Name: Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Lernen Sie die dynamische Clamp-Technik zur Untersuchung synaptischer Eingänge in retinalen Ganglienzellen der Maus. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle erregender und hemmender Leitfähigkeiten.

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Diese Arbeit wird durch das Australian Research Council (ARC DP0988227) und der Biomedical Science Research Initiative Zuschuss der Disziplin der biomedizinischen Wissenschaft, The University of Sydney unterstützt. Die Ausrüstung Patch-Clamp-Verstärker EPC 8 wurde von der Startup Fund aus der Disziplin der biomedizinischen Wissenschaft, The University of Sydney finanziert. Die Ausrüstung InstruTECH LIA 8 +8 Datenerfassungssystem wurde mit den Mitteln aus Rebecca L. Cooper Foundation und Startup Fund aus der Disziplin der biomedizinischen Wissenschaft, The University of Sydney gekauft. Wir möchten den anonymen Gutachtern für ihre aufschlussreichen Anregungen und Kommentare danken.

1. Allgemeine Einrichten und Tissue Vorbereitung <ol><li> Halten Sie die Maus in der Dunkelheit für 30 min (Zweck hat, ihren Stress zu reduzieren). Während des Wartens, bereiten 1 L von extrazellulären Lösung. Zunächst löst 1,9 g Natriumhydrogencarbonat in einem halben Liter Milli-Q-Wasser. Ihr pH-Wert wird bei 7,4 durch Durchblasen mit 95% O 2 und 5% CO 2 gehalten. Fünf Minuten später auflösen 8,8 g Ames Medium in 100 ml Milli-Q Wasser, fügen Sie der Natriumhydrogencarbonat-Lösung, oben bis zu 1 L mit Milli-Q-Wasser und gut mischen. Diese Lösung wird für den Rest des Experiments carboxygenated. </li><li> Nehmen Sie 250 ml des carboxygenated Ames Medium und stellen Sie die Flüssigkeit Reperfusion System in der elektrophysiologischen Set-up. Halten Sie die Lösung carboxygenated. </li><li> Einheitlich Abstrich eine dünne Schicht Vakuumfett auf der Unterseite des Perfusionskammer. Seal es mit einem Deckglas und sicherzustellen, dass es luftdicht. Nehmen Sie eine kleine Menge Fett (~ 2 mm im Durchmesser) und platzieren Sie es auf der Oberseite undunteren Enden der Kammer. Diese Kugeln werden das Raster (Platin-Rahmen mit Zahnseide besaitet) in Position zu halten und verhindern, dass es zu hart drücken auf der Netzhaut. Fix die Kammer auf die Plattform und richten die beiden Öffnungen. </li><li> Das Tier ist mit Isofluran betäubt zuerst für 2 min, und dann durch Genickbruch getötet. Schnelles Entfernen Augen mit einer kleinen Schere (Schaufeln), gründlich mit carboxygenated extrazellulären Flüssigkeit in ein kleines Becherglas, und legen Sie dann in einer Petrischale mit carboxygenated extrazellulären Flüssigkeit gefüllt. </li><li> Unter dem Binokular, stellen ein Einführloch in der Hornhaut (~ 2 mm von der Kante) mit einem 19-Gauge-Nadel. Wiederholen Sie für das andere Auge. Dieser wichtige Schritt sollte schnell sein, um Sauerstoffversorgung sowohl retinae ermöglichen. Entfernen Sie eine Hornhaut mit einem kleinen Paar Iris Schere durch Schneiden parallel zu dessen Rand. Dann entfernen Sie den Iris und Linse mit einer feinen Pinzette. Wiederholen Sie für das andere Auge. Übertragen Sie ein Auge cup in ein Becherglas mitcarboxygenated extrazellulären Lösung. </li><li> Mit einem Skalpell, schnitt ein Auge Tasse in die Hälfte, in der Lage sein, um die whole-mount glätten und zu zwei Ganzkörper-Aufnahmen pro Netzhaut erhalten. Sorgfältig trennen die Netzhaut vom Pigmentepithel mit einem stumpfen Sezieren Sonde oder indem Sie es vorsichtig aus. Einmal gelöst, ist die Netzhaut ziemlich transparent. Beachten Sie die konvexe Oberfläche ist die Photorezeptoren Seite. Die konkave Oberfläche der Ganglienzellen Seite und es können sich aufgrund des Vorhandenseins von klebrigen Glaskörper haften. </li><li> Mit einer feinen Pinzette, halten Sie den Rand der abgelösten Netzhaut Gewebe in der Nähe der Ora serrata und greifen die ora serrata mit einem anderen Paar von feinen Pinzette, ziehen Sie sie in Richtung der Mitte der Netzhaut. Dies ist ein schwieriger Prozess und kann ein paar Versuche dauern. Wenn dies gelingt, sind ora serrata, Ziliarkörper und Glaskörper durch dieses Verfahren entfernt, und die Krümmung der Netzhaut verringert wird (dh flacher). </li><li> Schneiden Sie die