Name: Ein Choroidplexus Epithelial Zell-basierte Modell des menschlichen Blut-Liquor-Schranke Bakterielle Infektion von der basolateralen Seite zu studieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von HIBCPP-Zellen zur Modellierung der Blut-Liquor-Schranke. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bakterieller Infektionen von der basolateralen Seite und liefert wertvolle Einblicke in ZNS-Infektionsmechanismen.

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Die Autoren danken Prof. Hartwig Wolburg für die Durchführung der Elektronenmikroskopie.

1. Bereiten Sie Cell Culture Filterpatronen für Seeding HIBCPP Zellen in einem Inverted Modellsystem <ol><li> Pre-warmen DMEM / F12 (Ham) mit 5 ug / ml Insulin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 10% fötalem Kälberserum (FCS). </li><li> Verwenden einer sterilen Pinzette 0,33 cm² Wachstumsbereich Zellkulturfiltereinsätze mit einer Porengröße von 3 um den Kopf stellen, in eine 12-Well - Platte (Abbildung 1E). </li><li> Füllmedium in das untere Kompartiment der Zellkulturfiltereinsatz (ca. 3 ml) und 100 &amp; mgr; l auf die Oberseite des Filtereinsatzes. Flood die Platte sowie das untere Fach mit Medium. Absaugen übermäßige Medium derart , daß das untere Fach des Filtereinsatzes bleibt gefüllt (Figur 1E). Hinweis: Es wird empfohlen, eine serologische Pipette für diesen Schritt zu verwenden. </li><li> Abdeckung 12-Well-Platte mit dem Deckel und übertragen die vorbereiteten Zellkulturfiltereinsätze in den Inkubator, 37 ° C,5% CO 2 bis zur Zugabe der Zellen. </li></ol> 2. Kultivierung und Passagierung von HIBCPP Zellen <ol><li> Bereiten DMEM / F12 (Ham), ergänzt mit 5 ug / ml, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 10% FCS. </li><li> Vorwärmen Medium und PBS in einem 37 ° C Wasserbad. Absaugen Medium von Kolben. 10 ml PBS in den Kolben und wirbeln. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt. </li><li> 3 ml 0,25% Trypsin-EDTA in den Kolben und wirbeln. Legen in den Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Nach etwa 20 Minuten wird der Kolben aus dem Inkubator entfernen. Stellen Sie sicher, dass die Zellen aus dem Boden des Kolbens abgelöst werden und zeigen eine runde Form, wenn sie mit dem Mikroskop vermessen. Anmerkung: Die Zellen lösen sich nicht vollständig voneinander und werden oft in Agglomerate gefunden. Es wird empfohlen, die Zellen 38 bis Passage zu verwenden. </li><li> So stoppen Sie Trypsinierung 17 ml Medium hinzu. Resuspendieren der Zellen durch Pipettieren auf und ab und übertragen die Aussetzungin einen 50-ml-Tube. Zentrifuge bei 50 × g für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen Medium und die Zellen durch Zählen unter Verwendung eines Hämozytometers. Anmerkung: Die Konzentration der resuspendierten Zellen HIBCPP sollte 1 x 10 6 Zellen / ml sein. Für die Versorgung der Zellen HIBCPP wird vorgeschlagen , eine Menge von 1-6 x 10 6 Zellen in 10 ml Medium zu einem T75-Kolben zu übertragen. Ändern Medium jeden zweiten Tag. </li></ol> 3. Seeding Inverted Zellkulturfilterpatronen mit HIBCPP Zellen <ol><li> Auf der jeweils invertierte Filtereinsatz (dh der unteren Seite des Filters) 80 &amp; mgr; l der Zellsuspension hinzu (dh. 8 x 10 4 Zellen) (1E). Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Zellen gleichmäßig in der Suspension verteilt werden durch das Rohr vor der Aussaat zu invertieren. </li><li> Decken Sie die ausgesäten-Zellkulturfiltereinsätze mit dem Deckel der 12-Well-Platte und den Transfer in den Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Am ersten Tag, füllen 1 ml Medium in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte. Heben Sie die Zellkulturfiltereinsätze mit einer Pinzette aus der 12-Well - Platte verwenden, entsorgen Sie das Medium nach innen, drehen Sie die Filtereinsätze und legen Sie sie in der Standard - Orientierung in die vorbereitete 24-Well - Platte (Abbildung 1E). </li><li> jeden zweiten Tag Legen Sie die Zellen in frisches Medium. Bereiten Sie 24-Brunnen mit frischem Medium und übertragen Sie die Filtereinsätze zu. Füllen Einsätze mit 0,5 ml frisches Medium. Überprüfen Sie TEER jeden Tag, wie in Abschnitt 4 beschrieben. </li><li> Wenn TEER-Werte von HIBCPP ausgesät-Zellen auf Zellkultureinsätzen über 70 Ω x cm² (etwa 4 Tage nach dem Aussäen), dann wird der Zellkultur in Medium weiterhin enthaltend 1% FCS und 5 &amp; mgr; g / ml Insulin. Bereiten Platten mit 24 Vertiefungen mit 1 ml Medium für jede Vertiefung. Übertragen Filtereinsätze auf die vorbereiteten Kavitäten und Austauschmedium in der oberen Kammer. Anmerkung: Diese Serumentzug nach Konfluenz führt zur Bildung voneine höhere Membranpotential. </li><li> Absaugen Medium aus dem Filterfach, Transfer zum gut vorbereitet und mit 500 &amp; mgr; l Medium zu füllen. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt. Setzen Sie die Zellen über Nacht in den Inkubator, 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> 4. Messung der transepitheliale Elektrischer Widerstand (TEER) <ol><li> Tauchen Sie die Elektrodenspitzen von Epithelgewebe Cell 15 min in 80% Ethanol. Übertragen Cell unter der Haube und lassen Elektrode trocken für einen Moment. Platzieren Elektrode in entsprechende Kulturmedium für die Zellen für weitere 15 min verwendet zu äquilibrieren. </li><li> Messungen durchführen, indem Sie den längeren Arm der Elektrode so, dass sie den Boden der unteren Kammer jedes Mal berührt, stellen Sie den kürzeren Arm in den Filtereinsatz Fach. Hinweis: Die Widerstandswerte von Zellkulturfiltereinsätze ohne Zellen in Medium sollte als Blindwerte verwendet werden ((Messwert (Ω) - Blindwert (Ω)) x FilterOberfläche (dh 0,33 cm²)). </li><li> Ort der Elektrode wieder in 80% Ethanol für 15 min Nach der Messung. An einem trockenen Rohr. </li></ol> 5. Bestimmung der parazelluläre Permeabilität <ol><li> Man löst 1 g FITC-Inulin in 200 ml Kulturmedium mit 5 ug / ml Insulin 1% FCS ergänzt. Anwenden 50 ug / ml der Lösung in das obere Filterabteil vor der Infektion der Zellen. </li><li> Nach der Infektion sammeln Mediumproben aus dem unteren und um zu bestimmen, wie viel Inulin aus der Filterkammer durch die Zellschicht geleitet. </li><li> Bereiten Sie eine FITC-Inulin Standardlösung und führen 1: 2-Verdünnungen, 10-mal (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% und 0%) . Bestimmen Sie Fluoreszenz durch Messung aller Proben in Mikrotiterplatten-Lesegerät. </li></ol> 6. Herstellung von Bakterien zur Infektion von HIBCPP Zellen auf Zellkulturfilterpatronen <ol><li> Einen Tag vor dem Experiment, schaben ter gefroren N. meningitidis - Stämme mit einem Glycerin-Lager und Streifen aus auf Schokolade - Agar mit Vitox ab. Wachsen über Nacht in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Auszug 20-30 Kolonien aus der Nachtkultur und Transfer in ein Röhrchen mit 8 ml Proteosepepton Medium ergänzt mit 0,042% NaHCO 3, 0,01 M MgCl 2 und 1% PolyViteX. </li><li> Schütteln, um die Bakterien für 1,25 Stunden bei 220 rpm, 37 ° C. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 2.684 g für 10 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und resuspendieren das Bakterienpellet mit 8 ml serumfreiem Medium. Vortex eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten. </li><li> Zu Kulturdichte bestimmen, wird eine Verdünnung von 1:10 bei einer optischen Dichte (OD) von 600 nm zu messen. Stellen Sie die Bakteriensuspension auf eine OD 600 von 0,1. Hinweis: Diese Suspension ca. enthält. 1 x 10 8 CFU / ml. </li><li> Um die Bakterienzellkonzentration bestätigen, verdünnte die Suspension schrittweise (1:10) bis zu einerVerdünnung von 10 -5 und Platte auf Schokoladen - Agar - Platten. Anmerkung: Ähnliche Verdünnungsreihen durchgeführt werden müssen Bakterienwachstumskurven zu berechnen. </li></ol> 7. Die Infektion von HIBCPP Zellen auf Zellkulturfilterpatronen und Bestimmung der bakteriellen Invasion durch Doppelimmunfluoreszenz <ol><li> Nachdem weiterhin eine epitheliale Gewebe unter Verwendung Cell-Zellkultur in Medium mit 1% FCS und 5 &amp; mgr; g / ml Insulin, täglich Zellen messen. Wenn Zellen, die einen TEER von etwa 500 Ω x cm² erreicht haben, tragen die Infektion aus. </li><li> Infizieren , die Zellen mit der hergestellten Bakteriensuspension bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10. Bewahren die infizierten Zellen