Hefekolonie Embedding-Methode

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Hefekolonien einzubetten. Dies wird erreicht, indem zuerst eine Kolonie und der darunter liegende Agar von einer Agarplatte entfernt, auf mehrere Tropfen geschmolzenen Agar gelegt und schnell mit mehr geschmolzenem Agar bedeckt wird. Als nächstes wird überschüssiges AER aus der Kolonie abgeschnitten, um es klein genug zu machen, um in eine Form zu passen.

Die in AER eingebettete Kolonie wird dann fixiert, gefärbt, dehydriert und schließlich mit Sporenharz infiltriert. Der Block wird dann in eine Form mit zusätzlichen Sporen gelegt, mit Harz inkubiert, bis es ausgehärtet ist, und dann geschnitten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Verteilung von Zelltypen innerhalb einer Hefekolonie durch Licht- oder Elektronenmikroskopie zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Rasterelektronenmikroskopie besteht darin, dass sie es ermöglicht, die innere Struktur der Kolonie zu bestimmen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der mikrobiellen Entwicklung zu beantworten, wie z.B. die Verteilung von Zelltypen innerhalb von Kolonien. Diese Methode gab Einblick in die Struktur von Krokodil-CAC-Kolonien, aber es ist wahrscheinlich, dass sie auch auf andere Mikroorganismen angewendet werden kann.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig sein kann, die Handhabung und Einbettung von Kolonien anhand eines schriftlichen Protokolls zu erlernen. Die Idee zu dieser Methode wurde durch einige genetische Daten inspiriert, die wir 2002 veröffentlichten und die darauf hindeuteten, dass die Sporen in den Bienenvölkern nicht gleichmäßig verteilt sind. Wir haben eine Methode zur Sektionierung von Kolonien adaptiert, die von engelberg im fin lab entwickelt wurde.

Also lasst uns loslegen. Beginnen Sie mit der Inkubation der Wild S visi-Hefe auf Schneckenplatten bei 30 Grad, bis etwa 300 Völker vorhanden sind. Entfernen Sie mit einem schmalen Spatel die Kolonien von ein bis zwei Millimetern Durchmesser nacheinander von der Platte.

Geben Sie dann mit einer Ein-Milliliter-Pipette mehrere Tropfen 2%Agar bei 42 Grad Celsius auf einen Objektträger und legen Sie die Kolonie sofort mit der Vorderseite nach oben auf den Agar, bevor sich der AER verfestigt. Geben Sie noch einige Tropfen Agar auf die Kolonie und lassen Sie den Agar fest werden. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Kolonie, einschließlich der Oberseite der Kolonie, von Agar umhüllt ist. In allen folgenden Protokollschritten mit einer Rasierklinge.

Schneiden Sie die AER um die Kolonie herum und platzieren Sie den AER-Block mit der Kolonie. In einem 3,5-Milliliter-Bo-Silikat-Fläschchen mit Schraubverschluss, das 2 % Paraformaldehyd und 2 % Glutaraldehyd-Fixiermittel enthält, müssen die Kolonien nacheinander verarbeitet werden, um ein Austrocknen zu verhindern, aber bis zu 10 Kolonien können in dasselbe Fläschchen gegeben werden. Lassen Sie die Völker sieben Tage lang bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie nach einer Woche das Fixiermittel und waschen Sie die Agri-Kolonien zweimal mit etwa 1,5 Millilitern 0,15 molaren Natrium. Bei pH 7,2 zitieren und nach jeder Wäsche 15 Minuten lang ohne Rühren auf Eis inkubieren. Nach dieser Wäsche noch zweimal.

Unter Verwendung von 1,5 Millilitern eines X OS-Puffers, bestehend aus 100 Millimolar Monokaliumphosphat und 10 Millimolar Magnesiumchlorid bei einem pH von 6,0, der nach jeder Wäsche fünf Minuten lang auf Eis inkubiert wird. Führen Sie anschließend mit demselben Fläschchen die Osmiumbehandlung und die Waschungen durch, die hier und im schriftlichen Teil dieses Protokolls aufgeführt sind. Führen Sie dann wieder mit demselben Fläschchen die hier und im begleitenden schriftlichen Protokoll aufgeführten schrittweisen Dehydrationen am frühen Morgen des nächsten Tages durch.

Bereiten Sie das Sporenreagenz vor, wie hier und im beigefügten schriftlichen Protokoll gezeigt. Waschen Sie die Agri-Blöcke sofort fünfmal für jeweils 10 Minuten mit 1,5 Millilitern Ethanol mit 100 % Raumtemperatur. Entfernen Sie nach der letzten Ethanolwäsche nur so viel Ethanol, dass der Agri-Block bedeckt bleibt.

