Name: Kryokonservierung und Wiederherstellen von Human iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Erfahren Sie die Kryokonservierung und Wiederherstellung humaner iPS-Zellen unter Verwendung von KnockOut SR-Feeder-freiem Medium. Dieses Protokoll demonstriert erfolgreiches Einfrieren und Auftauen mit gesunder Morphologie.

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Hinweis: Um sterile Kultur Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden alle Verfahren in diesem Protokoll unter Verwendung von sterilen Laborpraxis durchgeführt und führte unter einer Laminar-Flow-Haube. Vor dem Start, sicherzustellen, dass alle Medien äquilibriert bis 37 ° C und entsprechend vergast. Vorbereitung Geltrex-beschichteten Kulturschalen Hinweis: siehe Anhang für die Nutzung von CELLstart beschichteten Kulturschalen. <ol><li> Thaw eine Tube Geltrex (1 mL) langsam bei 2-8 ° C und verdünnt 1:100 in 99 ml Knockout D-MEM/F-12. Mischen Sie die Lösung vorsichtig. Hinweis: Einige iPS-Zelllinien kann eine andere Geltrex Verdünnung für ein optimales Wachstum benötigen. Siehe Anhang für alternative Verdünnungen. </li><li> Abdeckung der gesamten Oberfläche jeder Kulturschale mit dem Geltrex-Lösung (1 mL für eine 35-mm-Schale, 1,5 mL für eine 60-mm-Schale). </li><li> Seal jedes Gericht mit Parafilm zum Trocknen zu verhindern und inkubieren Sie die Gerichte für 1 Stunde bei 37 ° C. Hinweis: An dieser Stelle können Sie die Geltrex-beschichteten Kulturschalen bei 4 ° C lagern bis zu 1 Monat. Seal jedes Gericht mit Parafilm die Geltrex vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Vor dem Einsatz, übertragen Sie die Geltrex-beschichtete Platten zu einem Laminarströmungshaube und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur (ca. 1 Stunde) ausgleichen. </li></ol> Vorbereitung Komplette KnockOut SR Feeder-freiem Medium <ol><li> Zur Vorbereitung 1 mL von 10 pg / mL Grundlegende FGF-Lösung, aseptisch mischen die unten aufgeführten Komponenten. Aliquot der Lösung und bei -20 ° C bis zu 6 Monaten. <table border="0"><tbody><tr><td> Grundlegende FGF </td><td> 10 ug </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 990μL </td></tr><tr><td> 10% BSA </td><td> 10 l </td></tr></tbody></table> Hinweis: BSA mit HSA oder Knockout SR in der gleichen Konzentration ersetzt werden. </li><li> Zur Vorbereitung 50 ml 2 mg / mL Dispase-Lösung, aseptisch mischen die unten aufgeführten Komponenten. Filter sterilisieren der Lösung und lagern bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. <table border="0"><tbody><tr><td> Dispase </td><td> 100 mg </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> 50 mL </td></tr></tbody></table></li><li> Zur Herstellung von 100 ml komplette KnockOut SR Feeder-Free (KSR-FF) aseptisch verbinden die Komponenten in der Tabelle unten aufgeführt. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> Lager-Konzentration </td><td> Endkonzentration </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> Knockout DMEM/F12 (Kat.-Nr. 12660-012) </td><td> - </td><td> 1X </td><td> 76,8 mL </td></tr><tr><td> Glutamax-I (Kat. Nr. 35050-061) </td><td> 200 mM </td><td> 2 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> KnockOut SR (Kat.-Nr. 10828-028) </td><td> - </td><td> 20% </td><td> 20 mL </td></tr><tr><td> KnockOut SR-GFC (Kat.-Nr. A10580-01) </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td> 2 mL </td></tr><tr><td> bFGF (Kat.