in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für den angegebenen Zeitraum. Hinweis: Das MOI kann durch Berücksichtigung der Anzahl der Zellen pro Zellkulturfiltereinsatz bei Konfluenz (1,21 x 10 6 Zellen / cm 2) berechnet werden. </li><li> Stoppen Sie den InfektIons durch dreimal mit 500 &amp; mgr; l serumfreiem Medium (SFM), enthaltend 1% Rinderserumalbumin (BSA) in die Filterkammer Waschen angewendet, 1 ml zu dem unteren Abteil. </li><li> Blockieren mit 500 ul SFM, das 1% BSA-Puffer in dem Filterfach und 1 ml in der unteren Kammer 20 min bei Raumtemperatur Anhaftung von Antikörpern gegen unspezifische Bindungsstellen zu verhindern. </li><li> Inkubieren mit 100 &amp; mgr; l primärer Antikörper anti N. meningtidis α-OMP (1: 200) in dem Filterraum und 500 &amp; mgr; l in der unteren Kammer für 20 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Wenn erforderlich, die Antikörperkonzentration titriert werden muss. </li><li> Waschen Sie die Zellen, die durch das Medium aus dem Filterfach Absaugen, übertragen Sie den Filtereinsatz mit einem gut vorbereitet mit 1 ml SFM, die 1% BSA und füllen Sie den entleerten Filterfach mit 500 &amp; mgr; l SFM 1% BSA enthielt. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt. </li><li> Fix-Zellen mit 500 ul 4% Formaldehyd in dem Filter compartment, 1 ml in der unteren Kammer für 10 min bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Zellen, die durch das Medium aus dem Filterfach Absaugen, übertragen Sie den Filtereinsatz mit einem gut vorbereitet mit 1 ml PBS und füllen Sie den entleerten Filterfach mit 500 ul PBS. Wiederholen Sie einmal diesen Schritt. Anmerkung: Die Proben können über Nacht in PBS bei 4 ° C gelagert werden. </li><li> Cut feste Zellkultur filtert der Einsätze aus und waschen mit 250 ul PBS 1% BSA enthält. Inkubiere Zellen für 15 min bei Raumtemperatur mit 250 ul markiertem fluoreszierend (Anregungswellenlänge 594 nm) sekundären Antikörper Huhn-anti-Kaninchen (1: 500), extrazelluläre Bakterien zu färben. Hinweis: Wenn erforderlich, die Antikörperkonzentration titriert werden muss. </li><li> Permeabilisieren Zellen mit 250 ul PBS, enthaltend 1% BSA und 0,5% Triton X-100 für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Zellen dreimal mit 250 ul PBS, das 1% BSA enthält. </li><li> Inkubieren mit 250 &amp; mgr; l primärer Antikörper anti N. meningitidis </em&gt; α-OMP (1: 200) für 30 min extra- und intrazellulären Bakterien zu färben. Waschen Zellen dreimal mit 250 ul PBS, das 1% BSA enthält. </li><li> Anwenden 250 ul fluoreszenzmarkierten (Anregungswellenlänge 488 nm) sekundärer Antikörper (1: 500), gekennzeichnet fluoreszierend (Anregungswellenlänge 660 nm) Phalloidin (1: 250) und 4&#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI) ( 1: 50.000) 1 h lang bei Raumtemperatur zu färben extra- und intrazellulären Bakterien, Aktin-Zytoskelett und Kerne. Hinweis: Wenn erforderlich, die Antikörperkonzentration titriert werden muss. </li><li> Waschen Zellen dreimal mit 250 ul PBS, das 1% BSA enthält. Einbetten der Zellen Medium und lagern bei 4 ° C bis zur Untersuchung über Mikroskop bei der Montage. </li><li> Bestimmen Sie Anzahl der Invasion Bakterien pro vordefinierten Feld. Tun Sie dies durch 20 Felder pro Filtermembran zu zählen. Berechnen Sie den Prozentsatz der Invasion Bakterien. Hinweis: Multiplizieren Sie die mittlere Keimzahl in den 20 mikroskopischen Feldern mit einer Fläche zientient. Das Ergebnis drückt die Menge der gesamten Bakterien in einer 0,33 cm² Zellkulturfiltereinsatz. Diesen Wert durch die Menge der Bakterien in Medien während der Dauer der Infektion gezüchtet. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Epithelzellen des CP bilden die BCSFB, die die CSF aus dem Blut 2,3 trennt. Wir stellten kürzlich die HIBCPP Zelllinie als funktionelles menschliches Modell des BCSFB. Die Zellen zeigen wichtige Barrierefunktionen der BCSFB in vitro, einschließlich der Entwicklung eines hohen Membranpotential, eine geringe Permeabilität für Makromoleküle sowie die Anwesenheit von kontinuierlichen Strängen von TJs 5. Die TJ-Proteine ​​tragen zu einem apikalen / basolateralen Polarität der Zellen. Die Po...