Kanten, und dann übertragen sie auf die Pro-Fusion Kammer mit Ganglienzellen nach oben. Halten Sie das Gewebe an Ort und Stelle, indem das Gitter auf den Fett-Bälle. Legen Sie das verbleibende Gewebe mit dem anderen Auge Tasse für die spätere Verwendung. Ähnliche Verfahren zur retinalen Dissektion in Middleton und Protti 16 und Pottek et al. 17. </li><li> Montieren Sie die Aufnahme Kammer unter einem aufrechten Mikroskop. Unmittelbar Einrichten der kontinuierliche Perfusion der Netzhaut mit carboxygenated extrazellulären Lösung (35,5 ° C) bei einer Geschwindigkeit von 3 - 5 ml / min. Stellen Sie sicher, dass die Masse-Elektrode ist an Ort und Stelle. </li><li> An dem Mikroskop ist eine digitale Kamera ermöglicht die Visualisierung des Gewebes. Das ganze Set up sitzt über einem Luft-Tabelle (Stoßdämpfung) und innerhalb eines Faradayschen Käfigs (Blöcke externe statische und nicht-statische elektrische Felder). </li><li> Schalten Sie die Lichtquelle (Infrarot,&gt; 850 nm) und einem 40X-Objektiv, bringen ihren Fokus auf die Zellkörper der Ganglienzellen. Finden Sie den zentralen Bereich der whole-mount für recording. </li><li> Auftauen eine gefrorene Flasche K + basierte intrazellulären Lösung (300 ul, pH = 7,4), die (in mM) K-Gluconat: 140, HEPES Säure: 10, MgCl 2: 4.6, ATP-Na +: 4, GTP-Na + : 0,4 und EGTA: 10. Alle Reagenzien von Sigma-Aldrich. </li></ol> 2. Patching Zellkörper der retinalen Ganglienzellen <ol><li> Erstes Feuer polieren die Enden der Kapillare Borosilikatglas Glasröhren, dann ziehen Sie sie mit einem Glasmikroelektrode Abzieher mit zwei Heizstufen (Widerstand: 5 - 8 MQ). </li><li> In 3 ul Lucifer Yellow (Endkonzentration 0,2%) auf die intrazelluläre Lösung, gut mischen und zentrifugieren es. Als nächstes übertragen Sie die oberen 85% der Lösung in eine 1 ml Spritze, verbinden Sie es mit einem 0,22 um f ilter Einheit, dann zu einem 30 G wiederverwendbar Injektionsnadel. Kühlen. </li><li> Befestigen Sie die Glaspipette ähnlicher Größe wie die Spitze für Aufnahmen verwendet, in seiner Halterung und verschieben Sie sie unter dem Mikroskop mit einem micromanipulator. Unter einem 40X-Objektiv, langsam wieder die Pipette, bis er eine kleine Grübchen auf der Oberfläche der inneren Grenzmembran macht. Vorsichtig voran die Pipette nach vorne, bis es eine kleine Menge an Gewebe fängt, und bewegen Sie ihn dann nach oben und / oder seitlich ein kleines Loch, um die Zellkörper der Ganglienzellen aussetzen reißen. Je kleiner das Loch, desto höher ist der Grad der Integrität der Netzhaut Netzwerk aufrechterhalten wird. Falls gewünscht, Sulforhodamin 101 (SR101; 0,5-1 uM) kann in das extrazelluläre Medium zu beschädigten Nervenzellen durch Fluoreszenzmikroskopie 15 Bezeichnung hinzugefügt werden. </li><li> Füllen Sie eine saubere Pipette mit 8 - 10 ul der intrazellulären Lösung. Legen Sie es in die Halterung an der Verstärker-Kopf Bühne und stellen Sie sicher, das chlorierte Silberchloridelektrode eingetaucht ist. Verwerfen, wenn Schmutz und / oder Luftblasen vorhanden ist / sind. </li><li> Schalten Sie alle Geräte. Wir verwendeten einen EPC-8 Patch-Clamp-Verstärker von PatchMaster gesteuert Ganzzellableitungen in Voltage-Clamp-con erreichenFiguration. Beachten Sie, dass andere Verstärker, die Stromzange Aufnahmen erlauben im schnellen Modus können ebenfalls verwendet werden. Übernehmen und pflegen Überdruck in der Pipette Lösung. Markieren Sie eine Zelle mit einer großen Zellkörper so wahrscheinlich ist es ein Ganglienzellen anstatt einer verschobenen Amakrinzell oder Gliazellen. Langsam senken die Pipettenspitze so machen es ist ein kleines Grübchen auf der Oberfläche der Membran, zu stoppen und den Druck. Unmittelbar senken halten Potenzial - 60 mV. Sobald ein Giga (GOhm) zwischen ihnen erreicht wird, sanft zu saugen, um die Membran zu brechen, um eine Whole-Cell-Patch-Clamp-Konfiguration zu erzielen. Dieses Verfahren ist eine feine Schritt, wenn zu viel Unterdruck angelegt wird, wird die Verbindung undicht wird, wenn zu wenig, bleibt die Membran intakt. </li><li> Im Laufe der Zeit wird Lucifer Yellow füllen die Zelle, wodurch die Visualisierung der Zelle Morphologie. Wenn stabil, sollte dieses Set-up dauern 30 min oder mehr. </li></ol> 3. Aufnahmen von Ganglienzellen