Name: Erkennung von Viren von Bioaerosolen Anion Austausch Harz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Erfahren Sie eine anionenaustauschharzbasierte Methode zur Probennahme von Viren aus Bioaerosolen mittels Flüssigkeitsimpinger. Diese Technik ermöglicht eine empfindlichere molekulare Detektion und ist für Feldstudien geeignet.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Finanzierung von CDC/NIOSH High Plains Intermountain Center für landwirtschaftliche Gesundheit und Sicherheit (5U54OH008085) und Colorado Bioscience Entdeckung Auswertung Subventionsprogramms (14BGF-16).

1. Setup der Bioaerosol Kammer (siehe Abbildung 2)
<ol><li>
Vorspannung der flüssigen Impingers mit 20 mL 0,01 M Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,5 (PBS).
	<ol>
<li>0,5 g Anion Austausch Harz und unterbrechen Sie innerhalb der PBS eines flüssigen Impingers, mit einer anderen Flüssigkeit Ausbeute als Kontrolle dienen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lage flüssige Impingers parallel in der Bioaerosol-Kammer mit Klammer steht mit Aerosol Buchten mit Blick auf den Zerstäuber. Hinweis: Siehe Abbildung 2 für weitere Details.</li>
	<li>Zusammenlegung eines direkten lesenden Aerosol Monitors in der Nähe der flüssigen Impingers Konzentration (mg/m3) von dem Bioaerosol messen.</li>
	<li>Zusammenlegung von zusätzlichen direkten lesenden Instrumente (Raumluft Qualität Monitor und thermische Anemometer) in der Nähe der flüssigen Impingers Umgebungsvariablen wie Temperatur, Überwachung der relativen Luftfeuchtigkeit und Wind zu beschleunigen, innerhalb der Bioaerosol-Kammer.</li>
	<li>Führen Sie Axialventilatoren in den Ecken der Bioaerosol Kammer zur Erleichterung des Aerosols mischen. Hinweis: Axialventilatoren mit einer festen Geschwindigkeit laufen und sind nicht verstellbar.</li>
</ol>2. Bioaerosolization Modellversuche (siehe Abbildung 3)
<ol><li>Seriell, 10-divisibel Verdünnungen von MS2 Bakteriophagen und Influenza-Impfstoff zur gewünschten Konzentrationen in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durchführen. Hinweis: Werden die Methode hier, 103,5 FFU/mL von der Typ A und B Influenza-Impfstoff Virusstämme und 10 zeigen5 PFU/mL von der Bakteriophage MS2 genutzt. Um Titer für die Impfkulturen festzustellen, sind Bakteriophagen in Escherichia coli HS (pFamp) R propagiert und wie zuvor beschrieben20aufgelistet. Der kommerziellen Impfstoff enthält bekannte Mengen von vier live abgeschwächten Grippe-Virus-Stämme, zwei geben eine Influenza-Viren und zwei Typ B Influenza-Viren, ausgedrückt in fluoreszierenden Fokus Einheiten oder FFU.</li>
	<li>Bereiten Sie Impfkulturen in das Glasgefäß eine Kollision 6-Jet Vernebler durch die Schaffung von Suspensionen der gewünschten Konzentrationen von Viruspartikel in 100 mL PBS vor und installieren Sie innerhalb der benutzerdefinierten Bioaerosol-Kammer.</li>
	<li>Messgeräte zur Messung von Variablen innerhalb der Kammer Bioaerosol, wie Temperatur, % Relative Feuchte, Kohlendioxid-Konzentration und Windgeschwindigkeit (erzeugt mit einem Axialventilator) zu initiieren. Verwenden Sie einen direkten lesenden Aerosol Monitor Massenkonzentration innerhalb der Kammer Bioaerosol verfolgen und Konsistenz innerhalb und zwischen den Prüfungen zu etablieren.</li>
	<li>Versiegeln der Bioaerosol-Kammer und spülen Sie 10 min mit HEPA-gefilterte Luft.</li>
	<li>Der Vernebler mit 6,9 kPa liefern Sie gefilterte, getrocknete Luft.</li>