-Nr. PHG0024). </td><td> 10 ug / mL </td><td> 20 ng / mL </td><td> 200 ul </td></tr></tbody></table> Sie können die KSR-FF Medium bei 2-8 ° C lagern bis zu einer Woche. </li><li> Kurz vor pre-Gleichgewicht der gesamten mittel-bis Temperatur und Gase, aseptisch fügen Sie die erforderlichen Volumen von 2 Mercaptoethanol (55 mM Lager-Konzentration) für eine 0,1 mM Endkonzentration. Um zum Beispiel die Zubereitung von 100 ml KSR-FF medium 182 ul 55 mM 2-Mercaptoethanol (1:550 Verdünnung) Alternativ kann die 2-Mercaptoethanol zum 1X fertig zugesetzt werden und bei 2-8 ° C bis zu einer Woche. </li></ol> Vorbereitung Freezing / Kryokonservierungsmedium Die Kryokonservierung Medium besteht aus zwei Medien; Freezing Medium A und Einfriermedium B. Sie sind, um die Zellen zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen und müssen getrennt bleiben. Sie sind jeweils 50% des Gesamtvolumens der Kryokonservierung Medium benötigt. Das Gesamtvolumen der Kryokonservierung Medium benötigt wird 1 ml pro Fläschchen eingefroren werden. A 90% konfluent 60mm Teller hESC kann zu Bank 2 Fläschchen hESC in Kryokonservierung Medien eingesetzt werden. Bereiten Sie genügend Volumen von jeweils Freezing Medium mit einer zusätzlichen 2-5ml bis overage zu gewährleisten. <table border="1"><tbody><tr><td> Freezing Medium A (50% Endvolumen): </td><td> 50% DMEM/F12 </td><td> 50% KSR </td></tr><tr><td> Freezing Medium B (50% Endvolumen): </td><td> 80% DMEM/F12 </td><td> 20% DMSO </td></tr></tbody></table> Beispiel: Wenn Sie das Einfrieren 20 Ampullen von Zellen sind, müssen Sie 20 mL der Kryokonservierung Medium. Add 4mL für overage für eine Gesamtmenge von 24ml Kryokonservierung Medium. Das heißt, Sie müssen 12ml von Freezing Medium A (50% 24ml) und 12ml der Freezing Medium B (50% 24ml). <table border="1"><tbody><tr><td> Freezing Medium A (12 ml): </td><td> 6 mL DMEM/F12 </td><td> 6 mL KSR </td></tr><tr><td> Freezing Medium B (12 ml): </td><td> 9,6 ml DMEM/F12 </td><td> 2,4 ml DMSO </td></tr></tbody></table> Die endgültige Zusammensetzung der Kryokonservierung Medium beträgt 65% DMEM/F12, 25% KSR, und 10% DMSO. Kryokonservierung IPSCs <ol><li> Pre-warm das erforderliche Volumen der Dispase in einem 37 ° C Wasserbad. Siehe Tabelle 1 unten für Details auf den Datenträgern erforderlich. </li><li> Pre-Gleichgewicht das erforderliche Volumen des KSR-FF in einem 37 ° C Wasserbad for15 min. Siehe Tabelle 1below für Details auf den Datenträgern erforderlich. </li><li> Saugen Sie das verbrauchte Medium aus dem Kulturgefäß mit einer Pipette, und spülen Sie die Zellen zweimal mit D-PBS. </li><li> Vorsichtig fügen vorgewärmten Dispase-Lösung, um die Kultur Gefäß (z. B. 1 ml Dispase-Lösung pro 60-mm Kulturschale). Swirl das Kulturgefäß zu beschichten die gesamte Zelloberfläche. </li><li> Inkubieren Sie die Behälter bei 37 ° C für 3 Minuten. </li><li> Entfernen Sie das Gefäß aus dem Inkubator, absaugen Dispase-Lösung und vorsichtig waschen der Zellen mit D-PBS. </li><li> Vorsichtig kratzen die Zellen von der Oberfläche der Kulturschale mit einem Zellschaber, und übertragen Sie die Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Spülen Sie die Kulturschale zweimal mit KSR-FF, sanft &quot;Abspritzen&quot; alle Zellen, die nicht getrennt haben. Pool der Spül-Medium mit den Zellen in der 15 ml Tube. </li><li> Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 200 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur die Zellen zu pelletieren. </li><li> Vorsichtig absaugen der Überstand ohne die Zellpellet und entsorgen Sie sie. </li><li> Bereiten Sie eine ausreichende Menge an Kryoröhrchen. Sobald die Zellen in Kontakt mit DMSO sind, sollten sie aliquotiert und eingefroren werden innerhalb von 2-3 Minuten. </li><li> Gently Flick das Rohr voll zu verdrängen das Zellpellet aus dem Rohrboden und wieder die Zellen in Einfriermedium A. [durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren mit einer 5-ml-serologischen Pipette]. Nach gleichmäßige Suspension von Klumpen, fügen gleichen Volumen Einfriermedium B, um es in einem tropfenweise Weise, unter leichtem Schwenken der Zellsuspension zu mischen. Hinweis: An dieser Stelle werden die Zellen in Kontakt mit DMSO, und die Arbeit muss effizient durchgeführt werden. Sobald Zellen in Kontakt mit DMSO sind, sollten sie aliquotiert und eingefroren werden innerhalb von 2-3 Minuten. </li><li> Aliquot von 1 ml der Zellsuspension in jedes Kryoröhrchen. </li><li> Raschen Platzierung der Röhrchen in einem Mr. Frosty [schnell einfrieren] und überträgt es auf -80 ° C über Nacht. </li><li> Nach