Kostengünstige Methode für Mikrobielle Source Tracking mit spezifischen menschlichen und tierischen Viren

Kostengünstige Methode zur mikrobiellen Quellenverfolgung unter Verwendung spezifischer humaner und tierischer Viren. Die Studie beschreibt ein kostengünstiges Verfahren zur Identifizierung der Quelle von fäkaler Urinverunreinigung oder Nitratkontamination in Wasser mittels quantitativer PCR zur spezifischen Quantifizierung humaner, porciner und boviner DNA-Viren, Adenoviren und Polyomaviren, die als Werkzeuge für die mikrobielle Quellenverfolgung vorgeschlagen wurden. Wir haben ein Protokoll entwickelt, das die Anreicherung von Viren aus 10-Liter-Wasserproben durch organische Flockung, die Extraktion viraler Nukleinsäuren aus dem Sediment unter Verwendung von Magermilch sowie die Quantifizierung humaner, boviner oder porciner DNA-Viren mittels quantitativer PCR umfasst.

Es ist allgemein bekannt, dass mikrobielle Verunreinigungen des Vitamins ein erhebliches Gesundheitsrisiko darstellen, und wir müssen die Quellen dieser Verunreinigungen kennen. Wir haben vorgeschlagen, hochprävalente DNA-Viren als Werkzeuge zur Identifizierung mikrobieller Quellen einzusetzen. Die ausgewählten Viren sind Adenoviren und Polyomaviren.

Diese Viren werden das ganze Jahr über und in allen geografischen Regionen kontinuierlich ausgeschieden. In früheren Studien untersucht. Wir haben robuste, kostengünstige Anreicherungsmethoden für Viren im Wasser entwickelt und daran gearbeitet, QPCR-Assays zur Quantifizierung von humanen Adenoviren und bovinen Polyomaviren zu etablieren.

Außerdem verwenden wir humane Adenoviren und NGC-Polyomaviren, die mittels QPCR getestet werden, als Marker für humane Kontamination in Wasser; Probennahme von Wassermengen. In dieser Studie werden vier Wiederholungen à 10 Liter pro Wasserprobe in Kunststoffbehältern mit flachem Boden gesammelt sowie eine zusätzliche Probe als Prozesskontrolle. Diese letzte Probe wird mit einer bekannten Menge an viralen Partikeln, die als Kontrolle verwendet werden, angereichert.

Als Negativkontrolle wird im Labor Leitungswasser in einem zusätzlichen 10-Liter-Kunststoffbehälter vorbereitet. Falls die Probe eine hohe Menge an suspendierten Bestandteilen, Sand und anderen Materialien enthält, lässt man sie 15 Minuten lang sedimentieren und gießt das Wasser anschließend in einen neuen Behälter um. Virenkonzentration durch organische Flockung.

Die Detektion von Viren in wenig oder mäßig verschmutzten Wasserproben erfordert die Anreicherung der Viren aus mindestens mehreren Litern Wasser in einem deutlich kleineren Volumen. Das Anreicherungsverfahren umfasst die Ansäuerung von 10-Liter-Wasserproben, die Flokkulation unter Verwendung von Magermilch, die Schwerkraftsedimentation der Flocken und das Sammeln des Niederschlags in 10 Milliliter Phosphatpuffer, um den Prozess einzuleiten. Eine Lösung aus Magermilch in künstlichem Meerwasser wird hergestellt, indem 10 Gramm Magermilchpulver in einem Liter künstlichem Meerwasser gelöst und der pH-Wert vorsichtig auf 3,5 mit Salzsäure eingestellt wird. Die Flocken sollten sichtbar sein.

Bereiten Sie die Lösung unmittelbar vor Gebrauch vor oder lagern Sie sie 24 Stunden bei vier Grad Celsius. Die Wasserproben werden gerührt und die Leitfähigkeit in den Proben gemessen. Liegt sie unter 1,5 Millisiemens, werden Meeressalze zugesetzt.

Stellen Sie den pH-Wert der Wasserprobe durch Zugabe von Salzsäure auf 3,5 ein. Notieren Sie den pH-Wert der Proben vor und nach der Konditionierung sowie das verwendete Volumen an Salzsäure. Auch die Leitfähigkeit sollte aufgezeichnet werden.

Nach der Einstellung des pH-Werts geben wir 100 Milliliter 1 %iger sterilisierter Magermilch zum 10-Liter-Wasserprobe hinzu und rühren die Proben acht bis zehn Stunden lang um, damit die Viren an die Flocken adsorbieren können. Für die Spike-Probe, die als Prozesskontrolle dient, wird das standardmäßige Volumen des Kontrollvirus, beispielsweise ein Milliliter, zur Probe gegeben. Das Rühren wird gestoppt, und die Flocken werden acht bis zehn Stunden lang durch Schwerkraft sedimentieren gelassen.

Nach 16 Stunden, gewöhnlich am folgenden Tag, können wir die Sedimente sammeln. Entfernen Sie dazu den Überstand mithilfe einer peristaltischen Pumpe. Sammeln Sie das Sediment zusammen mit den Flocken, etwa 500 Milliliter, in einer Zentrifugenflasche.

