Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Auswirkungen von Änderungen des Verhältnisses und des relativen Timings von exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Inputs auf die Spike-Aktivität von Neuronen unter Verwendung von retinalen Ganglienzellen als Modellneuronen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem der Zellkörper einer Ganglienzelle in eine ganze Mount-Netzhaut geflickt wird, unter Verwendung einer Glaspipette, die mit einer intrazellulären Lösung gefüllt ist, die der physiologischen Ionenzusammensetzung ähnelt, und Luzifergelb, um den Zelltyp morphologisch zu identifizieren, wird in einem zweiten Schritt unter Verwendung einer dynamischen Klemme eine Reihe von exzitatorischen und inhibitorischen Leitfähigkeitswellenformen in den Zellkörper injiziert, die als Reaktion eine Änderung des Membranpotentials hervorrufen. Als nächstes werden verschiedene Leitwertwellenformen, die aus physiologischen Experimenten unter Kontrollbedingungen oder in Gegenwart von Medikamenten gewonnen wurden, in den Zellkörper injiziert, um die entsprechenden neuronalen Reaktionen zu erhalten.

Die Ergebnisse zeigen die Auswirkungen von Änderungen des Verhältnisses von Erregung und Hemmung auf die Spike-Aktivität von retinalen Ganglienzellen basierend auf der Injektion von Strömen, die aus exzitatorischen und inhibitorischen Leitwerten bestehen, mittels dynamischer Clamp-Aufzeichnungen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Stromzange oder Spannungsklemme besteht darin, dass sie ein interaktives Werkzeug bietet, mit dem das Verhältnis und das relative Timing von exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Leitwerten in Neuronen injiziert werden können, um den Einfluss auf zelluläre Reaktionen zu untersuchen. Diese Methodik kann Einblicke in die Funktion von retinalen Schaltkreisen sowie von anderen neuronalen Netzwerken im zentralen Nervensystem geben.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das Reperfusionssystem mit 250 Millilitern des mit Carboxysauerstoff angereicherten AIMS-Mediums im elektrophysiologischen Aufbau einrichten. Als nächstes schmieren Sie eine dünne Schicht Vakuumfett gleichmäßig auf den Boden der Perfusionskammer. Verschließen Sie es mit einem Deckglas und stellen Sie sicher, dass es luftdicht ist.

Geben Sie dann eine kleine Menge Fett auf das obere und untere Ende der Kammer. Das Fett hält das Gitter an Ort und Stelle und verhindert, dass es zu stark auf die Netzhaut drückt. Fixiere nun die Kammer auf der Plattform und richte danach beide Öffnungen aus.

Opfern Sie ein Tier durch Gebärmutterhalsluxation, nachdem es mit Isof-Fluor betäubt wurde. Entferne schnell die Augen mit einer kleinen gebogenen Schere. Waschen Sie sie gründlich mit sauerstoffreicher extrazellulärer Flüssigkeit in einem kleinen Becherglas und legen Sie sie in eine Petrischale, die mit sauerstoffreicher extrazellulärer Flüssigkeit gefüllt ist.

Machen Sie unter dem Präpariermikroskop mit einer 19-Gauge-Nadel ein Einstichloch in die Hornhaut, etwa zwei Millimeter vom Rand entfernt, an beiden Augen. Dieser wichtige Schritt sollte schnell erfolgen, um die Sauerstoffversorgung beider Zügel zu ermöglichen. Entfernen Sie danach eine Hornhaut mit einer kleinen Irisschere, indem Sie parallel zur Kante schneiden.

Entfernen Sie dann die Iris und die Linse mit einer feinen Pinzette und wiederholen Sie die Verfahren für das andere Auge. Eine Augenmuschel in ein Becherglas geben, das die sauerstoffhaltige extrazelluläre Lösung der Carbox enthält. Schneiden Sie mit der Skalpellklinge eine Augenmuschel in zwei Hälften, trennen Sie die Netzhaut vorsichtig mit einer stumpfen Präpariersonde vom Pigmentepithel oder ziehen Sie sie vorsichtig ab.