Lagerung über Nacht bei -80 ° C, übertragen Sie die Zellen, um eine flüssige Stickstoff-Tank für die langfristige Lagerung. </li></ol> iPSC Fläschchen auftauen und die Erholung der Zellen Hinweis: KSR-FF kann mit KSR-haltigen MEF-konditioniertem Medium oder KSR Medium für den Einsatz mit Zubringern ersetzt werden. Siehe Anhang finden Sie Anweisungen für die mediale Aufbereitung. Pre-warmen 10 mL KSR-FF-Medium in einem 50 ml Tube. <ol><li> Äquilibrieren der entsprechenden Menge Geltrex-beschichtete Platten auf Raumtemperatur und saugen jede Flüssigkeit aus der Gerichte nur vor dem Plattieren Sier-Zellen. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die hESC (oder IPSC) Fläschchen aus flüssigem Stickstoff Storage Tank. </li><li> Schnell Tauwetter gefrorenen Fläschchen von Zellen in einer 37 ° C Wasserbad, bis nur ein kleiner gefrorener Klumpen bleibt in der Flasche. </li><li> Spray Flasche mit 70% Isopropanol zu dekontaminieren und überträgt es auf die sterile Gewebekulturen Kapuze. </li><li> Überführen Sie den gesamten Inhalt des Fläschchens in einen 15 mL konischen Rohr mit einer 5-ml-Pipette. </li><li> Spülen Sie die Flasche mit 1 mL der KSR-FF und stell &#39;das zu den 15 mL Zentrifugenröhrchen. </li><li> Langsam, 4 ml KSR-FF, um Zellen in der 15 ml konischen Rohr tropfenweise. Beim Hinzufügen des Mediums, sanft bewegen Sie den Schlauch hin und her, um die Zellen zu mischen. (Dies reduziert osmotischen Schock der Zellen). </li><li> Zentrifugieren Sie die 15 ml Tube mit der Zellsuspension bei 1000rpm (200 x g) für 2 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Vorsichtig absaugen und den Überstand verwerfen, ohne das Zellpellet. </li><li> Re-suspend das Zellpellet in vorgewärmten KSR-FF (zB 4mL/60 mm-Schale) mit einer 5-ml-Pipette und sanft Pipette die Zellen auf und ab, bis Zellpellet vollständig dispergiert ist. Ein Lebensfähigkeit von mehr als 70% zu erwarten ist, wenn die Lebensfähigkeit von weniger als 70%, kann es länger dauern, bis die Zellen bis zur Konfluenz zu erreichen. </li><li> Mit der gleichen Pipette die Zellsuspension auf Geltrex-beschichtete Kulturschale voräquilibriert auf Raumtemperatur tropfenweise. </li><li> Legen Sie die Kulturschale in einem 37 ° C Inkubator mit einer angefeuchteten Atmosphäre von 4 bis 6% CO 2 in Luft. Vorsichtig schwenken Schiff in einem von Norden nach Süden, von Osten nach Westen Muster zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen. </li><li> Gently Fluid-Änderung der Kulturschale 24 Stunden nach dem Auftauen und danach täglich um Zelltrümmer zu entfernen und an die frische Nährstoffe liefern, bis das Gericht ist etwa 70-80% konfluent. Für die weitere Kultur und Passagierung der iPS-Zellen, zu unserem Protokoll mit dem Titel &quot;Feeder-Free Culture und Passagieren der menschlichen iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium&quot; beziehen </li></ol> Erwartete Ergebnisse Die Zellen sollten in etwa 70-80% konfluent vor Kryokonservierung werden. Dispase Verdauung Ergebnisse in Einrollen und Falzen der Kolonien entlang der Kolonie Margen. Nach der Ernte der Zellen werden sie als kleine Klumpen im Kryokonservierung Medien eingefroren. Sobald die Flasche wird aufgetaut, wieder Zellen und heften sich an die vorbeschichteten Gericht als kleine Klumpen. Sie wachsen schnell, was zu einer konfluenten Schale in 5-6 Tagen. Tabelle 1 - Empfohlene Volumes <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> 35mm Dish </td><td> 60mm Dish </td><td> 100mm Dish </td></tr><tr><td> Komplette KnockOut SR Medium </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Geltrex Lösung </td><td> 1 mL </td><td> 1,5 ml </td><td> 4-5 ml </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> 0,5 ml </td><td> 1 mL </td><td> 3-4 mL </td></tr><tr><td> D-PBS für das Spülen </td><td> 2 mL </td><td> 4 mL </td><td> 10 mL </td></tr></tbody></table> Bitte <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2237/2237_appendix.pdf">klicken Sie hier, um die Anlage zu sehen</a> .