Mit Dynamitec Clamp <ol><li> Zunächst wird eine Strom-Spannungs-Test (von - 75 bis + 35 mV alle 10 mV) wird unter Verwendung PatchMaster. Gehen Sie zu einem späteren Zeitpunkt Tests nur dann, wenn eine große Na + Strom (&gt; 1 nA) vorhanden ist. Beachten Sie, dass in den seltenen Fällen, wo ein verschobener Amakrinzell gepatcht wird, in diesem Fall wird nicht mit Zügen der Aktionspotentiale nachfolgende Strominjektionen reagieren. </li><li> Offene LabVIEW und führen Sie die benutzerdefinierte geschrieben Neuroakuma Programm, dann laden verschiedene Wellenformen Leitwert. Set Wiederholungszahl bis 8 (6 - 8 für statistische Zwecke). Set Umkehrpotentiale von erregenden und hemmenden Leitwerte bei 0 und - 75 mV bzw.. Wählen Sie ein passendes Paar von erregenden und hemmenden Leitwerte für die Prüfung. Excitatory Leitwert trace (in grün) und hemmenden Leitwert trace (in rot), wird in der unteren Platte erscheinen. </li><li> Gehen Sie zurück zu PatchMaster, wählen Stromzange Modus und schalten Sie sofort den Verstärker Stromzange &#39;CC + Comm FAST &quot;-Modus. Dieser Modus erlaubt es, nachurately folgen schnelle Änderungen des Membranpotentials. Wenn eine gute Abdichtung zwischen der Membran und Pipette aufrecht erhalten wird, wenig / kein Ausgleich erforderlich ist, da sonst die Aufnahme wird nicht lange dauern. In Neuroakuma, drücken Sie die &quot;Record&quot;-Taste. Die zelluläre Antwort (in der Regel mit einer phasischen Platzen der Aktionspotentiale, 1A) wird auf der oberen Platte erscheinen. Spritzen Strom in der Zelle mit niedriger Skalierung der Leitwerte zuerst, wenn wenig / keine Antwort beobachtet wird, in kleinen Schritten erhöhen, bis es eine starke Reaktion produziert. Übermäßige Stromeinspeisung kann töten die Zelle. Sobald Tests abgeschlossen sind, wählen Sie ein neues Paar Leitwert Wellenformen, wiederholen Sie die oben für alle Paare von physiologischen und künstliche Leitwerte. Die physiologischen Ströme (I) in Echtzeit injiziert basieren auf: I (t) = G exc (t) x (V m (t) - V exc) + G inh (t) x (V m (t) - V Inh.) </li></ol> Leitwert (G in nS) konnte sy seinnaptic oder künstlich. Erregenden und hemmenden synaptischen Leitfähigkeit Wellenformen wurden aus früheren Experimenten durch Protti, Di Marco, Huang, Vonhoff, Nguyen und Solomon (unveröffentlichte Ergebnisse) in Reaktion auf unterschiedliche visuelle Reize in Kontrollbedingungen und in Gegenwart von Tetrodotoxin durchgeführt gesammelt (TTX, 1 uM) . Künstliche Leitwert Wellenformen modelliert wurden unter Verwendung eines alpha-Funktion. V m (in mV) ist die aufgezeichnete Membranpotential. G und G ohne inh repräsentieren erregenden und hemmenden Leitwerte bzw. während V und ohne V Inh. stellen die Umkehrung Potenziale von erregenden und hemmenden bzw. Leitwerte. Time is t in ms. Abtastrate ist 40 kHz. I s = I 0 (t / α) e-&amp;agr; t Die obige Gleichung ist ein Alpha-Funktion (I 0 = maximale Strom, 1 / α = Zeit bis zur maximalen (s -1) des Stroms). Die Anstiegs-und Abklingzeit der synaptischenStrom wird durch α 4 diktiert. Die exzitatorische Leitfähigkeit war unverändert, während die Latenzzeit der inhibitorischen Leitfähigkeit geändert wurde, wodurch die Verzögerung relativ zu dem Beginn der Anregung (Fig. 2D). <ol start="4"><li> Nach der Aufnahme sorgfältig einfahren Pipette so die Zelle Körper bleibt intakt. Sofort den Gewebe in 4% Paraformaldehyd für 30 min, gefolgt von drei Waschungen 10 min mit 0,1 M Phosphat-Puffer. Kühlen und führen Antikörper-Färbung am folgenden Tag oder innerhalb einer Woche. </li></ol> 4. Antikörper-Färbung gegen Lucifer Yellow Gefüllt retinalen Ganglienzellen <ol><li> Antikörper-Färbung gegen Lucifer Yellow gefüllt Ganglienzellen bei Raumtemperatur (primäre Anti-Kaninchen-IgG Lucifer Yellow (= Verdünnung 1:10.000) für fünf Tage; am sechsten Tag, Übernachtung Färbung mit sekundären Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Verdünnung 1:500 = )). Nasspräparat die Netzhaut in Fluorescent Erhaltung Medien. Deckplättchenträger und mit Nagel p versiegelnolish. </li><li> Nehmen konfokale Bilder der Zellmorphologie mit einem Leica-Spec II konfokalen Mikroskop (Abbildung 1B). Die Anwesenheit eines Axons ermöglicht die Bestätigung der Ganglienzellen. </li></ol>