Halten Sie dann mit einer feinen Pinzette den Rand des abgelösten Netzhautgewebes nahe an die Aura Serta und greifen Sie mit einer weiteren feinen Pinzette nach der Aura Serta. Ziehe es in Richtung der Mitte der Netzhaut. Dies ist ein heikler Prozess und kann einige Versuche erfordern.

Bei erfolgreichem Erfolg werden Aura, Serta, Ziliarkörper und Glaskörper entfernt und die Krümmung der Netzhaut reduziert. Schneiden Sie anschließend die Ränder ab und übertragen Sie dann die Netzhaut mit den Ganglienzellen nach oben in die Perfusionskammer. Halten Sie das Taschentuch an Ort und Stelle, indem Sie das Gitter auf die Fettkugeln legen.

Bewahren Sie das restliche Gewebe mit der anderen Augenmuschel in der carbox sauerstoffhaltigen extrazellulären Lösung für die spätere Verwendung auf und montieren Sie die Aufnahmekammer unter einem aufrechten Mikroskop. Stellen Sie sofort sicher, dass die Erdungselektrode an Ort und Stelle ist. Stellen Sie sicher, dass die Erdungselektrode an Ort und Stelle ist. Stellen Sie sicher, dass die Erdungselektrode an Ort und Stelle ist. Schalten Sie nun die Lichtquelle des Mikroskops ein und richten Sie den Fokus durch das 40-fache Objektiv auf die Zellkörper der Ganglienzellen.

Suchen Sie die Mitte der Lochhalterung für die Aufnahme. Befestigen Sie in diesem Schritt eine Glaspipette von fünf bis acht Megaohm in ihrer Halterung und bewegen Sie sie unter dem Mikroskop mit einem Mikrom-Manipulator unter einem 40-fach-Objektiv. Senken Sie die Pipette langsam ab, bis sie ein kleines Grübchen auf der Oberfläche der inneren Begrenzungsmembran bildet.

Schieben Sie die Pipette vorsichtig nach vorne, bis sie eine kleine Menge Gewebe erfasst, und bewegen Sie sie dann nach oben und/oder zur Seite, um ein kleines Loch zu reißen, um die Zellkörper der Ganglienzellen freizulegen. Füllen Sie nun eine saubere Pipette mit acht bis 10 Mikrolitern, einer intrazellulären Lösung auf Kaliumbasis mit Luzifergelb. Setzen Sie es in die Halterung ein, die an der Kopfstufe des Verstärkers befestigt ist, und stellen Sie sicher, dass die Elektrode mit chloriertem Silberchlorid eingetaucht ist.

Wählen Sie eine Zelle mit einem großen Zellenkörper aus. Senken Sie die Pipettenspitze langsam mit positivem Druck ab, um ein kleines Grübchen auf der Oberfläche der Membran zu erzeugen. Halten Sie dann an und lassen Sie den Druck ab, um eine Giga-Dichtung zu erhalten.

Sobald eine Giga-Versiegelung erreicht ist, üben Sie vorsichtig Unterdruck aus, um die Membran zu brechen und eine Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration zu erreichen. Dieses Verfahren ist ein heikler Schritt. Wird zu viel Unterdruck angelegt, wird die Verbindung undicht.

Ist es zu wenig, bleibt die Membran intakt. Im Laufe der Zeit füllt Luzifergelb die Zelle und ermöglicht die Visualisierung der Morphologie der Zelle, wenn sie stabil ist. Diese Einrichtung sollte 30 Minuten oder länger dauern.

Führen Sie nun alle 10 Millivolt einen Stromspannungstest von minus 75 Millivolt auf positive 35 Millivolt mit dem Patch-Master durch und fahren Sie mit späteren Tests fort. Nur wenn ein Natriumstrom größer als ein Nanoampere anliegt. Öffnen Sie als Nächstes die Lab-Ansicht und führen Sie das benutzerdefinierte Neuro Acuma-Programm aus.