Die Blut-Liquor - Schranke (BCSFB) ist einer der drei Sperrstellen zwischen Blut und Gehirn 1. Seine morphologische Korrelat sind die Epithelzellen des Plexus (CP) 2,3, eine endotheliale-epithelialen Konvolut, das in den Ventrikeln des Gehirns stark gefäß und befindet. Der CP dient der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF), sowie zur Trennung der letzteren aus dem Blut zu erzeugen. Um die Barrierefunktion, die CP - Epithelzellen zeigen eine geringe pinozytotische Aktivität exprimieren spezifische Transporter und sind dicht verbunden durch ein kontinuierliches Netzwerk von Tight Junctions (TJs) 2,3 zu erreichen. Menschliche Plexuspapillom (HIBCPP) Zellen, abgeleitet von einem bösartigen Plexuspapillom einer japanischen Frau 4, wurden verwendet , um einen funktionellen in vitro - Modell des BCSFB zu konstruieren. HIBCPP Zellen zeigen einige Eigenschaften eines funktions BCSFB wie die Bildung von TJStränge, die Entwicklung eines hohen transepithelialen Membranpotential, die als transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) und kleinere Permeabilitäten für Makromoleküle bestimmt werden kann. Darüber hinaus exprimieren HIBCPP Zellen charakteristische Transporter, die die ionische Mikro regulieren dienen können, und apikal / basolateralen Polarität 5,6,7 zeigen. Die BCSFB wurde für Krankheitserreger (Bakterien, Viren und Pilze) in das zentrale Nervensystem (ZNS) 8 als Eintrittsstelle dargestellt funktionieren. Die Invasion von Krankheitserregern, einschließlich Neisseria meningitidis (N. meningitidis), ein gramnegative Bakterium, können schwere Krankheiten wie Meningitis verursachen. Der Nachweis , dass sie die Schutz epitheliale Barriere des CP überwindet , ist von histopathologischen Beobachtungen bei Patienten unterstützt mit Meningokokken - Erkrankung in den Gefäßen erhöhte Mengen an Meningokokken aufweisen und CP Epithelzellen 9,10. Um sich den Eintritt in die Wirtszellen bacteria fallen oft endozytotischen Mechanismen, die vermittelt werden, oder ausgelöst durch spezifische Oberflächenrezeptoren auf den Wirtszellen. Da Interaktionen von Pathogenen mit diesen Rezeptoren Spezies sein können spezifische 11, Tiermodelle können nur in beschränktem Umfang zu Rate gezogen werden. Die HIBCPP Zelllinie bietet die Möglichkeit, den Invasionsprozess sowie die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen im menschlichen Modellsystem zu studieren. Zellkultur-Einsätze Einsatz ermöglicht es uns, aus zwei verschiedenen Zellseiten Interaktionen von Pathogenen mit Wirtszellen zu analysieren. Viele Bakterien, einschließlich N. meningitidis, sind die Auswirkungen der Schwerkraft während der Infektion Assays stark unterworfen. Für eine optimale Wechselwirkung der Pathogene mit den HIBCPP Zellen während des Assays werden die Bakterien zunächst in das obere Kompartiment der Zellkulturfiltereinsatz System hinzugefügt. Zur Infektion von der apikalen oder der basolateralen Zellenseite ermöglichen jeweils zwei Varianten der in vitro - System gewesen ESTAblished: Im Standardsystem HIBCPP Zellen der oberen Kammer des Filtereinsatzes ausgesät, imitiert die Situation , wenn Mikroorganismen auf der CSF-Seite angeordnet sind und in Kontakt mit der apikalen Seite der Zellen (1A, C) erhalten. Im Gegensatz dazu spiegelt unter Verwendung der HIBCPP Zellen in einer umgekehrten Zellkulturfiltereinsatz System die Bedingungen, wenn Bakterien in den Blutstrom eingegeben haben. Mikroorganismen Verbreitung im Blut und Begegnung CP Epithelzellen aus der basolateralen Seite (1B, D). Bemerkenswert ist es in diesem Modellsystem wurde gezeigt , daß Bakterien eindringen HIBCPP Zellen in einem polaren Mode gezielt von der basolateralen Zellenseite 5,7. Anschließend auf eine Infektion des CP können die Invasion von Krankheitserregern des angeborenen Immunsystems durch Ligation an Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) erkannt werden. Nun beschriebenen Mitglieder der PRRs gehören zu den Toll-like Rezeptor (TLR) -Familie. TLRs kann bind charakteristische Strukturen von infektiösen Mikroorganismen, die genannte pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) sind. Ligierung der Rezeptoren führt zur Aktivierung von Wirtszellsignalkaskaden , die Expression auslösen von Zytokinen und Chemokinen 12, die wiederum Transmigration von Immunzellen über den BCSFB 13,14 stimulieren. Es hat sich gezeigt , dass HIBCPP Zellen mehrere TLR auf mRNA - Ebene und , dass eine Infektion mit N. ausdrücken meningitidis resultiert in der Sekretion von mehreren Cytokinen und Chemokinen, einschließlich CXCL1-3, IL6, IL8 und TNFa 15,16. Hier beschreiben wir Kultivierung und Infektion der menschlichen Zelllinie HIBCPP in einer umgekehrten Zellkultureinsatz System, das die BCSFB nachahmt. Dieses Modellsystem ermöglicht Interaktionen von Pathogenen mit der in vivo relevant basolateralen Zellenseite sowie die nachfolgende zelluläre Antwort zu studieren.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4&acute;,6 Diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>12-Well-Platten</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Neisseria meningitidis &alpha;-OMP</td><td></td><td></td><td>Dieser Antikörper war ein Geschenk von Dr. H. Claus und Dr. U. Vogel (Universität W&uuml; rzburg, Deutschland)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (Huhn gegen Kaninchen)</td><td>Invitrogen</td><td>A21441</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 (Huhn gegen Kaninchen)</td><td>Invitrogen</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 660 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22285</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Schokoladen-Agarplatten</td><td>Biomerieux</td><td>43109</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasin D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES ohne Phenolrot</td><td>Gibco</td><td>11039-047</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulin</td><td>Sigma</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>2393</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Mg + Ca</td><td>Gibco</td><td>14040-174</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Polyvitex</td><td>Biomerieux</td><td>55651</td><td></td></tr><tr><td>Proteose Pepton</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>serumfreies Medium</td><td>Gibco</td><td>10902-096</td><td></td></tr><tr><td>Thincert Zellkultureinsätze für 24-Well-Platten, Porengröße 3 & Mikro; m</td><td>Greiner</td><td>662630</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturflasche 75 cm&sup2; rote Kappe steril</td><td>Greiner</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Volt-Ohm Messgerät Millicell-ERS2 mit MERSSTX01 Elektrode</td><td>Millipore</td><td>MERSSTX00</td><td></td></tr></tbody></table>