	<li>Generieren Sie eine Zielkonzentration von viralen Bioaerosole (über Vernebler) in jeder Studie Bioaerosol-Kammer. In dieser Demo werden Bioaerosole mit einer Konzentration von 5 mg/m3 generiert.</li>
	<li>Die Masse Zielkonzentration des Aerosols angekommen, stoppen Sie Vernebelung.</li>
	<li>Betreiben Sie eine Luftpumpe Probenahme für jedes flüssige Ausbeute, die zu einer Durchflussmenge von 12,5 L/min Verhalten Kalibrierung mit einem Standard-Primärfluss vor und nach jeder Samplingereignis zur Sicherstellung der Konsistenz in Probenahme Volumen kalibriert wurde. Versorgung Verdünnung der Luft mit einem HEPA-Filtern in der Nähe des Verneblers und konstanten Druck in der Kammer zu erhalten.</li>
	<li>Genießen Sie aktiv die Bioaerosol Kammeratmosphäre, für einen Zeitraum von 40 min, ein Sampling-Volumen von 500 L pro Probe zu erreichen. Hinweis: Sampling für 40 min bei 12,5 L/min mit zwei Pumpen parallel kann für die Probenahme von 1.000 L die Bioaerosol. So wird am Ende des Experiments erwartet, dass die Mehrheit der Luft in der Kammer Bioaerosol entnommen und über ein HEPA Filter System in die Umwelt freigesetzt wurde. Dies wird durch die Abnahme der Partikelkonzentration belegt. Nach dem Experiment werden Oberflächen mit 10 % Haushalt Chlorid und 70 % Ethanol dekontaminiert. Indikatoren sind in dieser Demo verwendet; jedoch kann wenn bekannt, dass pathogene Organismen in diesem System verwendet werden, zusätzliche biologische Maßnahmen bedarf.</li>
</ol>(3) Nukleinsäure-Extraktion und qRT-PCR-Nachweis
<ol><li>
Isolieren Sie Nukleinsäuren direkt vom Anion Austausch Harz und zu Vergleichszwecken, aus der Flüssigkeit innerhalb der flüssigen Impingers verwendet. In diesem Beispiel eine RNA Isolierung ist beschrieben, aber ein ähnliches Protokoll für DNA-Viren genutzt werden.
	<ol>
<li>Nukleinsäure-Isolierung aus dem Anion Austausch Harz.<ol>
<li>Übertragen Sie gesamte Anion Austausch Harz-haltige Flüssigkeit von der flüssigen Ausbeute auf eine sterile 50 mL konische Rohr.</li>
			<li>Ermöglichen Sie das Harz zu begleichen, und Dekantieren Sie langsam die flüssige Probe aus dem Anion Austausch Harz. Verwenden Sie eine 1 mL-PIPETTENSPITZE, die restliche Flüssigkeit aus dem Anion Austausch Harz entfernen.</li>
			<li>Aus einem viralen RNA isolierungskit Hinzufügen von 560 µL virale Lyse Puffer mit Träger RNA direkt an das Anion Austausch Harz und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur mit periodischen mischen.</li>
			<li>Mit einer 1 mL-PIPETTENSPITZE übertragen die virale lysate (virale Lyse-Puffer), eine sterile 1,5 mL konische Rohr und fahren Sie mit RNA Isolierung mit einer viralen RNA Isolation kit (siehe Tabelle der Materialien) gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit Ausnahme die RNA ist in einem Gesamtvolumen von 60 µL Elution Puffer eluiert.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nukleinsäure-Isolierung von flüssigen Impingers.<ol>
<li>Pipette 140 µL der flüssigen Probe in ein steriles 1,5 mL konische Rohr und RNA-Isolierung mit dem viralen RNA isolierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit Ausnahme der eluierenden RNA in einem Gesamtvolumen von 60 µL Elution Puffer führen. Hinweis: 140 µL ist die maximale Sample-Volumen, das mit dem spezifischen viralen RNA isolierungskit hier in einer einstufigen Zubereitung beschäftigt verarbeitet werden können.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie qRT-PCR zur Detektion von MS2 und Influenza A und B Viren als zuvor beschriebenen23,24. In dieser Demo werden 5 µL der Nukleinsäure-Eluate für qRT-PCR verwendet.</li>
</ol>