Die Gefäße durch Zugabe von vorbehandeltem entrahmtem Milchpulver pH 3,5 ausgleichen, die Gefäße mit einem Hochgeschwindigkeitszentrifugen bei 8.000 × g 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Unmittelbar nach dem Stillstand der Zentrifuge die Zentrifugengefäße vorsichtig aus der Zentrifuge entfernen. Die Überstände sehr vorsichtig abgießen und verwerfen.

Lösen Sie das Pellet in jeder Zentrifugenflasche in einem Endvolumen von 10 Milliliter Phosphat auf, Nukleinsäure-Extraktion und Quantifizierung von Viren. Das virale Konzentrat wird für die Extraktion viraler Nukleinsäuren verwendet, und die spezifischen Adenoviren und Polyoma-Viren von Interesse werden mittels A-Q-P-C-R quantifiziert. Führen Sie eine Nukleinsäure-Extraktion mit dem KeyAmp Viral RNA Mini Kit durch.

Die Lyse der Viren in 140 µL Viruskonzentrat wird manuell durchgeführt, und die gesamten Nukleinsäuren werden in 80 µL eluiert. Dieses Kit ermöglicht die Verwendung einer automatisierten Plattform wie beispielsweise dem Key cube.

Der nächste Schritt ist die Quantifizierung des viralen Genoms. Kopien in den Proben können mittels einer quantitativen PCR mit TaqMan-Sonden für humane Adenoviren, JC-Polyomaviren und bovine Polyomaviren in derselben 96-Well-Platte quantifiziert werden. Da alle dieselben Amplifikationszyklen verwenden, sollten porzine Adenoviren zur Quantifizierung des Zielvirus separat in einer unabhängigen Platte getestet werden.

Bereiten Sie die quantitative PCR-Mischung in einem sauberen, separaten Bereich vor. Nach der Zubereitung der Mischung entnehmen Sie 15 Mikroliter und geben diese in jedes der Wells, einschließlich der Kontrollen. Fügen Sie in einem separaten Bereich die nukleinsaurehaltigen Extrakte der Proben hinzu – jeweils 10 Mikroliter sowie eine direkte und eine zehnfache Verdünnung in gereinigtem Wasser – jeweils im Duplikat. Das Gesamtvolumen pro Reaktion nach Zugabe der Probe beträgt 25 Mikroliter (15 Mikroliter Mischung plus 10 Mikroliter Probe oder Standard). Verschließen Sie die Wells mit einem Teil einer haftenden Abdeckfolie.

Bewahren Sie den anderen Teil der Abdeckung für den folgenden Schritt auf. AB-Verdünnung der DNA-Standardlösungen. 10 Mikroliter von 10 hoch null bis 10 hoch sechs Genomkopien, jeweils im Triplikat, unter Verwendung eines Mikropipettierspitzen, die ausschließlich für die DNA-Standardabdeckung verwendet wird.

Die Vertiefungen mit den Standards, bei denen zuvor die Klebfolie zugeschnitten wurde. Diese Abbildung zeigt die Verteilung der Standard-Suspensionsproben und der Kontrollen in der 96-Loch-Platte.

Führen Sie die QPCR in einem geeigneten System durch und wählen Sie die entsprechenden Parameter aus, nachdem das Amplitude Gold 10 Minuten lang aktiviert wurde. Bei 95 Grad Celsius werden 40 Amplifikationszyklen durchgeführt, sobald die Reaktionen abgeschlossen sind. Speichern Sie die Daten und Ergebnisse gemäß der Bedienungsanleitung des verwendeten Geräts.

Die DNA-Menge wird als Median der Daten definiert, die nach Korrektur des Verdünnungsfaktors gegebenenfalls erhalten wurden. Der Amplifikationsplot und die Standardkurve, die für die Quantifizierung von Schweineadenoviren erhalten wurden, wiesen einen Korrelationskoeffizienten von 0,999 auf. Akzeptable Steigungswerte liegen zwischen minus 3,1 und minus 3,6 gemäß dem Verfahren.

Beschriebene humane und tierische Viren wurden in Grundwasserproben aus einem Gebiet mit hohen Nitratkonzentrationen untersucht, um die Quellen der Kontamination zu bestimmen. Die vier analysierten Wiederholungen zeigten positive Ergebnisse für porcine Adenoviren (Mittelwert: 7,74 × 10² Genomkopien pro Liter), was auf das Vorhandensein von porcinen Gärresten im Bereich um den Probenahmestelle hinweist und die Anwesenheit fäkaler porciner Kontamination im Grundwasser belegt. In keiner der getesteten Proben war eine humane Kontamination nachweisbar.

Die virologischen Daten wurden durch eine nested-PCR und Sequenzierungsanalyse bestätigt. Schlussfolgerung: In dieser Studie haben wir Ergebnisse zur Analyse von Grundwasserproben vorgelegt, die eine Kontamination porcinen Ursprungs bei Abwesenheit menschlicher oder boviner Kontamination zeigen. Das Verfahren wurde außerdem zur Untersuchung von Badegewässern, Meerwasser und Flusswasser angewandt.

Hier stellen wir das Vorgehen zur Anwendung dieser Werkzeuge zur Identifizierung der Kontaminationsquelle im Grundwasser vor, wobei hohe Nitratkonzentrationen als Beispiel für die Anwendbarkeit der entwickelten Methoden zur Detektion der Schadstoffquelle in der Umwelt dienen.