Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkungen von Änderungen im Verhältnis und in der relativen zeitlichen Abfolge von exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Eingaben auf die Aktionspotentialaktivität von Neuronen mithilfe von Retinalganglienzellen als Modellneuronen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem der Zellkörper einer Ganglienzelle in einer retinalen Vollpräparation angezapft wird, wobei eine Glaspipette verwendet wird, die mit einer intrazellulären Lösung gefüllt ist, die der physiologischen ionischen Zusammensetzung entspricht, sowie mit Lucifer Yellow zur morphologischen Identifizierung des Zelltyps. In einem zweiten Schritt werden mithilfe des dynamischen Klemmverfahrens eine Reihe von exzitatorischen und inhibitorischen Leitfähigkeitswellenformen in den Zellkörper injiziert, wodurch eine Änderung des Membranpotentials als Antwort hervorgerufen wird. Anschließend werden verschiedene Leitfähigkeitswellenformen, die aus physiologischen Experimenten unter Kontrollbedingungen oder in Gegenwart von pharmakologischen Substanzen gewonnen wurden, in den Zellkörper injiziert, um die entsprechenden neuronalen Antworten zu erhalten.

Die Ergebnisse zeigen die Auswirkungen von Änderungen im Verhältnis von Erregung und Hemmung auf die Aktionspotentialaktivität retinaler Ganglienzellen, basierend auf der Injektion von Strömen, die aus erregenden und hemmenden Leitfähigkeiten über dynamische Klemmaufnahmen bestehen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Stromklemme oder Spannungsklemme liegt darin, dass sie ein interaktives Werkzeug bereitstellt, mit dem das Verhältnis und die relative zeitliche Abfolge erregender und hemmender synaptischer Leitfähigkeiten in Neuronen injiziert werden können, um deren Einfluss auf zelluläre Antworten zu untersuchen. Diese Methodik kann Einblicke in die Funktion retinaler Schaltkreise sowie anderer neuronaler Netzwerke im zentralen Nervensystem liefern.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das Reperfusionssystem in der elektrophysiologischen Versuchsanordnung mit 250 Milliliter carboxygeniertem AIMs-Medium einrichten. Anschließend tragen Sie eine dünne Schicht Vakuumfett gleichmäßig auf den Boden der Perfusionskammer auf. Versiegeln Sie diese mit einem Deckglas und stellen Sie sicher, dass die Abdichtung luftdicht ist.

Tragen Sie dann eine kleine Menge Fett auf die oberen und unteren Enden der Kammer auf. Das Fett hält das Gitter an Ort und Stelle und verhindert, dass es zu stark auf die Netzhaut drückt. Befestigen Sie nun die Kammer auf der Plattform und richten Sie anschließend beide Öffnungen aus.

Töten Sie ein Tier durch Halsbruch, nachdem es mit Isofluran anästhesiert wurde. Entfernen Sie die Augen schnell mit einer kleinen gebogenen Schere. Spülen Sie sie gründlich mit carbogen-sauerstoffhaltigem extrazellulärem Fluid in einem kleinen Becher aus und legen Sie sie in eine Petrischale, die mit carbogen-sauerstoffhaltigem extrazellulärem Fluid gefüllt ist.

Unter dem Stereomikroskop einen Einstichkanal mit einer 19-Gauge-Nadel in der Hornhaut etwa zwei Millimeter vom Rand entfernt an beiden Augen anlegen. Dieser wichtige Schritt sollte schnell durchgeführt werden, um eine Sauerstoffversorgung beider Augen zu ermöglichen. Danach die Hornhaut an einem Auge mit einer kleinen Iris-Schere entfernen, indem man parallel zum Rand schneidet.

Entfernen Sie anschließend die Iris und die Linse mit einer feinen Pinzette und wiederholen Sie die Schritte für das andere Auge. Überführen Sie eine Augenschale in ein Becherglas, das die mit Sauerstoff angereicherte, carboxylierte extrazelluläre Lösung enthält. Schneiden Sie mit der Skalpellklinge vorsichtig eine Augenschale entzwei und lösen Sie die Netzhaut mit einer stumpfen Präpariernadel oder durch vorsichtiges Abziehen von dem Pigmentepithel ab.