<ol><li>Pirtle, E. C., Beran, G. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1782426">Virus survival in the environment.</a> Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).</li>
<li>Nguyen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+community-wide+outbreak+of+legionnaires+disease+linked+to+industrial+cooling+towers--how+far+can+contaminated+aerosols+spread%3F%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers--how far can contaminated aerosols spread?</a> The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).</li>
<li>Marks, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+airborne+transmission+of+Norwalk-like+virus+%28NLV%29+in+a+hotel+restaurant%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant.</a> Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).</li>
<li>Marks, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+school+outbreak+of+Norwalk-like+virus%3A+Evidence+for+airborne+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission.</a> Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).</li>
<li>Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+detection+and+quantification+of+swine+influenza+a+virus+in+air+samples+collected+inside%2C+outside+and+downwind+from+swine+barns%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns.</a> PLoS One. 8 (8), e71444(2013).</li>
<li>Anderson, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioaerosol+sampling+in+modern+agriculture%3A+A+novel+approach+for+emerging+pathogen+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).</li>
<li>Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+air+sampling+to+detect+exotic+Newcastle+disease+virus+in+two+California+commercial+poultry+flocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).</li>
<li>Jonges, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wind-mediated+spread+of+low-pathogenic+avian+influenza+virus+into+the+environment+during+outbreaks+at+commercial+poultry+farms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms.</a> PLoS One. 10 (5), e0125401(2015).</li>
<li>Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+aerosol+transmission+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+under+controlled+field+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Veterinary+Record%22%5BJournal%5D)">Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions.</a> The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosolized+avian+influenza+A+%28H5N6%29+virus+isolated+from+a+live+poultry+market%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China.</a> The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).</li>
<li>Choi, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+animal+markets+in+Minnesota%3A+A+potential+source+for+emergence+of+novel+influenza+A+viruses+and+interspecies+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission.</a> Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).</li>
<li>Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioaerosol+sampling%3A+Sampling+mechanisms%2C+bioefficiency+and+field+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Hospical+Infection%22%5BJournal%5D)">Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies.</a> The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).</li>
<li>Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bioaerosol+aampling+for+airborne+virus+surveillance+in+swine+production+facilities%3A+A+mini+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review.</a> Frontiers in Veterinary Science. 4, 121(2017).</li>
<li>Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+sampling+of+airborne+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Methods for sampling of airborne viruses.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).</li>
<li>Hogan, C. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+methodologies+and+dosage+assessment+techniques+for+submicrometre+and+ultrafine+virus+aerosol+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles.</a> Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).</li>
<li>Yu, K. -P., Chen, Y. -P., Gong, J. -Y., Chen, Y. -C., Cheng, C. -C. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021850216300143">Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration.</a> Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).</li>
<li>Perez-Mendez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+simple+and+cost+effective+filter+paper-based+shipping+and+storage+medium+for+environmental+sampling+of+F-RNA+coliphages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages.</a> J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).</li>
<li>Chandler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-based+evaluation+of+a+male-specific+%28F%2B%29+RNA+coliphage+concentration+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method.</a> Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).</li>
<li>Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+of+enteric+viruses+from+tap+water+using+an+anion+exchange+resin-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method.</a> Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).</li>
<li>Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+an+anion+exchange+resin-based+method+for+concentration+of+F-RNA+coliphages+%28enteric+virus+indicators%29+from+water+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples.</a> Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).</li>
<li>Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+ion+exchange%3A+Basic+principles+and+their+application+in+food+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).</li>
<li>Chandler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+improved+detection+of+aerosolized+influenza+viruses+and+the+male-specific+%28F%2B%29+RNA+coliphage+MS2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2.</a> Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).</li>
<li>Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+assessment+of+a+real+time+reverse+transcription-PCR+method+to+genotype+single-stranded+RNA+male-specific+coliphages+%28Family+Leviviridae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae).</a> Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).</li>
<li>Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+three+influenza+A+and+B+real-time+reverse+transcription-PCR+assays+and+a+new+2009+H1N1+assay+for+detection+of+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).</li>
<li>Cademartiri, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+bacteriophages+on+modified+silica+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Immobilization of bacteriophages on modified silica particles.</a> Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).</li>
<li>Michen, B., Graule, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+points+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Appled+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Isoelectric points of viruses.</a> Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).</li>
<li>Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+bacteriophages+as+models+for+viral+aerosol+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).</li>
<li>Vergara, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+FRNA+coliphages+as+indicators+of+human+enteric+viruses+in+a+tropical+urban+freshwater+catchment%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment.</a> Water Research. 79, 39-47 (2015).</li>
<li>Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L. 3rd, Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosolization+of+a+human+norovirus+surrogate%2C+bacteriophage+MS2%2C+during+simulated+vomiting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting.</a> PLoS One. 10 (8), e0134277(2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für sensible virale Erfassung von bioaerosolen mit modifizierten flüssigen Impingers. Die Methode ist für die Erkennung und Quantifizierung von der Viruslast in bioaerosolen optimiert. Die gezielte Modifizierung demonstriert hier beinhaltet die Zugabe von Flüssigkeit in eine gemeinsame flüssige Impinger enthaltenen Anion Austausch Harz. Diese Methode wurde für seine Einfachheit in nachgeschalteten Probenverarbeitung entwickelt, wobei andere Probe Verarbeitungstechniken wie Zentrif...

