Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die entscheidende zeitliche Regulation zu identifizieren, die für die Differenzierung von Kardiomyozyten in embryonalen Stammzellen der Maus erforderlich ist. Dies wird erreicht, indem zunächst embryonale Körper in einer runden Bodenplatte mit 96 Vertiefungen gebildet werden, um die EB-Bildung in einem zweiten Schritt zu standardisieren. Proteine oder chemische Modulatoren werden dem EBS über einen vorgegebenen Zeitverlauf zugesetzt, was eine zeitliche Kontrolle der untersuchten Signalwege ermöglicht.

Als nächstes werden schlagende EBS manuell quantifiziert, um die Induktionseffizienz verschiedener Signalmodulationsschemata zu bestimmen. Es werden Ergebnisse erhalten, die den zeitlichen Bedarf essentieller Signalwege für die Kardiomyozytendifferenzierung basierend auf dem Prozentsatz der gebildeten schlagenden EBS und der Bestätigung mit der Hanging Drop-Methode zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie hängenden Tropfen besteht darin, dass sie ein arbeitsintensives Verfahren standardisiert und vereinfacht und ein einfaches Auslesen zur Quantifizierung ermöglicht.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Stammzellbiologie zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung einer essentiellen Signalgerinnung, die die Differenzierung in Richtung des gewünschten Zelltyps lenkt. Gro embryonale Stammzellen der Maus in 10 Zentimeter großen Zellkulturplatten mit Maus-ES-Zellmedium, ergänzt mit Leukämie-Hemmfaktor. Wenn die ES-Zellen bei 50 bis 70 % Konfluenz sind, sind sie einsatzbereit.

Entfernen Sie das ES-Medium und spülen Sie die Zellen einmal mit fünf Millilitern sterilem PBS. Geben Sie zwei Milliliter 0,05 % EDTA auf jede Platte und inkubieren Sie die Platten drei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Als nächstes werden die Trips in EDTA mit drei Millilitern ES-Medien pro Platte abgeschreckt und die Zellen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt.

Drehen Sie sich drei Minuten lang mit 1000 Umdrehungen pro Minute. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das Supinat und resuspendieren Sie das Küvettenpellet mit der gewünschten Menge EB-Medium. Zählen Sie die Zellzahl und verdünnen Sie dann die Zellen auf fünf mal 10 auf die drei Zellen pro Milliliter.

Geben Sie in EB-Medien mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter EB-Medien, die Zellen enthalten, in jede Vertiefung einer 96-Zylinder-Mikrotiterplatte mit rundem Boden. Die Anzahl der erforderlichen 96-Well-Platten hängt von der Anzahl der Bedingungen und Zeitpunkte des Experiments ab. Legen Sie die 96 Mikrotiterplatten mit rundem Boden in einen befeuchteten 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Inkubator, um kritische Zeitfenster wichtiger Signalwege für die Herz-Kreislauf-Genese zu identifizieren.

Modulatoren spezifischer Signalwege werden den ES-Zellen zugesetzt. In den 96 runden Vertiefungsplatten wird der Signalmodulator hinzugefügt, der zu verschiedenen Zeitpunkten in jedem Well in Medien verdünnt wird. Die Hälfte der Wells in jeder 96-Well-Platte wird für jeden Startzeitpunkt der Behandlung verwendet.

Den anderen 48 Vertiefungen wird für jeden Zeitpunkt eine Fahrzeugsteuerung hinzugefügt. An verschiedenen Haltepunkten werden wir die Signalmodulatoren aus jeder Vertiefung auswaschen, indem wir das Medium wechseln, und dabei muss große Sorgfalt walten gelassen werden, um eine Störung der embryonalen Körper zu verhindern. Waschen Sie die Modulatoren aus, indem Sie das EB-Medium für die Vertiefungen wechseln. Kippen Sie die 96-Well-Platte um einen Winkel von etwa 10 Grad und entfernen Sie das Medium vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette aus der Well.

Geben Sie dann EB-Medien ohne Modulator in jede Vertiefung für jede Behandlung, die länger als 48 Stunden dauert. Wechseln Sie das EB-Medium, das mit frischen Modulatoren ergänzt wird, alle zwei Tage bis zur gewünschten Stoppzeit. Punkte, sieben Tage nachdem EBS durch den Transfer von ES-Zellen auf 96-Well-Platten induziert wurden, untersuchen Platten die EB-Kontraktion unter einem Mikroskop.

Bewerten Sie die Vertiefungen mit kontrahierendem EBS als positiv, um den Prozentsatz der an EBS erkrankenden EBS für jeden verschiedenen Behandlungszeitverlauf zu erhalten. Die Zeitfenster der Signalübertragung für die Kardio-Genese, die durch die 96-Well-Platten-Experimente identifiziert wurden, können in EBS verifiziert werden, die aus hängenden Tröpfchen hergestellt wurden, um hängende EB-Tröpfchen herzustellen. Bereiten Sie zunächst Petrischalen vor, indem Sie drei bis vier Milliliter PBS hinzufügen, um später eine vorbeugende Aberration der Tröpfchen zu gewährleisten.

Als nächstes wird eine ES-Zellsuspension, die mit einer Enddichte von 2,5 mal 10 zu den vier Zellen pro Milliliter hergestellt wird, für einen einfachen Zugang in eine Bakterienschale gegossen. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 20 Mikroliter ES-Zellen auf die umgekehrten Deckel der Petrischale. Lassen Sie die einzelnen Tröpfchen nicht miteinander in Berührung kommen.

In der Regel kann ein Deckel bis zu 80 Tropfen aufnehmen. Klappen Sie dann den Deckel wieder über die Petrischale mit PBS und inkubieren Sie sie 48 Stunden lang in einem 37 Grad Celsius heißen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator, um die EB-Bildung zu ermöglichen. Nach 48 Stunden spülen Sie das EBS, das aus hängenden Tröpfchen von jedem Deckel gebildet wurde, mit drei Millilitern EB-Medium ab.

Ziehen Sie zwei Deckel von EBS in eine neue Petrischale. Inkubieren Sie die Petrischale vier Tage lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, am vierten Tag übertragen Sie EBS in Suspension auf 0,2 %ige gelatinebeschichtete Sechs-Well-Platten im Allgemeinen. 30 EBS werden zu dem in den 96-Well-Plattenexperimenten identifizierten Zeitraum sieben Tage nach der Herstellung der hängenden Tröpfchen auf jeden Well-Inkubations-Signalmodulator übertragen.

Beobachten Sie das EBS unter dem Mikroskop auf EB-Kontraktion: ES-Zellen, die in den runden Bodenwells einer 96-Well-Platte gezüchtet wurden, bilden EBS, wie in diesem repräsentativen Bild eines EB gezeigt, das am vierten Tag gebildet wurde. Die kritischen Zeitpunkte für die ES-Kardio-Genese sind die Zeitfenster, die im Vergleich zur Fahrzeugsteuerung den höchsten Prozentsatz an kontrahierenden EBS enthalten, die durch Signalmodulatoren behandelt werden. Hier ist ein spontan kontrahierender Fokus von Kardiomyozyten zu sehen, die aus dorsalen Morphin-behandelten ES-Zellen am Tag 10 der Differenzierung auf einer 96-Well-Mikrotiterplatte gebildet wurden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie kritische zeitliche Regulation und Fenster der wichtigsten Signalwege in der ES-Kardiogenese effizient identifizieren können.