Name: Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie mit einem standardisierten 96-Well-Platten-Assay die kardiogene Induktionseffizienz in embryonalen Mausstammzellen quantifizieren. Diese Methode ermöglicht die zeitliche Kontrolle von Signalwegen.

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Diese Arbeit wurde vom Veterans Affairs und NIH gewährt 5U01HL100398 und 1R01HL104040 unterstützt.

1. Embryonale Body (EB)-Bildung mit 96-Rundboden-Mikrotiterplatten <ol><li> Wachsen Sie mit der Maus ES-Zellen in 10cm-Zellkultur-Platten mit Maus ES-Zell-Medium mit LIF ergänzt. </li><li> Wenn ES-Zellen bereit für den Einsatz (in der Regel bei 50-70% Konfluenz), entfernen ES Medien und spülen Sie die Zellen einmal mit 5 ml sterilem PBS. </li><li> Add 2ml 0,05% Trypsin / EDTA zu jeder Platte und inkubieren Platten bei 37 ° C für 3 bis 5 Minuten, Quench Trypsin EDTA mit 3 ml ES-Medien. </li><li> Transfer-Zellen zu 50ml Falcon-Röhrchen und drehen mit 1000 rpm für 3 Minuten. </li><li> Überstand entfernen und Zellpellet resuspendieren mit der gewünschten Menge an EB Medien. </li><li> Zählen Sie die Zellzahl und verdünnten Zellen bis 5 x10 3 Zellen / ml in EB Medien. </li><li> Verwenden Sie Mehrkanalpipette zu 100 &amp;mgr; l der EB Medien hinzufügen enthaltenden Zellen in jedes Well der 96 - runde Loch-Mikrotiterplatten. </li><li> Legen Sie 96 - runde Loch-Mikrotiterplatten in einem Inkubator. </li></ol> 2. Identifizierung der kritischen Zeitfenster der Schlüssel-Signalweg (e) für Kardiogenese <ol><li> Add Modulatoren der spezifische Signalwege und Fahrzeugkontrolle in jedes Well der 96-well Mikrotiterplatten, die ES-Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten wie Tag 0, Tag 1, Tag 2, Tag 3 und Tag 4, etc. Die Hälfte der Brunnen in je 96 -Well-Platte (48 Bohrlöcher) sind für jeden ab Zeitpunkt der Behandlung eingesetzt. </li><li> Waschen Sie die Modulatoren, indem EB Medien für alle 48 Brunnen in verschiedenen Stoppzeit Punkte. Zum Beispiel, um 2 Tage Behandlung von ES-Zellen ab Tag 0 zu erhalten, waschen Modulatoren am Tag 2. Für jede Behandlung länger als 48 Stunden, ändern EB Medien mit frischen Modulatoren ergänzt alle zwei Tage, bis die gewünschte Endzeit Punkte. </li><li> Untersuchen EB Kontraktion unter dem Mikroskop nach Tag 7. Ergebnis der Brunnen mit Contracting EBs als positive auf Prozentsätze des öffentlichen EBs für jede unterschiedliche Behandlung Zeitverläufe zu bekommen. </li><li> Die kritischen Zeitpunkte für ES Kardiogenese sind die Zeiträume, in denen der höchste Prozentsatz von Contracting-EBs durch Signalisierung Modulatoren behandelt werden, wenn zur Steuerung des Fahrzeugs im Vergleich enthalten. </li></ol> 3. Überprüfung von Zeitfenstern der Signalisierung für Kardiogenese in EBs aus hängenden Tropfen <ol><li> Bereiten Sie Petrischalen, indem mit 3-4 ml PBS, um Verdunstung zu verhindern. </li><li> Folgen Sie den Schritten 1,1 ~ 1,5 bis ES-Zellen in 2.5x10 4 Zellen / ml Endzelldichte vorzubereiten. </li><li> Gießen Zellgemisch in bakterielle Gericht für einfachen Zugang. Mit Mehrkanal-Pipette 20 pl Tropfen (mit etwa 500 Zellen) auf umgekehrte Deckel. Lassen Sie die einzelnen Tröpfchen zu berühren. Im Allgemeinen ein Deckel passen bis zu 80 Tropfen. Klappen Sie den Deckel wieder auf die Schale mit PBS. Einer Inkubationszeit von 24 Stunden oder 48 Stunden zu EB-Bildung in einem Inkubator zu ermöglichen. </li><li> Waschen Sie die EB aus hängenden Tröpfchen aus jeder Deckel mit 3 ml EB Medien und Pool 2 Deckeln von EBs, um eine neue Petrischale gebildet. Add EB Medien bis zu einem Gesamtvolumen von 10ml. </li><li> Transfer-EBs in Suspension auf 0,2% Gelatine beschichtete 6-well Platten am Tag 4. In der Regel 30 EBs werden in jede Vertiefung überführt. Add EB Medien, die 2 ml Endvolumen für jeden gut zu bekommen. </li><li> Inkubieren Signalisierung Modulatoren auf den Zeitraum von 96-Well-Platte Experimenten identifiziert. </li><li> Beachten Sie die EB Kontraktion unter dem Mikroskop nach Tag 7 und Kardiogenese können weiterhin durch RT-PCR, Immunfärbung und andere, wenn nötig charakterisiert werden. </li></ol>

