Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, lichtinduzierte Antworten genetisch markierter Ganglienzellen in der isolierten Mausretina aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Retina aus dem Mausauge präpariert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Retina mit einem Enzym zu behandeln, um das verbleibende Glaskörpermaterial zu entfernen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Netzhaut mit der Ganglienzellseite nach oben in der Ableitungskammer zu platzieren, die Kammer auf dem Mikroskoptisch zu befestigen und die genetisch markierten Ganglienzellen zu identifizieren. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Durchführung einer Ganzzell-Ableitung der identifizierten Ganglienzelle und die Aufzeichnung lichtinduzierter Antworten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die funktionellen Eigenschaften eines definierten Ganglienzelltyps in der Mausretina zeigen und die Signale definieren, die sie über Einzelzell-Patch-Clamp-Ableitungen an das Gehirn weiterleitet.

Hallo, mein Name ist Tiffany Schmidt und ich bin Doktorandin im Fachbereich Neurowissenschaften im Labor von Dr. Paulo Ka Fuji an der University of Minnesota. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung und Ableitung von einer definierten, genetisch markierten Population der Ganglienzellen sowie anschließende morphologische Analysen. Mit dieser Technik können zentrale Fragen im Bereich der Sehforschung beantwortet werden, beispielsweise wie verschiedene Subtypen von Ganglienzellen wesentliche Merkmale visueller Reize verarbeiten, bevor die Operation durchgeführt wird.

Um die Netzhaut zu entfernen, müssen zunächst die acht Lösungen, die für das Experiment benötigt werden, zubereitet werden. Die Bestandteile aller in diesem Experiment verwendeten Lösungen sind im begleitenden Text angegeben. Überführen Sie 200 Milliliter der extrazellulären Lösung in ein 250-Milliliter-Becherglas zur Aufbewahrung der Netzhaut.

Geben Sie die verbleibende extrazelluläre Lösung in einen Trenntrichter für die Schwerkraft-Perfusion während der Aufzeichnung. Beide Lösungen müssen stets mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid gesättigt gehalten werden. Um die Dendriten während des Experiments sichtbar zu machen, fügen Sie der intrazellulären Lösung einen fluoreszierenden Farbstoff wie LOR 5 94 hinzu.

Wenn Sie beabsichtigen, nach der Ganzzellableitung eine Immunhistochemie durchzuführen, fügen Sie 0,3 % Neurobiotin zur intrazellulären Lösung hinzu. Sobald die erforderlichen Lösungen vorbereitet sind, euthanasieren Sie eine Maus durch Kohlendioxid-Asphyxie, enukleieren Sie den Augapfel, indem Sie eine abgewinkelte Nr.-2-Pinzette vorsichtig hinter das Auge einführen und den Augapfel herausheben. Entfernen Sie mit okularen Scheren die extraokularen Muskeln und durchtrennen Sie den Sehnerv.

Platzieren Sie das Augapfel in einer 35 Millimeter Petrischale, die mit extrazellulärer Lösung gefüllt ist. Schneiden Sie die Hornhaut mit okularen Scheren ab und entfernen Sie die Linse mit einer Pinzette Nummer fünf. Benutzen Sie die Pinzette Nummer fünf, um die Sklera aufzureißen, und durchtrennen Sie den verbleibenden Sehnerv an der Stelle, wo Netzhaut und Sklera zusammentreffen.

Ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig von der Augenschale ab, indem Sie die Pinzette im Zwischenraum zwischen Netzhaut und Sklera führen. Um Zeit zu sparen, führen Sie jeden Schritt an beiden Netzhäuten durch, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Ein entscheidender Schritt ist das Entfernen des an der Netzhaut haftenden Glaskörpers. Beginnen Sie damit, den durchsichtigen Glaskörper oberhalb der Netzhaut mit der Pinzette zu erfassen.

Wenn das Glaskörpermaterial erfolgreich entfernt wurde, sehen Sie eine kleine, klare, gallertartige Substanz an der Spitze der Pinzette. Schneiden Sie jede Netzhaut zur Maximierung der nutzbaren Gewebemenge und um das Montieren der Netzhaut in der Ableitungskammer zu erleichtern, der Länge nach in zwei Hälften. Geben Sie die Netzhäute in die mit Sauerstoff angereicherte extrazelluläre Lösung bei Raumtemperatur und minimieren Sie die Lichteinwirkung, indem Sie nur minimales Umgebungslicht, beispielsweise Licht von Computerbildschirmen, zulassen; unter diesen Bedingungen bleiben die Netzhäute etwa sechs Stunden lang funktionsfähig.

Nach der Dissektion 500 Mikroliter der extrazellulären Lösung aus der Lösung entnehmen, in der die zusätzlichen Netzhäute blubbern. Einen Aliquot der Kollagenase-Hyaluronidase-Enzymlösung darin verdünnen.

