Erkennung von Viren von Bioaerosolen Anion Austausch Harz

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen über die Art, den Gehalt und die Verteilung von Viren in Bioaerosolen zu beantworten, die für die öffentliche und tierärztliche Gesundheit wichtig sind. Die Hauptvorteile dieser Methode sind die Verbesserung der Empfindlichkeit beim molekularen Nachweis von Viren aus Bioaerosolen, ihre Feldtauglichkeit und ihre Benutzerfreundlichkeit. Erstellen Sie Suspensionen der experimentellen Konzentrationen von Viruspartikeln von Interesse in 100 Millilitern PBS Volumen in den Glasgefäßen eines Sechs-Jet-Kollisionsverneblers.

Um die Bioaerosolkammer einzurichten, werden zwei flüssige Impinger mit 20 Millilitern 0,01 molaren PBS vorgeladen, gefolgt von der Zugabe von 0,5 Gramm Anionenaustauscherharz zu einem einzelnen Impinger. Montieren Sie den Impinger. Installieren Sie die Aufhängungen in der Kammer.

Verwenden Sie Klemmständer, um Flüssigkeitsaufprallkörper parallel in der Bioaerosolkammer zu positionieren, wobei die Einlässe des Aerosolsammlers dem Vernebler zugewandt sind. Platzieren Sie ein direkt ablesbares Gerät in der Nähe der Flüssigkeitsaufpraller, um die Umgebungsvariablen zu überwachen, und platzieren Sie einen zusätzlichen direkt ablesbaren Aerosolmonitor in der Nähe der Flüssigkeitsaufpraller, um die Massenkonzentration des Bioaerosols zu messen. Lassen Sie dann die Axialventilatoren in den Ecken der Bioaerosolkammer laufen, um das Mischen des Aerosols zu erleichtern.

Wenn die Kammer fertig ist, starten Sie die Instrumente zur Messung der Variablen in der Bioaerosolkammer. Verwenden Sie ein primäres Durchflussnormal, um das System zu kalibrieren und die Konsistenz zwischen den Probenahmevolumina zu wahren. Versiegeln Sie die Kammer für eine 10-minütige Spülung mit HEPA-gefilterter Luft.

Geben Sie gefilterte, getrocknete Luft mit einem Druck von 6,9 Kilopascal an den Vernebler ab, um eine Zielkonzentration an viralen Bioaerosolen zu erzeugen. Wenn die Zielmassenkonzentration des Aerosols erreicht ist, stoppen Sie die Vernebelung. Verwenden Sie dann eine HEPA-gefilterte Leitung, die sich in der Nähe des Verneblers befindet, um verdünnte Luft zuzuführen, wobei Sie darauf achten, einen konstanten Druck in der Kammer aufrechtzuerhalten, und die Atmosphäre der Bioaerosolkammer 40 Minuten lang aktiv zu beproben, um ein Probenahmevolumen von 500 Litern pro Probe zu erreichen.

Die Kalibrierung des Instruments ist entscheidend für die Bestimmung der Konzentration von Luftverunreinigungen. Der Probenahmezug sollte vor und nach jedem Probenahmeereignis kalibriert werden. Die Vor- und Nachkalibrierungen sollten innerhalb von 5 % voneinander liegen.

Schalten Sie die Pumpen am Ende der Probenahme aus. Um Nukleinsäuren direkt aus dem Anionenaustauscherharz zu isolieren, überführen Sie das gesamte Anionenaustauscherharz, das Flüssigkeit aus den flüssigen Impingern enthält, in einzelne, sterile konische 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie das Harz abgesetzt haben, dekantieren Sie die flüssige Probe langsam aus dem Anionenaustauscherharz und entfernen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze die restliche Flüssigkeit aus dem Harz.

Als nächstes fügen Sie 560 Mikroliter viralen Lysepuffer mit Träger-RNA aus einem viralen RNA-Isolationskit direkt in das Anionenaustauscherharz für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit regelmäßigem Mischen hinzu. Am Ende der Inkubation wird das virale Lysat mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze in ein steriles konisches 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und die RNA-Isolierung gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Führen Sie dann eine quantitative Echtzeit-PCR zum Nachweis von MS2-Bakterienphagen und Influenza-A- und -B-Viren mit fünf Mikrolitern Nukleinsäure-Eluent pro Probe durch.

Wie in diesen repräsentativen qRT-PCR-Amplifikationskurven gezeigt, kann der Nachweis von Influenzaviren vom Typ A bei Verwendung von Anionenaustauscherharz um bis zu 3,26 Zyklen früher erreicht werden, verglichen mit einer direkten Untersuchung der Aufprallflüssigkeit. In einer qRT-PCR, die zu 100 % effizient ist, entspricht ein Gewinn von einem Schwellenwertzyklus einer zweifachen Erhöhung der Zielkonzentration, so dass die repräsentativen Ergebnisse auf eine 9,58-fache Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit hinweisen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist zu bedenken, dass bei der Luftprobenahme vor Ort Parameter wie relative Luftfeuchtigkeit und Temperatur die Abscheideeffizienz beeinflussen können und dass die Abscheidepuffer möglicherweise für verschiedene Viren optimiert werden müssen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere kulturbasierte Methoden verwendet werden, um zusätzliche Fragen zur viralen Infektiosität zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik Forschern und anderen Fachleuten aus den Bereichen Landwirtschaft und öffentliche Gesundheit den Weg geebnet, alternative Methoden zur Viruseinfang und -konzentration aus Bioaerosolen für die Risikobewertung bei der Überwachung von Viruserkrankungen zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Viren aus Bioaerosolen mit modifizierten flüssigen Impingern einfängt und konzentriert, Nukleinsäuren direkt aus dem Anionenaustauscherharz extrahiert und Viren mittels qRT-PCR nachweist. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung und der Biosicherheitsstufe zwei oder höher getroffen werden sollten.