Dann halten Sie mit einer feinen Pinzette die Kante des abgelösten Netzhautgewebes nahe an die Aura Serta und greifen die Aura serta mit einer weiteren feinen Pinzette an. Ziehen Sie sie in Richtung Zentrum der Netzhaut. Dieser Vorgang ist empfindlich und kann mehrere Versuche erfordern.

Wenn der Eingriff erfolgreich ist, werden der Ziliarkörper und der Glaskörper entfernt, und die Krümmung der Netzhaut wird verringert. Anschließend schneiden Sie die Ränder zurecht und überführen die Netzhaut in die Perfusionskammer, wobei die Ganglienzellen nach oben zeigen. Halten Sie das Gewebe an Ort und Stelle, indem Sie das Gitter auf die Fettkügelchen legen.

Das verbleibende Gewebe mit dem anderen Augenbecher in der mit Carboxygen gesättigten extrazellulären Lösung für die spätere Verwendung aufbewahren und die Ableitungskammer unter einem aufrechten Mikroskop platzieren. Unmittelbar die kontinuierliche Perfusionsströmung der Retina mit carboxygenierter extrazellulärer Lösung mit einer Geschwindigkeit von drei bis fünf Millilitern pro Minute bei 35,5 Grad Celsius einstellen und sicherstellen, dass die Erdungselektrode korrekt positioniert ist. Nun die Lichtquelle des Mikroskops einschalten und mit dem 40x-Objektiv auf die Zellkörper der Ganglienzellen fokussieren.

Suchen Sie die Mitte der Lochhalterung für die Ableitung. Befestigen Sie in diesem Schritt eine Glaspipette mit einem Widerstand von fünf bis acht Megaohm in ihrem Halter und bewegen Sie sie mit einem Mikromanipulator unter dem Mikroskop unter Verwendung eines 40x-Objektivs. Senken Sie die Pipette langsam ab, bis sie eine kleine Delle auf der Oberfläche der inneren Begrenzungsmembran erzeugt.

Bewegen Sie die Pipette vorsichtig nach vorne, bis sie eine kleine Menge Gewebe erfasst, und heben oder verschieben Sie sie dann nach oben und/oder seitlich, um ein kleines Loch zu reißen, das die Zellkörper der Ganglienzellen freilegt. Füllen Sie nun eine saubere Pipette mit acht bis zehn Mikrolitern einer auf Kalium basierenden intrazellulären Lösung mit Lucifer Yellow. Führen Sie sie in den Halter ein, der an der Kopfstufe des Verstärkers befestigt ist, und stellen Sie sicher, dass die chlorierte Silberchlorid-Elektrode untergetaucht ist.

Wählen Sie eine Zelle mit einem großen Zellkörper aus. Senken Sie die Pipettenspitze langsam unter positivem Druck ab, um eine kleine Delle auf der Membranoberfläche zu erzeugen. Stoppen Sie dann und lassen Sie den Druck ab, um eine Giga-Dichtung zu erhalten.

Wenn ein Giga-Seal erreicht ist, vorsichtig negativen Druck anwenden, um die Membran zu durchbrechen und eine Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration zu erzielen. Dieser Schritt ist empfindlich. Wird zu viel negativer Druck ausgeübt, wird die Verbindung undicht.

Falls zu wenig vorhanden ist, bleibt die Membran intakt. Mit der Zeit füllt Lucifer Yellow die Zelle und ermöglicht bei Stabilität die Visualisierung der Zellmorphologie. Diese Versuchsanordnung sollte 30 Minuten oder länger halten.

Führen Sie nun einen Strom-Spannungs-Test von minus 75 Millivolt bis plus 35 Millivolt in 10-Millivolt-Schritten mit Patch Master durch und fahren Sie mit den nachfolgenden Tests fort, jedoch nur, wenn ein Natriumstrom größer als ein Nanoampere vorhanden ist. Öffnen Sie anschließend LabVIEW und führen Sie das benutzerdefinierte Neuro-Acuma-Programm aus.