Der Zweck dieser Methode ist eine hochsensible Bioaerosol Probenahme Plattform zur molekularen Erkennung von negativ geladenen Viren von bioaerosolen Erleichterung bieten. Mikroorganismen, einschließlich Viruspartikel, können über einen längeren Zeitraum der Zeit1in bioaerosolen überleben. Bioaerosole können über relativ große Entfernungen reisen und Lebensfähigkeit und Infektiosität, zu erhalten, wie ein Ausbruch der Legionärskrankheit belegt, die aus industriellen Kühltürme befindet sich in einer Entfernung von 6 km von den betroffenen Personen stammen und 18 Todesfälle2führte. Indirekter Übertragung von Viren auf den Menschen vermittelt durch Bioaerosole für Norovirus Ausbrüche in Schulen und Restaurants3,4nachgewiesen und kann in mehreren Einstellungen auftreten. In ähnlicher Weise kann Bioaerosol Übertragung von Viren in landwirtschaftlichen Einstellungen wie z. B. bei Schweinen und Geflügel betrieben, mit dieser Übertragungsweg als ein wichtiger Faktor in der Bewegung von Viren zwischen Produktion Einrichtungen5, auftreten. 6 , 7 , 8 , 9.
Effektive Probenahme von bioaerosolen Virus beladenen ermöglicht eine Verbesserung der Schnelldiagnostik und Bereitschaft zur ausbruchsprävention, wie bei Demonstrationen gezeigt welche H5, Grippe eine Viren wurden von bioaerosolen im lebenden Tier entdeckt in China Märkten und die USA10,11. Aktuellen Bioaerosol-Sampling-Technologien beinhalten eine Reihe von verschiedenen Teilchen erfassen Prinzipien und in Impingers, Zyklone, Impaktoren und Filter12breit kategorisiert werden können. Es sprengt den Umfang dieses Protokolls erschöpfend decken alle Vorteile und Nachteile dieser Plattformen für die Probenahme von bioaerosolen Viren; Allerdings ist festzuhalten, dass der Großteil dieser Probenahmegeräte für die Sammlung von Viren und Bakteriophagen13nicht optimiert wurden. Darüber hinaus ist Infektiosität der Viruspartikel oft negativ beeinflusst, mit flüssigen Impingers als virale Infektiosität effektiver als sampling-Geräte wie solide Impaktoren oder Filter14pflegen. Ein Nachteil des flüssigen Impingement ist jedoch der Verwässerungseffekt Ziel, die tritt auf, weil Viren in relativ großen Mengen (in der Regel ≥20 mL) Flüssigkeit in den Sammelbehälter aufgefangen werden. Ein weiterer wichtiger Nachteil beinhaltet die suboptimale Effizienz des flüssigen Impingers Partikel konzentrieren < 0,5 µM in Größe15. Capture Effizienz dieser Geräte kann jedoch durch Immobilisierung auf festen Matrizen verbessert werden, wie Immobilisierung Erhaltung der viralen Nukleinsäuren und virale Infektiosität16,17verbessern kann.
Wir haben bereits gezeigt, dass Anion Austausch Harz ein wirksames Instrument für die Erfassung und die Konzentration der Viren aus flüssigen Matrizen ist, einschließlich F-RNA Bakteriophagen, Hepatitis A-Virus, menschliche Adenovirus und Rotaviren18,19 ,20. Wie vom Hersteller definiert, ist das Anion Austausch Harz genutzt in diesem Werk ein Macroreticular Polystyrol starke base Anion Austausch Harz in der funktionalisierten quartäres Amin Gruppen vermitteln Attraktion und Erfassung von Anionen in einer flüssigen Mittel21 . Infolgedessen soll das Anion Austausch Harz Viren mit Net-Negative Oberfläche Gebühren, einschließlich viele enterischen Viren, Influenza-Viren und andere Viren relevant für die Gesundheit von Mensch und Tier zu erfassen.
Das aktuelle Protokoll beinhaltet die Zugabe von Anion Austausch Harz zu einem flüssigen Ausbeute. In diesem System dient das Harz als eine sekundäre Konzentration Schritt für virale Partikel in die Ausbeute Flüssigkeit gefangen genommen. Nukleinsäuren können dann direkt in kleinen Mengen, bietet eine konzentrierte Probe für Molekulare Analysen eluiert werden. Der Hauptvorteil dieser Methode deshalb die Verbesserung der viralen Nachweisempfindlichkeit, vor allem durch Verringerung des Volumens der Probe. Darüber hinaus aufgrund der inhärenten unspezifische Einnahme negativ geladene Viren, die Methode ist wahrscheinlich für die Erkennung einer Vielzahl von Viren von Interesse. Hier wird die Methode für Impfstämme Typ A und Typ B Influenza-Viren und die FRNA Coliphage MS2 (MS2) demonstriert. Diese Viren sind anschließend mit standard qRT-PCR-Assays als zuvor beschriebenen22nachgewiesen. Der Endpunkt-Benutzer sollten nicht erwarten, Schwierigkeiten bei der Durchführung dieser Methode, da Änderungen an der aktuell vorhandenen Geräte sind keine größere Störungen zu den herkömmlichen Fluss Bioaerosol Probenahme-und Analysemethoden.

