Name: Kostengünstige Methode für Mikrobielle Source Tracking mit spezifischen menschlichen und tierischen Viren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zum mikrobiellen Source Tracking mit quantitativer PCR zur Quantifizierung spezifischer humaner, porciner und boviner DNA-Viren wie Adenoviren und Polyomaviren in Wasserproben.

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Diese Arbeit wurde teilweise von der spanischen Regierung &quot;Ministerio de Educación y Ciencia&quot; (Projekt AGL2008-05275-C01/ALI) unterstützt, die von der Europäischen Union im 7. Rahmenprogramm Forschung geförderten Projekten VIROBATHE (Contract No 513648), VIROCLIME (Contract No 243923 ) und durch die Katalanische Agentur für Wasserwirtschaft, Agència Catalana de l&#39;Aigua (ACA), Departament de Control i Millora dels Ecosistemes Wassersport. Während die entwickelten Studie Marta Rusiñol war Stipendiat der katalanischen Regierung &quot;AGAUR&quot; (FI-DGR).

1. Die Konzentration der viralen Partikel in Wasserproben <ol><li> Sammlung und Aufbereitung von Wässern <ol><li> Sammeln Sie mindestens 2 Wiederholungen von 10 L pro Probe in Kunststoff-Behälter mit flachem Boden und einer zusätzlichen Probe als einen Prozess zu steuern. Diese letzte Probe wird mit einer bekannten Menge von Viruspartikeln versetzt werden und als eine Kontrolle. Hinweis: Es wird empfohlen, spezielle getrennte Material (Flaschen, Rohre, etc.) für die aufgestockten Proben haben. </li><li> Überprüfen Sie die Kalibrierung des Leitfähigkeitsmesser und neu kalibrieren, wenn nötig. Bereiten Sie eine negative Kontrolle mit Leitungswasser vorher auf die ausreichende Leitfähigkeit eingestellt (siehe unten 1.6) in einem extra Kunststoff 10 l-Behälter. </li><li> Für dotierten Proben: Fügen Sie die Standard-Lautstärke der Kontrolle Virus (ca. 10 5 Genomkopien pro 10 l Wasser) auf die Probe. Mix durch Rühren vermeiden Spritzer und Aerosole. Positive Kontrollen könnten in einer ungewöhnlichen Belastung von Adenovirus s bestehenuch als HAdV-35 oder einem Bakteriophagen wie MS2. </li><li> Wenn die Probe stellt hohe Menge an suspendiertem Material (Sand oder anderen Materialien), lassen Sie es Sediment für 15 Minuten. Übertragen Sie die Wasser in einen neuen Container. </li><li> Den pH-Wert der Wasserprobe auf 3,5 (± 0,1) durch die Zugabe von 1 N HCl. Dieser Schritt ist für die Konzentration der Viren wichtig, so stellen Sie sicher, dass der pH-Wert wurde richtig eingestellt. Mix das Wasser gründlich durch kräftiges Rühren unter Zugabe der HCl. (Hinweis: Wenn der pH-Wert niedriger als 3,5 add 1 M NaOH). </li><li> Passen Sie die Leitfähigkeit. Wenn die Probe hat eine Leitfähigkeit von 1500 S / cm oder höher, ist dieser Schritt nicht erforderlich. Ist die Leitfähigkeit niedriger als 1500 S / cm die Bildung von ausgeflockte Material (Flocken) ist nicht garantiert, so stellen Sie die Leitfähigkeit bis 1500 S / cm durch den Zusatz von künstlichen See Salze (Sigma). Kräftig mischen, unter Rühren unter Zugabe von Meer-Salze. </li><li> Notieren Sie den pH-Wert der Proben vor und nach der Konditionierung als gut eins das Volumen der HCl verwendet. Die Leitfähigkeit sollte auch nach Einstellung des pH aufgezeichnet werden. Immer desinfizieren das pH-Meter und Konduktometer Elektroden mit einem frischen HCl-Lösung, mit 10% iger Lösung tiosulphate entchloren und schließlich mit destilliertem Wasser spülen. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Vor-geflockt 1% Magermilch (PSM) <ol><li> Überprüfen Sie die Kalibrierung des pH-Meter und die Konduktometer und neu kalibrieren, wenn nötig. </li><li> Bereiten Sie vor ausgeflockt Magermilch-Lösung (1% PSM, w / v) durch Auflösen von 10 g Magermilchpulver (Difco) in 1 L künstlichem Meerwasser (Auflösung 33,3 g künstliche Meersalz in 1 l entchlortem Leitungswasser und Autoklaven) und sorgfältig der pH-Wert auf 3,5 mit 1N HCl. Die Flocken sichtbar sein soll. Bereiten Sie die Lösung kurz vor verwendet werden soll oder lagern bei 4 ° C für 24 h Für Dechlorierung Verwendung von 1 ml 10% tiosulphate Lösung pro 100 ml Wasser. </li></ol></li><li> Flockung von Viruspartikeln in Wasserproben<ol><li> Add 100 ml von 1% PSM auf die 10-L Wasserprobe. </li><li> Rühren Sie die Proben für 8-10 h, damit die Viren an die Flocken zu adsorbieren. Verwenden Sie einen Timer zum Abschalten des Rührens nach 8-10 h. </li><li> Stoppen Sie das Rühren und lassen Sie die Flocken Sediment durch die Schwerkraft für 8-10 h. </li></ol></li><li> Das Sammeln und wieder Lösen der Flocken. Zentrifugation <ol><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer Schlauchpumpe und einer Kunststoff-Pipette verbunden mit einem Kunststoffrohr. Für dotierten Proben der Überstand sollte in eine Flasche gesammelt und desinfiziert werden nach internen Verfahren. In allen Fällen darauf achten, nicht auf das Pellet zu sammeln. </li><li> Sammeln Sie die Sedimente mit den Flocken (ca. 500 ml) in einer Zentrifuge Flasche. </li><li> Gleichen Sie die Töpfe durch die Zugabe von PSM pH 3,5. </li><li> Zentrifugieren Sie die Töpfe in einen Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge bei 8.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Sobald die Zentrifuge stoppt, entfernen Sie vorsichtig die Zentrifuge Töpfe aus der Zentrifuge. </li><li> Sehr gently abgießen und den Überstand verwerfen. Folgen Sie geeignete Maßnahmen zur infektiösem Material. </li><li> Add 7 ml Phosphatpuffer, um das Pellet in jede Zentrifuge Flasche zu lösen. </li><li> Nachdem die Flocken aufgelöst haben, messen und fügen Phosphatpuffer auf ein Gesamtvolumen von 10 ml zu erreichen. </li><li> Homogenisieren der viralen Konzentrat durch Vortexen und verteilen die 10 ml in ein sauberes Röhrchen, die bei -80 ° C sollte bis zum Gebrauch in die weitere Analyse. </li></ol></li></ol> 2. Nukleinsäure-Extraktion <ol><li> Führen Sie eine Nukleinsäure-Extraktion mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Dieses Kit ermöglicht die Verwendung eines automatisierten Plattform (wie QIAcube, Qiagen). </li></ol> 3. Quantitative PCR von humanen Adenoviren (HAdV), JC Polyomaviren (JCPyV), Schwein Adenoviren (PAdV) und Rinder-Polyomaviren (BPyV) <ol><li> Die Quantifizierung der Genom-Kopien in den Proben <ol><li> Vorbereitender qPCR Mix in einem sauberen separaten Bereich mit TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x (Applied Biosystems). Die Reaktion findet in einem 96-Loch-optische Reaktion Platte mit optischer Kleber abdeckt. Die Konzentrationen der Master Mix, sind Primer und Sonden in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Sobald die Mischung hergestellt wurde, aliquoten 15μl in jede Vertiefung, einschließlich der Kontrollen (siehe 3.2). Das Gesamtvolumen für eine Reaktion nach Zugabe von Ziel wird es sein 25 &amp;mgr; l (15μl Mix + 10 &amp;mgr; l Probe oder Standard). </li><li> Fügen Sie die Nukleinsäure-Extraktionen aus den Proben (10 &amp;mgr; l) in einem separaten Bereich. Run direkte und eine zehnfache Verdünnung in gereinigtem Wasser von jeder Probe in zweifacher Ausfertigung. Decken Sie die Vertiefungen mit den Proben mit einem Teil eines Klebstoffes decken, halten die anderen Teil der Abdeckung für den folgenden Schritt. </li><li> Add Verdünnungen der DNA-Standard-Suspensionen (10 &amp;mgr; l) von 10 0 bis 10 6 GC/10μl von dreifacher Ausfertigung und mit einer Mikropipette ausschließlich für den stan verwendetdard-DNA. Es ist ratsam, die Standards in einem Gebiet mit UV-Strahlung für die Zerstörung Plasmid-DNA und der Mikropipette nach jedem Gebrauch gereinigt ausgestattet hinzuzufügen. Decken Sie die Vertiefungen mit den Standards der pre-cut Klebstoff zu decken. Hinweis: Um Standard-Suspensionen in der