Kostengünstige Methode für Mikrobielle Source Tracking mit spezifischen menschlichen und tierischen Viren

Kostengünstige Methode zur Verfolgung mikrobieller Quellen unter Verwendung spezifischer humaner und tierischer Viren. Die Studie beschreibt eine kostengünstige Methode zur Identifizierung der Quelle der Kontamination durch fäkalen Urin oder der Kontamination durch Nitrate in Wasser mittels quantitativer PCR zur spezifischen Quantifizierung von humanen Schweine-, Rinder-, DNA-Viren, Adenoviren und Polyomaviren, die als Instrumente zur Verfolgung der mikrobiellen Quelle vorgeschlagen werden. Wir haben ein Protokoll für die Konzentration von Viren aus 10-Liter-Wasserproben durch organische Flockung unter Verwendung von Magermilchextraktion viraler Nukleinsäuren aus dem Sediment und Quantifizierung von DNI-Viren von menschlichen Rindern oder Schweinen mittels quantitativer PCR entwickelt.

Es ist allgemein bekannt, dass die mikrobielle Kontamination des Vitamins ein erhebliches Gesundheitsrisiko darstellt, und wir müssen die Quellen der Kontamination kennen. Wir haben die Verwendung von weit verbreiteten DNA-Viren als Instrumente zur Verfolgung mikrobieller Quellen vorgeschlagen. Bei den ausgewählten Viren handelt es sich um Adenoviren und Polyomaviren.

Diese Viren werden das ganze Jahr über und in allen geografischen Gebieten persistent ausgeschieden. In früheren Studien untersucht. Wir haben robuste, kostengünstige Konzentrationsmethoden für Viren in Wasser entwickelt und an der Entwicklung von QPCR-Assays für die Quantifizierung von Purin-Adenoviren und bovinen Polyomaviren gearbeitet.

Darüber hinaus verwenden wir humane Adenoviren, NGC-Polyomaviren, die mit QPCR getestet wurden, auch als Marker für menschliche Kontamination im Wasser, Entnahme von Wasserproben. In dieser Studie werden vier Replikate von 10 Litern pro Wasserprobe in Kunststoffbehältern mit flachem Boden und eine zusätzliche Probe als Prozesskontrolle gesammelt. Diese letzte Probe wird mit einer bekannten Menge der Viruspartikel besiedelt, die als Kontrolle verwendet werden.

Eine Negativkontrolle wird im Labor vorbereitet, indem konditioniertes Leitungswasser in einem zusätzlichen 10-Liter-Plastikbehälter verwendet wird. Wenn die Probe eine große Menge an Schwebstoffen, Sand und anderen Materialien enthält, lassen Sie sie 15 Minuten lang sedimentieren und füllen Sie das Wasser in einen neuen Behälter um. Viruskonzentration durch organische Flockung.

Der Nachweis von Viren in gering oder mäßig verschmutzten Wasserproben erfordert die Konzentration der Viren aus mindestens mehreren Litern Wasser in einem deutlich kleineren Volumen. Das Konzentrationsverfahren umfasst die Ansäuerung von 10-Liter-Wasserproben, die Flockung mit der Schwerkraft der Magermilch, die Sedimentation der Herden und das Sammeln des Niederschlags in 10 Millilitern Phosphatpuffer, um den Prozess zu starten, eine Lösung zur Lokalisierung von Magermilch in künstlichem Meerwasser wird hergestellt, indem 10 Gramm Magermilchpulver in einem Liter künstlichem Meerwasser aufgelöst und der pH-Wert vorsichtig auf 3,5 eingestellt wird. Bei Salzsäure sollte die Herde sichtbar sein.

Bereiten Sie die Lösung kurz vor der Verwendung vor oder lagern Sie sie 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Die Wasserproben werden gerührt und die Leitfähigkeit in den Proben gemessen. Liegt sie unter 1,5 Millisiemens, wird Meersalz zugesetzt.

Stellen Sie den pH-Wert der Wasserprobe durch Zugabe von Salzsäure auf 3,5 ein. Erfassen Sie den pH-Wert der Proben vor und nach der Konditionierung sowie das Volumen der verwendeten Salzsäure. Auch die Leitfähigkeit sollte aufgezeichnet werden.

Nachdem wir den pH-Wert angepasst haben, fügen wir 100 Milliliter Magermilch hinzu, 1 % zu der 10-Liter-Wasserprobe, und rühren die Proben acht bis 10 Stunden lang, damit die Viren in die Herden aufgenommen werden können. Für die Spike-Probe, die als Prozesskontrolle verwendet wird, fügen Sie der Probe das Standardvolumen des Kontrollvirus, z. B. einen Milliliter, hinzu. Stoppen Sie das Rühren und lassen Sie die Herde acht bis 10 Stunden lang durch die Schwerkraft sedimentieren.

Nach 16 Stunden, in der Regel am nächsten Tag, können wir die Sedimente einsammeln. Entfernen Sie dazu den Überstand mit einer Schlauchpumpe. Sammeln Sie das Sediment mit den Flocken, ca. 500 Milliliter in eine Zentrifugenflasche.