<table><tbody><tr><td>Escherichia coli Bakteriophagen MS2 (ATCC 15597-B1)</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 15597-B1</td><td></td></tr><tr><td>FluMist Quadrivalent</td><td>AstraZeneca</td><td>Hersteller kontaktieren</td><td>Die viralen Bestandteile dieses Impfstoffs können sich jährlich ändern</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>Primer und Sonden</td><td>Integrierte DNA-Technologien</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &Mikro; M Sterilfilter</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1 L Pyrexflaschen oder gleichwertig</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipettenspitzen</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Pipettierer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL serologische Pipette</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pipetenhilfe oder gleichwertig</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Virale RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Sonde RT-PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204443</td><td></td></tr><tr><td>Amberlite IRA-900 Chlorid Form</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216585-500G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Wasser (molekularbiologische Qualität)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf DNA LoBind Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>ThermoFisher</td><td>13-698-791</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL konische Zentrifugenröhrchen&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen</td><td>ThermoFisher</td><td>05-538-62</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit mit ROX</td><td>ThermoFisher</td><td>11745100</td><td></td></tr><tr><td>SKC Biosampler 20 mL, 3-teiliges Glasset</td><td>SKC Inc.</td><td>225-9593</td><td></td></tr><tr><td>Vac-u-Go Probenpumpen</td><td>SKC Inc.</td><td>228-9695</td><td></td></tr><tr><td>Collison Vernebler (6 Düsen)</td><td>BGI Inc.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>HEPA-Kapsel</td><td>PALL</td><td>12144</td><td></td></tr><tr><td>Q-TRAK Luftqualitätsmonitor für Innenräume 8554</td><td>TSI Inc.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Alnor Velometer thermisches Anemometer AVM440-A</td><td>TSI Inc.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>SidePak AM510 Persönlicher Aerosolmonitor</td><td>TSI Inc.</td><td></td><td></td>NA</tr><tr><td>Bioaerosol-Kammer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

