Name: Hefekolonie Embedding-Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Einbettungsmethode für Hefekolonien zur Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse von sporulierten und pseudohyphalen Zellen zur Untersuchung der Zellorganisation in Pilzgemeinschaften.

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Forschung wurde durch die NIH 1R15GM094770 finanziert.

1. Colony Isolierung und Fixierung <ol><li> Inkubieren 300 Kolonien auf Agar-Medium für die angegebene Zeit (eine isolierte Kolonie sollte 1-2 mm im Durchmesser). </li><li> Entfernen Kolonie (face up) und die zugrunde liegenden Medium mit einem schmalen Spachtel. </li><li> Einige Tropfen von 2% Agar 42 ° C auf einem Objektträger mit 1 mL Pipetman Spitze und sofort Platz Kolonie auf Agar Gesicht, bevor es erstarrt. </li><li> Einige Tropfen von 2% Agar 42 ° C auf Kolonie und damit zu verfestigen. </li><li> Tragen Sie Handschuhe für alle Schritte für den Rest dieses Protokolls </li><li> Trimmblock mit Rasierklinge und legen Sie sie in einem 3,5 ml Borosilikatglas Schraubverschluss Fläschchen mit 2% Paraformaldehyd / 2% Glutaraldehyd Fixativ für 7 Tage bei 4 ° C. </li></ol> 2. Wäscht und Osmium-Behandlung <ol><li> Nach ca. 1 Woche, waschen Agarblöcken auf Eis unter Laborabzug durch Inkubation zweimal für 15 Minuten mit genügend 0,15 Natriumcacodylat (pH 7,2), um vollständig zu bedecken die Kolonie (ca. 1,5 mL), dann noch zweimal für 5 Minuten mit dem gleichen Volumen 1X OS-Puffer (100 mM KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6,0). </li><li> Fügen Sie das gleiche Volumen von 1% OsO 4 [2 mL OsO 4 (2%) + 2 mL 2x OS Buffer], um Fläschchen (auf Eis) auf die Agar-Blöcke unter Laborabzug für 1 Stunde decken dann zweimal waschen mit der gleichen Menge 1X OS-Puffer für jeweils 10 Minuten. </li><li> Lassen Sie Vials über Nacht bei 4 ° C in 1X OS-Puffer. </li><li> Fixativ und alle Wäschen in diesem Schritt sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. Alle Pipetten mit OsO 4 gespült 3X mit Pflanzenöl. </li></ol> 3. Waschen und Dehydration <ol><li> Am nächsten Morgen waschen Agarblöcken zweimal auf dem Eis mit dem gleichen Volumen wie oben mit kaltem Wasser für jeweils 10 Minuten mit Pasteurpipette. </li><li> Wash nacheinander mit dem gleichen Volumen von 25%, 50%, 75%, 95% Ethanol für jeweils 10 Minuten um 2 Waschgänge mit 100% Ethanol für 10 Minuten. Lassen Sie über Nacht bei 4 ° C in 100% Ethanol. </li><li> Alle Wäschen in diesem Schritt sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. </li></ol> 4. Spurr der Vorbereitung <ol><li> Am nächsten Morgen (so früh wie möglich) wiegen die folgenden Lösungen (EM Sciences) in einen Einweg-Plastikbecher unter einer Abzugshaube zu Spurr-Reagenz vorbereiten. Für alle weiteren Arbeiten mit diesem Reagens, weiterhin einen Abzug verwenden. (ERL 4221-Lösung 5 Gramm) (DER 736-Lösung 4 Gramm) (NSA Lösung 13 Gramm) </li><li> Mischung dieser Lösungen (langsam) für 20 Minuten in der Kapuze mit einem Rührstab </li><li> Add DMAE-Lösung 0,15 Gramm und rühren 20 Minuten wie oben. </li><li> Degas obigen Mischung für 1-2 Stunden in der Kapuze. </li></ol> 5. Spurr die Infiltration <ol><li> Sobald Spurr ist gemacht waschen Agarblöcken 5 mal mit gleichem Volumen wie oben von 100% Raumtemp Ethanol für jeweils 10 Minuten. Nach dem letzten Ethanol waschen entfernen Sie den Ethanol mit einer Pasteurpipette, so dass die restliche Ethanol deckt gerade die Agar-Blöcke. </li><li> Fügen Sie etwa die gleiche Menge Spurr-Reagenz (ca. 0,5 mL) und drehen am Rad Fläschchen für 15 Minuten bei Raumtemperatur und dann lassen Sie es 30 Minuten stehen. Nach 30 Minuten entfernen Sie die Lösung vollständig mit einer Pasteurpipette, fügen Spurr auf Agar-Block (ca. 1,5 ml) Deckel ist, drehen Fläschchen auf Rad für 15 Minuten bei Raumtemperatur und lassen Sie es 30 Minuten stehen. Wiederholen Sie die Spurr Nachfolger, Rotation und Inkubation 3 weitere Male. </li><li> Nach der letzten 30 