Ein Choroidplexus Epithelial Zell-basierte Modell des menschlichen Blut-Liquor-Schranke Bakterielle Infektion von der basolateralen Seite zu studieren

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein auf Epithelzellen basierendes Modell der menschlichen Blut-Liquor-Schranke des menschlichen Blutes zu generieren. Ermöglicht die Untersuchung von bakteriellen Infektionen von der basal-lateralen Seite. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zu Infektionskrankheiten des Zentralnervensystems zu beantworten, z. B. welche Prozesse bei bakteriellen Wechselwirkungen mit dem Epithel des Plexus choroideus beteiligt sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Analyse der Wechselwirkungen von Krankheitserregern mit der basalen lateralen schwarzen Seite der Epithelzellen ermöglicht. Diese Methode kann auch auf andere Studien angewendet werden, wie z.B. auf die Untersuchung der Transmigration von Immunzellen und Tumorzellen durch das Epithel des Plexus choroideus. Die Idee, das humane Plexus-Plexus-Papillom (HIBCCP-Zellen) für diese Methode zu verwenden, kam mir zum ersten Mal, als ich das Manuskript von Shibata et.al aus dem Jahr 2005 las.

Beschreibung der Zelllinie. Beginnen Sie mit einer sterilen Pinzette, um 0,33 Zentimeter große Zellkulturfiltereinsätze mit einer Quadratgröße von drei Mikrometern kopfüber in einzelne Vertiefungen einer Zwölf-Well-Platte zu platzieren. Dann fluten Sie die Vertiefung mit einer serologischen Pipette mit etwa drei Millilitern des vorgewärmten Mediums und saugen Sie die überschüssige Lösung an, bis das untere Fach gerade gefüllt ist.

Geben Sie als Nächstes 100 Mikrometer 37-Grad-Subkulturmedium mit zehn Prozent FCS auf den Filter. Bei der Zugabe des Mediums ist es sehr wichtig, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, da die Blasen verhindern, dass die Zellen ausreichend gefüttert werden. Wenn das Medium zu allen Einsätzen hinzugefügt wurde, decken Sie die Platte ab und geben Sie die Einsätze in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit fünf Prozent CO2

Waschen Sie nun einen Kolben mit HIBCPP-Zellen mit zehn Millilitern PVS, zweimal mit Verwirbelung. Nach dem zweiten Waschgang geben Sie drei Milliliter 0,25 Prozent Tripsyn EDTA in die Zellen und schwenken Sie den Kolben. Inkubieren Sie die Zellen dann etwa zwanzig Minuten lang.

Vergewissern Sie sich am Ende der Inkubation, dass sich die Zellen vom Boden des Kolbens abgehoben haben und eine runde Form aufweisen. Die Zellen lösen sich nicht vollständig voneinander und sind häufig in Agglomeraten zu finden. Suspendieren Sie die Kultur erneut mit 17 Millilitern Medium, um die Reaktion zu stoppen, und überführen Sie die Suspension in ein 50-Milliliter-Röhrchen.

Schleudern Sie dann die Zellen herunter und suspendieren Sie das Pellet in einem geeigneten Volumen Medium für die Zählung. Als nächstes verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von eins mal zehn bis sechs Zellen pro Milliliter und drehen Sie das Röhrchen um, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Geben Sie dann 80 Mikroliter Zellen auf die Oberseite jedes Filtereinsatzes.

Wenn alle Einsätze ausgesät sind, decken Sie die Platte ab und stellen Sie sie zur Übernachtkultur in den Inkubator zurück. Geben Sie am nächsten Tag einen Milliliter Medium in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Heben Sie dann mit einer Pinzette jeden Einsatz an und entsorgen Sie das Medium im Inneren, indem Sie die Einsätze mit der rechten Seite nach oben in die einzelnen Vertiefungen der 24-Well-Platte legen.

Wenn die Filtereinsätze von der 12-Well-Platte in die 24-Well-Platte umgeklappt werden, achten Sie darauf, dass Sie die Filtermembran nicht mit den darauf wachsenden Zellen berühren. Füllen Sie die Einsätze mit 0,5 Millilitern frischem Medium und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Übertragen Sie die Einsätze alle zwei Tage in eine neue 24-Well-Platte mit frischem Medium und ersetzen Sie dabei das Medium im oberen Fach.

Um den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) der Zellen zu messen, tauchen Sie zunächst die Elektrodenspitzen eines epithelialen Gewebe-Volt-Ohm-Meters in 80 Prozent Ethanol. Entfernen Sie nach 15 Minuten die Elektrode aus dem Ethanol, damit die Elektrode trocknen kann. Legen Sie dann die Spitzen für weitere 15 Minuten in ein Aliquot des Subkulturmediums.

