Heterogenität Mapping von Protein Expression in Tumoren mittels quantitativer Immunfluoreszenz

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Biomarkerexpression über ganze Gewebeabschnitte von humanem Krebs hinweg genau zu quantifizieren, um dem Grad der Heterogenität der Proteinexpression einen numerischen Wert zuzuweisen. Dies wird erreicht, indem zunächst immunfluoreszenzmarkierte Schnitte von Krebsgewebe mit einem Ganzobjektträger-Fluoreszenzscanner gescannt werden. Als nächstes werden die interessierenden Regionen innerhalb des Tumors für die Bewertung ausgewählt.

Anschließend wird die Expression des interessierenden Proteins in den invasiven Tumorbereichen mit dem automatisierten Bildanalysesystem aqua analysis quantifiziert. Letztendlich kann diese Methode verwendet werden, um die Biomarker-Expression im Krebsgewebe abzubilden, das über den Gewebeschnitt hinweg oft sehr heterogen ist. Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber herkömmlichen Methoden wie der Immunhistochemie mit Farb- und metrischen Visualisierungsreagenzien besteht darin, dass die Immunfluoreszenz quantitativer und empfindlicher ist.

Durch die Kopplung dieser Analysemethoden mit einem ganzen Abschnitt ermöglicht das Immunfluoreszenz-Scanning die feinkörnige Kartierung subtiler Variationen in der Biomarker-Expression über Gewebe hinweg. Zum ersten Mal demonstriert Mark Gustafson, ein direkter Betriebsleiter des Histo RX-Labors, diese Verfahren. Nach dem Mikrotom, dem Schnitt einer Krebsgewebebiopsie und der Immunfluoreszenzfärbung der Probe zur Expression der interessierenden Biomarker werden bis zu fünf Objektträger der gefärbten Schnitte in die Objektträgerkassette des Objektträgerscanners geladen.

Verwenden Sie dann die Schnittstelle in der Konsole für den Untersuchungsbereich. Wählen Sie für jeden Objektträger einen Bereich aus, der das gesamte Gewebe auf dem Objektträger umfasst, unabhängig vom Färbemuster oder anderen beobachtbaren Aspekten der Probe. Als nächstes wählen Sie unter Verwendung der Scan-Oszilloskop-Konsole zunächst eine zu bewertende Geweberegion innerhalb der Tumorregion des Gewebes aus, um die beste Darstellung zu erzielen.

Bestimmen Sie nun mit der automatischen Belichtungsfunktion der Scanskopkonsole die Belichtungszeit für jeden Kanal zusammen mit dem Bildfokus, verwenden Sie die blaue Raute auf dem Konsolenbild des Scanskops, um einen zusätzlichen Bereich außerhalb des Gewebes auszuwählen, aber immer noch innerhalb des Bereichs des Objektträgers unter dem Deckglas, um den Hintergrundbereich zu definieren, in dem die Flat-Field-Korrekturbilder aufgenommen werden. Fügen Sie für jeden Filter Fokuspunkte zu dem Gewebebereich hinzu, der durch gelbe Quadrate dargestellt wird, um die Bildaufnahme zu optimieren. Wenn die Bilder einen hohen Hintergrund oder andere Bildartefakte aufweisen, sollte der Bildbereich verschoben und neue Bilder erfasst werden.

Das Gewebe wird dann gescannt und die aufgenommenen digitalen Objektträgerbilder werden dann automatisch in die Aperio-Spektrum-Datenbank hochgeladen. Doppelklicken Sie auf die Miniaturansicht des Spektrumprogramms, um die Folie für die Analyse aus der Liste der digitalen Folien in der Spektrumdatenbank auszuwählen. Kommentieren Sie dann mit dem beigefügten h- und d-kommentierten Bild den interessierenden Bereich auf dem Fluoreszenzbild.

Mehrere interessante Regionen, die mit einzelnen Kreisen abgegrenzt sind, können auf einer einzigen Probe ausgewählt werden. Die kommentierten Bilder werden automatisch in der Spektrumdatenbank gespeichert. Wählen Sie nun in der Menüleiste oben auf dem Bildschirm die Option Analysieren aus, wenn das Analysefenster angezeigt wird, und wählen Sie histo RX aqua analysis aus dem Pulldown-Menü aus.