Minuten, entfernen Spurr-Reagenz und fügen frische Spurr ist, um die Blöcke zu decken. Lassen Sie die Agar-Blöcke, um bei Raumtemperatur für 4 Stunden stehen. </li><li> Ersetzen Sie die Spurr und drehen über Nacht. </li><li> Am Morgen ersetzen Spurr und verlassen rotierenden bis zum nächsten Tag. </li><li> Am nächsten Morgen statt Spurr ist in nummerierte Silikonformen (Fisher Scientific) nur auf den Boden der Formen bedecken dann add Agarblöcken die Formen. Inkubation bei 60 ° C für 4 Stunden </li><li> Nach 4 Std., runden die Formen, mit mehr Spurr und Inkubieren bei 60 ° C über Nacht. </li><li> Wenn nach dem Entfernen der Blöcke aus den Formen der Blöcke noch leicht flexibel, um die Formen wieder und inkubieren eine zusätzliche 2 Tage </li></ol> 6. Sectioning <ol><li> Ein Leica Ultracut S Mikrotom wurde auf 0,5 μ dicke Schnitte für die Lichtmikroskopie und 0,1 μ dünne Schnitte für die Übertragung EM schneiden. </li><li> Für die Lichtmikroskopie, wie Abschnitte geschnitten wurden, wurden sie auf einen Rückgang von dH 2 O gelegt und getrocknet auf einer 52 ° C Wärme zu blockieren. Getrocknete Schnitte wurden dann mit einem Rückgang um 1,0% Toluidinblau, 1% Sodium Borate für 5-15 Sekunden gefärbt. Nach der Färbung wurden die Schnitte sofort unter einem Strom von Wasser gewaschen, getrocknet, bedeckt in Eindeckmittel (KPL) und ein Deckglas über die Probe versiegelt. </li></ol> Die breite Relevanz der Messung von Musterbildung in der Hefe und anderen Mikroorganismen wurden bisher 1 Bewertung. Besonders hervorzuheben ist die verbesserte Funktionalität der organisierten Mikrobenkolonien relativ unorganisiert Gemeinden. Das beschriebene Verfahren ist eine Abwandlung einer Methode zur Einbettung von größeren spezialisierten Kolonien 2 und eine kurze Beschreibung unserer Modifikationen wurde 3 veröffentlicht. Ein Beispiel für eine lichtmikroskopische Aufnahme eines Schnitts durch das Zentrum einer Kolonie von wilden S. cerevisiae Hefe Kolonie ist in Abbildung 1 dargestellt. Asci, Pseudohyphen und eiförmig Hefe sind leicht zu unterscheiden, und die Region der Kolonie Eindringen in die zugrunde liegenden Agar ist auch offensichtlich. Ein Beispiel für eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Labor-Hefestamm (W303 Hintergrund) ist in Abbildung 2 dargestellt. Das Bild ist aus einer Region der Kolonie, die eine hohe Frequenz von sporenbildenden Zellen. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Lichtmikroskopie einer wilden Hefe Kolonie. Diese Hefe (YPS133) wurde vor kurzem von Baum Exsudate 4 isolierte. Die Kolonie wurde für 6 Tage auf YNA Medium 5 vor dem Schneiden inkubiert. Offene Pfeile zeigen repräsentative Asci, gefüllt Pfeile zeigen repräsentative eiförmig vegetativen Zellen, gefüllt Pfeilspitzen zeigen Ketten von langgestreckten Zellen (Pseudohyphen) und Asci. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Elektronenmikroskopie eines Labor-Hefestamm. Die Kolonie der SH1020 (W303 Hintergrund) war für 6 Tage auf YNA Medium vor dem Schneiden 3 inkubiert. Bild zeigt einen Bereich des Abschnitts mit einer hohen Frequenz von Asci. Ein Pfeil zeigt die bi-Schicht-Struktur der Spore Wand. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Die Quantifizierung der Verteilung der sporenbildenden Zellen in Kolonien: A) ein Raster mit 15 angrenzenden Rechtecke entlang ihrer Längsseite gestapelt wird auf den zentralen Bereich eines Bildes von einer Kolonie Abschnitt überlagert. Das Gitter wird so skaliert, ohne dabei die Proportionen konstant, nur deckt den oberen und unteren Rand der Kolonie. (B &amp; C) Der Anteil der sporenbildenden Zellen in jedes Rechteck bezogen auf das Gesamtgewicht Zellen in diesem Rechteck wird durch visuelle Inspektion von Bildern aus 4-Tage alte (B) und 8-Tage-alten (C) Kolonien bestimmt. Zum Beispiel entspricht das Rechteck am oberen Rand der Kolonie (mit "1") auf der linken Seite des Diagramms. Mittel von 4 Kolonien gezeigt; die Fehlerbalken zeigen die std. Fehler.