Wenn die Elektrode äquilibriert ist, positionieren Sie den längeren Arm so, dass er den Boden des unteren Fachs einer Vertiefung der Zellkulturplatte berührt, und den kürzeren Arm so, dass er in das Filtereinsatzfach hineinragt. Messen Sie die Widerstandswerte der Zellkulturfiltereinsätze in einem Medium ohne Küvetten, um die Blindwerte zu erhalten. Messen Sie dann den TEER jeder der geseedeten Einsätze.

Legen Sie die Elektrode nach der Messung für 15 Minuten wieder in 80 Prozent Ethanol und lagern Sie sie anschließend in einem trockenen Röhrchen. Wenn die TEER-Werte der HIBCPP-Seeding-Einsätze 70 Ohm pro Quadratzentimeter überschreiten, erneuern Sie das Medium mit frischem Kulturmedium, das mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Insulin und einem Prozent FCS ergänzt wird, und stellen Sie die Platte über Nacht wieder in den Zellkulturinkubator ein. Um die parazelluläre Permeabilität der Einsatzkulturen zu bestimmen, geben Sie 50 Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereitetes FITC-Inulin in frischem Serum-Niederkulturmedium in das obere Filterfach jedes Einsatzes und geben Sie die Zellen wieder in den Inkubator.

Wenn die Kulturen einen TEER von etwa 500 Ohm pro Quadratzentimeter erreicht haben, infizieren Sie die Zellen mit einer bakteriellen Suspension, die bei einer Infektionsvielfalt von zehn von Interesse ist, und bringen Sie die Zellen für die entsprechende Kulturperiode in den Inkubator zurück. Waschen Sie dann die Zellen dreimal, indem Sie den Filter in eine neue Vertiefung mit einem Milliliter serumfreiem Medium umfüllen. Jedes Mal, wenn Sie das Medium mit 500 Mikrolitern desselben Mediums in das Filterfach geben, bestimmen Sie schließlich die Inulinkonzentration, die nach der bakteriellen Infektion aus dem Filterfach durch die Zellschicht gelangt ist, indem Sie Medienproben aus der unteren Vertiefung jedes Zellkulturfiltereinsatzes entnehmen und alle Proben in einem Mikroplatten-Reader gegen zehn Ein- und Zwei-FITC-Inulin-Standardverdünnungen messen.

HIBCCP-Zellen weisen spezifische Barrierefunktionen auf, die es ihnen ermöglichen, ihren molekularen Austausch in bescheidenem Maße einzuschränken. Zum Beispiel zeigen Immunfluoreszenzanalysen der Typübergang, die mit dem Protein assoziiert ist, ZO-1, Occludin und Claudin-1, ein ununterbrochenes Signal an den Stellen des Zell-zu-Zell-Kontakts. Veranschaulichung der Vernetzung der Zellen durch durchgehende Stränge von Tight Junctions.

Wenn sie unter den entsprechenden Bedingungen kultiviert werden, weisen HIBCPP-Zellen ein hohes Membranpotential auf, das ohne Behandlung bis zu etwa 500 Ohm pro Quadratzentimeter erreicht, wobei die typischen Barrierefunktionen der Blut-Liquor-Schranke, wie die Bildung eines Membranpotentials, sowie eine geringe Permeabilität für Makromoleküle erhalten bleiben. Mit zunehmender Dosierung von DMSO sinken die TEER-Werte jedoch dosisabhängig ab, wobei ein ähnlich signifikanter Abfall des TEER-Wertes nach der Behandlung mit Cytochalasin D beobachtet wurde. Darüber hinaus führt die Zugabe von zwei Volumenprozent DMSO oder Cytochalasin D zu einer entsprechenden signifikanten Erhöhung der Permeabilität für den FITC-Inulinfluss.

Des Weiteren führt die bakterielle Infektion der HIBCCP-Zellen zu einer signifikanten Invasion der Zellschicht durch zwei pathogene Bakterienstämme. MC58 und seine kapseldefiziente Mutante. Während für den apathogenen Alpha-14-Stamm nur eine geringe Invasion beobachtet wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Filtermembran nach dem Aussäen der Zellen nicht zu berühren, da die intakte HIBCCP-Schicht durch den Kontakt gestört wird. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie z.B. vitro-Transmigrationsassays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Mechanismen der Immun- und Tumorzellmigration durch Epithelzellen des Plexus choroideus zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Pharmakologie, um den Transfer von Substraten durch das Epithel des Plexus choroideus in vitro zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein HIBCCP-zellbasiertes Modell der Blut-Liquor-Schranke für eine basale laterale Infektion mit Krankheitserregern vorbereiten können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. das Arbeiten unter einer geeigneten Schutzhaube.