Ein Choroidplexus Epithelial Zell-basierte Modell des menschlichen Blut-Liquor-Schranke Bakterielle Infektion von der basolateralen Seite zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, ein auf Choroidplexusepithelzellen basierendes Modell der menschlichen Blut-Hirn-Rückenmarksflüssigkeits-Schranke zu erzeugen, das die Untersuchung bakterieller Infektionen von der basolateralen Seite ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu infektiösen Erkrankungen des Zentralnervensystems zu beantworten, beispielsweise, welche Prozesse während der Wechselwirkungen von Bakterien mit dem Choroidplexusepithel beteiligt sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Analyse der Wechselwirkungen von Krankheitserregern mit der basolateralen, der schwarzen Seite epithelialer Zellen ermöglicht. Diese Methode kann außerdem auf andere Untersuchungen angewendet werden, beispielsweise auf die Erforschung des Transmigrationsverhaltens von Immunzellen und Tumorzellen durch das Epithel des Plexus choroideus. Die Idee zur Verwendung menschlicher Choroidplexuspapillom- oder HIBCCP-Zellen für diese Methode kam mir erstmals, als ich die Manuskriptveröffentlichung von Shibata et al. aus dem Jahr 2005 las.

die die Zelllinie beschreibt. Beginnen Sie damit, mit sterilen Pinzetten 0,33 Quadratzentimeter große Zellkulturfiltereinsätze mit drei Mikrometer großen Poren verkehrt herum in einzelne Vertiefungen einer Zwölflochplatte zu legen. Anschließend überschwemmen Sie die Vertiefung mit einer serologischen Pipette mit etwa drei Milliliter des vorgewärmten Mediums und aspirations überschüssige Flüssigkeit, bis die untere Kammer gerade gefüllt ist.

Fügen Sie anschließend 100 Mikrometer Medium für die Subkultur bei 37 Grad, ergänzt mit zehn Prozent FCS, auf den Filter hinzu. Beim Hinzufügen des Mediums ist es sehr wichtig, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, da die Blasen verhindern, dass die Zellen ausreichend versorgt werden. Sobald das Medium zu allen Inserten hinzugefügt wurde, decken Sie die Platte ab und überführen Sie die Inserts in einen Inkubator mit 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2.

Waschen Sie nun eine Zellkulturflasche mit HIBCPP-Zellen zweimal mit jeweils zehn Milliliter PVS durch Schwenken. Nach dem zweiten Waschschritt geben Sie drei Milliliter 0,25-prozentige Trypsin-EDTA-Lösung zu den Zellen hinzu und schwenken die Flasche. Anschließend inkubieren Sie die Zellen etwa zwanzig Minuten lang.

Am Ende der Inkubation überprüfen, ob die Zellen sich vom Boden des Kolbens gelöst haben und eine runde Form aufweisen. Die Zellen lösen sich nicht vollständig voneinander und werden oft in Agglomerationen gefunden. Das Kulturmedium mit 17 Milliliter Medium resuspendieren, um die Reaktion zu stoppen, und die Suspension in ein 50-Milliliter-Gefäß überführen.

Anschießend die Zellen abzentrifugieren und das Pellet in einem geeigneten Volumen Medium zur Zellzählung resuspendieren. Danach die Zellen auf eine Konzentration von einer mal zehn hoch sechs Zellen pro Milliliter verdünnen und das Gefäß vorsichtig umstülpen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Anschließend 80 Mikroliter der Zellsuspension auf das obere Ende jedes Filtereinsatzes geben.

Nachdem alle Inserts beimpft wurden, decken Sie die Platte ab und stellen Sie sie für eine Übernacht-Kultur zurück in den Inkubator. Am nächsten Tag geben Sie ein Milliliter Medium in jedes Loch einer 24-Loch-Platte. Heben Sie dann mithilfe einer Pinzette jedes Insert vorsichtig an, entsorgen Sie das darin enthaltene Medium und stellen Sie die Inserts mit der richtigen Seite nach oben in einzelne Löcher der 24-Loch-Platte.

Wenn die Filtereinsätze von der 12-Loch-Platte in die 24-Loch-Platte umgekehrt werden, darauf achten, die Filtermembran mit den darauf wachsenden Zellen nicht zu berühren. Die Einsätze mit 0,5 Millilitern frischem Medium auffüllen und die Platte in den Inkubator zurückstellen. Die Einsätze alle zwei Tage in eine neue 24-Loch-Platte mit frischem Medium überführen, wodurch das Medium im oberen Kompartiment ersetzt wird.

Um den trans-epithelialen elektrischen Widerstand oder TEER der Zellen zu messen, tauchen Sie zunächst die Elektrodenspitzen eines epithelialen Gewebe-Volt-Ohm-Meters in 80 Prozent Ethanol ein. Nach 15 Minuten nehmen Sie die Elektrode aus dem Ethanol, damit sie trocknen kann. Anschließend stellen Sie die Spitzen 15 Minuten lang in eine Aliquotte des Subkulturmediums.