Quantifizierung der Genom-Kopien verwendet werden vorbereitet, sollte der Ziel-DNA Region in ein Plasmid und linearisierte geklont werden. In der folgenden Adresse finden Sie eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens, wie man Standard-Kurven mit Plasmid-DNA-Templates in qPCR eingesetzt werden zu erstellen: <a href="http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf">http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf</a> </li><li> Führen Sie die qPCR in ein angemessenes System der Auswahl der geeigneten Parameter (unter Berücksichtigung der Verwendung von Klebstoff Abdeckung und das Gesamtvolumen in jede Vertiefung, etc). Nach der Aktivierung der AmpliTaq Gold für 10 min bei 95 ° C, 40 Zyklen der Amplifikation sind wie folgt durchgeführt: 15 s bei 95 ° Cund 1 min bei 60 ° C für HAdV, JCPyV und BPyV und 15 s bei 95 ° C, 20s bei 55 ° C und 20s bei 60 ° C für PAdV. </li><li> Sobald die Reaktionen abgeschlossen sind, verwendet Daten speichern und die Ergebnisse wie in der Bedienungsanleitung des Gerätes beschrieben. Die DNA-Menge wird als der Median der Daten nach der Korrektur der Verdünnungsfaktor bei Bedarf erhalten definiert werden. </li></ol></li><li> Steuerung <ol><li> Verwenden Sie positive und negative Kontrollen. Der Test muss mehr als eine Nicht-Template (NTC) zu beweisen, Mix produziert keine Fluoreszenz. Es ist ratsam, den positiven Prozess-Steuerung laufen lassen, um mögliche enzymatische Hemmung durch Inhibitoren, die in den untersuchten Proben zu bewerten. </li><li> Rekordergebnis von qPCR-Assays von zwei verschiedenen Verdünnungen der Standard-DNA und von der Prozess-Steuerung. Verwenden Ergebnisse Regelkarten für die Qualitätskontrolle (QC)-Programme im Zusammenhang mit der Sensitivität und Effizienz des Tests vorzubereiten. </li></ol></li><li> Bestätigung derErgebnisse <ol><li> Positive Ergebnisse können weiter bestätigt werden mittels nested-PCR-und Nukleotid-Sequenzierung der Amplifikate, produziert zusätzliche Daten über die Nukleotidsequenzen der Stämme nachgewiesen 1,5,6,7,9,12. </li></ol></li></ol> Nach der beschriebenen Vorgehensweise haben menschlichen und tierischen Viren nachgewiesen und quantifiziert in Badegewässern, Meerwasser und Flusswasser 2,3. Als repräsentatives Beispiel wurden Grundwasserproben aus den Bereichen präsentiert ein hohes Maß an Nitraten ausgewertet, um die Quellen der Verunreinigungen zu definieren. Zehn-Liter-Wasser-Proben wurden aus 4 verschiedenen Brunnen in ländlichen Gebieten der Nordost-Region in Spanien gesammelt. Fünf Wiederholungen wurden in jede Vertiefung wird ein Replikat mit humanen Adenovirus 2 als Prozesskontrolle eingesetzt ausgesät gesammelt. Die Proben wurden nach dem Protokoll in Abbildung 1 dargestellt verarbeitet. Die vier Wiederholungen analysiert in einem der vier Standorte untersucht zeigten positive Ergebnisse für PAdV (Mittelwert 7,74x10 2 GC / L), die auf das Vorhandensein von Schweine-Schlämmen in den Bereichen rund um die Probenahme vor Ort bezogen sein würde und würde fäkale Kontamination Schweine als Quelle von Nitraten in das Grundwasser (Tabelle 2) zu unterstützen. 4. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2820/2820fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Verfahren zur Detektion und Quantifizierung von Viren im Wasser. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table1.jpg" alt="Tabelle 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 1"> Tabelle 1. Konzentration der Primer und Sonden für die qPCR-Assays. <img src="/files/ftp_upload/2820/2820table3.jpg" alt="Tabelle 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabelle 3"> Tabelle 2. Erkennung und Quantifizierung von tierischen und menschlichen Adenoviren und Polyomaviren in Grundwasserproben. n Anzahl der Wiederholungen analysiert % Anteil der positiven repliziert (-) Nicht erkannt

