Kryokonservierung und Wiederherstellen von Human iPS-Zellen unter Verwendung Komplette KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, IPS-Zellen unter Bedingungen mit oder ohne Fütterungszellen einzufrieren und wiederzugewinnen. Dies wird erreicht, indem man zunächst damit beginnt, die IPCs wie üblich zu verpacken. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen in ein serumfreies Einfriermedium zu überführen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, wie üblich kryokonservieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist das Auftauen der Zellen und der Beginn der Kultivierung. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine erfolgreiche Einfrierung und Wiederauftauchung von iPS-Zellen in einem serumfreien Einfriermedium durch gesunde Morphologie und Erholung nach dem Auftauen belegen.

Hallo, ich bin Kate Wagner am GCO-Standort bei Life Technologies. Die visuelle Demonstration dieses Protokolls ist entscheidend, da IPCs sehr empfindlich gegenüber Einfrieren und der Feinabstimmung von T sein können. Was dieses Protokoll vereinfacht, ist die Verwendung eines knock-out-Serumersatzes während des gesamten Arbeitsablaufs.

Heute umfasst die Produktfamilie KSR eine vollständige Liste an Medien und Reagenzien für die körperformer-, futterer- und xenofreie Kultur Ihrer embryonalen Stammzellen und induzierten pluripotenten Stammzellen. KSR kann für die Gewinnung, das Wachstum, die Kryokonservierung, die Vermehrung sowie die ersten Schritte der Differenzierung verwendet werden. Das folgende Video zeigt Ihnen, wie Sie das Auftauen und Einfrieren selbst mit KSR in einer petrischalenfreien Maschine durchführen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, erwärmen Sie zunächst eine geeignete Menge kompletten, frei von Futterzellen befindlichen Mediums auf 37 Grad Celsius in einem Wasserbad. Aspirieren Sie das verbrauchte Medium aus dem Kulturgefäß, in diesem Fall eine 60-Millimeter-Schale. Spülen Sie die humanen induzierten pluripotenten Stammzellen anschließend zweimal mit DPBS.

Fügen Sie dann ein Milliliter Dispa der Schale hinzu. Inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius für drei Minuten. Danach aspirieren Sie die Dispa-Lösung und waschen die Zellen vorsichtig mit DPBS.

Fügen Sie anschließend vollständiges, ohne Futterzellen hergestelltes Medium hinzu, um die Schale zu bedecken, und verwenden Sie einen Zellabstreifer, um die Zellen vorsichtig abzulösen und in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Spülen Sie die Schale mit vollständigem, ohne Futterzellen hergestelltem Medium aus, wobei Sie vorsichtig alle nicht abgelösten Zellen abspülen. Überführen Sie die Spüllösung in dasselbe 15-Milliliter-Röhrchen, das die Zellen enthält.

Spülen Sie die Petrischale ein zweites Mal mit Medium und pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation der Spüllösung bei 1000 U/min für drei Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation saugen Sie vorsichtig den Überstand ab und entsorgen ihn, ohne das Zellenpellet zu stören. Klopfen Sie das Röhrchen sanft an, um das Zellenpellet vollständig vom Boden des Röhrchens zu lösen.

Anschießend ein Milliliter Gefriermittel A unter Verwendung einer fünf Milliliter umfassenden serologischen Pipette hinzufügen und die Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren resuspendieren. Nach gleichmäßiger Suspension der Klumpen ein Milliliter Gefriermittel B tropfenweise dem Röhrchen hinzufügen, während die Zellsuspension vorsichtig geschwenkt wird, um eine Vermischung zu gewährleisten. Je ein Milliliter der Zellsuspension in jedes Kryoröhrchen abfüllen und die Zellen über Nacht bei minus 80 Grad Celsius in einer Isopropanolkammer einfrieren.

Am folgenden Tag überführen Sie die Zellgefäße in einen Flüssigstickstofftank zur Langzeitlagerung. Tauen Sie das gefrorene Zellgefäß schnell auf, indem Sie es für etwa drei bis vier Minuten in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius stellen, bis nur noch ein kleines gefrorenes Stückchen im Gefäß verbleibt. Nach dem Entnehmen des Gefäßes aus dem Wasserbad sprühen Sie es mit 70 % Isopropanol ab, um es zu desinfizieren, und übertragen anschließend mithilfe einer 5-Milliliter-Pipette den gesamten Inhalt des Gefäßes aseptisch in ein 15-Milliliter-Konischgefäß.

Der nächste Schritt könnte der schwierigste Aspekt des Verfahrens sein. Das fütterzellenfreie Medium muss langsam und vorsichtig zu den Zellen hinzugefügt werden. Um einen osmotischen Schock zu vermindern, geben Sie langsam vier Milliliter vollständiges fütterzellenfreies Medium tropfenweise zu den Zellen in dem 15-Milliliter-Konischglas.

Während des vorsichtigen Hinzufügens des Mediums die Röhre hin und her bewegen, um die Zellen zu vermischen. Dies verringert den osmotischen Schock für die Zellen. Das komplette, frei von Futterzellen hergestellte Medium kann durch ein Knockout-Serumersatz enthaltendes, mit Meth konditioniertes Medium oder durch Knockout-Serumersatz-Medium ersetzt werden, das in Kombination mit Futterzellen verwendet wird. Hinweise zur Mediumzubereitung finden sich im Protokolltext.

Nachdem insgesamt vier Milliliter Medium zugegeben wurden, zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1000 U/min. Nach der Zentrifugation saugen Sie vorsichtig das Überstandmedium ab und entsorgen es, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in vier Millilitern komplettem, feederfreiem Medium.

Unter Verwendung einer fünf Milliliter-Pipette die Zellsuspension tropfenweise einer mit Gelt-Trucks beschichteten 60-Millimeter-Kulturschale hinzufügen. Die Kulturschale in einen Inkubator bei 36 bis 38 Grad Celsius mit einer feuchten Atmosphäre aus vier bis 6 % Kohlendioxid in Luft stellen. Die Schale vorsichtig in einem Muster von Norden nach Süden und von Osten nach Westen schwenken, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.

24 Stunden nach dem Auftauen. Ersetzen Sie das Medium in der Petrischale durch frisches Medium. Ersetzen Sie das verbrauchte Medium danach täglich, bis die Zellen etwa 70 bis 80 % konfluent sind.

Dieses Kontrastbild zeigt humane induzierte pluripotente Stammzellen, die auf mit Gelt TRX beschichteten Kulturschalen in einem kompletten, serumfreien Medium ohne Fütterungszellen gezüchtet wurden. Die Zellen weisen eine Morphologie auf, die menschlichen embryonalen Stammzellen ähnelt und durch große Kerne sowie geringes Zytoplasma gekennzeichnet ist. Ein Beispiel für Zellen nach dem Auftauen und dem Austausch des Knockout-Serums.

Ein mittelfreies Medium auf Gelt TrackX wird hier gezeigt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass alle Zellkolonien die gleiche Größe beibehalten sollten. Bei der Kryokonservierung verbessert dies die Zellrückgewinnung.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.