erkennung von viren von bioaerosolen anion austausch harz

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

Dieses Protokoll zeigt eine angepasste Bioaerosol Sampling-Methode für Viren. In diesem System ist Anion Austausch Harz mit flüssigen Impingement-basierten Air Probenahmegeräte für wirksame Konzentration von negativ geladenen Viren von bioaerosolen gekoppelt. So dient das Harz als zusätzliche Konzentration Schritt im Workflow Bioaerosol Probenahme. Nukleinsäure-Extraktion der viralen Partikel erfolgt dann direkt aus dem Anion Austausch Harz, mit der sich daraus ergebenden Probe für Molekulare Analysen geeignet. Dieses Protokoll beschreibt weiter, eine Custom-Built Bioaerosol Kammer erzeugen Virus beladenen Bioaerosole unter verschiedensten Umweltbedingungen und damit für die kontinuierliche Überwachung der Umgebungsvariablen wie Temperatur, Feuchtigkeit, Windgeschwindigkeit und Aerosol Massenkonzentration. Der wesentliche Vorteil der Verwendung dieses Protokolls ist erhöhte Empfindlichkeit des Viren-Erkennung, da mittels direkter Vergleich zu einer unveränderten konventionelle flüssige Ausbeute bewertet. Weitere Vorteile sind die Möglichkeit, diverse negativ geladene Viren, die niedrigen Kosten der Anion Austausch Harz (~$0.14 pro Probe) und Benutzerfreundlichkeit zu konzentrieren. Nachteile sind die Unfähigkeit dieses Protokolls, Infektiosität von Harz adsorbiert Viruspartikel zu bewerten, und möglicherweise die Notwendigkeit zur Optimierung des Puffers flüssige Probenahme verwendet innerhalb der Ausbeute.

Abbildung 1 veranschaulicht das Prinzip hinter kostenlos-basierte Erfassung von Viren von bioaerosolen durch Einbeziehung des Harzes in flüssig-Impingers. Abbildung 2 zeigt den Aufbau der Custom-Built Bioaerosol Kammer. Abbildung 3 beschreibt die Schritte zur Einrichtung der Aerosolization Experiment und Maßnahmen zur Qualitätssicherung. Abbildung 4 zeigt Verstärkung Kur...

Ein Anion Austausch Harz-basierte Methode, angepasst an Flüssigkeit, die Impingement-basierte Bioaerosol Probenahme von Viren nachgewiesen wird. Kombination mit nachgeschalteter molekulare Erkennung ermöglicht die Methode facile und empfindlichen Nachweis von Viren von bioaerosolen.