<ol><li>Fukuda, K., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+a+source+of+regenerative+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes.</a> Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).</li>
<li>Foley, A. C., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+induction+by+Wnt+antagonists+depends+on+the+homeodomain+transcription+factor+Hex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex.</a> Genes Dev. 19, 387-396 (2005).</li>
<li>Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+biphasic+roles+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+cardiomyogenesis+and+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).</li>
<li>Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsomorphin%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+BMP+signaling%2C+promotes+cardiomyogenesis+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells.</a> PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).</li>
</ol>

Die hängenden Tropfen Methode hat den herkömmlichen Verfahren zur EB Bildung und In-vitro-Differenzierung verwendet worden. Es ist jedoch mühsam und Grenzen experimentellen Flexibilität durch logistische Belange. Aus dem gleichen Grund werden die Ergebnisse auch schwieriger zu validieren als die Geschicklichkeit des Experimentators ist entscheidend für die erfolgreiche EB Bildung und Manipulation als hängende Tropfen. Eine einfachere Methode ist die EBs in einen Rundkolben 96-Well-Platte als ein einstufiges Verfahren zu bilden. Dieses Format ermöglicht in vitro-Differenzierung zu standardisieren und kann mehr experimentellen Bedingungen durch die Leichtigkeit des EB Bildung und nachgelagerten Manipulation (zB Modulator Hinzufügen oder Entfernen) unterzubringen. Darüber hinaus kann die 96-Well-Platten-Format optimiert, um eine effiziente Screening-Instrument in Maus-ES-Zellen werden.

<ul><li> Maus CGR8 Zellen werden hauptsächlich verwendet. </li><li> ES-Medium: GMEM Medien mit 10% Hitze-inaktiviertes FBS, 2 mM L-Glutamin, 0,05 mM 2-Mercaptoethanol und 200 U / ml murinem LIF. </li><li> EB-Medium: Bereiten IMDM Medien mit 20% Hitze-inaktiviertes FBS, 1,6 mM L-Glutamin, 0,08 mM 2-Mercaptoethanol, und 1X MEM Non-essentielle Aminosäure-Lösung. </li></ul>

geändert maus embryonalen stammzellen basierte assay zur quantifizierung von kardiogener induction efficiency

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differenzierung von pluripotenten Stammzellen ist eng mit zeitlichen und räumlichen Regulation von mehreren wichtigen Signalwege gesteuert. Eine der Hürden, die ihr Verständnis hat die verschiedensten Methoden in Korrelation Veränderungen der wichtigsten Signalwege zur Differenzierung Effizienz. Wir beschreiben hier die Verwendung einer Maus embryonale Stammzellen (ES) zellbasierten Assay auf kritische Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal Aktivierung während kardiogenen Induktion zu identifizieren. Mit Scoring für Contracting embryonalen Körper (EVG) in einer 96-Well-Platte formatieren, können wir schnell zu quantifizieren kardiogenen Effizienz und identifizieren wichtige Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal-Aktivierung in einen zeitlichen Verlauf folgenden spezifischen Modulator Behandlungen. Die wichtigsten hier skizzierte ist nicht die kardiale Induktion allein, begrenzt und kann nach dem Studium vieler anderer Zelllinien eingesetzt werden. Darüber hinaus hat der 96-Well-Format das Potenzial, weiter als einen hohen Durchsatz, automatisierte Tests für die Prüfung von mehr anspruchsvolle experimentelle Hypothesen ermöglichen entwickelt werden.