Wenn Sie bereit sind, zu beginnen, drücken Sie die Schaltfläche "Analysieren". In der Windows-Taskleiste wird ein minimiertes Konsolenfenster angezeigt, in dem der Fortschritt der Übertragung der Bilder aus der Spectrum-Datenbank auf den lokalen Computer angezeigt wird. Sobald die Daten übertragen wurden, wird die Aqua-Analyse gestartet, um einen Aqua-Score unter Verwendung eines unüberwachten Aqua-Scoring-Algorithmus zu generieren, der auf der Daten-Clustering eines ersten Schwellenwerts der Probe, dem Pan-Cytokeratin-Bildsignal über dem Hintergrundbildsignal, basiert. Auf diese Weise kann mit Hilfe der Pixel eine Tumormaske definiert werden, die dann für nachfolgende Berechnungen verwendet werden kann.

Verwenden Sie die hochexprimierten Pan-Cytokeratin-Pixel, um auch die zytoplasmatischen oder nicht-nukleären Regionen der Tumorzellen zu definieren. Wie hier zu sehen ist, werden die Pixel mit einem hohen Signal im DPI-Kanal, die sich innerhalb der Tumormaske befinden, als nukleärer Natur identifiziert. Wenn bei der Überprüfung Felder identifiziert werden, die aufgrund von Proben- oder Bildgebungsartefakten nicht für die Bewertung geeignet waren, werden diese Felder aus der Bewertung geschwärzt und führen ebenfalls zu einem nicht bestandenen Endergebnis.

Die Ergebnisse des Aqua-Scores werden als Tabelle der Punktzahlen dargestellt, die jeder 512 x 512 Pixel-Kachel im interessierenden Bereich innerhalb einer ganzen Gewebeschnittprobe zugeordnet sind, die gespeichert und für die nachfolgende statistische Analyse verwendet werden kann. Diese Hämat-, Toin- und Eoin-gefärbten Mikroaufnahmen zeigen, wie verschiedene Bereiche desselben Eierstockkrebses eine unterschiedliche Morphologie aufweisen können. Die High-Power-Ansicht oben rechts in Abbildung B zeigt Zellen mit zytoplasmatischer Reinigung und einem soliden Wachstumsmuster im oberen Teil des Tumors.

Der untere Teil des Gewebes, der im unteren rechten Bereich der Abbildung C vergrößert ist, weist jedoch ein homogeneres eosinophiles Zytoplasma und ein papilläres Wachstumsmuster auf. Hier sind Heterogenitäts-Heatmaps der ER-Expression in einem Gewebeschnitt von Eierstockkrebs vor und nach einer Chemotherapie im oberen bzw. unteren Panel dargestellt. Beachten Sie den Wechsel von der variablen ER-Expression über den gesamten Abschnitt mit Bereichen mit hoher und niedriger Expression in der oberen Abbildung zu einer gleichmäßigen Verteilung der hohen ER-Expression, die in der unteren Abbildung rot dargestellt ist.

Die numerische Darstellung dieser Veränderung wird auf der linken Seite durch die Abnahme des Simpsons-Index gekennzeichnet. In dieser Abbildung sind die Heterogenitäts-Heatmaps von HER zwei in einem Gewebeschnitt des Eierstockkrebses vor und nach der Therapie erneut dargestellt, wie im oberen bzw. unteren Bild zu sehen ist. Beachten Sie auch hier den Wechsel von der variablen HER two-Expression über den gesamten Schnitt mit Bereichen mit hoher und niedriger Expression in der oberen Abbildung zu einer gleichmäßigen Verteilung der hohen HER two-Expression in der unteren Abbildung.

Wieder einmal ist zu beobachten, dass der Simpsons-Index sinkt. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Qualität der Daten, die durch die computergestützte Analyse generiert werden, nur so gut ist wie die Qualität der Färbung, und diese muss einen hohen technischen Standard haben.