Erkennung von Viren von Bioaerosolen Anion Austausch Harz

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen über die Art, den Gehalt und die Verteilung von Viren in Bioaerosolen zu beantworten, die für die öffentliche und tierärztliche Gesundheit wichtig sind. Die Hauptvorteile dieser Methode sind die Verbesserung der Empfindlichkeit beim molekularen Nachweis von Viren aus Bioaerosolen, ihre Feldtauglichkeit und ihre Benutzerfreundlichkeit. Erstellen Sie Suspensionen der experimentellen Konzentrationen von Viruspartikeln von Interesse in 100 Millilitern PBS Volumen in den Glasgefäßen eines Sechs-Jet-Kollisionsverneblers.Um die Bioaerosolkammer einzurichten, werden zwei flüssige Impinger mit 20 Millilitern 0,01 molaren PBS vorgeladen, gefolgt von der Zugabe von 0,5 Gramm Anionenaustauscherharz zu einem einzelnen Impinger. Montieren Sie den Impinger. Installieren Sie die Aufhängungen in der Kammer.Verwenden Sie Klemmständer, um Flüssigkeitsaufprallkörper parallel in der Bioaerosolkammer zu positionieren, wobei die Einlässe des Aerosolsammlers dem Vernebler zugewandt sind. Platzieren Sie ein direkt ablesbares Gerät in der Nähe der Flüssigkeitsaufpraller, um die Umgebungsvariablen zu überwachen, und platzieren Sie einen zusätzlichen direkt ablesbaren Aerosolmonitor in der Nähe der Flüssigkeitsaufpraller, um die Massenkonzentration des Bioaerosols zu messen. Lassen Sie dann die Axialventilatoren in den Ecken der Bioaerosolkammer laufen, um das Mischen des Aerosols zu erleichtern.Wenn die Kammer fertig ist, starten Sie die Instrumente zur Messung der Variablen in der Bioaerosolkammer. Verwenden Sie ein primäres Durchflussnormal, um das System zu kalibrieren und die Konsistenz zwischen den Probenahmevolumina zu wahren. Versiegeln Sie die Kammer für eine 10-minütige Spülung mit HEPA-gefilterter Luft.Geben Sie gefilterte, getrocknete Luft mit einem Druck von 6,9 Kilopascal an den Vernebler ab, um eine Zielkonzentration an viralen Bioaerosolen zu erzeugen. Wenn die Zielmassenkonzentration des Aerosols erreicht ist, stoppen Sie die Vernebelung. Verwenden Sie dann eine HEPA-gefilterte Leitung, die sich in der Nähe des Verneblers befindet, um verdünnte Luft zuzuführen, wobei Sie darauf achten, einen konstanten Druck in der Kammer aufrechtzuerhalten, und die Atmosphäre der Bioaerosolkammer 40 Minuten lang aktiv zu beproben, um ein Probenahmevolumen von 500 Litern pro Probe zu erreichen.Die Kalibrierung des Instruments ist entscheidend für die Bestimmung der Konzentration von Luftverunreinigungen. Der Probenahmezug sollte vor und nach jedem Probenahmeereignis kalibriert werden. Die Vor- und Nachkalibrierungen sollten innerhalb von 5 % voneinander liegen.Schalten Sie die Pumpen am Ende der Probenahme aus. Um Nukleinsäuren direkt aus dem Anionenaustauscherharz zu isolieren, überführen Sie das gesamte Anionenaustauscherharz, das Flüssigkeit aus den flüssigen Impingern enthält, in einzelne, sterile konische 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem Sie das Harz abgesetzt haben, dekantieren Sie die flüssige Probe langsam aus dem Anionenaustauscherharz und entfernen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze die restliche Flüssigkeit aus dem Harz.Als nächstes fügen Sie 560 Mikroliter viralen Lysepuffer mit Träger-RNA aus einem viralen RNA-Isolationskit direkt in das Anionenaustauscherharz für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur mit regelmäßigem Mischen hinzu. Am Ende der Inkubation wird das virale Lysat mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze in ein steriles konisches 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und die RNA-Isolierung gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Führen Sie dann eine quantitative Echtzeit-PCR zum Nachweis von MS2-Bakterienphagen und Influenza-A- und -B-Viren mit fünf Mikrolitern Nukleinsäure-Eluent pro Probe durch.Wie in diesen repräsentativen qRT-PCR-Amplifikationskurven gezeigt, kann der Nachweis von Influenzaviren vom Typ A bei Verwendung von Anionenaustauscherharz um bis zu 3,26 Zyklen früher erreicht werden, verglichen mit einer direkten Untersuchung der Aufprallflüssigkeit. In einer qRT-PCR, die zu 100 % effizient ist, entspricht ein Gewinn von einem Schwellenwertzyklus einer zweifachen Erhöhung der Zielkonzentration, so dass die repräsentativen Ergebnisse auf eine 9,58-fache Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit hinweisen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Bei diesem Verfahren ist zu bedenken, dass bei der Luftprobenahme vor Ort Parameter wie relative Luftfeuchtigkeit und Temperatur die Abscheideeffizienz beeinflussen können und dass die Abscheidepuffer möglicherweise für verschiedene Viren optimiert werden müssen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere kulturbasierte Methoden verwendet werden, um zusätzliche Fragen zur viralen Infektiosität zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung hat diese Technik Forschern und anderen Fachleuten aus den Bereichen Landwirtschaft und öffentliche Gesundheit den Weg geebnet, alternative Methoden zur Viruseinfang und -konzentration aus Bioaerosolen für die Risikobewertung bei der Überwachung von Viruserkrankungen zu erforschen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Viren aus Bioaerosolen mit modifizierten flüssigen Impingern einfängt und konzentriert, Nukleinsäuren direkt aus dem Anionenaustauscherharz extrahiert und Viren mittels qRT-PCR nachweist. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung und der Biosicherheitsstufe zwei oder höher getroffen werden sollten.

detection-of-viruses-from-bioaerosols-using-anion-exchange-resin

Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Source: Schaeffer, J. W., Chandler, et al. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the detection of viruses from bioaerosols using an anion exchange resin. A liquid impinger containing the resin is used to capture viruses from the air. The resin is collected and treated with a virus lysis buffer containing carrier RNA. The lysate is transferred to a microcentrifuge tube for viral RNA isolation, followed by qRT-PCR to amplify...

Anion Exchange Resin–Based Detection of Viruses from Bioaerosols

Source: Klaus, J. P. et al. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the extraction of viral RNA from surface-bound virions on epithelial cells using silica spin columns. The method includes chemical lysis, RNA stabilization, and membrane-based purification for downstream quantification of virus-cell attachment.