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 595-605 (2008).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).</li>
<li>Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+adult+rat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells.</a> Cell Stem Cell. 4, 11-15 (2009).</li>
<li>Dimos, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+generated+from+patients+with+ALS+can+be+differentiated+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons.</a> Science. 321, 1218-1221 (2008).</li>
<li>Aasen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnli%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnli. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 3, 1180-1186 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ausgeschaltetes DMEM/F12</td><td></td><td>12660-012</td><td>Hinweis: siehe Anhang zur Verwendung alternativer DMEM-Produkte GlutaMAX-I (Kat.-Nr. 35050-061)</td></tr><tr><td>KnockOut-Serumersatz</td><td></td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Wachstumsfaktor-Cocktail für KnockOut-Serumersatz</td><td></td><td>A10580-01</td><td></td></tr><tr><td>FGF-basic, human rekombinantes Protein, 10 &amp;mu;g</td><td></td><td>PHG0024</td><td>Hinweis: siehe Anhang für alternative bFGF-Packungsgrößen.</td></tr><tr><td>2-Mercapt&amp;#8211;ethanol</td><td></td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td></td><td>17105-041</td><td>Hinweis: siehe Anhang für alternative Passagemethoden</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-qualifizierte reduzierte Wachstumsfaktor-Basalmatrix, 1 mL</td><td></td><td>A10480-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (D-PBS) ohne Calcium und Magnesium</td><td></td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 500 mL</td><td>JT Baker</td><td>JT9224-1</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Zellkulturhaube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brutschrank eingestellt auf 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhilfe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad eingestellt auf 37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile serologische Pipetten (5 mL, 10 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-mL-Zentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60-mm-Zellkulturschalen mit Behandlung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff-Lagertank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol-Gefriermodule</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5-mL-Kryoröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kryokonservierung und wiederherstellen von human ips-zellen unter verwendung komplette knockout serum ersatz feeder-freiem medium

