Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Analyse der Morphologie von Dendriten und Axonen, die zusammen als Neuriten bezeichnet werden, mit einem halbautomatischen Programm, um lokale Veränderungen zu beobachten. Die erste Neuron J-Software wird verwendet, um Acht-Bit-TIFF-Bilder von Neuronen zu verfolgen, um die Position von Neuritensegmenten zu identifizieren. Die Neuron Studio-Software wird dann verwendet, um strukturelle Informationen über die Konnektivität zwischen Neuriten zu definieren.

Schließlich wird das bonfire MATLAB-Programm ausgeführt, um morphologische Daten aus den Zellen zu extrahieren, einschließlich der Untiefenanalyse, sowie der Anzahl der Neuritenverzweigungspunkte und Neuritenspitzen. Die Ergebnisse zeigen lokale Veränderungen in der Neuritenmorphologie, basierend auf der Durchführung der Schwarmanalyse an Subregionen des neurotischen Dorns. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Untiefenanalyse von Hand, besteht darin, dass das Programm halbautomatisiert ist, was die Effizienz der Analyse erheblich erhöht und es ermöglicht, die Daten zu überprüfen, so dass die Genauigkeit der Analyse überprüft werden kann.

Das Verfahren wird von Hirsch AWA-Studenten demonstriert, der den Sommer über im Firestein-Labor arbeitet. Um das bonfire-Programm zur Analyse der morphologischen Eigenschaften des Acht-Bit-tiffs der Neuriten verwenden zu können, müssen nach dem Herunterladen des bonfire-Programms Bilder von einzelnen Neuronen erhalten werden. Die Programmeinstellungen müssen basierend auf der Bildauflösung der Bilder angepasst werden, die Sie im Abschnitt "Bonfire-Parameter" des bonfire-Programms analysieren möchten. Ersetzen Sie den aktuellen Wert für die Konvertierung der Variablenauswahl durch den Wert der Bildauflösung Ihrer Bilder.

Damit bonfire die Daten analysieren kann, müssen die Dateien in einer bestimmten Struktur organisiert sein, einschließlich eines Master-Ordners, eines bonfire-Ordners, der die bonfire MATLAB M-Dateien enthält, Unterordner, die jede der verschiedenen Bedingungen enthalten, und der Zellenbilddateien in den verschiedenen Bedingungsordnern, die mit der Vorbereitung des Bildes für die Ablaufverfolgung beginnen. Für dieses Experiment werden nur die Dendriten verfolgt, um Veränderungen in der dendritischen Morphologie zu analysieren. Beginnen Sie damit, das Bild für die Nachzeichnung vorzubereiten.

Öffnen Sie das Bild, indem Sie auf die Schaltfläche "Öffnen" in der Symbolleiste von Neuron J klicken und das Bild auswählen, das Sie verfolgen möchten. Ändern Sie nun die Größe des Bildes, indem Sie auf die Schaltfläche Maximieren klicken, um die Helligkeit und den Kontrast des Bildes so anzupassen, dass Sie alle Neurites select-Bilder auf der Neuron J-Symbolleiste visualisieren können, und wählen Sie dann Helligkeitskontrast anpassen aus. Um mit der Ablaufverfolgung zu beginnen, wählen Sie die Schaltfläche "Ablaufverfolgungen hinzufügen" auf der Symbolleiste von Neuron J Trace around the perimeter of the cell body aus.

Wählen Sie dann die Schaltfläche "Beschriftungsverfolgungen" auf der Symbolleiste "Neuron J" aus, und wählen Sie "N eins" aus dem Dropdown-Menü "Ablaufverfolgungs-ID" aus, wählen Sie im Fenster "Neuron J-Attribute" den Typ Null sechs aus, und wählen Sie "Okay" aus. Um mit der Verfolgung der Neuriten zu beginnen, wählen Sie die Schaltfläche "Spuren hinzufügen" in der Symbolleiste von Neuron J aus, und fügen Sie eine Spur entlang jedes interessierenden Neuritenzweigs hinzu. Es empfiehlt sich, wenn die Segmente, die Sie zeichnen, an jedem Abzweigungspunkt mit jedem Tochterverzweigungspunkt aufhören und an diesem Punkt als neue Kurve beginnen.

