Großflächige Rekonstruktionen und Independent, Unvoreingenommene Clustering Basierend auf Morphologische Metriken Klassifizieren Neurons in Selective Populations

Dieses Protokoll beschreibt groß angelegte Rekonstruktion selektiver neuronaler Populationen, etikettiert folgende retrograden Infektion mit einem modifizierten Tollwutvirus Fluoreszenzmarker exprimieren, und unabhängig, unvoreingenommen Clusteranalysen, umfassende Charakterisierung der morphologischen Metriken unter verschiedene neuronale Subklassen ermöglichen.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Schritte zur Rekonstruktion der Morphologie von virusmarkierten Neuronen zu beschreiben und unabhängige, unvoreingenommene Clusteranalysen an Populationen markierter Neuronen durchzuführen, um eine umfassende Charakterisierung morphologischer Metriken entlang verschiedener neuronaler Unterklassen zu ermöglichen. Wir skizzieren einen neuartigen Ansatz zur Sammlung und Analyse neuroanatomischer Daten, um eine umfassendere Probenahme und eine unvoreingenommene Klassifizierung morphologisch einzigartiger neuronaler Typen innerhalb einer selektiven neuronalen Population zu ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine groß angelegte Analyse der neuronalen Morphologie ermöglicht und unvoreingenommene Methoden zur Klassifizierung unterschiedlicher neuronaler Unterklassen verwendet.

Die schwierigsten Aspekte morphologischer Rekonstruktionen sind die Auswahl gut isolierter Neuronen für die Rekonstruktion, die Zuweisung der richtigen Z-Tiefe und die Ausrichtung der Dorne, um die Rekonstruktionen über benachbarte Gewebeschnitte hinweg fortzusetzen. Beginnen Sie eine Rekonstruktion, indem Sie einen Objektträger auswählen, der einen gefärbten 50-Mikron-Hirngewebeschnitt von einem Primaten enthält, der stereotaktisch mit modifiziertem Tollwutvirus injiziert wurde, das EGFP exprimiert. Legen Sie den Objektträger in den Objektträgerhalter und fokussieren Sie sich mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung auf einen einzelnen interessanten Abschnitt.

Stellen Sie sicher, dass das Kamerabild im Live-Bild sichtbar ist, indem Sie den Kameraverschluss richtig positionieren. Wählen Sie ein einigermaßen isoliertes markiertes Neuron innerhalb der interessierenden Gehirnstruktur, um eine eindeutige Rekonstruktion der dendritischen Arborisation zu ermöglichen. Wechseln Sie auf 10-fache Vergrößerung und bringen Sie den Bereich in den Fokus.

Wählen Sie bevorzugt Neuronen aus, wenn sich der Zellkörper vollständig in einem einzigen Abschnitt befindet, um seine Fläche und Rundheit genau abzuschätzen. Sobald Sie ein gut gefärbtes, gut isoliertes Neuron ausgewählt haben, klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche Neuer Abschnitt, um den Home-Bereich, der den Zellkörper enthält, zum Abschnittsmanager hinzuzufügen. Geben Sie die Anzahl der Schnitte ein, die in die Rekonstruktion einbezogen werden sollen.

Es wird empfohlen, zunächst zwei bis drei Abschnitte einzufügen. Weisen Sie eine Querschnittsdicke von 50 Mikrometern zu. Wählen Sie das Ziel mit den zwei x, klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Kontur" in der oberen Symbolleiste und wählen Sie den Konturtyp aus dem Dropdown-Menü aus.

Zeichnen Sie die Kontur der Zielstruktur nach, indem Sie mit der Maus auf Punkte entlang der Kontur klicken. Wenn Sie mit dem Nachzeichnen der Kontur fertig sind, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und wählen Sie im Menü die Option Kontur schließen aus, um die Kontur zu schließen. Klicken Sie als Nächstes, während die Ansicht noch bei zwei x steht, auf das gewünschte Markierungssymbol in der linken Symbolleiste.

Klicken Sie dann auf die Mitte der Zielstruktur, um den Marker zu platzieren. Sobald die Konturen fertig sind, wählen Sie das 40x- oder 60x-Objektiv, um die Umrisse des Zellkörpers nachzuzeichnen. Wählen Sie dann die Schaltfläche Neuronenverfolgung in der oberen Symbolleiste aus und wählen Sie die zu verfolgende Neuronenstruktur, in diesem Fall den Zellkörper, aus dem Dropdown-Menü aus.