<ol><li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+symmetries%3A+regulation+of+Dictyostelium+development+through+chemoattractant+and+morphogen+signal-response%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response.</a> Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).</li>
<li>Palkova, Z., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+within+a+community%3A+benefit+to+yeast+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Life within a community: benefit to yeast long-term survival.</a> FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significances+of+bacterial+colony+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The significances of bacterial colony patterns.</a> Bioessays. 17, 597-597 (1995).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).</li>
<li>Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+stalk-like+structures+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).</li>
<li>Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+analysis+of+Saccharomyces+cerevisiae+stalk-like+structures+reveals+spatial+organization+and+cell+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization.</a> J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).</li>
<li>Piccirillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+pathway+and+alkaline+pH+regulate+pattern+formation+in+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies.</a> Genetics. 184, 707-707 (2010).</li>
<li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).</li>
<li>Piccirillo, S., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+patterning+and+invasive+growth+in+wild+and+domesticated+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies.</a> Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).</li>
<li>Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environ Microbiol. , (2009).</li>
</ol>

Die vorgestellte Methode zeigt, die inneren Strukturen der Kolonien. Da die Methode ist effektiv bei der Bestimmung Muster von Zelltypen in einer Reihe von S. cerevisiae-Stämme mit unterschiedlichen Morphologien Kolonie, und auch in einer verwandten Spezies S. paradoxus 5, ist das Verfahren auch am ehesten auf eine breite Palette von Pilzen und anderen Mikroorganismen zu arbeiten. Ein entscheidender Schritt für den Erfolg der Methode ist, um sicherzustellen, dass die gesa...

<table><tbody><tr><td>Osmiumtetroxid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19152</td><td></td></tr><tr><td>Silikon-Einbettformen</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC 9975029</td><td></td></tr><tr><td>alicyklisches Epoxidharz</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15004</td><td>ERL 4221</td></tr><tr><td>Epoxidharz</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13000</td><td>DER 736</td></tr><tr><td>Nonylsuccinianhydrid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19050</td><td>NSA</td></tr><tr><td>2-Dimethylamin&amp;#8211;ethanol</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13300</td><td>DMAE</td></tr><tr><td>Einbettmedium</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>Drehbare Walze</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Pelco 1055</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr></tbody></table>

