Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, lichtevozierte Reaktionen von genetisch markierten Ganglienzellen in der isolierten Netzhaut der Maus aufzuzeichnen. Dazu wird zunächst die Netzhaut vom Mausauge getrennt. Der zweite Schritt des Eingriffs besteht darin, die Netzhaut mit einem Enzym zu behandeln, um den verbleibenden Glaskörper zu entfernen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Ganglienzellseite der Netzhaut mit der Seite nach oben in die Aufnahmekammer zu montieren, die Kammer auf den Mikroskoptisch zu montieren und die genetisch markierten Ganglienzellen zu identifizieren. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, eine Ganzzellaufzeichnung der identifizierten Ganglienzelle zu erhalten und lichtevozierte Reaktionen aufzuzeichnen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die funktionellen Eigenschaften einer definierten Ganglienzelle zeigen, die Netzhaut der Maus einordnen und die Signale definieren, die sie durch Einzelzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen an das Gehirn übermittelt.

Hallo, mein Name ist Tiffany Schmidt und ich bin Doktorandin der Neurowissenschaften im Labor von Dr. Paulo Ka Fuji an der University of Minnesota. Diese Technik ermöglicht die Identifizierung und Aufzeichnung einer definierten, genetisch markierten Ganglienzellpopulation und die anschließende morphologische Analyse. Diese Technik kann helfen, wichtige Fragen im Gesichtsfeld zu beantworten, z. B. wie verschiedene Ganglienzell-Subtypen Schlüsselmerkmale visueller Reize vor der Durchführung der Operation verarbeiten.

Um die Netzhaut zu entfernen, besteht die erste Aufgabe darin, die acht für das Experiment benötigten Lösungen zu mischen. Die Zutaten für alle Lösungen, die in diesem Experiment verwendet werden, sind im Begleittext angegeben. Übertragen Sie 200 Milliliter der extrazellulären Lösung zur Aufbewahrung auf die Netzhaut in ein 250-Milliliter-Becherglas.

Geben Sie die restliche extrazelluläre Lösung in einen Scheidetrichter, um die Schwerkraft während der Aufzeichnung zu überfluten. Beide Lösungen sollten jederzeit mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid gesättigt bleiben. Um die Dendriten während des Experiments sichtbar zu machen, fügen Sie der intrazellulären Lösung einen fluoreszierenden Tracer wie LOR 5 94 hinzu.

Wenn Sie planen, nach der Ganzzellaufzeichnung eine Immunhistochemie durchzuführen, fügen Sie der intrazellulären Lösung 0,3%iges Neurobiotin hinzu. Sobald die notwendigen Lösungen vorbereitet sind, euthanasieren Sie eine Maus durch Kohlendioxid-Erstickung, entkernen Sie den Augapfel, indem Sie vorsichtig eine abgewinkelte Pinzette mit der Nummer zwei hinter das Auge einführen und den Augapfel herausheben. Verwenden Sie eine Augenschere, um die extraokulären Muskeln zu reinigen und den Sehnerv zu durchtrennen.

Legen Sie den Augapfel in eine 35 Millimeter große Petrischale, die mit extrazellulärer Lösung gefüllt ist. Schneiden Sie die Hornhaut mit einer Augenschere ab und ziehen Sie die Linse mit einer Pinzette mit der Nummer fünf heraus. Reißen Sie mit der Zange Nummer fünf die Sklera auf und durchtrennen Sie den verbleibenden Sehnerv an der Stelle, an der sich Netzhaut und Sklera treffen.

Ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig von der Augenmuschel weg, indem Sie die Pinzette in den Raum zwischen Netzhaut und Sklera führen. Um Zeit zu sparen, führen Sie jeden Schritt auf beiden Netzhäuten aus Bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, besteht ein entscheidender Schritt darin, den an der Netzhaut befestigten Glaskörper zu entfernen. Beginnen Sie damit, mit einer Pinzette den durchsichtigen Glaskörper über der Netzhaut zu greifen.

Wenn der Glaskörper erfolgreich entfernt wurde, siehst du eine kleine, klare gallertartige Substanz an der Spitze der Pinzette. Schneiden Sie jede Netzhaut in zwei Hälften, um die Menge an nutzbarem Gewebe zu maximieren und die Montage der Netzhaut in der Aufnahmekammer zu erleichtern. Legen Sie die Netzhäute bei Raumtemperatur in die sauerstoffhaltige extrazelluläre Lösung und minimieren Sie die Lichteinwirkung, indem Sie nur minimales Umgebungslicht, wie z. B. Licht von Computerbildschirmen, zulassen, die Netzhaut bleibt etwa sechs Stunden lang lebensfähig.

Entnehmen Sie nach der Dissektion 500 Mikroliter der extrazellulären Lösung aus der Lösung, in der die zusätzlichen Netzhäute sprudeln. Darin verdünnen. Ein Aliquot der Kollagenase Hyaluronidase Enzymlösung.

