Kryokonservierung und Wiederherstellen von Human iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Kryokonservierung und Rückgewinnung von IPS-Zellen unter Feeder-basierten oder feederfreien Kulturbedingungen. Dies wird erreicht, indem Sie zunächst damit beginnen, Ihre IPCs wie gewohnt zu verpacken. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen in ein serumfreies Gefriermedium zu überführen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Kryokonservierung wie gewohnt durchzuführen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen aufzutauen und mit der Wartung zu beginnen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die ein erfolgreiches Einfrieren und Auftauen von IPS-Zellen in serumfreiem Einfriermedium durch eine gesunde Morphologie und Erholung nach dem Auftauen zeigen.

Hallo, ich bin Kate Wagner am GCO-Standort bei Life Technologies. Die visuelle Demonstration dieses Protokolls ist von entscheidender Bedeutung, da IPCs sehr empfindlich auf Einfrieren und T fine reagieren können. Was dieses Protokoll einfacher macht, ist, dass der Knockout-Serumersatz während des gesamten Arbeitsablaufs verwendet werden kann.

Heute umfasst die KSR-Produktfamilie eine vollständige Liste von Medien und Reagenzien für die feederbasierte, futterfreie und xenofreie Kultivierung Ihrer embryonalen Stammzellen und induzierten pluripotenten Stammzellen. KSR kann für das Wachstum der Ableitung, die Kryokonservierung, die Expansion und die ersten Schritte der Differenzierung verwendet werden. Das folgende Video zeigt, wie Sie sich mit KSR in einer Peter-freien Maschine auftauen und einfrieren.

So starten Sie dieses Verfahren. Zuerst wird in einer geeigneten Menge des vollständigen Feeder-freien Mediums auf 37 Grad Celsius in einem Wasserbad abgesaugtes Medium aus dem Kulturgefäß, bei dem es sich um eine 60-Millimeter-Schale handelt, aspiriert. Spülen Sie in diesem Fall die humanen induzierten pluripotenten Stammzellen zweimal mit DPBS.

Gib dann einen Milliliter Dispa in das Gericht. Inkubieren Sie das Gericht drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Danach aspirieren Sie die Dispa-Lösung und waschen die Zellen vorsichtig mit DPBS.

Fügen Sie als Nächstes vollständiges Feeder-freies Medium hinzu, um die Schale abzudecken, und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen vorsichtig abzukratzen, um die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu übertragen. Spülen Sie die Schüssel mit einer vollständigen Zufuhr von freiem Medium aus und sprühen Sie vorsichtig alle Zellen ab, die sich nicht abgelöst haben. Füllen Sie die Spüllösung in dasselbe 15-Milliliter-Röhrchen mit den Zellen.

Spülen Sie das Gericht ein zweites Mal mit Medium aus und ziehen Sie diese Spüllösung mit den Pelletzellen der Zellen durch Zentrifugation bei 1000 U/min für drei Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig ansaugen und verwerfen, ohne das Zellpellet zu stören. Schnippen Sie vorsichtig mit dem Rohr, um das Zellpellet vollständig vom Boden des Rohrs zu lösen.

Fügen Sie dann einen Milliliter Gefriermedium A mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. Nach einer gleichmäßigen Suspension der Klumpen wird ein Milliliter Gefriermedium B tropfenweise in das Röhrchen gegeben, während die Zellsuspension zum Mischen vorsichtig geschwenkt wird. Geben Sie jeweils einen Milliliter Zellsuspension in jede Kryozelle, die über Nacht bei minus 80 Grad Celsius in einer Isopropanolkammer eingefroren wird.

Füllen Sie die Fläschchen mit den Zellen am nächsten Tag zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftank um. Tauen Sie das gefrorene Fläschchen mit den Zellen schnell auf, indem Sie es etwa drei bis vier Minuten lang in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad legen, bis nur noch ein kleines gefrorenes Stück im Fläschchen verbleibt. Nachdem Sie das Fläschchen aus dem Wasserbad genommen haben, sprühen Sie es mit 70 % Isopropanol auf, um es zu dekontaminieren, und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um den gesamten Inhalt des Fläschchens aseptisch in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen zu überführen.

Der nächste Schritt kann der schwierigste Aspekt des Verfahrens sein. Das feederfreie Medium muss langsam und vorsichtig in die Zellen gegeben werden. Um den osmotischen Schock zu reduzieren: Geben Sie langsam vier Milliliter des vollständigen Feeder-freien Mediums tropfenweise in die Zellen in das konische 15-Milliliter-Röhrchen.

Während der Zugabe des Mediums bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig hin und her, um die Zellen zu mischen. Dadurch wird der osmotische Schock für die Zellen reduziert. Das komplette Feeder-freie Medium kann durch einen Knockout-Serumersatz ersetzt werden, der ein Meth-konditioniertes Medium enthält, oder ein Knockout-Serum-Ersatzmedium für die Verwendung mit Feedern, siehe Protokolltext für Anweisungen zur Medienvorbereitung.

Sobald alle vier Milliliter des Mediums zugegeben wurden, zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1000 U/min. Nach der Zentrifugation ist das Sand vorsichtig zu aspirieren und zu entsorgen, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in vier Millilitern vollständigem Feeder-freiem Medium.

Geben Sie die Zellsuspension mit einer Fünf-Milliliter-Pipette vorsichtig tropfenweise in eine mit Gelt Trucks beschichtete 60-Millimeter-Kulturschale. Stellen Sie die Kulturschale in einen 36 bis 38 Grad Celsius heißen Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre von vier bis 6 % Kohlendioxid an der Luft. Schwenken Sie die Schale vorsichtig in einem Nord-Süd- und Ost-West-Muster, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.

24 Stunden nach dem Auftauen. Ersetzen Sie das Medium in der Schüssel durch frisches Medium. Ersetzen Sie das verbrauchte Medium danach täglich, bis die Zellen zu etwa 70 bis 80 % zusammenfließen

Dieses Kontrastbild zeigt humane induzierte pluripotente Stammzellen, die auf gelt TRX-beschichteten Kulturschalen unter Verwendung eines vollständigen Serumersatzes und eines Feeder-freien Mediums gezüchtet wurden. Die IPCs weisen eine ähnliche Morphologie wie menschliche embryonale Stammzellen auf, die durch große Zellkerne und wenig Zytoplasma gekennzeichnet sind. Ein Beispiel für Zellen nach dem Auftauen und dem Knockout-Serumersatz.

Hier ist das Feeder-freie Medium auf gelt TrackX zu sehen. Wenn Sie dieses Verfahren befolgen, ist es wichtig, daran zu denken, dass alle Ihre Zellkolonien die gleiche Größe haben. Bei der Kryokonservierung verbessert dies die Zellregeneration.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.