hefekolonie embedding-methode

Yeast Colony Embedding Method

Strukturierung von verschiedenen Zelltypen im Embryo ist ein wichtiger Mechanismus in Metazoen Entwicklung. Gemeinschaften von Mikroorganismen, wie Kolonien und Biofilmen zeigen auch Muster von Zelltypen. Zum Beispiel in der Hefe S. cerevisiae, sind sporenbildenden Zellen und pseudohyphal Zellen nicht gleichmäßig in Kolonien verteilt. Die funktionelle Bedeutung der Strukturierung und der molekularen Mechanismen, die diese Muster zugrunde liegen, sind noch weitgehend unverstanden. Eine Herausforderung in Bezug auf die Untersuchung Muster von Zelltypen in Pilzkolonien ist, dass im Gegensatz zu vielzelligen Gewebe, Zellen in Kolonien relativ schwach miteinander verbunden. Insbesondere sollten Sie Pilzkolonien nicht die gleichen umfangreichen Ebene der extrazellulären Matrix in den meisten Geweben gefunden. Hier berichten wir über eine Methode zum Einbetten und Schneiden Hefekolonien, dass das Innere Muster von Zelltypen zeigt in diesen Kolonien. Die Methode kann verwendet werden, um dicke Abschnitte vorbereiten (0,5 μ) sinnvoll für die Lichtmikroskopie und dünne Schnitte (0,1 μ) für Transmissions-Elektronenmikroskopie werden. Asci und pseudohyphal Zellen können leicht von eiförmige Hefezellen mittels Lichtmikroskopie unterschieden werden, während die innere Struktur dieser Zellen können mit Hilfe von EM. Die Methode basiert auf umliegenden Kolonien mit Agar-Agar, infiltrieren sie mit Spurr das Medium, und dann Schnitte basieren. Kolonien mit einem Durchmesser im Bereich von 1-2 mm eignen sich für dieses Protokoll. Zusätzlich zu visualisieren das Innere der Kolonien, erlaubt das Verfahren die Visualisierung der Region der Kolonie, dass die zugrunde liegenden Agar eindringt.

Eine Methode zur Einbettung von Hefe-Kolonien ermöglicht Schnitte für Licht-und Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll erlaubt die Bestimmung der Verteilung der sporenbildenden Zellen und pseudohyphal Zellen innerhalb Kolonien bietet ein neues Werkzeug zum Verständnis der Organisation von Zelltypen innerhalb eines Pilz-Gemeinschaft.