ein choroidplexus epithelial zell-basierte modell des menschlichen blut-liquor-schranke bakterielle infektion von der basolateralen seite zu studieren

A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

Die Epithelzellen des Plexus choroideus (CP), die sich im ventrikulären System des Gehirns befinden, bilden die Blut-Liquor-Schranke (BCSFB). Das BCSFB hat die Funktion, das Liquor cerebrospinalis (CSF) vom Blut zu trennen und den molekularen Austausch auf ein Minimum zu beschränken. Ein in vitro Modell des BCSFB basiert auf Zellen, die aus einem humanen Plexus choroideus papillom (HIBCPP) stammen. HIBCPP-Zellen weisen typische Barrierefunktionen auf, einschließlich der Bildung von Tight Junctions (TJs), der Entwicklung eines transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) sowie geringer Permeabilitäten für Makromoleküle. Es gibt mehrere Erreger, die über das BCSFB in das zentrale Nervensystem (ZNS) gelangen und in der Folge schwere Erkrankungen wie Hirnhautentzündungen verursachen können. Einer dieser Krankheitserreger ist Neisseria meningitidis (N. meningitidis), ein humanspezifisches Bakterium. Der Einsatz der HIBCPP-Zellen in einem invertierten Zellkultur-Filtereinsatzsystem ermöglicht es, die in vivo relevanten Interaktionen von Krankheitserregern mit Zellen des BCSFB von der basolateralen Zellseite aus zu untersuchen. In diesem Artikel beschreiben wir die Aussaat und Kultivierung von HIBCPP-Zellen auf Zellkulturinsertionen. Des Weiteren wird die Infektion der Zellen mit N. meningitidis zusammen mit der Analyse von eingedrungenen und anhaftenden Bakterien mittels doppelter Immunfluoreszenz demonstriert. Da die Zellen des CP auch an anderen Erkrankungen beteiligt sind, unter anderem an neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Multipler Sklerose sowie bei der Hirnmetastasierung von Tumorzellen, kann das Modellsystem auch in anderen Forschungsbereichen eingesetzt werden. Es bietet das Potenzial, molekulare Mechanismen zu entschlüsseln und neue therapeutische Ziele zu identifizieren.

Hier beschreiben wir die Kultivierung und Infektion von HIBCPP Zellen in einer umgekehrten Zellkultureinsatz System. Dieses Modell ermöglicht es uns Invasionsmechanismen und die zugrunde liegenden molekularen Signalwege von der basolateralen Zellseite zu studieren, eine physiologische Situation von Bakterien reproduzieren Verbreitung und Epithelzellen über den Blutstrom (Abbildung 1) eingeben. Die HIBCPP Zelle...

Die Epithelzellen des Plexus choroideus (CP) bilden die Blut-Liquor-Schranke (BCSFB). Ein In-vitro-Modell des BCSFB verwendet humane Zellen des Plexus choroidus papillom (HIBCPP). Dieser Artikel beschreibt die Kultivierung und basolaterale Infektion von HIBCPP-Zellen mit Hilfe eines Zellkultur-Filtereinsatzsystems.