Geben Sie die Enzymlösung in eine 35 Millimeter große Petrischale und übertragen Sie eine der präparierten Netzhäute in den Petri. Drehen Sie die Petrischale die ganze Zeit 15 Minuten lang vorsichtig und mischen Sie 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid in der Lösung. Die Enzymlösung entfernt alle verbleibenden Glaskörper und ermöglicht einen leichteren Zugang zur Ganglienzellschicht. Bei Netzhäuten jüngerer Tiere mit weniger Glaskörper oder wenn Nebenwirkungen beobachtet werden, kann die Verdauung auf fünf Minuten verkürzt werden.

Mit einer Transferpipette aus Kunststoff und einer abgeschnittenen Spitze die Netzhaut von dem enzymhaltigen Medium entfernen. Waschen Sie die Netzhaut ausgiebig in extrazellulärer Lösung.

Übertragen Sie die Netzhaut in die Aufnahmekammer. Leiten Sie mit der Photorezeptorschicht nach unten die verbleibende Flüssigkeit mit einer Pipette oder einem Taschentuch ab und rollen Sie die Seiten der Netzhaut aus, um das Gewebe abzuflachen. Achten Sie darauf, nur die Ränder der Netzhaut und nicht die Ganglienzellschicht zu berühren.

Um die Netzhaut zu verankern, legen Sie einen Platinring mit Nylonnetz über die Netzhaut und füllen Sie die Kammer sofort mit extrazellulärer Lösung. Montieren Sie die Aufnahmekammer auf dem Mikroskoptisch und befestigen Sie dann die Röhre für die Schwerkraftperfusion der extrazellulären Lösung, die Vakuum-Saugröhre und das Erdungskabel. Stellen Sie die Schwerkraft so ein, dass sie mit einem Milliliter pro Minute oder schneller tropft.

Wenn die Perfusionsrate zu langsam ist, wird das Gewebe nicht ausreichend mit Sauerstoff versorgt und die synaptische Signalübertragung kann gestört werden. Der nächste Schritt besteht darin, die Elektrode für die Aufzeichnung von Ganzzellpflastern einzurichten. Wählen Sie eine Pipette mit einem Widerstand im Bereich von drei bis fünf Megaohm.

Füllen Sie die Aufzeichnungspipette mit einem aufgetauten Aliquot der intrazellulären Lösung und führen Sie es unter Verwendung von Infrarotbeleuchtung und differentiellem Interferenzkontrast oder DIC-Optik unter einem 10-fach-Objektiv in den Pipettenhalter ein. Visualisieren Sie die Netzhaut und die Aufnahmepipette. Das Infrarotlicht wird verwendet, um die Exposition der Netzhaut gegenüber sichtbarem Licht zu minimieren und die Lichtanpassung zu minimieren, schalten Sie auf ein 40-faches Objektiv um und bringen Sie die Elektrode direkt über dem Gewebe ins Blickfeld.

Die in dieser Studie verwendete Mauslinie exprimiert EGFP in ihren Ganglienzellen, und somit sind die Ganglienzellen unter epi-Fluoreszenz sichtbar. Die Mikroskopie beleuchtet die Netzhaut mit Epi-Fluoreszenz bei 480 Nanometern. Ist die Netzhaut gesund, sollten einzelne Ganglienzellen sichtbar sein.

Ungesunde Netzhäute haben große granulierte Kerne und sollten verworfen werden. Wählen Sie eine der fluoreszierenden Ganglienzellen für die Aufzeichnung aus und markieren Sie die ausgewählte Zelle mit Laborband auf dem Computermonitor. Schalten Sie auf Infrarotoptik um, so dass der ausgewählte Ganglienzellkörper sichtbar ist.

Positionieren Sie die Aufzeichnungselektrode in der Nähe der Zielganglienzelle. Reinigen Sie den Bereich, der die Zelle sofort bedeckt, indem Sie sanften Überdruck auf die Aufnahme ausüben. Der Elektrodendruck wird über eine 12-cm³-Kunststoffspritze angelegt, die mit dem Pipettenhalter und einem Polyethylenschlauch am Nullpunkt des Verstärkers verbunden ist.

Beliebige Spannungsversätze. Platzieren Sie die Elektrode auf der ausgewählten Ganglienzelle, bis ein Grübchen auf der Zelloberfläche erscheint. Wenn sich der Verstärker im Spannungsklemmenmodus befindet, legen Sie einen Testimpuls an und überwachen Sie den durch die Pipette fließenden Strom.

Üben Sie Unterdruck aus, um eine Abdichtung zwischen Elektrode und Zelle zu schaffen. Lassen Sie den Unterdruck ab, wenn sich die Dichtung zu bilden beginnt, und warten Sie, bis der Haltestrom auf eine elektrische Giga-Dichtung zwischen der Zellmembran und der Pipette hinweist. Wenden Sie sanfte Impulse mit negativem Druck an, bis kapazitive Transienten auftreten, die anzeigen, dass der Aufzeichnungsmodus für die gesamte Zelle erreicht wurde, und lassen Sie dann die Druckanwendung los.