Hefekolonie Embedding-Methode

Die Musterbildung verschiedener Zelltypen in Embryonen ist ein Schlüsselmechanismus in der Entwicklung von Metazoen. Gemeinschaften von Mikroorganismen, wie Kolonien und Biofilme ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hefekolonien einzubetten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kolonie zusammen mit dem darunterliegenden Agar von einer Agarplatte entfernt, auf mehrere Tropfen geschmolzenes Agar gegeben und umgehend mit weiterem geschmolzenen Agar bedeckt wird. Anschließend wird überschüssiges Agar von der Kolonie abgetragen, um sie klein genug zu machen, damit sie in eine Form passt.Die eingebettete AER-Kolonie wird anschließend fixiert, gefärbt, dehydriert und schließlich mit Spurr-Harz infiltriert. Der Block wird dann in eine Form mit zusätzlichem Spurr-Harz gegeben und bis zur Aushärtung inkubiert, bevor er geschnitten wird. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Licht- oder Elektronenmikroskopie die Verteilung der Zelltypen innerhalb einer Hefe-Kolonie zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Rasterelektronenmikroskopie besteht darin, dass sie die Bestimmung der inneren Struktur der Kolonie ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der mikrobiellen Entwicklung zu beantworten, beispielsweise die Verteilung von Zelltypen innerhalb von Kolonien. Diese Methode lieferte Erkenntnisse über die Struktur von croce CAC-Kolonien, ist jedoch vermutlich auch auf andere Mikroorganismen anwendbar.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das Handhaben und Einbetten von Kolonien anhand eines schriftlichen Protokolls schwer zu erlernen sein kann. Die Idee zu dieser Methode entstand aus einigen genetischen Daten, die wir 2002 veröffentlichten und die darauf hindeuteten, dass Sporen in Kolonien nicht gleichmäßig verteilt sind. Wir haben eine Methode zur Schnittführung von Kolonien angepasst, die von engelberg im fin-Labor entwickelt wurde.Beginnen wir also. Inkubieren Sie Wildtyp-Saccharomyces-cerevisiae-Hefe auf Agarplatten bei 30 Grad, bis etwa 300 Kolonien vorhanden sind. Entfernen Sie mithilfe eines schmalen Spatels einzeln Kolonien mit einem Durchmesser von ein bis zwei Millimetern von der Platte.Danach mit einer Ein-Milliliter-Pipette mehrere Tropfen von 2 % Agar bei 42 Grad Celsius auf einen Mikroskopobjektträger geben und sofort die Kolonie mit der Agarseite nach oben aufbringen, bevor der Agar erstarrt. Weitere Tropfen Agar auf die Kolonie geben und den Agar vollständig erstarrten lassen, wobei sichergestellt werden muss, dass die gesamte Kolonie, einschließlich der Oberseite der Kolonie, vom Agar umschlossen ist. Bei allen nachfolgenden Protokollschritten mit einem Rasierklingenmesser verfahren.Schneiden Sie die AER um die Kolonie herum zurecht und legen Sie den AER-Block mit der Kolonie in ein 3,5-Milliliter-Bo-Silikat-Schraubglas mit Verschluss, das 2 % Paraformaldehyd und 2 % Glutaraldehyd enthält. Die Kolonien müssen zur Fixierung einzeln verarbeitet werden, um Austrocknung zu verhindern; jedoch können bis zu 10 Kolonien im selben Gefäß platziert werden. Lassen Sie die Kolonien sieben Tage lang bei vier Grad Celsius stehen.Nach einer Woche das Fixierungsmittel entfernen und die Agri-Kolonien zweimal mit jeweils etwa 1,5 Milliliter 0,15 molarer Natriumlösung bei pH 7,2 waschen. Nach jedem Waschschritt 15 Minuten auf Eis inkubieren, ohne zu schütteln. Danach zwei weitere Waschungen durchführen.Unter Verwendung von 1,5 Milliliter eines X-OS-Puffers, bestehend aus 100 Millimolar Monokaliumphosphat, 10 Millimolar Magnesiumchlorid bei pH 6,0, jeweils nach jeder Waschung fünf Minuten auf Eis inkubieren. Anschließend mit demselben Gefäß die hier und im schriftlichen Teil dieses Protokolls aufgeführte Behandlung mit Osmium sowie die Waschschritte durchführen. Danach erneut mit demselben Gefäß am nächsten Morgen die hier und im begleitenden schriftlichen Protokoll aufgeführten stufenweisen Dehydrierungen durchführen.Bereiten Sie das Spurs-Reagenz wie hier und in der beigefügten schriftlichen Anleitung beschrieben zu. Waschen Sie die Agri-Blöcke unmittelbar anschließend fünfmal je 10 Minuten lang mit jeweils 1,5 Milliliter 100 % Ethanol