nach 15 Minuten drehen Sie das Röhrchen wieder um und inkubieren Sie es weitere 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Um die Module mit den Endothelzellen dynamisch zu inkubieren, wird das 15-Milliliter-Röhrchen bei 37 Grad Celsius 60 Minuten lang sanft geschaukelt. Sobald die Inkubation mit den Endothelzellen abgeschlossen ist, übertragen Sie die Module auf eine nicht mit Gewebekultur behandelte Platte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius am nächsten Tag. Legen Sie die Module in eine neue, nicht mit Gewebekultur behandelte Platte mit frischem Medium, um nicht gebundene Endothelzellen zu entfernen. Inkubieren Sie Module, die mit Endothelzellen beschichtet sind, bei 37 Grad Celsius, bis die Zellen 100 % der Oberfläche der Module bedecken.

Dies dauert in der Regel etwa sieben Tage. Die Module sehen zylindrisch aus, wenn sie zum ersten Mal aus der Röhre genommen werden. Wenn sie mit Endothelzellen beschichtet sind, können sie sich bis zu 50 % des Volumens zusammenziehen und eine ovale Form entwickeln, sowie dichter und undurchsichtiger werden, wenn sie durch Lichtmikroskopie betrachtet werden.

In diesen Bildern sind der Durchmesser und die Länge der Module mit d bzw. l gekennzeichnet. Das nächste Bild zeigt eingebettetes Hep G, zwei Zellen, die zum Zeitpunkt der Herstellung gleichmäßig in den Modulen verteilt sind. Die Zellen behielten eine hohe Lebensfähigkeit, was durch die grüne Farbe der lebenden Zellen angezeigt wird.

Tote Zellen würden rot gefärbt sein, wenn die Endothelzellen zusammenfließen. Auf der Oberfläche der Module bilden sich Tight Junctions, die durch Immunfluoreszenz sichtbar sind. Die Färbung der VE-Cadherin-Stofftransferanalyse hat gezeigt, dass Module in der Lage sind, hohe Zelldichten zu unterstützen, ohne einen nekrotischen Kern aufgrund eines unzureichenden Sauerstofftransports zu entwickeln, der in größeren Geweben oft problematisch ist.

In diesem Beispiel zeigen Massen-Tri-Chro-Färbungen typischer kleiner Module, dass die Module sieben Tage nach der Herstellung eine gleichmäßige und hohe Verteilung lebender Zellen beibehielten. Im Gegensatz dazu hatte sich im Kern der großen Module eine große Anzahl toter Zellen gebildet, so dass nur ein dünner Rand lebensfähiger Zellen übrig blieb. Module wurden auch mit einer Mischung aus Kollagen und einem in-Polymer hergestellt oder enthalten arzneimittelfreisetzende Mikrosphären.

Wenn h hm EC one Zellen auf Palin-Kollagenmodulen sitzen, behalten die Module ihre zylindrische Form bei und es gibt begrenzte Zelladhäsionseigenschaften im Vergleich zu reinen Kollagenmodulen. Hier ist eine lichtmikroskopische Aufnahme eines Kollagenmoduls zu sehen, das biologisch abbaubare Mikrosphären auf PLGA-Basis enthält. Mehrere In-vitro-Assays haben sich als kompatibel mit Modulen erwiesen.

Zum Beispiel können in einem Angiogenese-Assay kapillarartige Formationen auf einem Modul, das mit Endothelzellen besetzt ist, nach fünftägiger Inkubation mit aus Fett gewonnenen Stammzellen leicht nachgewiesen und quantifiziert werden. In einem anderen Beispiel zeigen konfokale Mikroskopiebilder eines Lebend-Tot-Assays auf Modulen lebende Zellen, die grün gefärbt sind, und tote Zellen, die rot gefärbt sind. Schließlich wurden Module auch in mikrofluidischen Kammern verwendet und in Mäuse und Ratten implantiert, um die Interaktion zwischen verschiedenen Zelltypen zu untersuchen und zu untersuchen, wie die Mikrogewebe durch die Wirtsreaktion umgebaut werden.

Nach dem Verfahren können die Module in einer Petrischale oder anderen Gefäßen wie einem Bioreaktor oder einem mikrofluidischen Gerät kultiviert werden. Diese Methode kann auch angepasst werden, um unterschiedliches Gewebe zu erzeugen, indem verschiedene Kombinationen von Zelltypen oder Schläuche mit unterschiedlichen Durchmessern verwendet werden. Danke fürs Zuschauen.