Cryopreserving and Recovering of Human iPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

Die Entdeckung im Jahr 2006, dass Mensch und Maus-Fibroblasten umprogrammiert könnte zu iPS-Zellen 1-3 mit Qualitäten bemerkenswert ähnlich wie embryonale Stammzellen zu erzeugen ist eine wertvolle neue Quelle für pluripotente Zellen für die Wirkstoffforschung, Zell-Therapie und Grundlagenforschung geschaffen. GIBCO Medien und Reagenzien sind an der Spitze der pluripotenten Stammzellen seit Jahren. Knockout DMEM mit Knockout Serum Replacement ergänzt wird das Medium der Wahl für die embryonalen Stammzellen das Wachstum und nun iPS Zellkultur 3-9. Dieser Goldstandard Medien kann nun für Feeder-freien Kultur mit der Zugabe von Knockout SR Growth Factor Cocktail verwendet werden. Traditionelle menschliche ES-und iPS-Zellkultur-Methoden erfordern den Einsatz von Maus oder humanen Fibroblasten Feederschichten oder Feeder-konditioniertem Medium. Diese Kultur Methoden sind arbeitsintensiv, hart zu skalieren und es ist schwierig, Hüften Zellen undifferenziert wegen der undefinierten Zustand zu erhalten. Invitrogen hat Knockout SR Growth Factor Cocktail entwickelt, damit Sie auf einfache Weise Übergang Hüfte und hES-Zell-Kulturen zu Feeder-free unter Beibehaltung Ihrer Benutzung der Knockout SR.