bei Raumtemperatur. Nach dem letzten Ethanolwaschgang entfernen Sie nur so viel Ethanol, dass der Agri-Block weiterhin bedeckt bleibt.Unter Verwendung einer Pasteurpipette etwa 0,5 Milliliter Spurs-Reagenz in das Gefäß geben und 15 Minuten lang bei niedriger Geschwindigkeit auf einem Rotor vermischen. Nach der Rotation bei Raumtemperatur das Gefäß 30 Minuten lang stehen lassen. Anschließend die Lösung vollständig entfernen.Dann 1,5 Milliliter Spurs-Reagenz hinzufügen, um den Agri-Block zu bedecken. Das Röhrchen erneut 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rollwälzer rotieren lassen und anschließend 30 Minuten stehen lassen. Diesen Waschschritt wiederholen.Wiederholen Sie den Schritt noch dreimal. Nach den letzten 30 Minuten entfernen Sie das Spurs-Reagenz und geben frisches Spurs-Reagenz hinzu, um die Blöcke zu bedecken. Lassen Sie die Agri-Blöcke vier Stunden bei Raumtemperatur stehen.Ersetzen Sie das Spurs-Reagenz und rotieren Sie über Nacht. Am folgenden Morgen ersetzen Sie das Spurs-Reagenz erneut und lassen die Gefäße bis zum nächsten Tag rotieren. Am übernächsten Morgen geben Sie das Spurs-Reagenz in nummerierte Silikonformen, sodass der Boden der Formen gerade bedeckt ist.Als Nächstes die Agar-Blöcke in die Formen geben und vier Stunden lang bei 60 Grad Celsius inkubieren. Nach vier Stunden die Formen mit weiteren Sporen, Reagenz, auffüllen und über Nacht bei 60 Grad Celsius inkubieren. Die Blöcke anschließend aus den Formen nehmen, um sie zu schneiden.Ein Beispiel für ein Lichtmikrograf eines Schnitts durch das Zentrum einer Wildtyp-S. visiae-Hefekolonie ist hier dargestellt. Diese Hefe ist ein Wildtyp-Stamm, der aus Baumexsudaten isoliert wurde. Die Kolonie wurde vor dem Einbetten sechs Tage lang auf YNA-Medium inkubiert.In dieser Abbildung sind asai-, pseudo-hyphäre und ovoide Hefezellen leicht unterscheidbar, und der Bereich der Kolonie, der das darunterliegende Agarmedium infiltriert, ist ebenfalls erkennbar. Offene Pfeile zeigen repräsentative asai-Zellen, ausgefüllte Pfeile zeigen repräsentative ovoide vegetative Zellen, ausgefüllte Pfeilspitzen zeigen Ketten verlängerter Zellen und si. Diese Abbildung ist ein Beispiel für ein Elektronenmikroskopbild aus einer Dünnschnittpräparation eines Labormusters der Hefe SH 1 0 2 0 und W 3 0 3. Hintergrund.Die Kolonie wurde sechs Tage lang auf YNA-Medium vor der Schnittführung inkubiert. Das Bild zeigt einen Bereich der Kolonie mit einer hohen Häufigkeit von sporulierten Zellen. Ein Pfeil weist auf die Doppelschichtstruktur der Sporenwand hin.In Teil A zeigen wir einen Ausschnitt einer vier Tage alten Kolonie mit einem Raster aus 15 Rechtecken, das in Teil B über das Bild gelegt ist. Die Häufigkeit sporenbezogener Zellen in jedem Rechteck wird durch 15 Balken dargestellt, die den 15 Rechtecken in Teil A entsprechen. Die Daten zeigen den Mittelwert und den Standardfehler von vier unabhängigen vier Tage alten Kolonien. In Teil C sind die Mittelwerte und Standardfehler für vier unabhängige acht Tage alte Kolonien dargestellt. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei Wochen durchgeführt werden, wobei ein ganzer Tag sowie mehrere Tage mit einer bis drei Stunden benötigt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Lösungen unverzüglich hinzuzufügen, damit die Schnitte nicht austrocknen, nachdem dieses Verfahren durchgeführt wurde.Andere Methoden, wie die immunoelektronenmikroskopische Untersuchung, könnten möglicherweise verwendet werden, um die Verteilung von Zellen zu bestimmen, die bestimmte Proteine nach ihrer Entwicklung exprimieren. Mithilfe dieser Technik konnten wir nicht nur die Musterung sporulierender Zellen, sondern auch die Musterung von Pseudo-Hyphen-Zellen in croce-CCI-Kolonien untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hefe-Kolonien zum Schneiden einbettet.Vergessen Sie nicht, dass viele der in diesem Protokoll verwendeten Mikroskopie-Reagenzien äußerst gefährlich sein können. Denken Sie daran, eine Abzugshaube zu verwenden, Schutzkleidung zu tragen und die Reagenzien ordnungsgemäß zu entsorgen. Gut, das war's.Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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