Geben Sie die Enzymlösung in eine 35-Millimeter-Petri-Schale und überführen Sie eine der präparierten Netzhäute in die Schale. Drehen Sie die Petri-Schale 15 Minuten lang kontinuierlich, während die Lösung ständig sanft mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid überspült wird. Die Enzymlösung entfernt jegliches verbleibende Glaskörpermaterial und ermöglicht einen leichteren Zugang zur Ganglienzellschicht. Bei Netzhäuten jüngerer Tiere mit weniger Glaskörper oder wenn unerwünschte Effekte beobachtet werden, kann die Verdauungsdauer auf fünf Minuten verkürzt werden.

Unter Verwendung einer Plastik-Transferpipette mit abgeschnittenem Spitzenende die Retina aus dem enzymhaltigen Medium entfernen. Die Retina umfassend in extrazellulärer Lösung waschen.

Überführen Sie die Netzhaut in die Ableitungskammer. Mit der Photorezeptorschicht nach unten streichen Sie verbleibende Flüssigkeit vorsichtig mit einer Pipette oder einem Tuch ab und rollen die Ränder der Netzhaut ab, um das Gewebe zu glätten. Achten Sie darauf, nur die Ränder der Netzhaut zu berühren und nicht die Ganglienzellschicht.

Um die Netzhaut zu fixieren, platzieren Sie einen Platinring mit Nylonnetz über die Netzhaut und füllen Sie die Kammer anschließend sofort mit extrazellulärer Lösung auf. Bringen Sie die Ableitungskammer auf dem Mikroskoptisch an und verbinden Sie anschließend das Rohr für die Schwerkraft-Perfusion der extrazellulären Lösung, das Vakuumsaugrohr und den Erdungsdraht. Stellen Sie die Schwerkraft so ein, dass die Lösung mit einer Geschwindigkeit von einem Milliliter pro Minute oder schneller tropft.

Wenn die Perfusionsrate zu langsam ist, wird das Gewebe nicht ausreichend mit Sauerstoff versorgt und die synaptische Signalübertragung kann gestört werden. Der nächste Schritt besteht darin, die Elektrode für die Ganzzell-Patch-Aufnahme einzurichten. Wählen Sie eine Pipette mit einem Widerstand im Bereich von drei bis fünf Megaohm aus.

Füllen Sie die Aufzeichnungspipette mit einer aufgetauten Portion der intrazellulären Lösung und setzen Sie sie unter Verwendung von Infrarotbeleuchtung und Differentialinterferenzkontrast- oder DIC-Optik unter einem 10×-Objektiv in den Pipettenhalter ein. Visualisieren Sie die Netzhaut und die Aufzeichnungspipette. Das Infrarotlicht dient dazu, die Belichtung der Netzhaut mit sichtbarem Licht zu minimieren und eine Lichtanpassung zu vermeiden. Wechseln Sie zu einem 40×-Objektiv und bringen Sie die Elektrode knapp oberhalb des Gewebes in den Sichtbereich.

Die in dieser Studie verwendete Mauslinie exprimiert EGFP in ihren Ganglienzellen, wodurch die Ganglienzellen unter Epifluoreszenz sichtbar sind. Die Mikroskopie beleuchtet die Netzhaut mit Epifluoreszenz bei 480 Nanometern. Wenn die Netzhaut gesund ist, sollten einzelne Ganglienzellen sichtbar sein.

Ungesunde Netzhäute weisen große, granulierte Kerne auf und sollten verworfen werden. Wählen Sie eine der fluoreszierenden Ganglienzellen zur Ableitung aus und markieren Sie die ausgewählte Zelle mit Laborklebeband auf dem Computermonitor. Wechseln Sie zu Infrarotoptik, sodass der Zellkörper der ausgewählten Ganglienzelle sichtbar ist.

Platzieren Sie die Ableitelektrode in der Nähe der angestrebten Ganglienzelle. Reinigen Sie den Bereich direkt über der Zelle, indem Sie sanften positiven Druck über die Ableitelektrode ausüben. Der Elektrodruck wird über eine 12-cc-Kunststoffspritze ausgeübt, die mit dem Pipettenhalter über Polyethylen-Schlauch an die Verstärker-Nullstellung angeschlossen ist.

Jegliche Spannungsverschiebungen. Platziere die Elektrode auf die ausgewählte Ganglienzelle, bis eine Delle auf der Zelloberfläche erscheint. Schalte den Verstärker in den Spannungs-Klemm-Modus, gib einen Testimpuls an und überwache den Strom, der durch die Pipette fließt.

Wenden Sie negativen Druck an, um eine Dichtung zwischen der Elektrode und der Zelle zu erzeugen. Nehmen Sie den negativen Druck weg, sobald die Dichtung zu bilden beginnt, und warten Sie, bis der Haltestrom auf eine Giga-Dichtung zwischen der Zellmembran und der Pipette hinweist. Geben Sie sanfte negative Druckimpulse ab, bis kapazitive Überschwingungen erscheinen, was darauf hindeutet, dass der Ganzzell-Aufnahmemodus erreicht ist, und nehmen Sie danach jegliche Druckanwendung zurück.