Verfolgen Sie den Zellkörper, indem Sie auf Punkte um die größte Ausdehnung des Zellkörpers klicken und die Z-Tiefe nach Bedarf anpassen, um den Zellkörper in den Fokus zu bringen. Und klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Kontur des Zellkörpers zu vervollständigen. Platzieren Sie als Nächstes einen Marker mit einem anderen Stil in der Mitte der Zellkörperkontur und stellen Sie sicher, dass sich der Marker ungefähr in der Mitte in der Z-Tiefe befindet.

Es ist wichtig, die korrekte Z-Tiefe im Home-Bereich sowie in angrenzenden Abschnitten zu ermitteln, bevor Sie mit der Verfolgung beginnen, damit die Werte der Z-Achse korrekt sind. Um mit der Verfolgung dendritischer Dorne zu beginnen, wählen Sie Dendriten aus dem oberen Dropdown-Menü aus.

Verfolgen Sie dann jeden Dendriten beginnend am Zellkörper. Wenn sich ein Dendrit verzweigt, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie einen gabelnden Knoten oder einen dreiteiligen Knoten, um einen Knoten an diesem Verzweigungspunkt zu platzieren. Achten Sie darauf, die Z-Tiefe während der gesamten Nachzeichnung anzupassen, um den Winkel und die Richtung des Dendriten genau zu erfassen.

Klicken Sie am Ende des Dendriten in diesem Abschnitt mit der rechten Maustaste und wählen Sie Ende aus dem Dropdown-Menü aus. Wenn alle dendritischen Dorne im Heimatbereich verfolgt sind, identifizieren Sie die dendritischen Enden, die sich wahrscheinlich in den angrenzenden Abschnitt fortsetzen werden. Und bringen Sie diese in der passenden z-Tiefe im Mikroskopbild bei 20x in den Fokus.

Nehmen Sie wichtige Orientierungspunkte in der Nähe auf, wie z. B. Blutgefäße oder leicht erkennbare Dendritenmuster oder -bündel in das Mikroskopbild. Nehmen Sie als Nächstes ein Bild des Live-Bildes mit einer Digitalkamera auf, die auf den Computerbildschirm gerichtet ist. Schalten Sie dann das Mikroskopobjektiv auf zwei x und bewegen Sie sich zum angrenzenden Bereich auf dem Objektträger.

Richten Sie dann die Konturen des zuvor verfolgten Abschnitts in der Softwareansicht mit den Grenzen von LGN und TRN im neuen Schnitt aus. Kehren Sie zu 20x zurück und richten Sie es anhand von Orientierungspunkten aus. Verschieben Sie dann mit Hilfe des Fotos der Dendritenenden aus dem zuvor nachgezeichneten Schnitt die Nachzeichnung, um die Dendriten auszurichten, indem Sie zuerst mit dem Pfeilwerkzeug die Rekonstruktion auswählen.

Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, wählen Sie Verschieben aus dem Dropdown-Menü und verschieben Sie die Ablaufverfolgung entsprechend. Um die Nachzeichnung zu drehen, klicken Sie mit der rechten Maustaste, wählen Sie Drehen aus dem Dropdown-Menü und drehen Sie die Nachzeichnung entsprechend. Alternativ können Sie das Matching-Tool aus der Dropdown-Liste der Top-Tools auswählen und die Anzahl der Punkte auswählen, die abgeglichen werden sollen.

Klicken Sie dann auf das Ende in der Rekonstruktion und den entsprechenden Fortsetzungspunkt im Livebild, um dendritische Enden mit Anfängen abzugleichen. Sobald die Nachzeichnung aus dem vorherigen Abschnitt mit den Dendriten im neuen Abschnitt ausgerichtet ist, fügen Sie dem Abschnittsmanager wie zuvor einen neuen Abschnitt hinzu. Alternativ können Sie einfach den angrenzenden Abschnitt auswählen, der zuvor erstellt wurde, und die Z-Tiefe auf die gleiche Weise anpassen.

Stellen Sie sicher, dass der entsprechende neue Abschnitt im Abschnittsmanager ausgewählt ist, indem Sie auf den aktuellen Abschnitt klicken. Nachdem Sie die Vergrößerung auf 40x oder 60x erhöht haben, wählen Sie den Dendriten mit dem Pfeil aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Ende des Dendriten aus dem vorherigen Abschnitt und wählen Sie im Dropdown-Menü die Option Zum Ende hinzufügen aus.