Stellen Sie die Wiederholungszahl auf acht ein. Stellen Sie dann die Umkehrpotentiale der exzitatorischen und hemmenden Leitwerte auf null bzw. minus 75 Millivolt ein. Wählen Sie ein passendes Paar von exzitatorischen und inhibitorischen Leitwerten für den Test aus, und die grüne exzitatorische Leitfähigkeitsspur und die rote inhibitorische Leitwertspur werden im unteren Bereich angezeigt.

Gehen Sie danach zurück zum Patch-Master und wählen Sie den aktuellen Clamp-Modus. Schalten Sie den Verstärker sofort in den Stromzangenmodus in neuro acuma. Drücken Sie die Aufnahmetaste.

Die zelluläre Reaktion mit einem aphasischen Ausbruch von Aktionspotentialen wird auf dem oberen Feld angezeigt. Dann injizieren Sie Strom mit niedrigem Leitwert in die Zelle. Erstens, wenn eine geringe oder keine Reaktion beobachtet wird, erhöhen Sie den Strom in kleinen Schritten, bis er eine starke Reaktion erzeugt.

Eine übermäßige Strominjektion kann die Zelle töten. Sobald die Tests abgeschlossen sind. Wählen Sie ein neues Paar von Leitwertwellenformen aus und wiederholen Sie die Verfahren für alle Paare physiologischer und künstlicher Leitfähigkeiten.

Ziehen Sie die Pipette nach der Aufnahme vorsichtig zurück, damit der Zellkörper intakt bleibt. Danach fixieren Sie sofort das Gewebe und 4% para-Formaldehyd für 30 Minuten, gefolgt von drei 10-minütigen Waschgängen mit 0,1 molaren Phosphatpuffern, kühlen Sie es und führen Sie am nächsten Tag oder innerhalb einer Woche, wenn es fertig ist, eine Antikörperfärbung durch. Färben Sie auf Luzifergelb gefüllte Ganglienzellen bei Raumtemperatur mit einem primären Anti-Luzifer-Gelbkaninchen-IgG in einer Verdünnung von eins bis 10.000 für fünf Tage.

Dann, am sechsten Tag, über Nacht mit dem sekundären Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, fügen Sie eine Verdünnung von eins bis 500 hinzu Am Ende die Netzhaut in fluoreszierenden Konservierungsmedien nass montieren. Deckglas aufsetzen und mit Nagellack versiegeln. Nehmen Sie konfokale Bilder der Zellmorphologie mit einem Leica SPECT Zwei-Konfokalmikroskop auf.

Hier sind die Reaktionen einer Ganglienzelle auf die Injektion von exzitatorischen und inhibitorischen Leitfähigkeitswellenformen, die aus den Kontrollexperimenten erhalten wurden, die in grün bzw. rot dargestellt sind. Und hier sind die Reaktionen auf die Injektion von Leitwertwellenformen, die nach der Badanwendung von Tetrodatoxin aufgezeichnet wurden. Hier sind die Reaktionen einer anderen Ganglienzelle auf verschiedene Paare von Leitfähigkeitswellenformarmen.

Die Verhältnisse zwischen dem exzitatorischen Leitwert und dem inhibitorischen Leitwert wurden von eins auf null auf eins auf zwei verändert. Mit zunehmendem Grad der Hemmung nahm die Reaktion der Zelle ab, und hier sind die Reaktionen einer Ganglienzelle auf das gleiche Erregungsniveau, bei dem der Beginn der Hemmung variiert wurde. Delta T stellt die Zeitdifferenz zwischen dem Einsetzen von inhibitorischen und exzitatorischen Leitwerten dar.

Als die Verzögerung der Hemmung abnahm, wurde die Reaktion der Zelle schwächer. Dieses Verfahren ist eine leistungsfähige Technik, die hilft, die Wechselwirkungen zwischen exci three und inhibitorischem Synap-Input aufzudecken, der neuronalen Output erzeugt.