<ol><li>Robinson, H. P. C., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp%3A+artificial+conductances+in+biological+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons.</a> Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).</li>
<li>Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clamp%3A+computer-generated+conductances+in+real+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).</li>
<li>Johnson, D., Wu, S. M. -S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+D+%22Foundations+of+cellular+neurophysiology%22">Foundations of cellular neurophysiology</a>. , The MIT Press. London. (1995).</li>
<li>Taylor, W. R., Vaney, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+synaptic+mechanisms+generate+direction+selectivity+in+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina.</a> Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).</li>
<li>Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique+in+ion+channel+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique in ion channel research.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).</li>
<li>Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+clamp+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dynamic clamp comes of age.</a> Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).</li>
<li>Williams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+and+functional+impact+of+conductance+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).</li>
<li>Perkins, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-attached+voltage-clamp+and+current-clamp+recording+and+stimulation+techniques+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).</li>
<li>Feng, S. S., Jaeger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+SK+calcium-dependent+potassium+currents+in+regulating+the+activity+of+deep+cerebellar+nucleus+neurons%3A+a+dynamic+clamp+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study.</a> Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).</li>
<li>Butera, R., Lin, R. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aButera%2C+R+%22Dynamic-Clamp+From+Principles+to+Applications+Series%3A+Springer+Series+in+Computational+Neuroscience%22">Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience</a>. Destexhe, A., Bal, T. 1, Springer. (2009).</li>
<li>Marco, S. D. i, Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+functional+reorganization+of+retinal+circuits+induced+by+early+long-term+visual+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+technique%3A+review+of+the+current+state+of+the+art+and+potential+contributions+from+nanoengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+N%3A+Journal+of+Nanoengineering+and+Nanosystems%22%5BJournal%5D)">Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).</li>
<li>Lobb, C. J., Paladini, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+NMDA+receptor+conductance+in+rat+midbrain+dopaminergic+neurons+using+the+dynamic+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique.</a> J. Vis. Exp. (46), e2275(2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).</li>
<li>Middleton, T. P., Protti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+modulate+spontaneous+synaptic+activity+in+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells.</a> Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).</li>
<li>Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+GFP-expressing+cell+populations+in+the+intact+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina.</a> J. Vis. Exp. (57), e3457(2011).</li>
</ol>