Ein Choroidplexus Epithelial Zell-basierte Modell des menschlichen Blut-Liquor-Schranke Bakterielle Infektion von der basolateralen Seite zu studieren

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, ein auf Choroidplexusepithelzellen basierendes Modell der menschlichen Blut-Hirn-Rückenmarksflüssigkeits-Schranke zu erzeugen, das die Untersuchung bakterieller Infektionen von der basolateralen Seite ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu infektiösen Erkrankungen des Zentralnervensystems zu beantworten, beispielsweise, welche Prozesse während der Wechselwirkungen von Bakterien mit dem Choroidplexusepithel beteiligt sind.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Analyse der Wechselwirkungen von Krankheitserregern mit der basolateralen, der schwarzen Seite epithelialer Zellen ermöglicht. Diese Methode kann außerdem auf andere Untersuchungen angewendet werden, beispielsweise auf die Erforschung des Transmigrationsverhaltens von Immunzellen und Tumorzellen durch das Epithel des Plexus choroideus. Die Idee zur Verwendung menschlicher Choroidplexuspapillom- oder HIBCCP-Zellen für diese Methode kam mir erstmals, als ich die Manuskriptveröffentlichung von Shibata et al. aus dem Jahr 2005 las.die die Zelllinie beschreibt. Beginnen Sie damit, mit sterilen Pinzetten 0,33 Quadratzentimeter große Zellkulturfiltereinsätze mit drei Mikrometer großen Poren verkehrt herum in einzelne Vertiefungen einer Zwölflochplatte zu legen. Anschließend überschwemmen Sie die Vertiefung mit einer serologischen Pipette mit etwa drei Milliliter des vorgewärmten Mediums und aspirations überschüssige Flüssigkeit, bis die untere Kammer gerade gefüllt ist.Fügen Sie anschließend 100 Mikrometer Medium für die Subkultur bei 37 Grad, ergänzt mit zehn Prozent FCS, auf den Filter hinzu. Beim Hinzufügen des Mediums ist es sehr wichtig, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, da die Blasen verhindern, dass die Zellen ausreichend versorgt werden. Sobald das Medium zu allen Inserten hinzugefügt wurde, decken Sie die Platte ab und überführen Sie die Inserts in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2.Waschen Sie nun eine Zellkulturflasche mit HIBCPP-Zellen zweimal mit jeweils zehn Milliliter PVS durch Schwenken. Nach dem zweiten Waschschritt geben Sie drei Milliliter 0,25-prozentige Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen hinzu und schwenken die Flasche. Anschließend inkubieren Sie die Zellen etwa zwanzig Minuten lang.Am Ende der Inkubation überprüfen, ob die Zellen sich vom Boden des Kolbens gelöst haben und eine runde Form aufweisen. Die Zellen lösen sich nicht vollständig voneinander und werden oft in Agglomerationen gefunden. Das Kulturmedium mit 17 Milliliter Medium resuspendieren, um die Reaktion zu stoppen, und die Suspension in ein 50-Milliliter-Gefäß überführen.Anschießend die Zellen abzentrifugieren und das Pellet in einem geeigneten Volumen Medium zur Zellzählung resuspendieren. Danach die Zellen auf eine Konzentration von einer mal zehn hoch sechs Zellen pro Milliliter verdünnen und das Gefäß vorsichtig umstülpen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Anschließend 80 Mikroliter der Zellsuspension auf das obere Ende jedes Filtereinsatzes geben.Nachdem alle Inserts beimpft wurden, decken Sie die Platte ab und stellen Sie sie für eine Übernacht-Kultur zurück in den Inkubator. Am nächsten Tag geben Sie ein Milliliter Medium in jedes Loch einer 24-Loch-Platte. Heben Sie dann mithilfe einer Pinzette jedes Insert vorsichtig an, entsorgen Sie das darin enthaltene Medium und stellen Sie die Inserts mit der richtigen Seite nach oben in einzelne Löcher der 24-Loch-Platte.Wenn die Filtereinsätze von der 12-Loch-Platte in die 24-Loch-Platte umgekehrt werden, darauf achten, die Filtermembran mit den darauf wachsenden Zellen nicht zu berühren. Die Einsätze mit 0,5 Millilitern frischem Medium auffüllen und die Platte in den Inkubator zurückstellen. Die Einsätze alle zwei Tage in eine neue 24-Loch-Platte mit frischem Medium überführen, wodurch das Medium im oberen Kompartiment ersetzt wird.Um den trans-epithelialen elektrischen Widerstand oder TEER der Zellen zu messen, tauchen Sie zunächst die Elektrodenspitzen eines epithelialen Gewebe-Volt-Ohm-Meters in 80 Prozent Ethanol ein. Nach 15 Minuten nehmen Sie die Elektrode aus dem Ethanol, damit sie trocknen kann. Anschließend stellen Sie die Spitzen 15 Minuten lang in eine Aliquotte des Subkulturmediums. Nachdem die Elektrode ausgeglichen