Gleichen Sie die Töpfe durch Zugabe von Magermilch mit einem pH-Wert von 3,5 aus, zentrifugieren Sie die Töpfe mit einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge von 8.000 g 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Sobald die Zentrifuge stoppt, nehmen Sie die Zentrifugentöpfe vorsichtig aus der Zentrifuge. Gießen Sie den Überstand sehr vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn.

Lösen Sie das Pellet in jeder Zentrifugenflasche auf ein Endvolumen von 10 Milliliter Phosphat auf, Nukleinsäureextraktion und Quantifizierung der Viren. Das virale Konzentrat wird für die Extraktion von viralen Nukleinsäuren verwendet und die spezifischen Adenoviren und Polyomaviren von Interesse werden mit A-Q-P-C-R quantifiziert. Führen Sie eine Nukleinsäure-Extraktion mit dem Key Amp Viral RNA Mini-Kit durch.

Die Lyse der Viren vorhanden in 140. Die Mikroliter der viralen Konzentrate werden manuell durchgeführt und die Gesamtnukleinsäuren werden auf 80 Mikroliter extrahiert. Dieses Kit ermöglicht die Verwendung einer automatisierten Plattform wie z.B. Key cube.

Der nächste Schritt ist die Quantifizierung des viralen Genoms. Kopien in den Proben unter Verwendung einer quantitativen PCR mit Tac-Man-Sonden, humanen Adenoviren, JC-Polyomaviren und bovinen Polyomaviren können in derselben 96-Well-Platte quantifiziert werden. Da alle die gleichen Amplifikationszyklen verwenden, sollten porzine Adenoviren zur Quantifizierung des Zielvirus separat in einer unabhängigen Platte getestet werden.

Bereiten Sie den quantitativen PCR-Mix in einem sauberen, abgetrennten Bereich vor. Sobald die Mischung vorbereitet ist, geben Sie 15 Mikroliter in jede Vertiefung, einschließlich der Kontrollen. Fügen Sie die Nukleinsäureextraktionen aus den Proben 10 Mikroliter in einem separaten Bereich hinzu, führen Sie eine direkte und zehnfache Verdünnung in gereinigtem Wasser jeder Probe in doppelter Ausführung durch, das Gesamtvolumen für eine Reaktion nach Zugabe des Ziels beträgt 25 Mikroliter, 15 der Mischung plus 10 der Probe oder die Standardabdeckung der Vertiefungen, die die Proben enthalten, mit einem Teil einer Klebeabdeckung

Bewahren Sie den anderen Teil der Abdeckung für den folgenden Schritt auf. AB-Verdünnung der DNA-Standardsuspensionen. 10 Mikroliter von 10 bis null auf 10 bis sechs Genomkopien, vorgetäuschte Mikroliter in dreifacher Ausfertigung und unter Verwendung eines Mikro-Pbits, das ausschließlich für die Standard-DNA-Abdeckung verwendet wird.

Die Vertiefungen, die die Standards enthalten, mit der zuvor abgeschnittenen Klebeabdeckung. Diese Abbildung zeigt die Verteilung der Standardsuspensionsproben und Kontrollen. In der 96-Well-Platte.

Führen Sie die QPCR in einem geeigneten System durch und wählen Sie die entsprechenden Parameter aus, nachdem das Amplitudengold 10 Minuten lang aktiviert wurde. Bei 95 Grad Celsius werden 40 Amplifikationszyklen durchgeführt, sobald die Reaktionen abgeschlossen sind. Speichern Sie Daten und Ergebnisse wie in der Bedienungsanleitung des verwendeten Geräts beschrieben.

Die DNA-Menge wird als Median der Daten definiert, die nach Korrektur des Verdünnungsfaktors bei Bedarf erhalten werden. Das Amplifikationsdiagramm und die Standardkurve für die Quantifizierung von Schweineadenoviren zeigten einen Korrelationskoeffizienten von 0,999. Zulässige Steigungswerte liegen je nach Verfahren zwischen minus 3,1 und minus 3,6.

Beschriebene humane und tierische Viren wurden in Grundwasserproben aus einem Gebiet mit hohen Nitratgehalten getestet, um die Kontaminationsquellen zu bestimmen. Die vier analysierten Replikate zeigten positive Ergebnisse für den Mittelwert von Schweineadenoviren von 7,74 pro 10 bis zwei Genomkopien pro Liter, der mit dem Vorhandensein von Schweinegülle in der Umgebung der Probenahmestelle zusammenhängt und das Vorhandensein von fäkaler Schweinekontamination im Grundwasser beweist. In keiner der untersuchten Proben war eine Kontamination des Menschen vorhanden.

Die virologischen Daten wurden durch Nested PCR und Sequenzierungsanalyse bestätigt. Schlussfolgerung. In dieser Studie haben wir Ergebnisse der Analyse von Grundwasserproben vorgelegt, die eine Kontamination schweinischen Ursprungs in Abwesenheit von Kontaminationen durch Mensch oder Rind darstellen. Das Verfahren wurde auch bei der Analyse von Badegewässern, Meerwasser und Flusswasser angewendet.

Wir stellen hier das Verfahren zur Anwendung dieser Werkzeuge zur Identifizierung der Kontaminationsquelle im Grundwasser vor und stellen hohe Nitratgehalte als Beispiel für die Anwendbarkeit der entwickelten Methoden zum Nachweis der Kontaminationsquelle in der Umwelt vor.