Wir beschreiben die Verwendung einer Maus ES-Zell-basierte Assays, um kritische Zeitfenster für Wnt / β-Catenin und BMP-Signal Aktivierung während kardiogenen Induktion zu identifizieren. Die Methode bietet eine standardisierte Plattform, die zuverlässig quantifiziert kardiogenen Effizienz, und es ist für das Studium der anderen Zelllinien.

Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Die Differenzierung pluripotenter Stammzellen wird durch die zeitliche und räumliche Regulierung mehrerer wichtiger Signalwege eng gesteuert. Eine der Hürden ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die entscheidende zeitliche Regulation zu identifizieren, die für die Differenzierung von Kardiomyozyten in embryonalen Stammzellen der Maus erforderlich ist. Dies wird erreicht, indem zunächst embryonale Körperchen in einer 96-Loch-Rundbodenplatte gebildet werden, um die EB-Bildung zu standardisieren, was als zweiter Schritt dient. Über einen vorbestimmten Zeitraum hinweg werden den EBs Protein- oder chemische Modulatoren hinzugefügt, wodurch eine zeitliche Kontrolle der untersuchten Signalwege ermöglicht wird.Anschließend werden die schlagenden EBS manuell quantifiziert, um die Induktionseffizienz verschiedener Signalmodulationsschemata zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die zeitlichen Anforderungen essentieller Signalwege für die Differenzierung zu Kardiomyozyten auf, basierend auf dem Prozentsatz gebildeter schlagender EBS sowie der Bestätigung mittels der Hanging-Drop-Methode. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie den Hanging Drops besteht darin, dass sie ein arbeitsintensives Verfahren standardisiert und vereinfacht und eine direkte quantitativen Auswertung ermöglicht.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Stammzellbiologie beantworten, beispielsweise die Identifizierung wesentlicher Signalwege, die die Differenzierung in den gewünschten Zelltyp steuern. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie Gro-Maus-embryonale Stammzellen in 10 cm Zellkulturschalen mit Maus-ES-Zellmedium, das mit Faktor zur Hemmung der Leukämie ergänzt ist, kultivieren. Wenn die ES-Zellen eine Konfluenz von 50 bis 70 % erreicht haben, sind sie gebrauchsfertig.Entfernen Sie das ES-Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit fünf Millilitern steriler PBS. Geben Sie zwei Milliliter 0,05 %iger Trypsin-EDTA-Lösung pro Platte hinzu und inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten. Danach stoppen Sie die Trypsin-EDTA-Wirkung durch Zugabe von je drei Millilitern ES-Medium pro Platte und überführen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Bei 1000 Umdrehungen pro Minute drei Minuten lang zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und das Zellenpellet mit der gewünschten Menge EB-Medien resuspendieren. Die Zellanzahl bestimmen und anschließend die Zellen auf fünf mal 10 hoch drei Zellen pro Milliliter verdünnen.In EB-Medien mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter EB-Medien, die Zellen enthalten, in jedes Loch einer 96-Rundboden-Mikrotiterplatte geben. Die Anzahl der benötigten 96-Loch-Platten hängt von der Anzahl der Bedingungen und Zeitpunkte des Experiments ab. Die 96-Rundboden-Mikrotiterplatten in einen befeuchteten 37 °C warmen 5 % CO₂-Inkubator stellen, um kritische Zeitfenster wichtiger Signalwege für die Kardiogenese zu identifizieren.Modulatoren spezifischer Signalwege werden den ES-Zellen hinzugefügt. In die Rundbodenmikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen werden die in Medium verdünnten Signalwegmodulatoren zu verschiedenen Zeitpunkten in jede Vertiefung gegeben. Die Hälfte der Vertiefungen jeder 96-Loch-Platte wird für jeden Behandlungsbeginn verwendet.Einer Kontrolle mit Fahrzeuglösung werden jeweils für jeden Zeitpunkt die anderen 48 Vertiefungen hinzugefügt. An verschiedenen Endpunkten