In einer Eingabeaufforderung werden Sie gefragt, ob sich die Fortsetzung in einem neuen Abschnitt befindet. Klicken Sie auf Ja. Zeichnen Sie dann die Fortsetzung des Dendriten nach, indem Sie die Maus als Zeichenwerkzeug verwenden.

Machen Sie Bilder von den Enden, um sie für den nächsten Abschnitt vorzubereiten. Fügen Sie dann Fortsetzungen zu dendritischen Spuren hinzu, bis mindestens drei Abschnitte für das Neuron verfolgt werden oder bis die Dendriten nicht mehr verfolgt oder gefunden werden können. Öffnen Sie mit einem Extraktionsprogramm, das mit dem Neuronenrekonstruktionssystem verknüpft ist, eine abgeschlossene Rekonstruktionsdatei.

Wählen Sie im Dropdown-Menü "Bearbeiten" die Option "Alle Objekte auswählen" aus. Wählen Sie in der oberen Symbolleiste der Analyse die Option Analyse der Zweigstruktur, klicken Sie dann auf jede Registerkarte und wählen Sie die gewünschten Analyseoptionen in jeder Registerkarte aus. Extrahieren Sie alle gewünschten Daten, indem Sie im Analysefenster auf die Schaltfläche OK klicken, und speichern Sie sie in einem Tabellenformat, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Ausgabefenster klicken und zur weiteren Analyse nach Excel exportieren auswählen.

Dieses Foto zeigt einen einzelnen koronalen Schnitt durch die dorsale LGN eines Tieres. Die Cytochromoxidase-Färbung wird verwendet, um LGN-Schichten sichtbar zu machen. Und die GFP-Färbung markiert die Injektionsstelle des Virus.

Der Pfeil zeigt Regionen mit dichten, retrograd markierten, thalamischen Neuronen des retikulären Kerns. Die Orientierung des Schnitts ist entsprechend dem dorsalen, ventralen, medialen lateralen Kompass dargestellt. Die Maßstabsleiste ist in der unteren linken Ecke dargestellt.

Dieses Bild zeigt die Konturen des LGN in Rot und des TRN in Kastanienbraun für alle Abschnitte, die eine Virusinjektion enthalten, wie durch die schwarzen Konturen angezeigt. Gelbe Sterne zeigen die Zentren der Injektionsstellen an. Dieses Bild zeigt die 3D-Darstellung der Konturen und der Injektionsstelle.

Dies ist eine Karte der Standorte von rekonstruierten TRN-Neuronen, die entsprechend der Clusterzuordnung innerhalb einer einzelnen aggregierten TRN-Kontur farbcodiert sind, die in Kastanienbraun dargestellt ist. Die Maßstabsleiste stellt 500 Mikrometer dar. Dieses Bild zeigt die aggregierten Konturen von TRN in schwarz und LGN in grau mit fünf rekonstruierten TRN-Neuronen, die entsprechend ihrer medialen lateralen Position innerhalb des TRN warm bis kühl gefärbt sind.

Der Maßstabsbalken stellt 500 Mikrometer dar. Diese Fotos zeigen die Details der gleichen fünf TRN-Neuronen mit farblich abgestimmten Skalenbalken, die 100 Mikrometer darstellen. Dieser hierarchische Dendrogrammbaum veranschaulicht die Kopplungsabstände zwischen 160 rekonstruierten TRN-Neuronen auf der Grundlage von 10 unabhängigen morphologischen Metriken und zeigt die Gesamtergebnisse der Clusteranalyse.

Drei unterschiedliche Cluster von TRN-Neuronen sind in Blau, Grün und Rot dargestellt. Sobald diese neuronalen Rekonstruktionstechniken beherrscht sind, kann ein einzelnes Neuron in ein bis zwei Stunden vollständig rekonstruiert werden. Es ist wichtig, die Z-Tiefe bei der Rekonstruktion von Neuronen ständig zu überwachen und anzupassen.

Das hier skizzierte Protokoll ist eine Verbesserung gegenüber traditionellen, stärker verzerrten neuroanatomischen Analysemethoden und ermöglicht es Forschern, neuartige Unterklassen von Neuronen auf der Grundlage umfangreicher morphologischer Daten zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Neuronen durch benachbarte Gewebeschnitte rekonstruiert und morphologische Daten für die weitere Analyse extrahiert.