Alle Verfahren wurden zunächst von der Animal Care Ethikkommission der Universität von Sydney genehmigt, und dann in Übereinstimmung mit den Richtlinien des australischen Code of Practice für die Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken (National Health and Medical Research Council of Australia durchgeführt ).

Hier zeigen wir die Verwendung von dynamischen Haken, um den Einfluß des Verhältnisses und Timing der Erregung und Hemmung von retinalen Ganglienzellen Ausgang bewerten. Dynamische Klammer nutzt Computersimulationen physiologisch aufgezeichneten oder künstliche synaptischen Leitwerte in lebende Neuronen einzuführen. Diese Methode bietet ein interaktives Werkzeug, mit dem Leitwerte können modifiziert werden und injiziert in Neuronen zur Berechnung ihres Einflusses auf neuronalen Antworten. Leitwert Wellenformen von Exper...

Die Netzhaut ist eine nahezu transparente neuronalen Gewebe an der Rückseite des Auges. Viele Studien verwenden die Netzhaut als Modell, um die ersten Schritte in der visuellen Verarbeitung und Mechanismen der synaptischen Signalisierung zu untersuchen. Da die Netzhaut Netzwerk in der whole-mount Vorbereitung bleibt nach Dissektion, stellt es ein ideales System, um synaptische Interaktionen zu untersuchen, wie ihre physiologischen Reaktionen sehr ähnlich zu der in vivo-Bedingungen sind. Somit ist die Verwendung eines isolierten Netzhaut die Eigenschaften der Neuronen untersucht mittels Patch-Clamp-Verfahren (für Bewertungen auf der Technik, siehe 6,9,13) werden kann. Ermittlung des genauen Beitrag der spezifischen Schaltungen und Neurotransmitter Ganglienzellen Reaktion wird jedoch üblicherweise behindert als pharmakologische Wirkstoffe an unterschiedlichen Standorten handeln. Physiologische Reaktionen von retinalen Neuronen mit Licht, die natürliche Reiz, kann mit Glas-Pipetten mit intrazellulären Flüssigkeit gefüllt aufgezeichnet werden. Mit Patch clamp Techniken, neuronale Reaktionen auf Licht Stimulation kann als Membranpotential Schwankungen (Stromzange) oder als Ströme (Voltage-Clamp) aufgezeichnet werden. Durch Halten des Membranpotentials mit unterschiedlichen Spannungen und Umsetzung einer posteriori Leitfähigkeit Analyse ist es möglich, zu isolieren und hemmende erregenden synaptischen Eingänge 5,12. Diese Art der Experimente sind in normalen Badmedium und in Gegenwart von verschiedenen pharmakologischen Mitteln, um den Beitrag von verschiedenen Neurotransmittern und Rezeptoren auf neuronale Reaktionen isolieren durchgeführt werden. Eine Fülle von Studien aus vielen Laboratorien dadurch die Abhängigkeit der Spick-Ausgang und erregenden und hemmenden Eingänge Reiz Eigenschaften wie Größe, Kontrast, räumlichen und zeitlichen Frequenzen, Richtung, Orientierung und anderen Stimulus Variablen. Obwohl diese experimentelle Ansätze liefern Informationen über die Beziehung zwischen Spike Ausgang und synaptische Eingänge in Abhängigkeit von Stimulus-Eigenschaften,Interpretation des Beitrags spezifische Zelltypen und deren synaptische Eingänge Zellerregbarkeit ist nicht einfach. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass in der Regel sowohl erregenden und hemmenden Eingänge mit Stimulus Eigenschaften variieren und somit ist es nicht möglich, die genaue Wirkung, dass Änderungen in diesen beiden Eingängen auf neuronale Spiking bewerten. Ein alternativer Ansatz, diese Einschränkungen zu umgehen, ist die Durchführung von dynamischen Clamp Messungen, die eine kritische Bewertung des Beitrags der einzelnen synaptischen Eingänge Spick Ausgang zu ermöglichen. Die dynamische Clamp-Technik erlaubt die direkte Injektion von Strom in die Zelle und die Menge der injizierten Strom zu einem bestimmten Zeitpunkt hängt von der aufgezeichneten Membranpotential damals 1,2,3 (für eine Übersicht siehe 7,14). Es ist eine modifizierte Stromzange Set-up, wo ein Echtzeit-, schnelles Feedback Interaktion zwischen der Zelle unter Aufnahme und der Ausrüstung, die spezielle Hardware, Softwareund einen Computer erzielt wird. Die Strommenge, die in die Zelle injiziert wird entsprechend berechnet. Daher ist der Vorteil dieses Verfahrens, dass