<ol><li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li>
<li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li>
<li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel%2C+Mytilus+edulis%3A+the+first+Scandinavian+report%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li>
<li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li>
<li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li>
<li>de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li>
<li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li>
<li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li>
<li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Z.+Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li>
</ol>

Zwei Patentanmeldungen wurden 2009 eingereicht, um das geistige Eigentum von Protokollen für die Quantifizierung der PAdV und BPyV schützen.

<html> Die beschriebene Vorgehensweise würde die Voraussetzungen für eine passende Methode für den Routineeinsatz Umwelt und öffentliche Gesundheit Laboratorien: reproduzierbar, zuverlässig, unkompliziert und kostengünstig. Das Protokoll ist einfach, aber es müssen unbedingt beachtet werden. Niedrige Leitfähigkeit in den Proben ohne Zugabe von der angeforderten Konzentration von künstlichem Meerwasser Salze würden drastisch reduzieren die Wiederherstellung von Viren wie der Fall wäre, wenn die Rührzeit zur Flockung deutl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> High-Speed-Zentrifuge (8.000 xg) </td><td> Berckman Coulter </td><td> Avanti J-20XP </td><td></td></tr><tr><td> pH-Meter, Thermometer und Konduktometer </td><td> Afora </td><td> LPPC3003 </td><td></td></tr><tr><td> Kunststoffrohre 100-200 cm Länge </td><td> Deltalab </td><td> 350059 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile absolvierte Einwegpipetten </td><td> Labclinics </td><td> PN10E1 </td><td></td></tr><tr><td> Sterile Plastikröhrchen von 1,5 und 10-15 ml (Eppendorf, Falken, etc.) </td><td> Afora </td><td> KA298/00 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuge Töpfe (500 mL) </td><td> Fisher Scientific </td><td> SE5753512 </td><td></td></tr><tr><td> Magnetrührer und Magneten (eine proProbe) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10510 </td><td></td></tr><tr><td> Glas-oder Kunststoffbehältern mit flachem Boden, die Nutzung der Magnetrührer ermöglichen </td><td> Deltalab </td><td> 191642 </td><td></td></tr><tr><td> Eine peristaltische Pumpe zum Entfernen des Überstandes (oder ein Wasser-Strahl-Vakuumpumpe) </td><td> Watson-Marlow </td><td> 323E / D </td><td></td></tr><tr><td> Timer zum Abschalten des Rühren nach 8-10 Stunden </td><td> Deltalab </td><td> 900400 </td><td></td></tr><tr><td> Salzsäure (1 N und 0,1 N) </td><td> Panreac </td><td> 141020.1611 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydroxid (1 N) </td><td> Panreac </td><td> 131687.1211 </td><td></td></tr><tr><td> Künstlichem Meerwasser Meersalz </td><td> Sigma </td><td> S9883 </td><td></td></tr><tr><td> Magermilch (SM) </td><td> Difco </td><td> 232100 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatpuffer pH 7, 5 </td><td></td><td></td><td> 1:2 v / v steriler Na 2 HPO 4 0,2 M NaH 2 PO 4 0,2 M bei pH 7,5 </td></tr><tr><td> Thiosulfat </td><td> Panreac </td><td> 121879.1209 </td><td> Machen Sie eine 10% ige Lösung in Wasser </td></tr><tr><td> QIAamp Viral RNA Mini Kit </td><td> Qiagen </td><td> 52904 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Well-optische Reaktion Platte (500 Einheiten) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 43426659 </td><td></td></tr><tr><td> Optische Abdecktüchern (100 Einheiten) </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311971 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4396838 </td><td></td></tr></tbody></table>

kostengünstige methode für mikrobielle source tracking mit spezifischen menschlichen und tierischen viren