Nachdem die Elektrode ausgeglichen hat, positionieren Sie den längeren Arm so, dass er den Boden der unteren Kammer eines Wells der Zellkulturplatte berührt, und den kürzeren Arm so, dass er in die Filterinsert-Kammer ragt. Messen Sie die Widerstandswerte der Zellkultur-Filterinserts im Medium ohne Zellen, um die Leerwerte zu erhalten. Anschließend messen Sie den TEER jedes beimpften Inserts.

Nach der Messung die Elektrode für 15 Minuten in 80 Prozent Ethanol zurücklegen und anschließend in einem trockenen Gefäß aufbewahren. Wenn die TEER-Werte der mit HIBCPP besiedelten Inserte 70 Ohm pro Quadratzentimeter überschreiten, das Medium erneuern, indem frisches Kulturmedium ergänzt mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Insulin und ein Prozent FCS verwendet wird, und die Platte über Nacht in den Zellkulturgehätsch zurückstellen. Um die parazelluläre Permeabilität der Insertkulturen zu bestimmen, 50 Mikrogramm pro Milliliter frisch hergestelltes FITC-Inulin in frischem kulturmedium mit niedrigem Serumanteil dem oberen Filterkompartiment jedes Inserts hinzufügen und die Zellen anschließend in den Inkubator zurückstellen.

Wenn die Kulturen einen TEER-Wert von etwa 500 Ohm pro Quadratzentimeter erreicht haben, infizieren Sie die Zellen mit einer bakteriellen Suspension der gewünschten Art bei einer Multiplizität der Infektion von zehn und stellen Sie die Zellen für den entsprechenden Kulturzeitraum in den Inkubator zurück. Anschließend waschen Sie die Zellen dreimal, indem Sie den Filter in eine neue Vertiefung mit einem Milliliter serumfreiem Medium überführen. Dabei geben Sie jedes Mal 500 Mikroliter desselben Mediums in den Filterkompartiment. Schließlich bestimmen Sie die Konzentration an Inulin, das nach der bakteriellen Infektion vom Filterkompartiment durch die Zellschicht hindurchgetreten ist, indem Sie Mediumproben aus dem unteren Behälter jedes Zellkultur-Filtereinsatzes sammeln und alle Proben gegen zehn ein- und zweifache FITC-Inulin-Standardverdünnungen in einem Mikroplattenreader messen.

HIBCCP-Zellen weisen spezifische Barrierefunktionen auf, die es ihnen ermöglichen, ihren molekularen Austausch in geringem Maße einzuschränken. Beispielsweise zeigen immunfluoreszenzanalytische Untersuchungen der mit dem Protein ZO-1, Occludin und Claudin-1 assoziierten Tight-Junction-Typen ein durchgehendes Signal an den Stellen des Zell-zu-Zell-Kontakts. Dies veranschaulicht die Vernetzung der Zellen durch kontinuierliche Stränge von Tight Junctions.

Wenn HIBCPP-Zellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, weisen sie ein hohes Membranpotential auf, das unbehandelt Werte von bis zu etwa 500 Ohm pro Quadratzentimeter erreichen kann, wobei die typischen Barrierefunktionen der Blut-Hirn-Flüssigkeits-Schranke erhalten bleiben, wie die Ausbildung eines Membranpotentials sowie eine geringe Permeabilität für Makromoleküle. Mit steigenden Konzentrationen von DMSO hingegen sinken die TEER-Werte dosisabhängig, wobei ein ähnlicher signifikanter Abfall der TEER-Werte auch nach Behandlung mit Cytochalasin D beobachtet wird. Zudem führt die Zugabe von zwei Volumenprozent DMSO oder Cytochalasin D zu einem entsprechenden signifikanten Anstieg der Permeabilität für den FITC-Inulin-Fluss.

Außerdem führt die bakterielle Infektion der HIBCCP-Zellen zu einer signifikanten Invasion der Zellschicht durch zwei pathogene Bakterienstämme, MC58 und seinen kapseldefizienten Mutanten, während für den apathogenen Stamm alpha 14 nur eine geringe Invasion beobachtet wird.

Während des Ablaufs dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Filtermembran nach der Zellaussaat nicht zu berühren, da die intakte HIBCCP-Schicht durch den Kontakt beschädigt würde. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie in-vitro-Transmigrationsassays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Mechanismen der Migration von Immun- und Tumorzellen über die Epithelzellen des Plexus choroideus zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Pharmakologie den Weg, um den Substrattransport über das Epithel des Plexus choroideus in vitro zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein HIBCCP-Zell-basiertes Modell der Blut-Hirn-Schrankenflüssigkeitsbarriere zur basolateralen Infektion mit Krankheitserregern vorbereitet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit humanen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und dass stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit unter einer geeigneten Sicherheitshaube getroffen werden sollten, während Sie dieses Verfahren durchführen.