Extraction of Viral RNA from Surface-Bound Virions Using a Silica Spin Column

Wir beschreiben eine schnelle, molekülbasierten Influenza A und B-Assay. Die Influenza-Test weist jedes Ziel innerhalb von 15 Minuten durch den Einsatz von isothermen Amplifikation mit Influenza-spezifischen Primer durch Zielerfassung mit molekularen Signalsonden gefolgt. Das Influenza-A-und B-Test ist benutzerfreundlich und benötigt minimale Hands-on-Zeit auszuführen.

Schnelle molekulare Erkennung und Differenzierung von Influenza-Viren A und B

Hochdurchsatz-Untersuchung von DNA und RNA basieren Pathogenen durch nanoskalige PCR beschrieben wird ein syndromic Eckzahn und equine Atmungs PCR Panel.

Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR

Ein Protokoll zur Charakterisierung der chemischen Zusammensetzung der Ausatmungsluft in Echtzeit mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation gekoppelt an hochauflösende Massenspektrometrie nachgewiesen wird.

Echtzeit-Atem-Analyse mithilfe von sekundären Nanoelectrospray Ionisation mit hochauflösenden Massenspektrometrie gekoppelt

Ein schnell einsetzbaren, off-Grid Labor wurde entworfen und für abgelegene, ressourcenbeschränkte globale Einstellungen gebaut. Die Eigenschaften und kritische Aspekte der logistisch verbessert, erweiterbar, multifunktionale Labormodule werden erforscht. Eine Checkliste für einen Labor-Workflow und ein Protokoll für die Atemwege virale diagnostischer Test entwickelt und vorgestellt.

Entfernten Labor Management: Respiratorischen Virus-Diagnostik

Wir stellen ein Protokoll vor, das die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation mit einem CRISPR/Cas12a-System für den Spurennachweis von DNA-Viren kombiniert und eine tragbare Smartphone-Mikroskopie mit einer durch künstliche Intelligenz unterstützten Klassifizierung für den Point-of-Care-Nachweis von DNA-Viren entwickelt.

DNA-Virusnachweissystem basierend auf RPA-CRISPR/Cas12a-SPM und Deep Learning

Verschiedene bakterielle Krankheitserreger können Atemwegsinfektionen verursachen und zu ernsthaften Gesundheitsproblemen führen, wenn sie nicht genau erkannt und sofort behandelt werden. Der schnelle und genaue Nachweis dieser Erreger durch schleifenvermittelte isotherme Amplifikation ermöglicht ein effektives Management und eine effektive Kontrolle von Atemwegsinfektionen im klinischen Umfeld.

Schneller Nachweis von bakteriellen Krankheitserregern, die Infektionen der unteren Atemwege verursachen, durch mikrofluidische Chip-basierte schleifenvermittelte isotherme Amplifikation

Um den schnellen und präzisen Nachweis von Acinetobacter baumannii zu ermöglichen, stellen wir ein Protokoll vor, das die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) in Verbindung mit der LbaCas12a-Endonuklease zur Identifizierung von A. baumannii-Infektionen verwendet.

Schneller und spezifischer Nachweis von Acinetobacter baumannii-Infektionen mit einem Rekombinase-Polymerase-Amplifikations-/Cas12a-basierten System

Hier präsentieren wir eine Studie zur Bewertung der antiviralen Wirksamkeit kupfer- und silberbasierter Oberflächenbeschichtungen auf Luftfiltern. Mit einer Bioaerosolkammer und Phi6-Bakteriophagen quantifiziert diese Methode die virale Inaktivierung und mechanische Filtrationseffizienz für selbstdesinfizierende Innenraumlufttechnologien.

Bewertung der Wirkung von beschichteten Filtern und Vorfiltern auf die Infektivität und Konzentration des aerosolisierten Phi6-Virus

Erfahren Sie eine anionenaustauschharzbasierte Methode zur Probennahme von Viren aus Bioaerosolen mittels Flüssigkeitsimpinger. Diese Technik ermöglicht eine empfindlichere molekulare Detektion und ist für Feldstudien geeignet.

Erkennung von Viren von Bioaerosolen Anion Austausch Harz

Weitere Videos entdecken