Wählen Sie die Schaltfläche "Spuren speichern" in der Symbolleiste von neuron J und speichern Sie die gerade erstellte Nachzeichnung im selben Ordner wie die ursprüngliche Bilddatei. Exportieren Sie als Nächstes die Trace-Dateien und die Trace-Identifier-Dateien aus neuron J.Wählen Sie die Schaltfläche trace exportieren in der Symbolleiste von neuron J aus. Wählen Sie nun die Option Tabulator: durch Trennzeichen getrennte Textdateien, separate Datei für jede Spur im Exportdialog von Neuron J und wählen Sie OK, damit Neuron J die Namen der Dateien und den Speicherort auswählen kann.

Wählen Sie auf der Symbolleiste von Neuron J die Schaltfläche Ablaufverfolgungen messen aus, und wählen Sie dann im Fenster Neuron J-Messungen die Option Nachverfolgungsmessungen anzeigen aus, und wählen Sie im Fenster Neuron J-Nachverfolgungen die Option Datei auswählen aus, und wählen Sie dann Speichern unter aus, und speichern Sie die Datei. Der Dateiname muss genau mit dem Namen der ursprünglichen Bilddatei übereinstimmen, gefolgt von Unterstrichinformationen, und sollte keine Dateierweiterung mit drei Buchstaben enthalten. Vergewissern Sie sich, dass Ihr Computer nicht automatisch eine XLS-Dateierweiterung hinzufügt.

Wenn dies der Fall ist, muss die Dateierweiterung manuell gelöscht werden. Organisieren Sie zunächst die Ordner mit bonfire load neu, indem Sie matlab öffnen und auf die Schaltfläche mit drei Punkten oben rechts im Befehlsfenster klicken. Wählen Sie den Bonfire-Ordner in Ihrem Master-Ordner aus, geben Sie im Fenster "Ordner suchen" bonfire load in das Befehlsfenster ein und drücken Sie die Eingabetaste.

Wählen Sie den Bedingungsordner, den Sie analysieren möchten, im Ordner und Fenster "Nach suchen" aus, und wählen Sie ihn aus. Okay. Dadurch wird die Ordnerstruktur neu organisiert, indem Zellenunterordner erstellt werden, die alle Daten für jede einzelne Zelle enthalten. Um nun einen Dateinamen zu erstellen, geben Sie bonfire underscore NDF two s WC in das Befehlsfenster ein und drücken Sie die Eingabetaste.

Wählen Sie im Fenster "Ordner suchen" denselben Bedingungsordner aus, der gerade mit bonfire load neu organisiert wurde, und wählen Sie ihn aus. Okay. Dadurch wird in jedem Zellenordner eine WC-Datei für die ausgewählte Bedingung erstellt. Jeder Zellenordner enthält fünf Dateien.

Das ursprüngliche TIF-Bild, die NDF-Datei, die Unterstrich-Infos, die Ablaufverfolgungs-ID-Datei, eine TXT-Datei und eine swc-Datei. Bevor Sie Neuron Studio verwenden, empfehlen wir Ihnen, sich mit den Funktionen und Verknüpfungen des Programms vertraut zu machen. Sie haben ein ausgezeichnetes Online-Benutzerhandbuch, und wenn Sie die Tastenkombinationen kennen, sparen Sie viel Zeit.

Um mit dem Öffnen des Neuron Studio-Programms zu beginnen, und wählen Sie Datei öffnen in der Neuron Studio-Symbolleiste aus, suchen Sie das TIF-Bild des Neurons. Sie möchten es bearbeiten und öffnen. Wählen Sie Ausführungseinstellungen aus, und geben Sie eine Einstellung in jedes der drei Felder ein.

Wählen Sie im Fenster Voxelgröße die Option file import s wc aus. Wählen Sie die entsprechende s WC-Datei aus, die der Datei entspricht, mit der Sie arbeiten möchten. Die Bilddatei wird nun mit dem Trace-Bild überlagert.

Das Zellsoma sollte mit einem roten Kreis überlagert werden, um die Neuriten zu verknüpfen. Verwenden Sie das Neuriten-Werkzeug, um Knoten so zu verbinden, dass jeder Verzweigungspunkt, der durch gelbe Knoten dargestellt wird, nur zwei Verzweigungen erstellen kann. Alle Spuren müssen mit dem Soma durchgehend sein.

Um nun Daten aus Neuron Studio zu exportieren, wählen Sie Datei aus, speichern Sie Neuriten und speichern Sie sie als Standardnamen, um nach Fehlern in den SWC-Dateien des Typs bonfire trace zu suchen. Checken Sie in das Befehlsfenster ein und drücken Sie die Eingabetaste. Wählen Sie im Fenster "Ordner suchen" den Bedingungsordner mit den Daten aus, die gerade verarbeitet wurden, und wählen Sie "OK" aus, wenn in einem der Bilder im Ordner Fehler auftreten.