Wenn der Zugangswiderstand größer als 30 Megaohm ist, kann dies häufig durch zusätzliche sehr sanfte Impulse negativen Drucks verbessert werden. Nachdem der Ganzzellmodus erreicht wurde, schalten Sie das Infrarotlicht aus und bedecken Sie das Mikroskop mit einem schwarzen Tuch. Lassen Sie die Zelle fünf Minuten lang im Dunkeln adaptieren.

Nach fünf Minuten ist die Vorbereitung zur Aufnahme bereit. Schalten Sie im Strom-Klemm-Modus die Vollfeld-Weißlicht-Stimulation ein und nehmen Sie die Antwort der Ganglienzelle auf. Falls die Ganglienzelle mehrmals stimuliert werden soll, sollte die Netzhaut zwischen den Stimulationen je nach Bedarf zur Dunkeladaption freigegeben werden.

Der Lichtreiz kann an diesem Punkt ebenfalls modifiziert werden, um gemusterte oder chromatische Reize einzubeziehen, um die Antworteigenschaften der Ganglienzellen nach der Aufzeichnung zu bewerten. Der fluoreszierende Farbstoff in der intrazellulären Lösung wird sich durch den Wechsel zwischen Epifluoreszenz und DIC-Infrarotoptik bereits in die Dendriten ausgebreitet haben. Der Farbstoff kann unter Epifluoreszenz bei 594 Nanometern sichtbar gemacht werden, und Sie können die Dendriten untersuchen, um festzustellen, ob die Ganglienzelle on-, off- oder stratifiziert ist. Das Neurobiotin, das der intrazellulären Lösung hinzugefügt wurde, hat sich in die Ganglienzelle hinein ausgebreitet, und daher besteht der nächste Schritt darin, die Netzhaut für die Immunhistochemie vorzubereiten.

Ziehen Sie die Pipette vorsichtig zurück, um die Zellmembran so wenig wie möglich zu stören. Beachten Sie, dass Sie, wenn Sie pro Präparation nur eine retinale Ganglienzelle aufzeichnen und füllen, spezifische Korrelationen zwischen der aufgezeichneten Ganglienzelle und ihrer detaillierten Morphologie herstellen können. Anschließend legen Sie die Netzhaut in die Paraformaldehydlösung und fixieren sie über Nacht bei vier Grad Celsius, nachdem sie über Nacht fixiert wurde.

Spülen Sie die fixierte Netzhaut in PBS, wobei der PBS-Lösung über einen Zeitraum von zwei oder mehr Stunden mindestens sechs Mal erneuert wird. Nach dem Spülen überführen Sie die Netzhaut in eine Platte mit Blockierungslösung, stellen die Platte auf einen Schüttler und lassen sie zwei Stunden lang stehen. Ersetzen Sie bei Raumtemperatur die Blockierungslösung durch die Strep-Evidence-Lösung, stellen Sie die Netzhaut erneut auf den Schüttler und inkubieren Sie sie zwei Tage lang bei vier Grad Celsius.

Nach zwei Tagen die Retina in PBS spülen, wobei sechs Spülgänge à 20 Minuten durchgeführt werden, um die Retina zu montieren. Legen Sie sie mit der Ganglienzellschicht nach oben auf einen Objektträger unter Verwendung von Vector Shield. Mit einem Deckglas abdecken, verrutschen und mit Nagellack versiegeln; die markierte Ganglienzelle kann nun unter einem konfokalen Mikroskop betrachtet werden.

Diese Abbildung zeigt GFP-positive retinale Ganglienzellen, die links im epifluoreszenten Auflicht bei 40-facher Vergrößerung und rechts im DIC-Auflicht dargestellt sind. Bei gesunder Retina und erfolgreicher Präparation sind einzelne Ganglienzellen im DIC bei hoher Vergrößerung sichtbar. Ungesunde Retinas weisen große granulierte Kerne auf und sollten verworfen werden.

Diese Abbildung zeigt die Art der Lichtantwort, die typisch für eine M2-On-stratifizierende intrinsisch lichtempfindliche retinale Ganglienzelle ist. Je nach Art der genetisch markierten retinalen Ganglienzelle in einer gegebenen Präparation unterscheiden sich die Antworteigenschaften. Wenn die synaptische Antwort einer bestimmten Ganglienzelle intakt ist, sollte die Zelle bei Lichtbeginn oder -ende mit Aktionspotentialen reagieren.

Und im Fall einer intrinsisch lichtempfindlichen Ganglienzelle ergibt sich eine anhaltende Depolarisation. Diese Abbildung einer mit Neurobiotin gefüllten Ganglienzelle zeigt die Morphologie einer typischen M1-off-stratifizierenden, intrinsisch lichtempfindlichen retinalen Ganglienzelle. Nach der Ganzzellaufzeichnung ermöglicht die immunhistochemische Färbung eine Korrelation zwischen der dendritischen Morphologie und der elektrophysiologischen Antwort der retinalen Ganglienzelle. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, das Retinalbad zu oxygenieren und das Gewebe schnell zu perfundieren, um die synaptischen Antworten zu erhalten.

Vielen Dank für das Anschauen dieser Demonstration.