Stellen Sie die Wiederholungszahl auf acht ein. Danach stellen Sie die Umkehrpotenziale der exzitatorischen und inhibitorischen Leitfähigkeiten jeweils auf null und minus 75 Millivolt ein. Wählen Sie ein passendes Paar aus exzitatorischer und inhibitorischer Leitfähigkeit zur Prüfung aus, und die grüne Spur der exzitatorischen Leitfähigkeit sowie die rote Spur der inhibitorischen Leitfähigkeit erscheinen im unteren Feld.

Danach kehren Sie zu Patch Master zurück und wählen den Strom-Klemm-Modus aus. Schalten Sie den Verstärker in Neuro Acuma unmittelbar in den Strom-Klemm-Modus. Drücken Sie die Aufnahmetaste.

Die zelluläre Antwort mit aphasischem Burst von Aktionspotentialen erscheint im oberen Feld. Anschließend injizieren Sie Strom in die Zelle mit geringer Leitfähigkeit. Zunächst, wenn eine geringe oder keine Reaktion beobachtet wird, erhöhen Sie den Strom in kleinen Schritten, bis eine starke Reaktion hervorgerufen wird.

Übermäßige Strominjektion kann die Zelle töten. Sobald die Tests abgeschlossen sind, wählen Sie ein neues Paar von Leitfähigkeitswellenformen aus und wiederholen Sie die Verfahren für alle Paare physiologischer und künstlicher Leitfähigkeiten.

Nach der Aufnahme ziehen Sie die Pipette vorsichtig zurück, sodass der Zellkörper intakt bleibt. Danach fixieren Sie das Gewebe unverzüglich 30 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd, gefolgt von drei Waschungen mit 0,1 molarer Phosphatpufferlösung je 10 Minuten, kühlen Sie es anschließend und führen Sie die Antikörperfärbung am nächsten Tag oder innerhalb einer Woche bei Bedarf durch. Färben Sie die mit Lucifer Yellow gefüllten Ganglienzellen bei Raumtemperatur mit einem primären Kaninchen-Antikörper gegen Lucifer Yellow in einer Verdünnung von 1 zu 10.000 über fünf Tage.

Am sechsten Tag inkubieren Sie über Nacht mit der sekundären Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörperlösung in einer Verdünnung von 1:500. Anschließend montieren Sie die Retina in einem feuchten Präparat mit einem fluoreszenzschonenden Medium. Bringen Sie einen Deckgläser auf und verschließen Sie mit Nagellack. Erstellen Sie konfokale Aufnahmen der Zellmorphologie mit einem Leica SPECT two-Konfokalmikroskop.

Hier sind die Reaktionen einer Ganglienzelle auf die Injektion von exzitatorischen und inhibitorischen Leitfähigkeitswellenformen. Die aus den Kontrollexperimenten erhaltenen Wellenformen sind jeweils grün und rot markiert. Und hier sind die Reaktionen auf die Injektion von Leitfähigkeitswellenformen, die nach der Badapplikation von Tetrodotoxin aufgezeichnet wurden. Hier sind die Reaktionen einer anderen Ganglienzelle auf verschiedene Paare von Leitfähigkeitswellenformen.

Die Verhältnisse zwischen der erregenden Leitfähigkeit und der hemmenden Leitfähigkeit wurden von eins zu null auf eins zu zwei geändert. Mit zunehmendem Hemmungsgrad nahm die Zellantwort ab, und hier sind die Antworten einer Ganglienzelle auf das gleiche Maß an Erregung, bei der der Beginn der Hemmung variiert wurde. Delta T stellt die Zeitdifferenz zwischen dem Beginn der hemmenden und der erregenden Leitfähigkeiten dar.

Wenn die Hemmungsverzögerung abnahm, wurde die Zellantwort schwächer. Dieses Verfahren ist eine leistungsstarke Technik, die dabei hilft, die Wechselwirkungen zwischen exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Eingängen aufzudecken, die die neuronale Ausgabe erzeugen.