Das Programm gibt Bilder aus, die zeigen, wo sich der Fehler befindet, um morphologische Daten aus den Punkt-S-WC-Dateien zu extrahieren. Geben Sie bonfire in das Befehlsfenster ein und drücken Sie die Eingabetaste. Wählen Sie im Fenster "Ordner suchen" den Bedingungsordner aus, den Sie analysieren möchten, und wählen Sie für jedes der interessierenden Neuronen die Option "OK" aus.

Die Lagerfeueranalyse wird ein Diagramm der neuronalen Morphologie zusammen mit den in der Analyse verwendeten Schulterringen erstellen. Darüber hinaus generiert der Befehl bonfire die MAT-Datei, die alle morphologischen Informationen enthält, die aus der Analyse entnommen wurden. Um die vorläufigen Diagramme des Datentyps bonfire results im MATLAB-Befehlsfenster anzuzeigen, wählen Sie im Fenster "Ordner suchen" den Bedingungsordner für die Bedingung aus, der angezeigt werden soll, und wählen Sie aus. Okay.

Das Fenster "Nach Ordner suchen" wird vorübergehend geschlossen und erneut geöffnet, sodass zusätzliche Bedingungen ausgewählt werden können. Nachdem Sie die Bedingungen ausgewählt haben, wählen Sie Abbrechen, um den Auswahlprozess zu beenden. Das Bonfire-Ergebnis gibt Zusammenfassungsdiagramme zurück, die die Daten aus den Bedingungsordnern enthalten, die Sie ausgewählt haben, um die morphologischen Daten in Excel zu exportieren. bonfire Export in das MATLAB-Befehlsfenster.

Wählen Sie im Fenster "Ordner suchen" den Bedingungsordner mit den Daten aus, die Sie exportieren möchten, und wählen Sie ihn aus. Okay, der Bonfire-Export erstellt Excel-Dateien der morphologischen Daten und legt sie in dem ausgewählten Zustandsordner ab. Jetzt zeigen wir Ihnen ein Beispiel für die Daten, die vom Bonfire-Programm für einen Datensatz generiert werden, der zwei Bedingungen enthält.

Dies sind Beispiele für invertierte Bilder beider Bedingungen. Auf diesen Bildern ist zu erkennen, dass Bedingung eins mehr Dendriten enthält als Bedingung zwei. Dieses Phänomen kann auch in einer Vielzahl von Diagrammen beobachtet werden, die vom Lagerfeuerprogramm erzeugt werden.

Da das Bonfire-Programm seine Analyse an Unterregionen der Dendriten durchführt, können die erhöhten Dendriten in Zustand eins leicht identifiziert werden. Das Zeichnen der Untiefenkurve des gesamten dendritischen Dorns zeigt, dass es mehr Dendriten distal des Zellkörpers für Bedingung eins Neuronen gibt. Das Aufzeichnen der durchschnittlichen Anzahl von Verzweigungspunkten und Endpunkten pro Zelle zeigt, dass Bedingung eins sowohl mehr Verzweigungspunkte als auch mehr Endpunkte enthält als Bedingung zwei. Die durchschnittliche Anzahl der Prozesse pro Zelle wird für primäre, sekundäre, tertiäre oder höhere Dendriten angezeigt. Es gibt mehr Dendriten tertiärer und höherer Ordnung für Bedingung eins Das Plotten der durchschnittlichen Anzahl von Prozessen pro Zelle für Wurzel-, Zwischen- und Enddendriten zeigt, dass Bedingung eins mehr Zwischen- oder Endprozesse aufweist als Bedingung zwei.

Hier sind die segmentidentitätsspezifischen Untiefenanalysekurven dargestellt, in denen die Segmente als primär, sekundär oder tertiär oder größer gruppiert sind. Die Zunahme der tertiären Dendriten erfolgt distal des Zellkörpers für die Bedingung eins Neuronen. Es werden die segmentidentitätsspezifischen Untiefenanalysekurven angezeigt, in denen die Segmente als Wurzelsegmente, Zwischensegmente oder Endsegmente gruppiert sind.

Die Zunahme sowohl der intermediären als auch der terminalen Dendriten im ersten Zustand tritt distal des Zellkörpers auf. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit dem Bonfire-Programm eine Schwarmanalyse durchführt, um lokale Veränderungen in der Neuromorphologie zu beobachten.