die Zelle mit verschiedenen Kombinationen von Leitfähigkeit Wellenformen stimuliert werden kann, und die Antwort wird die Aktivierung von Rezeptoren, die synaptischen Eingänge vermitteln imitieren. Zum Beispiel der Vergleich der Reaktion auf Injektion von erregenden und hemmenden Leitwerte für einen kleinen Ort mit der Antwort auf Injektion von erregenden Leitwert für einen kleinen Ort nur Informationen über die Auswirkungen der Hemmung auf Zell-Antwort. Ebenso können andere Kombinationen von physiologisch aufgezeichnet Leitwerte co-injiziert werden zu zeigen, wie Stimulus-abhängigen Veränderungen in erregenden und / oder hemmenden Leitfähigkeiten beeinflussen Spike Ausgang. In unserer Studie wird die dynamische Clamp-Technik verwendet, um die Auswirkung der relativen Amplitude und Zeitpunkt der synaptischen Eingänge der Brenneigenschaften von retinalen Ganglienzellen demonstrieren. Verschiedene Leitwerteerhalten von physiologischen Experimente in Steuerbedingungen oder in Gegenwart von pharmakologischen Mitteln wurden als Eingänge verwendet. Darüber hinaus wurden künstliche Leitwerte auf alpha-Funktionen basierend auch verwendet werden, um zu untersuchen, wie synaptische Eingänge von den Neuronen integriert sind. Somit ist eine vielseitige Technik, die verschiedene Typen von Leitfähigkeit erzeugt entweder physiologisch oder pharmakologisch rechnerisch in die gleiche Ganglienzellen injiziert werden, so Vergleich der Antworten auf diese Eingaben vorgenommen werden können.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz</td></tr><tr><td>Isofluran Inhalation Anästhetikum</td><td>Pharmachem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ames Medium mit L-Glutamat (Pulver)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaliumgluconat, wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich HEPES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloridlösung ( 4,9 mol/l)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosin 5'-triphosphat (ATP)-Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanosin 5'-triphosphat Natriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylenglykol-bis(2-amin&#8211; Thylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd Pulver, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Luzifer Gelb, Kaninchen IgG-Fraktion (3 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) 2 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluoreszierendes Konservierungsmedium</td><td>BioFX Laboratorien Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Ausrüstung</stark></td></tr><tr><td>Kapillarglasröhre mit flammpolierten Enden (AD = 1,50 mm, ID = 0,86 mm, Länge = 15 cm)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0794</td><td></td></tr><tr><td>Einstufiges Glasmikroskop&#8211; Lectrode Puller</td><td>Narishinge Japan</td><td>Modell PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 2</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV 0,22 &mu; m Filter Einheit</td><td>Millipore Corporation</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>Luer-Lock-Wiederverwendbare Injektionsnadel: 30 g</td><td>Smith Neeffe (Australien)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einzelne Inline-Lösungsheizung</td><td>Warner Instruments</td><td>Modell SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Dualer automatischer Temperaturregler</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Stereomikroskop SZ61</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus Mikroskop BX50WI: mit 40X Objektiv</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0-30 V 2,5 A DC Netzteil</td><td>Dick Smith Electronics</td><td>Q1770</td><td></td></tr><tr><td>Digital Microscopic Camera ProgResMF cool</td><td>Jenoptik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator MP-225</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp Amplifier EPC 8</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>InstruTECH LIH 8+8 Datenerfassungssystem</td><td>HEKA Elektronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Computer: DELL</td><td>Dell Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