hat, positionieren Sie den längeren Arm so, dass er den Boden der unteren Kammer eines Wells der Zellkulturplatte berührt, und den kürzeren Arm so, dass er in die Filterinsert-Kammer ragt. Messen Sie die Widerstandswerte der Zellkultur-Filterinserts im Medium ohne Zellen, um die Leerwerte zu erhalten. Anschließend messen Sie den TEER jedes beimpften Inserts.Nach der Messung die Elektrode für 15 Minuten in 80 Prozent Ethanol zurücklegen und anschließend in einem trockenen Gefäß aufbewahren. Wenn die TEER-Werte der mit HIBCPP besiedelten Inserte 70 Ohm pro Quadratzentimeter überschreiten, das Medium erneuern, indem frisches Kulturmedium ergänzt mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Insulin und ein Prozent FCS verwendet wird, und die Platte über Nacht in den Zellkulturgehätsch zurückstellen. Um die parazelluläre Permeabilität der Insertkulturen zu bestimmen, 50 Mikrogramm pro Milliliter frisch hergestelltes FITC-Inulin in frischem kulturmedium mit niedrigem Serumanteil dem oberen Filterkompartiment jedes Inserts hinzufügen und die Zellen anschließend in den Inkubator zurückstellen.Wenn die Kulturen einen TEER-Wert von etwa 500 Ohm pro Quadratzentimeter erreicht haben, infizieren Sie die Zellen mit einer bakteriellen Suspension der gewünschten Art bei einer Multiplizität der Infektion von zehn und stellen Sie die Zellen für den entsprechenden Kulturzeitraum in den Inkubator zurück. Anschließend waschen Sie die Zellen dreimal, indem Sie den Filter in eine neue Vertiefung mit einem Milliliter serumfreiem Medium überführen. Dabei geben Sie jedes Mal 500 Mikroliter desselben Mediums in den Filterkompartiment. Schließlich bestimmen Sie die Konzentration an Inulin, das nach der bakteriellen Infektion vom Filterkompartiment durch die Zellschicht hindurchgetreten ist, indem Sie Mediumproben aus dem unteren Behälter jedes Zellkultur-Filtereinsatzes sammeln und alle Proben gegen zehn ein- und zweifache FITC-Inulin-Standardverdünnungen in einem Mikroplattenreader messen.HIBCCP-Zellen weisen spezifische Barrierefunktionen auf, die es ihnen ermöglichen, ihren molekularen Austausch in geringem Maße einzuschränken. Beispielsweise zeigen immunfluoreszenzanalytische Untersuchungen der mit dem Protein ZO-1, Occludin und Claudin-1 assoziierten Tight-Junction-Typen ein durchgehendes Signal an den Stellen des Zell-zu-Zell-Kontakts. Dies veranschaulicht die Vernetzung der Zellen durch kontinuierliche Stränge von Tight Junctions.Wenn HIBCPP-Zellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, weisen sie ein hohes Membranpotential auf, das unbehandelt Werte von bis zu etwa 500 Ohm pro Quadratzentimeter erreichen kann, wobei die typischen Barrierefunktionen der Blut-Hirn-Flüssigkeits-Schranke erhalten bleiben, wie die Ausbildung eines Membranpotentials sowie eine geringe Permeabilität für Makromoleküle. Mit steigenden Konzentrationen von DMSO hingegen sinken die TEER-Werte dosisabhängig, wobei ein ähnlicher signifikanter Abfall der TEER-Werte auch nach Behandlung mit Cytochalasin D beobachtet wird. Zudem führt die Zugabe von zwei Volumenprozent DMSO oder Cytochalasin D zu einem entsprechenden signifikanten Anstieg der Permeabilität für den FITC-Inulin-Fluss.Außerdem führt die bakterielle Infektion der HIBCCP-Zellen zu einer signifikanten Invasion der Zellschicht durch zwei pathogene Bakterienstämme, MC58 und seinen kapseldefizienten Mutanten, während für den apathogenen Stamm alpha 14 nur eine geringe Invasion beobachtet wird.Während des Ablaufs dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Filtermembran nach der Zellaussaat nicht zu berühren, da die intakte HIBCCP-Schicht durch den Kontakt beschädigt würde. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie in-vitro-Transmigrationsassays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Mechanismen der Migration von Immun- und Tumorzellen über die Epithelzellen des Plexus choroideus zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Pharmakologie den Weg, um den Substrattransport über das Epithel des Plexus choroideus in vitro zu untersuchen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein HIBCCP-Zell-basiertes Modell der Blut-Hirn-Schrankenflüssigkeitsbarriere zur basolateralen Infektion mit Krankheitserregern vorbereitet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit humanen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit unter einer geeigneten Sicherheitshaube getroffen werden sollten, während Sie dieses Verfahren durchführen.