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Mikrobielle Kontamination der Umwelt stellt eine erhebliche Gesundheitsgefahr. Klassische bakterielle fäkalen Indikatoren haben gezeigt, dass erhebliche Einschränkungen haben, sind Viren resistenter gegen viele Inaktivierung Prozesse und Standards fäkalen Indikatoren nicht auf die Quelle der Verunreinigung zu informieren. Die Entwicklung von kosteneffizienten Methoden für die Konzentration der Viren aus dem Wasser und molekularen Assays ermöglicht die Anwendbarkeit von Viren als Indikatoren für fäkale Verunreinigungen und mikrobiellen Quelle Tracking (MST)-Tools. Adenoviren und Polyomaviren sind DNA-Viren infizieren bestimmten Wirbeltierarten einschließlich des Menschen und werden dauerhaft in Kot und / oder Urin in allen geografischen Gebieten studiert ausgeschieden. In früheren Studien, schlugen wir die Quantifizierung von humanen Adenoviren (HAdV) und JC Polyomaviren (JCPyV) durch quantitative PCR (qPCR) als Index für die menschliche fäkale Verunreinigungen. Vor kurzem haben wir qPCR-Assays für die spezifische Quantifizierung von por entwickeltcine Adenoviren (PAdV) und Rinder-Polyomaviren (BPyV) als tierische Fäkalien Marker der Kontamination mit Empfindlichkeiten von 1-10 Genom Kopien pro Reagenzglas. In dieser Studie stellen wir die Verfahren, nach dem die Quelle der Kontamination in Wasserproben mit diesen Tools zu identifizieren. Als Beispiel für repräsentative Ergebnisse, ist die Analyse der Viren im Grundwasser stellt ein hohes Maß an Nitraten gezeigt. Nachweis von Viren in niedrig oder mäßig verschmutztes Wasser erfordert die Konzentration der Viren von mindestens mehrere Liter Wasser in einem viel kleineren Volumen, ein Verfahren, das in der Regel umfasst zwei Schritte Konzentration in Serie. Diese etwas umständliche Prozedur und die Variabilität der viralen Erholungen zu beobachten wesentlich erschweren die gleichzeitige Verarbeitung einer großen Anzahl von Wasserproben. Zur Beseitigung des Engpasses durch die Zwei-Schritt-Verfahren verursacht haben wir in einem Schritt-Protokoll in den vergangenen studie entwickelt beantragt haben,s und für eine Vielfalt von Wasser-Matrizen. Das Verfahren umfasst: Versauerung der Zehn-Liter-Wasser-Proben, Flockung von Magermilch, Schwerkraftsedimentation der geflockten Materialien, Sammlung des Niederschlags und Zentrifugation, Resuspension des Niederschlags in 10 ml Phosphat-Puffer. Die virale Konzentrat wird für die Extraktion von viralen Nukleinsäuren und die spezifischen Adenoviren und Polyomaviren von Interesse sind, durch qPCR quantifiziert werden. Hohe Anzahl von Proben können gleichzeitig analysiert werden mit dieser Low-Cost-Konzentration Methode. Das Verfahren ist auf die Analyse von Badegewässern, Meerwasser und Flusswasser angewendet, und bei dieser Studie präsentieren wir Ergebnisse der Analyse Grundwasserproben. Diese High-Throughput-quantitative Methode ist zuverlässig, unkompliziert und kostengünstig.

Die Studie beschreibt eine kostengünstige Methode für die Identifizierung der Quelle der fäkale / Urin Kontamination oder Verunreinigung durch Nitrat in Wasser mittels qPCR für die spezifische Quantifizierung von Mensch / Schwein / Rind DNA-Viren, Adenoviren und Polyomaviren als MST-Tools vorgeschlagen.

Kostengünstige Methode für Mikrobielle Source Tracking mit spezifischen menschlichen und tierischen Viren

Die mikrobielle Kontamination der Umwelt stellt ein erhebliches Gesundheitsrisiko dar. Klassische bakterielle fäkale Indikatoren haben sich als signifikant ...