implementieren dynamische clamp mit synaptic und künstliche leitfähigkeiten in maus retinalen ganglienzellen

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglienzellen sind die Ausgangs-Neuronen der Netzhaut und ihre Tätigkeit spiegelt die Integration von mehreren synaptischen Eingänge auf Grund von spezifischen neuronalen Schaltkreisen. Patch-Clamp-Technik, in Voltage-Clamp und Stromzange Konfigurationen, werden häufig verwendet, um die physiologischen Eigenschaften von Neuronen zu untersuchen und ihre synaptischen Eingänge zu charakterisieren. Obwohl die Anwendung dieser Techniken ist sehr informativ, stellen sie verschiedene Einschränkungen. Zum Beispiel ist es schwierig zu quantifizieren, wie die genauen Wechselwirkungen der erregenden und hemmenden Eingänge Antwortausgabe bestimmen. Um dieses Problem anzugehen, verwendeten wir eine modifizierte Strom-Clamp-Technik, dynamische Klemme, die auch als Leitwert Klemme 1, 2, 3 und untersuchte den Einfluss von erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge auf die neuronale Erregbarkeit. Diese Technik erfordert die Injektion von Strom in die Zelle und ist abhängig von der Echtzeit-Feedback der Membranpotential zu dieser Zeit. Die INJECTEd Strom von vorgegebenen erregende und hemmende synaptische Leitwerte, ihre Potenziale und Umkehrung der Zelle momentanen Membranpotential berechnet. Details zu den experimentellen Verfahren werden Patch-Clamp-Zellen, um eine Whole-Cell-Konfiguration und Einsatz der dynamischen Clamp-Technik erreichen in diesem Video-Artikel dargestellt. Hier zeigen wir die Antworten der Maus retinalen Ganglienzellen auf verschiedene Wellenformen Leitwert von physiologischen Experimenten unter Kontrolle Bedingungen oder in Gegenwart von Medikamenten erhalten. Darüber hinaus zeigen wir die Verwendung von künstlichen erregenden und hemmenden Leitwerte generiert unter Verwendung von Alpha-Funktionen, um die Reaktionen der Zellen zu untersuchen.

Der Beitrag der verschiedenen Quellen von hemmenden Eingänge Ganglienzellen Antworten wird durch die Anwendung verschiedener Leitfähigkeit Wellenformen gezeigt. Diese Wellenformen wurden mit Stimuli unterschiedlicher Leuchtdichte unter normalen Bedingungen und in Gegenwart von TTX einen spannungsgesteuerten Na +-Kanal-Blocker, der die Wirkung Potentialerzeugungsschaltung nur bei einem Teil der Retina hemmende interneurons. 2A eine repräsentative Antwort auf Injektion zeigt erhaltene erregende...

Dieses Video zeigt die Artikel-Set-up, die Verfahren zum Zellkörper patchen und wie man dynamische Clamp Messungen von Ganglienzellen in whole-mount Maus retinae umzusetzen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der genauen Anteil von erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge und ihre relative Größe und den Zeitpunkt zu neuronalen Spiking.

Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkungen von Änderungen im Verhältnis und in der relativen zeitlichen Abfolge von exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Eingaben auf die Aktionspotentialaktivität von Neuronen mithilfe von Retinalganglienzellen als Modellneuronen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem der Zellkörper einer Ganglienzelle in einer retinalen Vollpräparation angezapft wird, wobei eine Glaspipette verwendet wird, die mit einer intrazellulären Lösung gefüllt ist, die der physiologischen ionischen Zusammensetzung entspricht, sowie mit Lucifer Yellow zur morphologischen Identifizierung des Zelltyps. In einem zweiten Schritt werden mithilfe des dynamischen Klemmverfahrens eine Reihe von exzitatorischen und inhibitorischen Leitfähigkeitswellenformen in den Zellkörper injiziert, wodurch eine Änderung des Membranpotentials als Antwort hervorgerufen wird. Anschließend werden verschiedene Leitfähigkeitswellenformen, die aus physiologischen Experimenten unter Kontrollbedingungen oder in Gegenwart von pharmakologischen Substanzen gewonnen wurden, in den Zellkörper injiziert, um die entsprechenden neuronalen Antworten zu erhalten.D

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In diesem Video zeigen wir, wie man einen Leitwert in einem dopaminergen Neuronen in der ganzen Zelle Konfiguration in Hirnschnitten der Ratte festgestellt werden. Diese Technik nennt man das dynamische Klemme.

Die Anwendung eines NMDA-Rezeptor-Leitwert in Rat Mittelhirn dopaminergen Neuronen Mit der Dynamic-Clamp-Technik

Dieser Artikel enthält eine Beschreibung, wie zu sezieren und Datensatz aus der isolierten Netzhaut Vorbereitung in der Maus. Insbesondere beschreiben wir, wie Licht von Antworten eines fluoreszenzmarkierten Ganglienzelle Bevölkerung aufzunehmen und anschließend zu identifizieren und zu analysieren, ihre Morphologie.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

Dieses Video zeigt eine Ganzzell-Patch-Clamp-Technik für die elektrophysiologische Aufzeichnung von einer flach montierten Mausnetzhaut. Eine dünne Glaspipette mit einer Elektrode wird verwendet, um sich den Starburst-Amakrinzellen (SACs) innerhalb der Netzhaut zu nähern. Nach dem Formen einer Versiegelung wird ein Sog angewendet, um die Membran zu brechen und die Ganzzell-Patch-Clamp-Konfiguration zu bilden. Schließlich wird der Fluss von Ionen durch die synaptischen SAC-Rezeptoren anhand der...