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Forschung

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Dieses Video zeigt ein In-vitro-Modell zur Untersuchung von Krankheitserregern, die die Blut-Hirn-Schranke (BHS) überwinden. Mikrovaskuläre Endothelzellen, die Tight Junctions exprimieren, bilden eine Endothelschicht in der oberen Kammer, während Neuronen, Astrozyten und Mikroglia das Hirnparenchym in der unteren Kammer darstellen, das durch eine poröse Membran getrennt ist. Die Virusinfektion im BHS-Modell ahmt den Erreger nach, der vom Blut ins Gehirn gelangt. Bei der Einführung eines...

Ein in vitro Modell zur Untersuchung der Überquerung der Blut-Hirn-Schranke durch Krankheitserreger und der Infektion von Gehirnzellen

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Hier beschreiben wir ein menschliches Blut-Hirn-Schrankenmodell, das es ermöglicht, die Transmigration von Lymphozyten in das zentrale Nervensystem in vitro zu untersuchen.

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Isolierung der zerebralen Kapillaren aus frischem menschlichen Hirngewebe

Hier stellen wir Ihnen ein Protokoll beschreibt die Einstellung einer in Cellulo BBB (Blut-Hirn-Schranke)-Minibrain aus Polyester poröse Membran Kultur einfügen System um den Transport von Biomolekülen oder infektiöse Erreger über eine menschliche BBB zu bewerten und ihre physiologische Wirkung auf die benachbarten Gehirnzellen.

Ein menschliches Blut-Hirn-Schnittstellenmodell Barriere Kreuzungen durch Krankheitserreger oder Medikamente und ihre Wechselwirkungen mit dem Gehirn zu studieren

Hier zeigen wir, wie man ein kostengünstiges Volt-Amperemeter mit programmierbarer Ausgangsfrequenz aufstellt, das mit handelsüblichen Essstäbchenelektroden für transepitheliale/endotheliale elektrische Widerstandsmessungen verwendet werden kann.

Ein einfacher Ansatz zur Durchführung von TEER-Messungen mit einem selbst gefertigten Volt-Amperemeter mit programmierbarer Ausgangsfrequenz

Die menschliche Blut-Hirn-Schranke verhindert selektiv das Eindringen hydrophiler Moleküle und Krankheitserreger in das Gehirn. Mehrere Pathologien, einschließlich Meningitis und postoperatives Delirium, sind mit einer erhöhten Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke verbunden. Hier beschreiben wir ein Endothelzellkulturmodell, um die Barrieredurchlässigkeit durch mikrobielle Traversal zu testen.

Analyse der Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Barriere durch mikrobielle Traversale durch mikrovaskuläre Endothelzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Etablierung eines menschlichen Blut-Hirn-Schranken-Modells (BBB). Die Endothelzellen und Perizyten werden auf jeder Seite eines Einsatzfilters (Blutkompartiment) ausgesät, und Astrozyten werden in der unteren Vertiefung (Gehirnkompartiment) ausgesät. Das charakterisierte Modell wurde für Nanopartikeltransportexperimente verwendet.

Ein Dreifachkulturzellsystem, das die menschliche Blut-Hirn-Schranke modelliert

Diese Studie verwendet Durchflusszytometrie und zwei verschiedene Gating-Strategien an isolierten perfundierten Mäusen Gehirn-Aderhautplexus; Dieses Protokoll identifiziert die wichtigsten Untergruppen von Immunzellen, die diese Gehirnstruktur bevölkern.

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Der Plexus choroideus (CP), ein in den Neurowissenschaften wenig erforschtes Gewebe, spielt eine Schlüsselrolle bei der Gesundheit und Erkrankung des zentralen Nervensystems. Dieses Protokoll beschreibt eine Mikrodissektionstechnik zur Isolierung des CP und die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie, um einen Gesamtüberblick über seine zelluläre Struktur zu erhalten.

Mikrodissektion und Whole-Mount-Rasterelektronenmikroskopie Visualisierung des Aderhautplexus der Maus

Erfahren Sie die Kultivierung von HIBCPP-Zellen zur Modellierung der Blut-Liquor-Schranke. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung bakterieller Infektionen von der basolateralen Seite und liefert wertvolle Einblicke in ZNS-Infektionsmechanismen.

Ein Choroidplexus Epithelial Zell-basierte Modell des menschlichen Blut-Liquor-Schranke Bakterielle Infektion von der basolateralen Seite zu studieren (Video) | JoVE Journal

Ein Choroidplexus Epithelial Zell-basierte Modell des menschlichen Blut-Liquor-Schranke Bakterielle Infektion von der basolateralen Seite zu studieren

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