werden wir die Signalmoleküle durch Mediumwechsel aus jeder Vertiefung auswaschen, wobei besondere Vorsicht geboten ist, um die embryonalen Körperchen nicht zu stören. An verschiedenen Zeitpunkten erfolgt das Auswaschen der Modulatoren durch Erneuern des EB-Mediums in den Vertiefungen. Kippen Sie die 96-Loch-Platte um etwa 10 Grad und entfernen Sie vorsichtig das Medium aus den Vertiefungen mit einer Mehrkanalpipette.Gegeben Sie anschließend EB-Medien ohne Modulator zu jedem Brunnen hinzu, wenn die Behandlung länger als 48 Stunden dauert. Ersetzen Sie die mit frischen Modulatoren angereicherten EB-Medien alle zwei Tage, bis der gewünschte Endzeitpunkt erreicht ist. Untersuchen Sie sieben Tage nach Induktion der EBS durch Übertragung der ES-Zellen in 96-Well-Platten die EB-Kontraktion unter dem Mikroskop.Bewerten Sie die Vertiefungen mit kontrahierenden EBS als positive Ergebnisse, um die Prozentsätze kontrahierender EBS für jeden unterschiedlichen Behandlungszeitverlauf zu erhalten. Die durch die 96-Loch-Platten-Experimente identifizierten Zeitfenster der Signalübertragung für die Kardiogenese können an EBS überprüft werden, die aus hängenden Tropfen hergestellt wurden, um hängende EBS-Tropfen zu erzeugen. Bereiten Sie zunächst Petrischalen vor, indem Sie drei bis vier Milliliter PBS hinzufügen, um später eine Verformung der Tropfen zu verhindern.Als Nächstes wird eine ES-Zellsuspension, die eine Enddichte von 2,5 × 10⁴ Zellen pro Milliliter aufweist, in eine Bakterienschale gegeben, um einen einfachen Zugang zu ermöglichen. Mit einer Mehrkanalpipette werden 20-μl-Tropfen der ES-Zellen auf die umgedrehten Deckel der Petrischalen appliziert. Dabei dürfen die einzelnen Tropfen einander nicht berühren.Im Allgemeinen kann ein Deckel bis zu 80 Tropfen aufnehmen. Danach den Deckel umdrehen und über die Petrischale mit PBS legen, und 48 Stunden in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren, um die Bildung von EBs zu ermöglichen. Nach 48 Stunden die aus hängenden Tropfen gebildeten EBs von jedem Deckel mit drei Milliliter EB-Medium abwaschen.Ziehen Sie zwei Deckel von EBS in eine neue Petrischale. Inkubieren Sie die Petrischale vier Tage lang in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Am vierten Tag übertragen Sie die EBS in Suspension auf mit 0,2 % Gelatine beschichtete Sechs-Well-Platten. Jeweils 30 EBS werden in jede Vertiefung übertragen und mit Signalmolekülen inkubiert, und zwar zu dem Zeitpunkt, der in den Experimenten mit 96-Well-Platten ermittelt wurde, sieben Tage nachdem die hängenden Tropfen hergestellt wurden.Beobachten Sie die EBs unter dem Mikroskop auf Kontraktion. ES-Zellen, die in den runden Bodenmulden einer 96-Loch-Platte kultiviert werden, bilden EBs, wie in diesem repräsentativen Bild eines am vierten Tag gebildeten EBs dargestellt. Die entscheidenden Zeitpunkte für die ES-Kardio-Genese sind die Zeitfenster, die im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle den höchsten Prozentsatz an kontrahierenden EBs aufweisen, nach Behandlung mit Signalmolekül-Modulatoren. Gezeigt ist hier ein spontan kontrahierender Fokus von Kardiomyozyten, der sich aus dorsomorphinbehandelten ES-Zellen am Tag 10 der Differenzierung in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte gebildet hat.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man effizient kritische zeitliche Regulationsmechanismen und zeitliche Fenster wichtiger Signalwege in der ES-Kardio-Genese identifiziert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Kardioblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen kardialen Vorläuferzellen und funktionelle Kardiomyozyten für Herz-Kreislauf-Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Generierung und Quantifizierung verschiedener reprogrammierter kardialer Subtypen unter Verwendung einer Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5.