Etablierung einer Ganzzell-Patch-Klemme für die elektrophysiologische Aufzeichnung von einer flach montierten Maus-Netzhaut

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung von lichtevozierten postsynaptischen Reaktionen in einer dunkeladaptierten Maus-Netzhaut-Gewebeschnittpräparation. Der Netzhautschnitt wird in eine Aufnahmekammer gelegt, und eine Aufnahmepipette wird verwendet, um die elektrische Kontinuität mit einer retinalen Ganglienzelle herzustellen. Mit Lichtimpulsen werden exzitatorische postsynaptische Potentiale in den Ganglienzellen erzeugt, die mit der Pipette aufgezeichnet werden.

Lichtevozierte postsynaptische Reaktionen in Neuronen von Netzhautschnitten von Mäusen

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Untersuchung der synaptischen Effizienz im lateralen entorhinalen Kortex (LEC) durch optogenetische Stimulation der medialen präfrontalen Kortex (mPFC) Axone und Aufzeichnung der Reaktionen von Pyramidenneuronen im LEC. Diese Methode kombiniert Patch-Clamp-Aufzeichnungen mit synaptischer Aktivierung durch Lichtstimulation, um die synaptische Plastizität zu untersuchen.

Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung synaptischer Ereignisse in Hirnschnitten von Ratten

Immunhistochemie Protokolle werden verwendet, um die Lokalisierung eines bestimmten Proteins in der Netzhaut zu untersuchen. Calcium-Imaging-Techniken verwendet werden, um Calciumdynamik in retinalen Ganglienzellen und ihre Axone zu studieren.

Immunhistochemischen und Calcium Imaging Methoden in der Wholemount Rat Retina

Closed-Loop-Protokolle werden in der modernen Elektrophysiologie immer weiter verbreitet. Wir stellen eine einfache, vielseitige und kostengünstige Möglichkeit vor, komplexe elektrophysiologische Protokolle in kortikalen Pyramidenneuronen in vitro mit einem Desktop-Computer und einer digitalen Erfassungsplatine durchzuführen.

Echtzeit-Elektrophysiologie: Mit Closed-loop Protokolle Probe neuronaler Dynamik und darüber hinaus

Dieses Protokoll zeigt, wie Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung auf die retinale Neuronen aus einem flachen-Mount-Vorbereitung durchzuführen.

Patch-Clamp-Aufzeichnung von Starburst-Amakrinzellen in einer Wohnung Montage Herstellung von Deafferentated Maus Retina

Hier stellen wir Protokolle zur Herstellung von akuten Hirnscheiben vor, die den lateralen Geniculate-Kern enthalten, und die elektrophysiologische Untersuchung der Funktion retinogenes und kortikogener Synapsen. Dieses Protokoll bietet eine effiziente Möglichkeit, Synapsen mit der hohen Freisetzungs- und Low-Release-Wahrscheinlichkeit in den gleichen akuten Gehirnscheiben zu untersuchen.

Elektrophysiologische Untersuchungen der Retinogeneulate und Corticogeniculate Synapse-Funktion

Wir fassen einen Workflow zusammen, um das Verhalten eines Netzhautneurons als Reaktion auf elektrische Stimulation rechnerisch zu modellieren. Das Berechnungsmodell ist vielseitig und umfasst Automatisierungsschritte, die nützlich sind, um eine Reihe von physiologischen Szenarien zu simulieren und die Ergebnisse zukünftiger In-vivo/In-vitro-Studien zu antizipieren.

Computational Modeling of Retinal Neurons for Visual Prosthesis Research - Grundlegende Ansätze

Die dynamische Klemmelektrophysiologie kann kausale Zusammenhänge zwischen neuronalen Feuerungsdefiziten und Ionenkanaldysfunktionen herstellen. Wir beschreiben dynamische Clamp-Methoden und -Protokolle in zerebellären Purkinje-Neuronen der Maus und erwähnen nützliche Ressourcen und technische Überlegungen. In einer repräsentativen Studie fügen wir modellierte Natriumleitfähigkeit zu Tsc1-/- Purkinje-Neuronen hinzu, um wiederholtes Feuern zu verhindern.

Dynamische Clamp-Methoden zur Untersuchung der gestörten neuronalen Erregbarkeit im Zusammenhang mit Autismus

Lernen Sie die dynamische Clamp-Technik zur Untersuchung synaptischer Eingänge in retinalen Ganglienzellen der Maus. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle erregender und hemmender Leitfähigkeiten.

Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen

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