Geben Sie mit einer Weidepipette etwa 0,5 Milliliter Sporenreagenz in das Fläschchen und drehen Sie es 15 Minuten lang bei niedriger Geschwindigkeit auf einem Rad. Lassen Sie die Durchstechflasche nach dem Drehen bei Raumtemperatur 30 Minuten stehen. Entfernen Sie anschließend die Lösung vollständig.

Fügen Sie dann 1,5 Milliliter Sporenreagenz hinzu, um den Agri-Block zu bedecken. Drehen Sie das Fläschchen erneut 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Rad und lassen Sie es 30 Minuten stehen. Wiederholen Sie diese Wäsche.

Gehe noch drei Mal vor. Entfernen Sie nach den letzten 30 Minuten das Sporenreagenz und fügen Sie frisches Sporenreagenz hinzu, um die Blöcke zu bedecken. Lassen Sie die Agri-Blöcke vier Stunden lang bei Raumtemperatur stehen.

Ersetzen Sie das Sporenreagenz und drehen Sie es über Nacht. Ersetzen Sie am nächsten Morgen das Sporenreagenz und lassen Sie die Durchstechflaschen bis zum nächsten Tag rotieren. Geben Sie am nächsten Morgen das Sporenreagenz in nummerierte Silikonformen, um nur den Boden der Formen zu bedecken.

Anschließend legen Sie die Agri-Blöcke in die Formen und inkubieren vier Stunden lang bei 60 Grad Celsius. Nach vier Stunden die Formen mit weiteren Sporen und Reagenzien auffüllen und über Nacht bei 60 Grad Celsius inkubieren. Entferne die Blöcke aus der Form, um sie zu schneiden.

Hier ist ein Beispiel für eine lichtmikroskopische Aufnahme eines Schnitts durch das Zentrum einer Kolonie der Wild S Visia Hefekolonie zu sehen. Bei dieser Hefe handelt es sich um einen Wildtyp-Stamm, der aus Baumexsudaten isoliert wurde. Die Kolonie wurde vor der Sektion sechs Tage lang auf YNA-Medium inkubiert.

In diesem Bild sind Asai, Pseudohyphy und eiförmige Hefe leicht zu unterscheiden, und auch die Region der Kolonie, die in den darunter liegenden Agar eindringt, ist zu erkennen. Offene Pfeile zeigen repräsentative Asai-gefüllte Pfeile an, zeigen repräsentative eiförmige vegetative Zellen an, gefüllte Pfeilspitzen zeigen Ketten von länglichen Zellen und si an. Dieses Bild ist ein Beispiel für eine elektronenmikroskopische Aufnahme aus einem Dünnschliff eines Laborstammes von Hefen SH 1 0 2 0 und W 3 0 3.Hintergrund.

Die Kolonie wurde vor der Sektion sechs Tage lang auf YNA-Medium inkubiert. Das Bild zeigt eine Region der Kolonie, die eine hohe Häufigkeit von sporulierten Zellen aufweist. Ein Pfeil zeigt den Doppelschichtaufbau der Sporenwand an.

In Teil A zeigen wir einen Ausschnitt einer viertägigen Kolonie mit einem Gitter aus 15 Rechtecken, die das Bild in Teil B überlagern.Die Häufigkeit der sporenverwandten Zellen in jedem Rechteck ist ein Transplantat mit den 15 Balken, die den 15 Rechtecken entsprechen, die in Teil A gezeigt werden.Die Daten sind der mittlere und der Standardfehler von vier unabhängigen viertägigen Kolonien. Die Mittelwerte und Standardfehler für vier unabhängige Acht-Tage-Kolonien sind dargestellt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Wochen mit einem ganzen Tag und mehreren ein- bis dreistündigen Tagen durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Lösungen sofort hinzuzufügen, damit die Blöcke nicht austrocknen.

Andere Methoden, wie die Immunelektronenmikroskopie, könnten möglicherweise verwendet werden, um die Verteilung von Zellen zu bestimmen, die bestimmte Proteine nach ihrer Entwicklung exprimieren. Diese Technik ermöglichte es uns, nicht nur die Musterung von Sporulatzellen, sondern auch die Musterung von Pseudo-Hyphenzellen in Krokodil-CCI-Kolonien zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hefekolonien für die Sektion einbettet.

Vergessen Sie nicht, dass viele der in diesem Protokoll verwendeten Mikroskopie-Reagenzien extrem gefährlich sein können. Bitte denken Sie daran, einen Abzug zu verwenden, Schutzkleidung zu tragen und die Reagenzien ordnungsgemäß zu entsorgen. Okay, das war's.

Danke fürs Zuschauen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.