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Hier präsentieren wir eine Methode, um effizient die kardialen Differenzierung junge Quellen humaner mesenchymaler Stammzellen um funktionelle, Auftraggeber, Cardiomyocyte-wie Zellen erzeugen Potenzial in-vitro-.

In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

Hier präsentieren wir eine robuste Methode zur primären embryonale Fibroblasten in funktionellen Herzmuskelzellen durch Überexpression des GATA4, Hand2, Mef2c und Tbx5, MiR-1 und MiR-133 (GHMT2m) neben Hemmung der TGF-β-Signal neu zu programmieren. Unser Protokoll generiert schlagende Herzzellen bereits 7 Tage nach Transduktion mit bis zu 60 % Wirkungsgrad.

Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalisierung potenziert Faktor-vermittelten Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ausbildung einer Zellpopulation, die mit elektrischen und mechanischen Reizen emuliert kardiale Physiologie. Diese elektromechanische Stimulation erhöht das Cardiomyogenic Potenzial der behandelten Zellen und ist eine vielversprechende Strategie für weitere Zelltherapie, Krankheit Modellierung und Drogen-Screening.

Gleichzeitige elektrische und mechanische Stimulation, Cells Cardiomyogenic Potenzial zu steigern

In diesem Protokoll zeigen wir und erläutern, wie man humaninduzierte pluripotente Stammzellen zur Kardiomyozytendifferenzierung und -reinigung verwendet und weiter, wie die Transplantationseffizienz mit dem Rho-assoziierten Proteinkinase-Inhibitor verbessert werden kann. Vorbehandlung in einem Maus-Myokardinfarktmodell.

Verbesserung der Transplantation von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten Kardiomyozyten über eine transiente Hemmung der Rho Kinase Aktivität

Wir beschreiben hier die Einrichtung und Anwendung einer Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (unten als αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 bezeichnet) Maus-Reporterlinie zur Beurteilung der kardialen Reprogrammierung. Neonatale kardiale Fibroblasten (NCFs), die aus dem Mausstamm isoliert wurden, werden in induzierte Kardiomyozyten (iCMs) umgewandelt, was eine bequeme und effiziente Bewertung der Reprogrammierungseffizienz und der funktionellen Reifung von iCMs über den...

In-vitro-Beurteilung der kardialen Reprogrammierung durch Messung des kardialspezifischen Calciumflusses mit einem GCaMP3-Reporter

Die ultraschallgesteuerte Zellabgabe um die Stelle des Myokardinfarkts bei Mäusen ist eine sichere, effektive und bequeme Art der Zelltransplantation.

Ultraschallgesteuerte induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten-Implantation bei myokardinfarktierten Mäusen

Die Kombination aus Laserporation und Mikroelektrodenarrays (MEA) ermöglicht aktionspotentialartige Aufnahmen von kultivierten Primär- und Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten. Die Wellenformform bietet einen besseren Einblick in die Wirkungsweise von Testverbindungen als Standardaufzeichnungen. Es verbindet Patch-Clamp und MEA-Anzeige, um die kardiosichere Forschung in Zukunft weiter zu optimieren.

Laserinduzierte Aktionspotential-ähnliche Messungen von Kardiomyozyten an Mikroelektrodenarrays für erhöhte Vorhersagbarkeit der Sicherheitspharmakologie

Dieses Protokoll stellt einen detaillierten methodischen Rahmen für die Elektroporations-basierte Transgenese von Herzzellen in sich entwickelnden Mausherzen dar. Die hier bereitgestellten Video-Assets erleichtern das Erlernen dieser vielseitigen Technik.

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Dieses Protokoll misst quantitativ die Stabilität und Halbwertszeit intergener und intragenischer Enhancer-RNAs in embryonalen Mausstammzellen mittels Actinomycin-D-Behandlung, RT-qPCR und nichtlinearer Regressionsanalyse. Positionsspezifische Normalisierungsstrategien werden integriert, um die Zerfallsdynamik von eRNA kontextabhängig genau zu modellieren.

Optimierte quantitative Bewertung der Stabilität der Enhancer-RNA in embryonalen Mausstammzellen

Erfahren Sie, wie Sie mit einem standardisierten 96-Well-Platten-Assay die kardiogene Induktionseffizienz in embryonalen Mausstammzellen quantifizieren. Diese Methode ermöglicht die zeitliche Kontrolle von Signalwegen.

Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

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