Dieses Protokoll beschreibt die Einzelheiten des Verfahrens zur Kryokonservierung humanen iPS-Zellen in KnockOut SR Kryokonservierungsmedium und Gewinnung dieser Zellen in völliger KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) mittel-oder Feeder-basierte KnockOut SR Medium.

Kryokonservierung und Wiederherstellen von Human iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Die im Jahr 2006 gemachte Entdeckung, dass menschliche und maus-Fibroblasten reprogrammiert werden können, um iPS-Zellen 1-3 mit Eigenschaften zu generieren, die denen embryonaler Stammzellen bemerkenswert ähnlich sind ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, IPS-Zellen unter Bedingungen mit oder ohne Fütterungszellen einzufrieren und wiederzugewinnen. Dies wird erreicht, indem man zunächst damit beginnt, die IPCs wie üblich zu verpacken. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen in ein serumfreies Einfriermedium zu überführen. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, wie üblich kryokonservieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Auftauen der Zellen und der Beginn der Kultivierung. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine erfolgreiche Einfrierung und Wiederauftauchung von iPS-Zellen in einem serumfreien Einfriermedium durch gesunde Morphologie und Erholung nach dem Auftauen belegen.Hallo, ich bin Kate Wagner am GCO-Standort bei Life Technologies. Die visuelle Demonstration dieses Protokolls ist entscheidend, da IPCs sehr empfindlich gegenüber Einfrieren und der Feinabstimmung von T sein können. Was dieses Protokoll vereinfacht, ist die Verwendung eines knock-out-Serumersatzes während des gesamten Arbeitsablaufs.Heute umfasst die Produktfamilie KSR eine vollständige Liste an Medien und Reagenzien für die körperformer-, futterer- und xenofreie Kultur Ihrer embryonalen Stammzellen und induzierten pluripotenten Stammzellen. KSR kann für die Gewinnung, das Wachstum, die Kryokonservierung, die Vermehrung sowie die ersten Schritte der Differenzierung verwendet werden. Das folgende Video zeigt Ihnen, wie Sie das Auftauen und Einfrieren selbst mit KSR in einer petrischalenfreien Maschine durchführen.Um dieses Verfahren zu beginnen, erwärmen Sie zunächst eine geeignete Menge kompletten, frei von Futterzellen befindlichen Mediums auf 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Aspirieren Sie das verbrauchte Medium aus dem Kulturgefäß, in diesem Fall eine 60-Millimeter-Schale. Spülen Sie die humanen induzierten pluripotenten Stammzellen anschließend zweimal mit DPBS.Fügen Sie dann ein Milliliter Dispa der Schale hinzu. Inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius für drei Minuten. Danach aspirieren Sie die Dispa-Lösung und waschen die Zellen vorsichtig mit DPBS.Fügen Sie anschließend vollständiges, ohne Futterzellen hergestelltes Medium hinzu, um die Schale zu bedecken, und verwenden Sie einen Zellabstreifer, um die Zellen vorsichtig abzulösen und in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Spülen Sie die Schale mit vollständigem, ohne Futterzellen hergestelltem Medium aus, wobei Sie vorsichtig alle nicht abgelösten Zellen abspülen. Überführen Sie die Spüllösung in dasselbe 15-Milliliter-Röhrchen, das die Zellen enthält.Spülen Sie die Petrischale ein zweites Mal mit Medium und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation der Spüllösung bei 1000 U/min für drei Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation saugen Sie vorsichtig den Überstand ab und entsorgen ihn, ohne das Zellenpellet zu stören. Klopfen Sie das Röhrchen sanft an, um das Zellenpellet vollständig vom Boden des Röhrchens zu lösen.Anschießend ein Milliliter Gefriermittel A unter Verwendung einer fünf Milliliter umfassenden serologischen Pipette hinzufügen und die Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren resuspendieren. Nach gleichmäßiger Suspension der Klumpen ein Milliliter Gefriermittel B tropfenweise dem Röhrchen hinzufügen, während die Zellsuspension vorsichtig geschwenkt wird, um eine Vermischung zu gewährleisten. Je ein Milliliter der Zellsuspension in jedes Kryoröhrchen abfüllen und die Zellen über Nacht bei minus 80 Grad Celsius in einer Isopropanolkammer einfrieren.Am folgenden Tag überführen Sie die Zellgefäße in einen Flüssigstickstofftank zur Langzeitlagerung. Tauen Sie das gefrorene Zellgefäß schnell auf, indem Sie es für etwa drei bis vier Minuten in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius stellen, bis nur noch ein kleines gefrorenes Stückchen im Gefäß verbleibt. Nach dem Entnehmen des Gefäßes aus dem Wasserbad sprühen Sie es mit 70 % Isopropanol ab, um es zu desinfizieren, und übertragen anschließend mithilfe einer 5-Milliliter-Pipette den gesamten Inhalt des Gefäßes aseptisch in ein 15-Milliliter-Konischgefäß. Der nächste Schritt könnte der schwierigste Aspekt des Verfahrens sein. Das fütterzellenfreie Medium muss langsam und vorsichtig zu den Zellen hinzugefügt werden. Um einen osmotischen Schock zu vermindern, geben Sie langsam vier Milliliter vollständiges fütterzellenfreies Medium tropfenweise zu den Zellen in dem 15-Milliliter-Konischglas. Während des vorsichtigen Hinzufügens des Mediums die Röhre hin und her bewegen, um die Zellen zu vermischen. Dies verringert den osmotischen Schock für die Zellen. Das komplette, frei von Futterzellen hergestellte Medium kann durch ein Knockout-Serumersatz enthaltendes, mit Meth konditioniertes Medium oder durch Knockout-Serumersatz-Medium ersetzt werden, das in Kombination mit Futterzellen verwendet wird. Hinweise zur Mediumzubereitung finden sich im Protokolltext.Nachdem insgesamt vier Milliliter Medium zugegeben wurden, zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1000 U/min. Nach der Zentrifugation saugen Sie vorsichtig das Überstandmedium ab und entsorgen es, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in vier Millilitern komplettem, feederfreiem Medium.Unter Verwendung einer fünf Milliliter-Pipette die Zellsuspension tropfenweise einer mit Gelt-Trucks beschichteten 60-Millimeter-Kulturschale hinzufügen. Die Kulturschale in einen Inkubator bei 36 bis 38 Grad Celsius mit einer feuchten Atmosphäre aus vier bis 6 % Kohlendioxid in Luft stellen. Die Schale vorsichtig in einem Muster von Norden nach Süden und von Osten nach Westen schwenken, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.24 Stunden nach dem Auftauen. Ersetzen Sie das Medium in der Petrischale durch frisches Medium. Ersetzen Sie das verbrauchte Medium danach täglich, bis die Zellen etwa 70 bis 80 % konfluent sind.Dieses Kontrastbild zeigt humane induzierte pluripotente Stammzellen, die auf mit Gelt TRX beschichteten Kulturschalen in einem kompletten, serumfreien Medium ohne Fütterungszellen gezüchtet wurden. Die Zellen weisen eine Morphologie auf, die menschlichen embryonalen Stammzellen ähnelt und durch große Kerne sowie geringes Zytoplasma gekennzeichnet ist. Ein Beispiel für Zellen nach dem Auftauen und dem Austausch des Knockout-Serums.Ein mittelfreies Medium auf Gelt TrackX wird hier gezeigt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass alle Zellkolonien die gleiche Größe beibehalten sollten. Bei der Kryokonservierung verbessert dies die Zellrückgewinnung.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Das folgende Protokoll enthält Anweisungen für die Anpassung menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu Feeder-freien Kultur mit kompletten KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium (KSR-FF). Einmal angepasst, Anweisungen für die kontinuierliche Wartung sind ebenfalls vorhanden.

Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

Die regelmäßige Charakterisierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs), um die Aufrechterhaltung ihres pluripotenten Zustands zu gewährleisten, ist ein wichtiger Schritt, bevor diese Zellen für andere Anwendungen verwendet werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur kleinskaligen Vermehrung von humanen iPSCs, die speziell entwickelt wurde, um ihre einfache und routinemäßige Charakterisierung mittels Immunzytochemie zu ermöglichen.