Kostengünstige Methode zur mikrobiellen Quellenverfolgung unter Verwendung spezifischer humaner und tierischer Viren. Die Studie beschreibt ein kostengünstiges Verfahren zur Identifizierung der Quelle von fäkaler Urinverunreinigung oder Nitratkontamination in Wasser mittels quantitativer PCR zur spezifischen Quantifizierung humaner, porciner und boviner DNA-Viren, Adenoviren und Polyomaviren, die als Werkzeuge für die mikrobielle Quellenverfolgung vorgeschlagen wurden. Wir haben ein Protokoll entwickelt, das die Anreicherung von Viren aus 10-Liter-Wasserproben durch organische Flockung, die Extraktion viraler Nukleinsäuren aus dem Sediment unter Verwendung von Magermilch sowie die Quantifizierung humaner, boviner oder porciner DNA-Viren mittels quantitativer PCR umfasst.Es ist allgemein bekannt, dass mikrobielle Verunreinigungen des Vitamins ein erhebliches Gesundheitsrisiko darstellen, und wir müssen die Quellen dieser Verunreinigungen kennen. Wir haben vorgeschlagen, hochprävalente DNA-Viren als Werkzeuge zur Identifizierung mikrobieller Quellen einzusetzen. Die ausgewählten Viren sind Adenoviren und Polyomaviren.Diese Viren werden das ganze Jahr über und in allen geografischen R

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Forschung

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Immunology and Infection

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Hier stellen wir VirWaTest vor, eine einfache, erschwingliche und tragbare Methode zur Konzentration und Detektion von Viren aus Wasserproben am Einsatzort.

VirWaTest, eine Point-of-Use-Methode zum Nachweis von Viren in Wasserproben

Zahlreiche neuartige virusähnliche Sequenzen wurden aufgrund des umfangreichen Einsatzes von Sequenzierungstechnologien in Stechmücken gefunden. Wir stellen ein effektives Verfahren zur Isolierung und Amplifikation von Viren unter Verwendung von Wirbeltier- und Mückenzelllinien zur Verfügung, das als Grundlage für zukünftige Studien zu Stechmücken-assoziierten Viren, einschließlich mückenübertragener und mückenspezifischer Viren, dienen könnte.

Mückenassoziierte Virusisolierung aus im Feld gesammelten Stechmücken

Wir stellen ein Protokoll vor, das die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation mit einem CRISPR/Cas12a-System für den Spurennachweis von DNA-Viren kombiniert und eine tragbare Smartphone-Mikroskopie mit einer durch künstliche Intelligenz unterstützten Klassifizierung für den Point-of-Care-Nachweis von DNA-Viren entwickelt.

DNA-Virusnachweissystem basierend auf RPA-CRISPR/Cas12a-SPM und Deep Learning

Hier stellen wir einen schnellen und kostengünstigen Workflow zur Charakterisierung von Tollwutvirusgenomen (RABV) mit Hilfe der Nanoporentechnologie vor. Der Arbeitsablauf soll die genomikgestützte Überwachung auf lokaler Ebene unterstützen und Informationen über zirkulierende RABV-Linien und deren Einordnung in regionale Phylogenien liefern, um Maßnahmen zur Tollwutbekämpfung zu steuern.

Sequenzierung des gesamten Genoms zur schnellen Charakterisierung des Tollwutvirus mittels Nanoporentechnologie

Hier beschreiben wir einen neu entwickelten Multiplex-Fluoreszenz-Immunoassay, der ein durchflusszytometrisches System mit zwei Reportern verwendet, um gleichzeitig zwei einzigartige Spike-Protein-Epitope auf intakten Viruspartikeln des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) zu detektieren, die von Angiotensin-konvertierenden Enzym-2-gekoppelten magnetischen Mikrosphären eingefangen wurden.

Profilierung von Oberflächenprotein-Epitopen auf viralen Partikeln mittels Multiplex-Dual-Reporter-Strategie

Erfahren Sie eine kostengünstige Methode zum mikrobiellen Source Tracking mit quantitativer PCR zur Quantifizierung spezifischer humaner, porciner und boviner DNA-Viren wie Adenoviren und Polyomaviren in Wasserproben.

Kostengünstige Methode für Mikrobielle Source Tracking mit spezifischen menschlichen und tierischen Viren

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