Ist der Zugangswiderstand größer als 30 Megaohm, kann dies oft durch zusätzliche sehr sanfte Unterdruckimpulse gemildert werden. Nachdem Sie den Ganzzellmodus erhalten haben, schalten Sie das Infrarotlicht aus und decken Sie das Mikroskop mit einem schwarzen Tuch ab. Lassen Sie die Zelle fünf Minuten lang dunkel adaptieren.

Nach fünf Minuten ist die Vorbereitung bereit für die Aufnahme. Schalten Sie im Strom-Clamp-Modus die Vollfeld-Weißlichtstimulation ein und zeichnen Sie die Reaktion der Ganglienzelle auf. Wenn die Ganglienzelle mehrfach stimuliert werden soll, sollte die Netzhaut zwischen den Stimulationen bei Bedarf dunkel angepasst werden.

Der Lichtreiz kann an dieser Stelle auch modifiziert werden, um gemusterte oder chromatische Reize einzuschließen, um die Reaktionseigenschaften der Ganglienzellen zu beurteilen. Nach der Aufzeichnung wird der fluoreszierende Tracer in der intrazellulären Lösung durch Umschalten zwischen Epi-Fluoreszenz und DIC-Infrarotoptik zu den Dendriten diffundiert sein. Der Tracer kann unter Epi-Fluoreszenz bei 594 Nanometern sichtbar gemacht werden, und Sie können die Dendriten untersuchen, um festzustellen, ob die Ganglienzelle eingeschaltet oder geschichtet ist. Das Neurobiotin, das der intrazellulären Lösung zugesetzt wurde, ist in die Ganglienzelle diffundiert, so dass der nächste Schritt darin besteht, die Netzhaut für die Immunhistochemie vorzubereiten.

Ziehen Sie die Pipette vorsichtig zurück, um eine Störung der Zellmembran zu minimieren. Beachten Sie, dass, wenn Sie nur eine retinale Ganglienzelle pro Präparation aufnehmen und füllen, Sie dann spezifische Korrelationen zwischen der aufgenommenen Ganglienzelle und ihrer detaillierten Morphologie herstellen können. Legen Sie anschließend die Netzhaut in die Paraform-Aldehydlösung und fixieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius, nachdem Sie sie über Nacht fixiert haben.

Spülen Sie die fixierte Netzhaut mit PBS und wechseln Sie die PBS-Lösung mindestens sechs Mal im Laufe von zwei oder mehr Stunden. Übertragen Sie die Netzhaut nach dem Spülen auf eine Platte mit Blockierungslösung, legen Sie die Platte auf einen Schüttler und lassen Sie sie zwei Stunden lang einwirken. Ersetzen Sie bei Raumtemperatur die Blockierungslösung durch die Streptokokken-Evidenzlösung, legen Sie die Netzhaut wieder auf den Shaker und lassen Sie sie zwei Tage lang bei vier Grad Celsius inkubieren.

Spülen Sie die Netzhaut nach zwei Tagen in PBS mit sechs Spülungen von jeweils 20 Minuten, um die Netzhaut zu befestigen. Platzieren Sie es mit der Ganglienzellseite nach oben auf einem Objektträger mit Vektorschild. Abdeckung des Montagemediums mit einer Glasabdeckung, Gleiten und Versiegeln mit Nagellack, die markierte Ganglienzelle kann nun unter einem konfokalen Mikroskop betrachtet werden.

Diese Abbildung zeigt GFP-positive retinale Ganglienzellen, die unter epi-fluoreszierender Beleuchtung bei 40-facher Vergrößerung auf der linken Seite und unter DIC-Beleuchtung auf der rechten Seite sichtbar gemacht wurden. Ist die Netzhaut in Ordnung und die Dissektion war erfolgreich, sind einzelne Ganglienzellen unter DIC bei hoher Vergrößerung sichtbar. Ungesunde Netzhäute haben große granulierte Kerne und sollten verworfen werden.

Diese Abbildung zeigt die Art der Lichtreaktion, die typisch für eine M zwei ist, bei der Stratifizierung von intrinsisch photosen empfindlichen retinalen Ganglienzellen. Abhängig von der Art der retinalen Ganglienzelle, die in einem bestimmten Präparat genetisch markiert ist, unterscheiden sich die Reaktionseigenschaften. Wenn die synaptische Reaktion einer gegebenen Ganglienzelle intakt ist, dann sollte die Zelle bei Lichtbeginn reagieren oder mit Aktionspotentialen versetzt werden.

Und im Falle einer intrinsisch lichtempfindlichen Ganglienzelle, einer anhaltenden Depolarisation, zeigt diese Abbildung einer mit Neurobiotin gefüllten Ganglienzelle die Morphologie einer typischen M1-off stratifizierenden, intrinsisch lichtempfindlichen retinalen Ganglienzelle. Die Immunhistochemie nach der Ganzzellaufzeichnung ermöglicht eine Korrelation der dendritischen Morphologie und der elektrophysiologischen Reaktion der retinalen Ganglienzelle. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Netzhaut gut mit Sauerstoff zu versorgen und das Gewebe schnell zu perfundieren, um die synaptischen Reaktionen zu erhalten.

Vielen Dank, dass Sie sich diese Demonstration angesehen haben.