Kleines Vermehrung von menschlichen iPS-Zellen in Serum-freien Bedingungen für die Routine Immunzytochemische Charakterisierung

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Entwicklung eines dreidimensionalen (3-D) -Systems aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), dem so genannten serumfreien Embryoidkörper (SFEB). Dieses 3-D-Modell kann wie eine organotypische Scheibenkultur verwendet werden, um die menschliche kortikale Entwicklung zu modellieren und für die physiologische Abfrage der Entwicklung von neuronalen Schaltungen.

Entwickeln von HiPSC-abgeleiteten serumfreien Embryoidkörpern zur Vernehmung von 3-D-Stammzellkulturen unter Verwendung physiologisch relevanter Assays

Die Produktion von spezialisierten netzhautzellen aus pluripotenten Stammzellen ist ein Wendepunkt in der Entwicklung der Stammzell-Therapie für Erkrankungen der Netzhaut. Der vorliegende Beitrag beschreibt eine einfache Methode für eine effiziente Erzeugung von retinalen Organellen und retinalen Pigment Epithel für Grund-, translationalen und klinischen Forschung.

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

Primordiale Keimzellen (PGCs) sind gemeinsame Vorläufer von Spermien und Eizellen. Menschliche embryonale PGCs sind aus pluripotenten Epiblast Zellen durch Interaktionen von Zytokinen angegeben. Hier beschreiben wir eine 13-tägige Protokoll des Verursachens von menschlichen Zellen Transcriptomally ähnlich PGCs an der Oberfläche des Embryoid Körper von grundiert Pluripotenz induzierte pluripotente Stammzellen.

Generation von menschlichen Ur Keimzelle-wie Zellen an der Oberfläche der Embryoid Körper von grundiert Pluripotenz induzierte pluripotente Stammzellen

Endotheliale Vorläufer, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-EPs) gewonnen werden, haben das Potenzial, Herz-Kreislauf-Behandlungen zu revolutionieren und die Schaffung von originalgetreueren Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu ermöglichen. Dabei werden die Verkapselung von iPSC-EPs in dreidimensionalen (3D) Kollagen-Mikroumgebungen und eine quantitative Analyse des vaskulogenen Potenzials dieser Zellen beschrieben.

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Die Zellumprogrammierung erfordert die Einführung von Schlüsselgenen, die den pluripotenten Zellzustand regulieren und aufrechterhalten. Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Bildung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen dermalen Fibroblasten ohne virale/integrierende Methoden, aber unter Verwendung nicht modifizierter RNAs (NM-RNAs) in Kombination mit Immunumgehungsfaktoren, die die zellulären Abwehrmechanismen reduzieren.

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Hier stellen wir ein Protokoll für ein automatisiertes Zellkultursystem vor. Dieses automatisierte Kultursystem reduziert den Arbeitsaufwand und kommt den Anwendern zugute, einschließlich Forschern, die mit dem Umgang mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) nicht vertraut sind, von der Wartung von iPS-Zellen bis hin zur Differenzierung in verschiedene Zelltypen.

Ein automatisiertes Kultursystem zur Erhaltung und Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die effiziente Kryokonservierung von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen.

Kryokonservierung von aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen im optimalen Stadium

Hier stellen wir eine Methode zur Differenzierung und Erweiterung von humanen iPSC-abgeleiteten chimären Antigenrezeptoren (CAR)-exprimierenden natürlichen Killerzellen mit verbesserter Abtötung gegen verschiedene Malignome vor. Dieses Protokoll demonstriert die Differenzierung und Expansion von für natürliche Killer (NK) optimierten iPSC-abgeleiteten CAR-NK-Zellen und die Messung der Antitumoraktivität gegen verschiedene Tumorzelllinien.

Fortschritte bei humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die von chimären Antigenrezeptoren abgeleitet werden und natürliche Killerzellen exprimieren

Erfahren Sie die Kryokonservierung und Wiederherstellung humaner iPS-Zellen unter Verwendung von KnockOut SR-Feeder-freiem Medium. Dieses Protokoll demonstriert erfolgreiches Einfrieren und Auftauen mit gesunder Morphologie.

Kryokonservierung und Wiederherstellen von Human iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium (Video) | JoVE Journal

Kryokonservierung und Wiederherstellen von Human iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

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